Specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych dla poklatkowej mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Protokół pozwala na specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych w żywych komórkach i ilościowe badanie ich ruchu w wysokiej rozdzielczości. Inkubacja z barwnikiem fluorescencyjnym jedynie omija potrzebę nadmiernej ekspresji białka fluorescencyjnego, unikając powiązanych artefaktów i ograniczeń oraz umożliwiając zastosowanie naszego protokołu do komórek nietransfekulowalnych. Aby uzyskać preferencyjne barwienie nukleoidów, należy użyć SYBR Gold i niczego innego w warunkach, które zoptymalizowaliśmy.

W przeciwnym razie całkowite DNA komórkowe może zostać wybarwione. Na dzień przed procedurą znakowania należy wyhodować cztery razy 10 do piątej komórki HeLa w dwóch mililitrach pożywki na 35-milimetrowej szalce Petriego. Następnego ranka umyj komórki w dwóch mililitrach PBS przed dodaniem jednego mililitra pożywki hodowlanej wolnej czerwieni fenolowej i jednego mililitra odpowiedniego roztworu do znakowania 2X.

Po 30 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, ostrożnie odessać barwnik zawierający supernatant z każdej 35-milimetrowej szalki Petriego i umyć komórki dwoma mililitrami PBS. Następnie nakarm komórki świeżą pożywką do hodowli komórek wolnych od czerwieni fenolowej i wróć do inkubatora do hodowli komórkowych chronionego przed światłem do czasu obrazowania na żywo. W przypadku obrazowania żywych komórek, co najmniej godzinę przed sesją obrazowania, umieść inkubator na stoliku mikroskopu z oświetleniem strukturalnym o super rozdzielczości i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza, a stężenie dwutlenku węgla na 5%Włącz wszystkie elementy mikroskopu, w tym lasery, i wybierz duże powiększenie, Obiektyw zanurzeniowy o dużej aperturze numerycznej zalecany przez producenta mikroskopu do mikroskopii oświetlenia strukturalnego o wysokiej rozdzielczości.

Gdy lasery się rozgrzeją, zainstaluj 35-milimetrową szalkę Petriego na stoliku mikroskopu i użyj okularów, aby zlokalizować obszar zainteresowania z komórkami przymocowanymi do dna czaszy. Aby uzyskać obrazy z mikroskopii oświetlenia strukturalnego o super rozdzielczości, użyj wysokiej klasy kamery sprzężonej z ładunkiem zwielokrotnionym elektronami. W oprogramowaniu do akwizycji obrazu ustaw wysokie wzmocnienie zwielokrotnienia elektronów zgodnie z zaleceniami dla aparatu.

Przed uzyskaniem serii poklatkowej do śledzenia nukleoidów, uzyskaj dwukolorowy obraz mikroskopii oświetlenia strukturalnego o super rozdzielczości o tym samym polu widzenia w jednym kanale do barwienia mitochondriów i drugim dla złota SYBR. Ustaw kanał barwny obrazu mitochondrialnego na odpowiednie wzbudzenie i emisję dla użytego barwnika mitochondrialnego i ustaw odpowiedni filtr emisji wzbudzenia i huku Pass dla złotego barwnika SYBR. Ustaw najniższą możliwą moc lasera dla obu kanałów.

Jeśli mikroskop rejestruje kanały tylko sekwencyjnie, wyłącz kanał wykrywania barwienia mitochondrialnego. odznacz pole Z-stack w oprogramowaniu, aby wyłączyć akwizycję Z-stack, aby ustawić akwizycję pojedynczej płaszczyzny ogniskowej i ustawić najkrótszy możliwy czas naświetlania aparatu. Ustaw trzy obroty siatki i uzyskaj dwuwymiarowe obrazy oznaczonych komórek przy kilku wartościach mocy lasera i kilku czasach naświetlania, aby zoptymalizować moc lasera w czasie ekspozycji kamery.

