Name: Specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych dla poklatkowej mikroskopii oświetlenia strukturalnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Poznaj metodę specyficznego znakowania nukleoidów mitochondrialnych w żywych komórkach HeLa przy użyciu barwnika SYBR Gold i mikroskopii SR-SIM. Technika umożliwia śledzenie dynamiki mitochondrialnej bez artefaktów ekspresji białkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Asifie Akhtar i Angelice Rambold (obie z Instytutu Immunobiologii i Epigenetyki im. Maxa Plancka) za dostarczenie komórek HeLa.

UWAGA: Wszystkie wymienione tutaj linie komórkowe były hodowane w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM) o wysokim poziomie glukozy, uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), glutaminą, penicyliną/streptomycyną i pirogronianem. Zrównoważyć wszystkie pożywki i suplementy, które mają być użyte w dniu etykietowania i obrazowania, ogrzewając je do 37 °C w inkubatorze nastawionym na 5% CO2 . Wszystkie prace związane z hodowlą komórkową, w tym znakowanie, odbywają się w sterylnych warunkach pod okapem z przepływem laminarnym.
1. Etykietowanie komórek na żywo
<ol>
	<li>Dzień przed procedurą znakowania należy wyhodować 4 x 105 komórek HeLa w 2 ml pożywki na szalce Petriego o średnicy 35 mm ze szklanym dnem #1,5. Można stosować szkiełka wielostudzienkowe, ale objętości należy regulować proporcjonalnie do objętości studni. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową do około 50 000 komórek/ml i zasiać 2 ml zawiesiny komórkowej na szalce Petriego o średnicy 35 mm.</li>
	<li>Przygotować następujące rozcieńczenia komercyjnego roztworu podstawowego SYBR Gold (SG): 1:5 000. Przygotować Mitotracker Deep Red (dalekie czerwone barwienie) lub Mitotracker CMXRos Red (czerwone barwienie) (tabela materiałów; materiał handlowy rozcieńczony 1:2,000) w pożywce hodowlanej wolnej od czerwieni fenolowej. Przygotować taki sam zestaw rozcieńczeń picoGreen, jak dla SG. 
	nuta: Rozwiązania opisane w kroku 1.2 to 2x rozwiązania do etykietowania. W miarę możliwości należy chronić wszystkie roztwory zawierające barwniki fluorescencyjne przed światłem.</li>
	<li>Umyj przylegające komórki 2 ml PBS raz. Dodać 1 ml pożywki hodowlanej wolnej od czerwieni fenolowej do szalki Petriego o średnicy 35 mm. W przypadku szkiełka z 8-dołkową komorą należy użyć objętości równej 1/2 całkowitej pojemności studzienki (np. dodać 125 μl, jeśli całkowita pojemność studzienki wynosi 250 μl).</li>
	<li>Dodać 1 ml 2x roztworu do etykietowania przygotowanego na etapie od 1,2 do 35 mm na szalce Petriego. W przypadku szkiełka z 8-dołkową komorą należy użyć objętości równej 1/2 całkowitej pojemności studni. Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2, 
	nuta: Nie inkubuj komórek z roztworem znakującym SG dłużej niż 1 godzinę, ponieważ dłuższa inkubacja spowoduje znakowanie jądrowego DNA.</li>
	<li>Ostrożnie odessać pożywkę zawierającą barwniki fluorescencyjne i raz przemyć komórki PBS.</li>
	<li>Dodać pożywkę do hodowli komórkowych bez czerwieni fenolowej i trzymać komórki w ciemności w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C do czasu obrazowania.</li>
	<li>Obrazowanie żywych komórek na mikroskopie SR-SIM wyposażonym w jednostkę inkubacyjną (patrz poniżej).</li>
</ol>
2. Akwizycja obrazu SR-SIM
<ol>
	<li>Zainstaluj inkubator typu stage top na stoliku mikroskopu. Ustaw żądaną temperaturę i stężenie CO2 (np. 37 °C i 5% dla komórek ssaków) i utrzymuj ciepło przez co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem akwizycji obrazu.</li>
	<li>Włącz wszystkie elementy mikroskopu SR-SIM, w tym lasery, i pozostaw je do rozgrzania na co najmniej 1 godzinę.</li>
	<li>Wybierz obiektyw zanurzeniowy o dużym powiększeniu i dużej aperturze numerycznej (NA) (np. olej 100x 1,46 NA) zalecany do SR-SIM przez producenta mikroskopu.</li>
	<li>Zainstalować szkiełko z komorą lub szalkę 35 mm z oznaczonymi komórkami (od kroku 1.6) na stoliku mikroskopu inkubowanego.</li>
	<li>Zlokalizuj obszar zainteresowania na próbce, najlepiej za pomocą okularów. Aby uzyskać najlepszą jakość obrazowania SR-SIM, wybierz ogniwa, które są dobrze przymocowane do szkła.</li>
	<li>Użyj wysokiej klasy kamery EM-CCD z urządzeniem do namnażania elektronów (EM-SIM), aby uzyskać obrazy SR-SIM.</li>
	<li>Korzystając z oprogramowania do akwizycji obrazu, ustaw wysokie wzmocnienie EM zalecane dla używanego aparatu (np. 300).</li>
	<li>Przed uzyskaniem serii poklatkowej do śledzenia nukleoidów, uzyskaj dwukolorowy obraz SR-SIM o tym samym polu widzenia: jeden kanał do barwienia mitochondriów, a drugi do SG. Ustaw pierwszy kanał koloru odpowiedni dla użytego barwnika mitochondrialnego (np. dla dalekiego czerwonego barwienia mitochondrialnego ustaw wzbudzenie na 633 nm lub więcej i filtr emisyjny długoprzepustowy 650 nm). Dla sygnału SG ustaw wzbudzenie na 488 nm i filtr emisyjny pasmowo-przepustowy 500–550 nm.</li>
	<li>Korzystając z oprogramowania, ustaw najniższą możliwą moc lasera zarówno dla linii barwienia 488 nm, jak i dalekiej czerwieni. 
	nuta: Typowe ustawienie to 1% mocy wyjściowej lasera regulowanej przez przestrajalny filtr akustyczno-optyczny (AOTF).</li>
	<li>Jeśli mikroskop SIM rejestruje kanały tylko sekwencyjnie (konfiguracja z jedną kamerą), wyłącz kanał wykrywania dalekiej czerwonej plamy.</li>
	<li>Ustaw akwizycję pojedynczej płaszczyzny ogniskowej, wyłączając akwizycję Z-stack, odznaczając pole Z-stack w oprogramowaniu.</li>
	<li>Ustaw najkrótszy możliwy czas naświetlania kamery EM-CCD.</li>
	<li>Ustaw trzy obroty siatki zamiast pięciu.</li>
	<li>Aby zwiększyć liczbę klatek na sekundę, w zakładce Pobieranie oprogramowania ustaw kamerę tak, aby odczytywała dane tylko z centralnego obszaru czujnika kamery zamiast "Full Chip". 
