Specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych dla poklatkowej mikroskopii oświetlenia strukturalnego
June 4th, 2020
Protokół opisuje specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych za pomocą komercyjnie dostępnego barwnika żelowego DNA, akwizycję serii poklatkowych żywych znakowanych komórek za pomocą super-rozdzielczej mikroskopii oświetlenia strukturalnego (SR-SIM) oraz automatyczne śledzenie ruchu nukleoidów.
Protokół pozwala na specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych w żywych komórkach i ilościowe badanie ich ruchu w wysokiej rozdzielczości. Inkubacja z barwnikiem fluorescencyjnym jedynie omija potrzebę nadmiernej ekspresji białka fluorescencyjnego, unikając powiązanych artefaktów i ograniczeń oraz umożliwiając zastosowanie naszego protokołu do komórek nietransfekulowalnych. Aby uzyskać preferencyjne barwienie nukleoidów, należy użyć SYBR Gold i niczego innego w warunkach, które zoptymalizowaliśmy.
W przeciwnym razie całkowite DNA komórkowe może zostać wybarwione. Na dzień przed procedurą znakowania należy wyhodować cztery razy 10 do piątej komórki HeLa w dwóch mililitrach pożywki na 35-milimetrowej szalce Petriego. Następnego ranka umyj komórki w dwóch mililitrach PBS przed dodaniem jednego mililitra pożywki hodowlanej wolnej czerwieni fenolowej i jednego mililitra odpowiedniego roztworu do znakowania 2X.
Po 30 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, ostrożnie odessać barwnik zawierający supernatant z każdej 35-milimetrowej szalki Petriego i umyć komórki dwoma mililitrami PBS. Następnie nakarm komórki świeżą pożywką do hodowli komórek wolnych od czerwieni fenolowej i wróć do inkubatora do hodowli komórkowych chronionego przed światłem do czasu obrazowania na żywo. W przypadku obrazowania żywych komórek, co najmniej godzinę przed sesją obrazowania, umieść inkubator na stoliku mikroskopu z oświetleniem strukturalnym o super rozdzielczości i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza, a stężenie dwutlenku węgla na 5%Włącz wszystkie elementy mikroskopu, w tym lasery, i wybierz duże powiększenie, Obiektyw zanurzeniowy o dużej aperturze numerycznej zalecany przez producenta mikroskopu do mikroskopii oświetlenia strukturalnego o wysokiej rozdzielczości.
Gdy lasery się rozgrzeją, zainstaluj 35-milimetrową szalkę Petriego na stoliku mikroskopu i użyj okularów, aby zlokalizować obszar zainteresowania z komórkami przymocowanymi do dna czaszy. Aby uzyskać obrazy z mikroskopii oświetlenia strukturalnego o super rozdzielczości, użyj wysokiej klasy kamery sprzężonej z ładunkiem zwielokrotnionym elektronami. W oprogramowaniu do akwizycji obrazu ustaw wysokie wzmocnienie zwielokrotnienia elektronów zgodnie z zaleceniami dla aparatu.
Przed uzyskaniem serii poklatkowej do śledzenia nukleoidów, uzyskaj dwukolorowy obraz mikroskopii oświetlenia strukturalnego o super rozdzielczości o tym samym polu widzenia w jednym kanale do barwienia mitochondriów i drugim dla złota SYBR. Ustaw kanał barwny obrazu mitochondrialnego na odpowiednie wzbudzenie i emisję dla użytego barwnika mitochondrialnego i ustaw odpowiedni filtr emisji wzbudzenia i huku Pass dla złotego barwnika SYBR. Ustaw najniższą możliwą moc lasera dla obu kanałów.
Jeśli mikroskop rejestruje kanały tylko sekwencyjnie, wyłącz kanał wykrywania barwienia mitochondrialnego. odznacz pole Z-stack w oprogramowaniu, aby wyłączyć akwizycję Z-stack, aby ustawić akwizycję pojedynczej płaszczyzny ogniskowej i ustawić najkrótszy możliwy czas naświetlania aparatu. Ustaw trzy obroty siatki i uzyskaj dwuwymiarowe obrazy oznaczonych komórek przy kilku wartościach mocy lasera i kilku czasach naświetlania, aby zoptymalizować moc lasera w czasie ekspozycji kamery.