Wybierz moc lasera i czasy naświetlania kamery, które dają obrazy z mikroskopii oświetlenia strukturalnego z jasnymi punktami w mitochondriach z niewielkimi lub żadnymi artefaktami, a następnie rozpocznij akwizycję serii poklatkowej przy użyciu zoptymalizowanych ustawień. W celu analizy obrazów poklatkowych otwórz przekonwertowane obrazy mikroskopii oświetlenia strukturalnego i odpowiednie oprogramowanie do analizy obrazu, które ma moduł śledzenia plam, a następnie kliknij przycisk Dodaj nowe punkty, aby uruchomić kreatora tworzenia plam. Na karcie tworzenia kliknij pozycję śledź miejsca w czasie i przejdź do drugiego kroku kreatora.

Ustaw szacowaną średnicę x-y na 0,1 do 0,15 mikrometra. Kliknij opcję Odejmowanie tła i przejdź do trzeciego kroku kreatora. Przeciągnij pionową linię na histogramie, aby dostosować próg filtra jakości, aż większość nukleotydów zostanie wykryta, ponieważ miejsca w artefaktach nie są wykrywane w każdej klatce.

Przejdź do czwartego i piątego kroku kreatora i wybierz algorytm ruchu autoregresyjnego. Ustaw maksymalną odległość na 0,5 mikrometra, a maksymalny rozmiar odstępu na zero. Gdy precyzyjnie dostrojone parametry pozwolą oprogramowaniu wykryć wszystkie miejsca i poprawnie zbudować ścieżki, kliknij przycisk strzałki teraz, aby potwierdzić utworzenie ścieżek i kliknij ikonę statystyk, aby wyodrębnić statystyki ścieżek.

Następnie wybierz niezbędne parametry statystyczne i kliknij przycisk Zapisz jako, aby wyeksportować wartości jako pliki CSV z kropkami w celu kwantyfikacji i wizualizacji. Znakowanie wysokimi stężeniami złota SYBR lub PicoGreen powoduje obfite barwienie jąder i barwienie punktowe w cytoplazmie. Przy niższych stężeniach słaby złoty sygnał SYBR pojawia się w jądrach w postaci wzoru jasnych plam obserwowanych w cytoplazmie.

Etykietowanie PicoGreen w niskich stężeniach daje głównie barwienie jądrowe. Jednoczesne barwienie niskimi stężeniami złota SYBR w dalekim czerwonym barwniku mitochondrialnym ujawnia, że prawie całe barwienie złotem SYBR występuje w mitochondriach, podczas gdy znakowanie w wysokich stężeniach powoduje znaczne zabarwienie jąder i cytoplazmy. Obrazowanie poklatkowe ujawnia, że po 45 minutach barwienie nukleoidem jest bliskie nasycenia.

Utrwalenie powoduje nieznaczną redystrybucję barwnika do jądra, podczas gdy przenikanie utrwalonych komórek eliminuje kropkowany wzór barwienia mitochondriów i wzmacnia barwienie jądrowe. Jeśli złoto SYBR zostanie dodane do komórek po utrwaleniu i permeablizacji, wówczas barwnik jest równomiernie rozprowadzany w cytoplazmie i jądrze, co powoduje utratę specyficzności barwienia. Obrazowanie 3D na żywo za pomocą mikroskopu oświetlenia strukturalnego o super rozdzielczości ujawnia nukleoid mitochondrialny jako jasne punkty w mitochondriach.

Śledzenie pozycji nukleoidu w rozdzielczości wykraczającej poza granicę dyfrakcji pokazuje, że większość nukleoidów wykazuje losowe ruchy na krótkie odległości, które prawdopodobnie są ograniczone do sieci mitochondrialnej. Należy zauważyć, że protokół ten nie jest zgodny z utrwalaniem próbki. Jednak nasz protokół powinien być kompatybilny z szeroką gamą testów opartych na obrazowaniu żywych komórek w celu badania morfologii, dynamiki i aktywności cząsteczek i organelli.

Nasze badanie ilustruje korzyści płynące z retargetowania barwników nieorganicznych w technikach opartych na komórkach. Może to zainspirować do eksploracji innych barwników fluorescencyjnych pod kątem ich zastosowania w badaniach komórkowych.