	nuta: Na przykład przełączenie z odczytu obszaru 1 000 x 1 000 pikseli z pełnym czujnikiem na odczyt tylko 256 x 256 pikseli pozwala skrócić czas ekspozycji aparatu z 50 ms do 13,4 ms i całkowity czas wyświetlania klatki z 1,8 s do 1,2 s. Jeśli odczytywana jest tylko środkowa część matrycy aparatu, pole widzenia będzie bardzo małe dla obiektywu 63x lub 100x zwykle używanego w SR-SIM. Krótszy czas naświetlania zmniejszy stosunek sygnału do szumu obrazów.</li>
	<li>Zoptymalizuj moc lasera i czas ekspozycji kamery: uzyskaj dwuwymiarowe (2D) obrazy SR-SIM znakowanych komórek przy kilku wartościach mocy lasera (np. 0,5%, 1%, 1,5%, 2%) i kilku czasach naświetlania (np. 13,4 ms, 25 ms, 50 ms).</li>
	<li>Przetwórz nieprzetworzone zestawy danych SIM (patrz krok 3.1).</li>
	<li>Wybierz moc lasera i czasy naświetlania kamery, które dają obrazy SIM z jasnymi punktami w mitochondriach (tj. nukleoidami) z niewielkimi lub żadnymi artefaktami generowanymi przez przetwarzanie SIM. Sprawdź obszary poza mitochondriami (np. 1% mocy lasera na ciele stałym 488 nm i 25 ms ekspozycji kamery EM-CCD).</li>
	<li>Rozpocznij rejestrację serii poklatkowej, korzystając z ustawień zoptymalizowanych w krokach 2.15–2.17.</li>
</ol>
3. Przetwarzanie i analiza danych
<ol>
	<li>Przetwarzaj surowe zestawy danych SIM za pomocą modułu oświetlenia strukturalnego odpowiedniego oprogramowania (tabela materiałów): zaznacz pole wyboru Auto dla parametrów przetwarzania karty SIM. Aby automatycznie przetwarzać wiele plików, użyj narzędzia do przetwarzania wsadowego, usuń zaznaczenie opcji Użyj bieżącego dla wsadu, kliknij przycisk Uruchom wsadowo i wybierz wiele plików do przetwarzania na karcie SIM.</li>
	<li>Konwertuj zestawy danych szeregów czasowych przetwarzanych przez kartę SIM do formatu IMS za pomocą oprogramowania do konwersji plików Imaris (tj. wersji odpowiadającej wersji oprogramowania Imaris).</li>
	<li>Otwórz przekonwertowany plik w oprogramowaniu (wersja 8.4.1 lub nowsza), które ma licencję na moduł Lineage (lub Track).</li>
	<li>Uruchom kreatora tworzenia "Spoty", klikając ikonę Dodaj nowe miejsca. Zostanie uruchomiony kreator tworzenia.</li>
	<li>Wybierz kartę Utwórz kreatora.</li>
	<li>W pierwszym kroku kreatora kliknij opcję Śledź miejsca (w czasie) i przejdź do drugiego kroku kreatora.</li>
	<li>Ustaw Szacowana średnica XY na 0,1-0,15 μm, kliknij Odejmowanie tła i przejdź do trzeciego kroku.</li>
	<li>Dostosuj próg w filtrze "Jakość", przeciągając pionową linię na histogramie tak, aby większość nukleoidów była wykrywana jako "plamy", podczas gdy artefakty nie były wykrywane (tj. wykryte miejsca były oznaczone jako kulki nałożone na obraz). Sprawdź, czy tak jest w przypadku każdej klatki i w razie potrzeby ponownie dostosuj próg. Przejdź do czwartego, a następnie do piątego kroku kreatora.</li>
	<li>Wybierz algorytm ruchu autoregresyjnego. Ustaw maksymalną odległość na 0,5 μm. Ustaw maksymalny rozmiar odstępu na 0.</li>
	<li>Przyjrzyj się każdej klatce w szeregach czasowych i sprawdź, czy nie są rysowane fałszywe ścieżki i czy nie są wprowadzone przerwy między ścieżkami (ścieżki zbudowane przez kreatora z bieżącymi ustawieniami są natychmiast oznaczane jako linie nałożone na obraz). W razie potrzeby dostosuj "Maksymalną odległość". Przejdź do szóstego kroku kreatora. Wybierz filtr Czas trwania ścieżki i ustaw próg 3–5 s.</li>
	<li>Jeśli aktualnie wykryte miejsca lub ścieżki nie są optymalne, wróć do poprzednich kroków kreatora za pomocą przycisków nawigacyjnych (w dolnej części okna kreatora) potrzebnych do precyzyjnego dostrojenia dowolnego parametru tworzenia spotów lub ścieżek.</li>
	<li>Gdy precyzyjnie dostrojone parametry pozwolą oprogramowaniu wykryć wszystkie miejsca i poprawnie zbudować ścieżki, kliknij przycisk nawigacyjny z zieloną strzałką w kreatorze, aby potwierdzić utworzenie ścieżek.</li>
	<li>Wyodrębnij statystyki ścieżek, klikając okno z ikoną Statystyki. Wybierz potrzebne parametry statystyk (zakładki Szczegółowe i Wartości średnie w obszarze Statystyki) i wyeksportuj wartości jako pliki csv, klikając ikonę stacji dyskietek w celu kwantyfikacji i wizualizacji. 
	nuta: Przykładami ważnych parametrów są maksymalna prędkość toru, średnia prędkość toru, długość toru i przemieszczenie toru.</li>
	<li>Jeśli zestaw danych obrazów musi zostać zaprezentowany lub opublikowany, utwórz migawki i/lub pliki wideo reprezentujące serię poklatkową z opcjonalnie nałożonymi ścieżkami za pomocą narzędzi Migawka lub Animacja.</li>
</ol>
4. Akwizycja obrazu konfokalnego
<ol>
	<li>Zainstalować inkubator typu stage top na stoliku mikroskopowym, ustawić żądaną temperaturę i stężenie CO2 (tj. 37 °C i 5% dla komórek ssaków) i utrzymywać w cieple przez co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem akwizycji obrazu.</li>
	<li>Włącz wszystkie elementy konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego, w tym lasery, i pozostaw je do rozgrzania na co najmniej 1 godzinę.</li>
	<li>Wybierz żądany obiektyw o średnim lub dużym powiększeniu i próbkowaniu przestrzennym zgodnie z kryteriami Nyquista.</li>
	<li>Dla kanału SG ustaw wzbudzenie na 488 nm i zakres wykrywania 500–550 nm. W przypadku mitochondrialnego kanału barwienia ustaw na 561 nm i emisję 570–630 nm dla barwnika czerwonego lub wzbudzenie 633 nm i emisję >650 nm dla barwnika dalekiej czerwieni.</li>
	<li>Ustaw najniższą możliwą moc lasera (zwykle 1% lub mniej), która pozwala na akwizycję sygnałów o wzmocnieniu detektora PMT wynoszącym 700 mV.</li>
	<li>Uzyskaj dwukolorowe obrazy konfokalne komórek, w których nukleoidy mitochondrialne są wykrywane w "kanale SG", a mitochondria są wykrywane w kanale "czerwonym" lub "dalekim czerwonym".</li>
</ol>