Wybierz moc lasera i czasy naświetlania kamery, które dają obrazy z mikroskopii oświetlenia strukturalnego z jasnymi punktami w mitochondriach z niewielkimi lub żadnymi artefaktami, a następnie rozpocznij akwizycję serii poklatkowej przy użyciu zoptymalizowanych ustawień. W celu analizy obrazów poklatkowych otwórz przekonwertowane obrazy mikroskopii oświetlenia strukturalnego i odpowiednie oprogramowanie do analizy obrazu, które ma moduł śledzenia plam, a następnie kliknij przycisk Dodaj nowe punkty, aby uruchomić kreatora tworzenia plam. Na karcie tworzenia kliknij pozycję śledź miejsca w czasie i przejdź do drugiego kroku kreatora.
Ustaw szacowaną średnicę x-y na 0,1 do 0,15 mikrometra. Kliknij opcję Odejmowanie tła i przejdź do trzeciego kroku kreatora. Przeciągnij pionową linię na histogramie, aby dostosować próg filtra jakości, aż większość nukleotydów zostanie wykryta, ponieważ miejsca w artefaktach nie są wykrywane w każdej klatce.
Przejdź do czwartego i piątego kroku kreatora i wybierz algorytm ruchu autoregresyjnego. Ustaw maksymalną odległość na 0,5 mikrometra, a maksymalny rozmiar odstępu na zero. Gdy precyzyjnie dostrojone parametry pozwolą oprogramowaniu wykryć wszystkie miejsca i poprawnie zbudować ścieżki, kliknij przycisk strzałki teraz, aby potwierdzić utworzenie ścieżek i kliknij ikonę statystyk, aby wyodrębnić statystyki ścieżek.
Następnie wybierz niezbędne parametry statystyczne i kliknij przycisk Zapisz jako, aby wyeksportować wartości jako pliki CSV z kropkami w celu kwantyfikacji i wizualizacji. Znakowanie wysokimi stężeniami złota SYBR lub PicoGreen powoduje obfite barwienie jąder i barwienie punktowe w cytoplazmie. Przy niższych stężeniach słaby złoty sygnał SYBR pojawia się w jądrach w postaci wzoru jasnych plam obserwowanych w cytoplazmie.
Etykietowanie PicoGreen w niskich stężeniach daje głównie barwienie jądrowe. Jednoczesne barwienie niskimi stężeniami złota SYBR w dalekim czerwonym barwniku mitochondrialnym ujawnia, że prawie całe barwienie złotem SYBR występuje w mitochondriach, podczas gdy znakowanie w wysokich stężeniach powoduje znaczne zabarwienie jąder i cytoplazmy. Obrazowanie poklatkowe ujawnia, że po 45 minutach barwienie nukleoidem jest bliskie nasycenia.
Utrwalenie powoduje nieznaczną redystrybucję barwnika do jądra, podczas gdy przenikanie utrwalonych komórek eliminuje kropkowany wzór barwienia mitochondriów i wzmacnia barwienie jądrowe. Jeśli złoto SYBR zostanie dodane do komórek po utrwaleniu i permeablizacji, wówczas barwnik jest równomiernie rozprowadzany w cytoplazmie i jądrze, co powoduje utratę specyficzności barwienia. Obrazowanie 3D na żywo za pomocą mikroskopu oświetlenia strukturalnego o super rozdzielczości ujawnia nukleoid mitochondrialny jako jasne punkty w mitochondriach.
Śledzenie pozycji nukleoidu w rozdzielczości wykraczającej poza granicę dyfrakcji pokazuje, że większość nukleoidów wykazuje losowe ruchy na krótkie odległości, które prawdopodobnie są ograniczone do sieci mitochondrialnej. Należy zauważyć, że protokół ten nie jest zgodny z utrwalaniem próbki. Jednak nasz protokół powinien być kompatybilny z szeroką gamą testów opartych na obrazowaniu żywych komórek w celu badania morfologii, dynamiki i aktywności cząsteczek i organelli.