<ol><li>Kaufman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+transcription+factor+TFAM+coordinates+the+assembly+of+multiple+DNA+molecules+into+nucleoid-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).</li>
<li>Farge, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+sliding+and+DNA+denaturation+are+essential+for+DNA+organization+by+human+mitochondrial+transcription+factor+A%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A.</a> Nature Communications. 3, 1013(2012).</li>
<li>Bogenhagen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+nucleoid+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA nucleoid structure.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 914-920 (2012).</li>
<li>Kang, D., Kim, S. H., Hamasaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+transcription+factor+A+%28TFAM%29%3A+roles+in+maintenance+of+mtDNA+and+cellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions.</a> Mitochondrion. 7 (1-2), 39-44 (2007).</li>
<li>Tauber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+mitochondrial+nucleoids+upon+mitochondrial+network+fragmentation+and+network+reintegration+in+HEPG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Distribution of mitochondrial nucleoids upon mitochondrial network fragmentation and network reintegration in HEPG2 cells.</a> International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (3), 593-603 (2013).</li>
<li>Garrido, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+dynamics+of+human+mitochondrial+nucleoids%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1583-1596 (2003).</li>
<li>Pernas, L., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mito-Morphosis%3A+Mitochondrial+Fusion%2C+Fission%2C+and+Cristae+Remodeling+as+Key+Mediators+of+Cellular+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function.</a> Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).</li>
<li>Caielli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidized+mitochondrial+nucleoids+released+by+neutrophils+drive+type+I+interferon+production+in+human+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxidized mitochondrial nucleoids released by neutrophils drive type I interferon production in human lupus.</a> Journal of Experimental Medicine. 213 (5), 697-713 (2016).</li>
<li>Okayama, S., Ohta, K., Higashi, R., Nakamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light+and+electron+microscopic+observation+of+mitochondrial+DNA+in+mammalian+cells+by+using+focused-ion+beam+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Correlative light and electron microscopic observation of mitochondrial DNA in mammalian cells by using focused-ion beam scanning electron microscopy.</a> Microscopy (Oxf). 63 (Suppl 1), i35(2014).</li>
<li>Alan, L., Spacek, T., Jezek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delaunay+algorithm+and+principal+component+analysis+for+3D+visualization+of+mitochondrial+DNA+nucleoids+by+Biplane+FPALM%2FdSTORM%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM.</a> European Biophysics Journal. 45 (5), 443-461 (2016).</li>
<li>Kukat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+reveals+that+mammalian+mitochondrial+nucleoids+have+a+uniform+size+and+frequently+contain+a+single+copy+of+mtDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).</li>
<li>Kukat, C., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mtDNA+makes+a+U-turn+for+the+mitochondrial+nucleoid%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">mtDNA makes a U-turn for the mitochondrial nucleoid.</a> Trends in Cell Biology. 23 (9), 457-463 (2013).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Benke, A., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+dSTORM+of+cellular+DNA+based+on+direct+DNA+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Live-cell dSTORM of cellular DNA based on direct DNA labeling.</a> ChemBioChem. 13 (2), 298-301 (2012).</li>
<li>Ishigaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+super-resolution+imaging+of+mitochondria+labeled+with+TMRM+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells.</a> Mitochondrion. 28, 79-87 (2016).</li>
<li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348(2015).</li>
<li>Gustafsson, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li>
<li>Hirano, Y., Matsuda, A., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+structured-illumination+microscopy+toward+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in structured-illumination microscopy toward live-cell imaging.</a> Microscopy (Oxf). 64 (4), 237-249 (2015).</li>
<li>Brown, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+fluorescence+imaging+of+mitochondrial+nucleoids+reveals+their+spatial+range%2C+limits%2C+and+membrane+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction.</a> Molecular and Cellular Biology. 31 (24), 4994-5010 (2011).</li>
<li>Lewis, S. C., Uchiyama, L. F., Nunnari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+contacts+couple+mtDNA+synthesis+with+mitochondrial+division+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria contacts couple mtDNA synthesis with mitochondrial division in human cells.</a> Science. 353 (6296), aaf5549(2016).</li>
<li>Dellinger, M., Geze, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+mitochondrial+DNA+in+living+animal+cells+with+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Detection of mitochondrial DNA in living animal cells with fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 204 (Pt 3), 196-202 (2001).</li>
<li>Ban-Ishihara, R., Ishihara, T., Sasaki, N., Mihara, K., Ishihara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+nucleoid+structure+regulated+by+mitochondrial+fission+contributes+to+cristae+reformation+and+release+of+cytochrome+c%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dynamics of nucleoid structure regulated by mitochondrial fission contributes to cristae reformation and release of cytochrome c.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11863-11868 (2013).</li>
<li>Zurek-Biesiada, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+microscopy+of+DNA+in+situ+using+Vybrant%28%28R%29%29+DyeCycle+Violet+fluorescent+probe%3A+A+new+approach+to+study+nuclear+nanostructure+at+single+molecule+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Localization microscopy of DNA in situ using Vybrant((R)) DyeCycle Violet fluorescent probe: A new approach to study nuclear nanostructure at single molecule resolution.</a> Experimental Cell Research. 343 (2), 97-106 (2016).</li>
<li>He, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AAA%28%2B%29+protein+ATAD3+has+displacement+loop+binding+properties+and+is+involved+in+mitochondrial+nucleoid+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The AAA(+) protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization.</a> Journal of Cell Biology. 176 (2), 141-146 (2007).</li>
<li>Ashley, N., Harris, D., Poulton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+mitochondrial+DNA+depletion+in+living+human+cells+using+PicoGreen+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Detection of mitochondrial DNA depletion in living human cells using PicoGreen staining.</a> Experimental Cell Research. 303 (2), 432-446 (2005).</li>
<li>Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SYBR+Gold+dye+enables+preferential+labeling+of+mitochondrial+nucleoids+and+their+time-lapse+imaging+by+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">SYBR Gold dye enables preferential labeling of mitochondrial nucleoids and their time-lapse imaging by structured illumination microscopy.</a> PLoS One. 13 (9), e0203956(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół składa się z kilku krytycznych elementów: Aby osiągnąć preferencyjne znakowanie mitochondrialnego DNA, stężenie barwnika wiążącego DNA podczas inkubacji powinno być utrzymywane na bardzo niskim poziomie (np. rozcieńczenie 1:10 000 typowego komercyjnego stada), a czas inkubacji powinien wynosić 30 minut. Czas inkubacji nigdy nie powinien przekraczać 1 godziny. Należy użyć barwnika SYBR Gold; inne barwniki wiążące DNA nie są wystarczająco jasne, aby wygenerować silny sygnał po znakowaniu w niskim stężeniu.
<p ...

Okrągłe cząsteczki DNA o wielkości 16,5 kbp stanowią materiał genetyczny mitochondriów, kodując 22 tRNA, 2 rRNA i 13 polipeptydów potrzebnych do mitochondrialnych kompleksów fosforylacji oksydacyjnej. Mitochondrialne DNA związane z mitochondrialnym czynnikiem transkrypcyjnym A (TFAM) i kilkoma innymi białkami tworzy mitochondrialne nukleoidy1,2,3,4. Nukleoidy mitochondrialne przemieszczają się i redystrybuują między składnikami sieci mitochondrialnej5,6 podczas jej morfologicznej przebudowy, rozszczepienia lub fuzji w zależności od fazy cyklu komórkowego, stresu i innych czynników (recenzja w Pernas et al.7). Ponadto ruch nukleoidów mitochondrialnych jest związany z chorobą tocznia rumieniowatego układowego8 i może odgrywać rolę w innych chorobach. Mikroskopia fluorescencyjna jest prostą techniką do badań żywych komórek organelli, ale technika ta ma rozdzielczość >200 nm, która jest większa niż rozmiar nukleoidów mitochondrialnych (~100 nm9,10,11,12). Limit ten został ominięty przez tak zwane techniki "super-rozdzielczości", takie jak wymuszone zubożenie emisji (STED) i mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek (SMLM)13,14. Do tej pory mutocyondrium i inne DNA obrazowano w żywych komórkach za pomocą bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (dSTORM)15. Drobne struktury submitochondrialne z pozycjami korelującymi z mtDNA zaobserwowano za pomocą STED w żywych komórkach16. Jednak te techniki super-rozdzielczości wymagają dużej intensywności oświetlenia, co powoduje efekty fototoksyczne na żywe komórki17. Dlatego obrazowanie poklatkowe nukleoidów mitochondrialnych z rozdzielczością przekraczającą granicę dyfrakcji jest wyzwaniem. Aby rozwiązać ten problem, użyliśmy mikroskopii oświetlenia strukturalnego o wysokiej rozdzielczości (SR-SIM)18. SIM wymaga znacznie niższej dawki oświetlenia niż STED i SMLM19. Ponadto, w przeciwieństwie do technik STED i SMLM, SIM pozwala na proste, wielokolorowe, trójwymiarowe obrazowanie (3D) i nie wymaga szczególnych właściwości fotofizycznych fluoroforów ani składu bufora obrazowania19.
Konwencjonalną strategią oznaczania nukleoidów mitochondrialnych w żywych komórkach jest fluorescencyjne znakowanie mitochondrialnego białka nukleoidowego, takie jak TFAM20. Jednak w wielu przypadkach ta strategia nie jest odpowiednia. Co więcej, nadekspresja TFAM znakowanego białkiem fluorescencyjnym powoduje powstanie poważnego artefaktu21. Znakowanie DNA barwnikami organicznymi ma przewagę nad strategią opartą na białkach fluorescencyjnych (FP). Barwniki organiczne są wolne od ograniczeń związanych ze znakowaniem FP: mogą być stosowane do każdego rodzaju komórek lub tkanek i mogą być stosowane w dowolnym momencie eksperymentu. Obrazowanie żywych komórek nukleoidów mitochondrialnych zostało opisane za pomocą kilku barwników wiążących DNA: DAPI22, SYBR Green23, Vybrant DyeCycle24 i picoGreen15,25,26. Istotną wadą większości barwników wiążących DNA do znakowania nukleoidów jest to, że barwią one całe DNA w komórce. Ukierunkowanie barwnika wyłącznie na mitochondrialne DNA jest wysoce pożądane. Aby to osiągnąć, konieczny jest staranny dobór barwnika o odpowiednich właściwościach fizykochemicznych. Wiadomo, że barwniki lipofilowe posiadające zdelokalizowany ładunek dodatni, takie jak rodamina 123, gromadzą się w żywych mitochondriach, które zachowują swój ujemny potencjał błonowy. Ponadto idealny barwnik do specyficznego znakowania nukleoidów mitochondrialnych powinien wiązać DNA z wysokim powinowactwem i emitować jasną fluorescencję po związaniu DNA. Biorąc pod uwagę te wymagania, niektóre cyjaniny są obiecujące (np. picoGreen), ale DNA jądrowe jest obficie barwione tymi barwnikami jednocześnie z DNA mitochondrialnym15,25,26. Niniejszy protokół opisuje specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych w żywych komórkach innym barwnikiem cyjaninowym, SYBR Gold (SG), oraz śledzenie nukleoidów w poklatkowych filmach SIM o superrozdzielczości. Co więcej, żywe komórki barwione SG mogą być obrazowane za pomocą dowolnego rodzaju odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego (konfokalny, wirujący dysk, epifluorescencja itp.) odpowiedniego dla żywych komórek i wyposażonego w źródło światła 488 nm.