Nasze badanie ilustruje korzyści płynące z retargetowania barwników nieorganicznych w technikach opartych na komórkach. Może to zainspirować do eksploracji innych barwników fluorescencyjnych pod kątem ich zastosowania w badaniach komórkowych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół umożliwia specyficzną oznaczanie nukleoidów mitochondrialnych w żywych komórkach, ułatwiając ilościowe badanie ich ruchu z wysoką rozdzielczością. Dzięki zastosowaniu komercyjnie dostępnego barwnika do żelu DNA, metoda omija potrzebę nadekspresji białka fluorescencyjnego, unikając w ten sposób artefaktów i poszerzając zastosowanie na nietransfekowalne typy komórek.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Biologia komórki
- Mikroskopia
- Biologia molekularna
Tło
- Nukleoidy mitochondrialne odgrywają kluczową rolę w funkcjonowaniu komórki.
- Konwencjonalne metody barwienia mogą wprowadzać artefakty.
- Badanie koncentruje się na optymalizacji warunków selektywnego oznaczania nukleoidów.
Zastosowane metody
- Superrozdzielcze mikroskopia z strukturalnym oświetleniem (SR-SIM)
- Komórki HeLa
- Barwienie SYBR Gold
Główne wyniki
- Protokół umożliwia efektywne wizualizowanie nukleoidów mitochondrialnych jako jasnych plamek.
- Zdjęcia time-lapse umożliwiają śledzenie ruchu nukleoidów w czasie rzeczywistym.
- Wysokiej rozdzielczości obrazowanie ujawnia dynamię przekraczającą limit dyfrakcji.
Wnioski
- To badanie pokazuje nową metodę oznaczania nukleoidów mitochondrialnych, dając cenny wgląd w ich ruch.
- Wyniki te zwiększają zrozumienie dynamiki mitochondrialnej i jej znaczenia w badaniach nad biologią komórki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables artifact-free, live-cell visualization of mitochondrial nucleoids, supporting mechanistic de-risking in mitochondrial target validation. By avoiding fluorescent protein overexpression, it ensures phenotypic fidelity in early discovery assays. The method enhances predictive confidence in nucleoid dynamics as a biomarker for mitochondrial function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct interrogation of mitochondrial DNA-protein complexes without overexpression artifacts.
- Operational Value: Compatible with non-transfectable cells, expanding target validation models.
- Predictive Value: Provides quantitative motion data to de-risk mechanistic hypotheses about nucleoid function.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible fluorescent signals for high-content nucleoid tracking.
- Scalability: Uses a single dye (SYBR Gold) under optimized conditions for consistent labeling across plates.
- Quantitative Output: Enables spot detection and trajectory analysis for dose-response or genetic screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Links nucleoid dynamics to mitochondrial health in preclinical disease models.
- Translational Continuity: Supports longitudinal tracking from discovery to validation stages.
- Risk-Adjusted Decisions: Nucleoid motion parameters inform go/no-go criteria for mitochondrial-targeted compounds.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits between early target hypothesis testing and lead optimization, providing dynamic readouts that bridge static imaging and functional assays.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about nucleoid involvement in mitochondrial inheritance and stress response.
- Screening: Delivers quantitative motility metrics for compound effect profiling.
- Analytics: Generates track statistics (velocity, confinement, directionality) for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects nucleoid behavior to mitochondrial membrane potential or ROS biomarkers.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging module for mitochondrial quality control across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial genetics and nucleoid-protein interactions.
- Operational Value: Eliminates transfection steps, improving assay throughput and consistency.
- Strategic Value: Increases confidence in target engagement by linking compound effects to nucleoid dynamics.
- Portfolio Impact: Enables early prioritization of compounds based on subcellular functional readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell super-resolution microscopy and image analysis.
- Needs structured illumination microscopy with environmental control (37°C, 5% CO2).
- Demands standardization of dye concentration and incubation time to avoid nuclear staining.
- Requires adaptation for different mitochondrial stains when multiplexing.
- Limited to live-cell applications; incompatible with fixation or permeabilization steps.