<table><tbody><tr><td>Elyra PS1</td> multimodalny mikroskop superrozdzielczy <td>Carl Zeiss</td><td></td><td>zawierający moduł do superrozdzielczej strukturalnej mikroskopii świetlnej (SR-SIM)</td></tr><tr><td>Wysokoglukozowa DMEM</td><td>GIBCO/ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>miska ibidi 35 mm, szklane dno</td><td>Ibidi Gmbh</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>ibidi 8-dołkowy microSlide, szklane dno</td><td>Ibidi Gmbh</td><td>80827</td><td></td></tr><tr><td>Pakiet oprogramowania do przetwarzania i wizualizacji obrazu</td> <td>Imaris 8.4.1</td><td>Bitplane/Oxford Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Kamera iXon 885</td><td>Andor Technologies</td><td></td><td>EMCCD z czujnikiem podświetlanym</td></tr><tr><td>LSM880 Airyscan</td><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Carl Zeiss</td><td></td> z detektorem matrycowym</tr><tr><td>Mitotracker CMXRos Red</td><td>ThermoFischer</td><td>M7512</td><td>czerwony mitochondrialny z żywymi komórkami barwienie</td></tr><tr><td>Mitotracker Deep Red FM</td><td>ThermoFischer</td><td>M22426</td><td>daleka czerwień żywe barwienie mitochondrialne</td></tr><tr><td>picoGreen</td><td>ThermoFischer</td><td>P7581</td><td>barwnik DNA permeant DNA</td></tr><tr><td>Plan Apochromat 100x/1.46 Obiektyw olejowy</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold</td><td>ThermoFischer</td><td>S11494</td><td>barwnik DNA permeant cell</td></tr><tr><td>Zen Black 2012 oprogramowanie</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>oprogramowanie do akwizycji i przetwarzania obrazów</td></tr></tbody></table>

specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych dla poklatkowej mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Nukleoidy mitochondrialne to zwarte cząstki utworzone przez cząsteczki mitochondrialnego DNA pokryte białkami. Mitochondrialne DNA koduje tRNA, rRNA i kilka niezbędnych polipeptydów mitochondrialnych. Nukleoidy mitochondrialne dzielą się i rozprowadzają w dynamicznej sieci mitochondrialnej, która ulega rozszczepieniu/fuzji i innym zmianom morfologicznym. Mikroskopia fluorescencyjna na żywo o wysokiej rozdzielczości jest prostą techniką charakteryzowania położenia i ruchu nukleoidu. W tej technice nukleoidy są zwykle znakowane za pomocą znaczników fluorescencyjnych ich składników białkowych, a mianowicie czynnika transkrypcyjnego a (TFAM). Jednak strategia ta wymaga nadekspresji konstruktu znakowanego białkiem fluorescencyjnym, co może powodować artefakty (zgłaszane dla TFAM) i w wielu przypadkach nie jest wykonalne. Organiczne barwniki wiążące DNA nie mają tych wad. Jednak zawsze wykazują barwienie zarówno jądrowego, jak i mitochondrialnego DNA, przez co brakuje im swoistości dla nukleoidów mitochondrialnych. Biorąc pod uwagę właściwości fizykochemiczne takich barwników, wybraliśmy barwnik żelowy z kwasem nukleinowym (SYBR Gold) i uzyskaliśmy preferencyjne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych w żywych komórkach. Właściwości barwnika, w szczególności jego wysoka jasność po związaniu się z DNA, pozwalają na późniejszą kwantyfikację ruchu mitochondrialnego nukleoidu przy użyciu szeregów czasowych obrazów oświetlenia strukturalnego o wysokiej rozdzielczości.

Charakteryzacja znakowania żywych komórek za pomocą SG 
W pierwszej kolejności, za pomocą mikroskopii konfokalnej, scharakteryzowano rozkład SG w komórkach po inkubacji z barwnikiem w różnych rozcieńczeniach. Po inkubacji z wysokimi stężeniami SG lub picoGreen oba barwniki znakowały głównie jądra komórkowe i wykazywały punktowe barwienie w cytoplazmie (Rysunek 1), podobnie jak w opublikowanych danych dla innego dodatnio naładowanego barwni...

Protokół opisuje specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych za pomocą komercyjnie dostępnego barwnika żelowego DNA, akwizycję serii poklatkowych żywych znakowanych komórek za pomocą super-rozdzielczej mikroskopii oświetlenia strukturalnego (SR-SIM) oraz automatyczne śledzenie ruchu nukleoidów.

Specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych dla poklatkowej mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

Protokół pozwala na specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych w żywych komórkach i ilościowe badanie ich ruchu w wysokiej rozdzielczości. Inkubacja z barwnikiem fluorescencyjnym jedynie omija potrzebę nadmiernej ekspresji białka fluorescencyjnego, unikając powiązanych artefaktów i ograniczeń oraz umożliwiając zastosowanie naszego protokołu do komórek nietransfekulowalnych. Aby uzyskać preferencyjne barwienie nukleoidów, należy użyć SYBR Gold i niczego innego w warunkach, które zoptymalizowaliśmy.W przeciwnym razie całkowite DNA komórkowe może zostać wybarwione. Na dzień przed procedurą znakowania należy wyhodować cztery razy 10 do piątej komórki HeLa w dwóch mililitrach pożywki na 35-milimetrowej szalce Petriego. Następnego ranka umyj komórki w dwóch mililitrach PBS przed dodaniem jednego mililitra pożywki hodowlanej wolnej czerwieni fenolowej i jednego mililitra odpowiedniego roztworu do znakowania 2X.Po 30 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, ostrożnie odessać barwnik zawierający supernatant z każdej 35-milimetrowej szalki Petriego i umyć komórki dwoma mililitrami PBS. Następnie nakarm komórki świeżą pożywką do hodowli komórek wolnych od czerwieni fenolowej i wróć do inkubatora do hodowli komórkowych chronionego przed światłem do czasu obrazowania na żywo. W przypadku obrazowania żywych komórek, co najmniej godzinę przed sesją obrazowania, umieść inkubator na stoliku mikroskopu z oświetleniem strukturalnym o super rozdzielczości i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza, a stężenie dwutlenku węgla na 5%Włącz wszystkie elementy mikroskopu, w tym lasery, i wybierz duże powiększenie, Obiektyw zanurzeniowy o dużej aperturze numerycznej zalecany przez producenta mikroskopu do mikroskopii oświetlenia strukturalnego o wysokiej rozdzielczości.Gdy lasery się rozgrzeją, zainstaluj 35-milimetrową szalkę Petriego na stoliku mikroskopu i użyj okularów, aby zlokalizować obszar zainteresowania z komórkami przymocowanymi do dna czaszy. Aby uzyskać obrazy z mikroskopii oświetlenia strukturalnego o super rozdzielczości, użyj wysokiej klasy kamery sprzężonej z ładunkiem zwielokrotnionym elektronami. W oprogramowaniu do akwizycji obrazu ustaw wysokie wzmocnienie zwielokrotnienia elektronów zgodnie z zaleceniami dla aparatu.Przed uzyskaniem serii poklatkowej do śledzenia nukleoidów, uzyskaj dwukolorowy obraz mikroskopii oświetlenia strukturalnego o super rozdzielczości o tym samym polu widzenia w jednym kanale do barwienia mitochondriów i drugim dla złota SYBR. Ustaw kanał barwny obrazu mitochondrialnego na odpowiednie wzbudzenie i emisję dla użytego barwnika mitochondrialnego i ustaw odpowiedni filtr emisji wzbudzenia i huku Pass dla złotego barwnika SYBR. Ustaw najniższą możliwą moc lasera dla obu kanałów.Jeśli mikroskop rejestruje kanały tylko sekwencyjnie, wyłącz kanał wykrywania barwienia mitochondrialnego. odznacz pole Z-stack w oprogramowaniu, aby wyłączyć akwizycję Z-stack, aby ustawić akwizycję pojedynczej płaszczyzny ogniskowej i ustawić najkrótszy możliwy czas naświetlania aparatu. Ustaw trzy obroty siatki i uzyskaj dwuwymiarowe obrazy oznaczonych komórek przy kilku wartościach mocy lasera i kilku czasach naświetlania, aby zoptymalizować moc lasera w czasie ekspozycji kamery.Wybierz moc lasera i czasy naświetlania kamery, które dają obrazy z mikroskopii oświetlenia strukturalnego z jasnymi punktami w mitochondriach z niewielkimi lub żadnymi artefaktami, a następnie rozpocznij akwizycję serii poklatkowej przy użyciu zoptymalizowanych ustawień. W celu analizy obrazów poklatkowych otwórz przekonwertowane obrazy mikroskopii oświetlenia strukturalnego i odpowiednie oprogramowanie do analizy obrazu, które ma moduł śledzenia plam, a następnie kliknij przycisk Dodaj nowe punkty, aby uruchomić kreatora tworzenia plam. Na karcie tworzenia kliknij pozycję śledź miejsca w czasie i przejdź do drugiego kroku kreatora.Ustaw szacowaną średnicę x-y na 0,1 do 0,15 mikrometra. Kliknij opcję Odejmowanie tła i przejdź do trzeciego kroku kreatora. Przeciągnij pionową linię na histogramie, aby dostosować próg filtra jakości, aż większość nukleotydów zostanie wykryta, ponieważ miejsca w artefaktach nie są wykrywane w każdej klatce.Przejdź do czwartego i piątego kroku kreatora i wybierz algorytm ruchu autoregresyjnego. Ustaw maksymalną odległość na 0,5 mikrometra, a maksymalny rozmiar odstępu na zero. Gdy precyzyjnie dostrojone parametry pozwolą oprogramowaniu wykryć wszystkie miejsca i poprawnie zbudować ścieżki, kliknij przycisk strzałki teraz, aby potwierdzić utworzenie ścieżek i kliknij ikonę statystyk, aby wyodrębnić statystyki ścieżek.Następnie wybierz niezbędne parametry statystyczne i kliknij przycisk Zapisz jako, aby wyeksportować wartości jako pliki CSV z kropkami w celu kwantyfikacji i wizualizacji. Znakowanie wysokimi stężeniami złota SYBR lub PicoGreen powoduje obfite barwienie jąder i barwienie punktowe w cytoplazmie. Przy niższych stężeniach słaby złoty sygnał SYBR pojawia się w jądrach w postaci wzoru jasnych plam obserwowanych w cytoplazmie.Etykietowanie PicoGreen w niskich stężeniach daje głównie barwienie jądrowe. Jednoczesne barwienie niskimi stężeniami złota SYBR w dalekim czerwonym barwniku mitochondrialnym ujawnia, że prawie całe barwienie złotem SYBR występuje w mitochondriach, podczas gdy znakowanie w wysokich stężeniach powoduje znaczne zabarwienie jąder i cytoplazmy. Obrazowanie poklatkowe ujawnia, że po 45 minutach barwienie nukleoidem jest bliskie nasycenia.Utrwalenie powoduje nieznaczną redystrybucję barwnika do jądra, podczas gdy przenikanie utrwalonych komórek eliminuje kropkowany wzór barwienia mitochondriów i wzmacnia barwienie jądrowe. Jeśli złoto SYBR zostanie dodane do komórek po utrwaleniu i permeablizacji, wówczas barwnik jest równomiernie rozprowadzany w cytoplazmie i jądrze, co powoduje utratę specyficzności barwienia. Obrazowanie 3D na żywo za pomocą mikroskopu oświetlenia strukturalnego o super rozdzielczości ujawnia nukleoid mitochondrialny jako jasne punkty w mitochondriach.Śledzenie pozycji nukleoidu w rozdzielczości wykraczającej poza granicę dyfrakcji pokazuje, że większość nukleoidów wykazuje losowe ruchy na krótkie odległości, które prawdopodobnie są ograniczone do sieci mitochondrialnej. Należy zauważyć, że protokół ten nie jest zgodny z utrwalaniem próbki. Jednak nasz protokół powinien być kompatybilny z szeroką gamą testów opartych na obrazowaniu żywych komórek w celu badania morfologii, dynamiki i aktywności cząsteczek i organelli.Nasze badanie ilustruje korzyści płynące z retargetowania barwników nieorganicznych w technikach opartych na komórkach. Może to zainspirować do eksploracji innych barwników fluorescencyjnych pod kątem ich zastosowania w badaniach komórkowych.

specific-labeling-mitochondrial-nucleoids-for-time-lapse-structured

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Kennedy, L. H., et. al. Wizualizacja i obrazowanie na żywo organelli oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem i mikroskopii konfokalnej. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje obrazowanie mitochondriów oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu myszy. Plaster umieszcza się w komorze kąpielowej z ciągłą cyrkulacją płynu i kontrolowaną temperaturą. Po ustawieniu różnych parametrów mikroskopu konfokalnego wykonywane są obrazy...

Obrazowanie konfokalne ruchu mitochondriów w oligodendrocytach w organotypowych kulturach wycinków mózgu

Tutaj prezentujemy protokół wielokolorowej lokalizacji pojedynczych białek błonowych w organellach żywych komórek. Do przyłączania fluoroforów stosuje się białka samoznakujące. Białka, znajdujące się w różnych przedziałach błonowych tych samych organelli, mogą być lokalizowane z precyzją ~18 nm.

Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

Przedstawiamy protokół do badania rozkładu mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej za pomocą korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła i objętości, w tym barwienia peroksydazą askorbinianową 2 i peroksydazy chrzanowej, seryjnego cięcia komórek z i bez genu docelowego w tej samej sekcji oraz seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.

Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej

Genom mitochondrialny drożdży piekarskich koduje osiem polipeptydów. Celem obecnego protokołu jest oznaczenie ich wszystkich, a następnie wizualizacja ich jako oddzielnych pasm.

Znakowanie i wizualizacja produktów ekspresji genomu mitochondrialnego w drożdżach piekarskich Saccharomyces cerevisiae

Opisano procedurę badania dynamiki metabolizmu mitochondrialnego DNA (mtDNA) w komórkach przy użyciu formatu wielodołkowej płytki i automatycznego obrazowania immunofluorescencyjnego w celu wykrycia i ilościowego określenia syntezy i dystrybucji mtDNA. Można to dalej wykorzystać do zbadania wpływu różnych inhibitorów, stresów komórkowych i wyciszania genów na metabolizm mtDNA.

Wysokoprzepustowa, obrazowa kwantyfikacja syntezy i dystrybucji mitochondrialnego DNA

Ten protokół przedstawia proces propagacji, różnicowania i barwienia hodowanych komórek SH-SY5Y oraz pierwotnych neuronów hipokampa szczura do wizualizacji i analizy ultrastruktury mitochondriów za pomocą mikroskopii stymulowanego zubożenia emisji (STED).

Wykorzystanie obrazowania STED na żywych komórkach do wizualizacji ultrastruktury wewnętrznej błony mitochondrialnej w modelach komórek neuronalnych

W tym badaniu opisujemy krok po kroku protokół i kładziemy nacisk na kluczowe szczegóły dotyczące określania cech morfologicznych mitochondriów w żywych komórkach, w tym przygotowanie próbki, akwizycję obrazu i analizę danych. Ta metoda jest powszechnie stosowana do badania morfologii mitochondriów w celu badania różnych schorzeń.

Oznaczanie morfologii mitochondriów w żywych komórkach za pomocą mikroskopii konfokalnej

W tym miejscu opisujemy lokalizator zdarzeń mitochondrialnych (MEL), wtyczkę ImageJ przydatną w ilościowym określaniu trójwymiarowych zmian w rozszczepieniu mitochondriów i aktywności fuzyjnej w czasie. Opisujemy również potok przetwarzania obrazu przydatny do czyszczenia mikrofotografii przed analizą w ImageJ.

Zrozumienie zmian w morfologii mitochondriów za pomocą dynamicznych i trójwymiarowych mikrofotografii fluorescencyjnych

Przedstawiamy trójkolorowy protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczkowej chromatyny (SMLM), który umożliwia powtarzalne mapowanie euchromatyny, heterochromatyny i RNAP II do analizy przestrzennej. Protokół ten umożliwia efektywne wielokolorowe oznakowanie w gęstych środowiskach jądrowych, w tym na celach związanych z chromatyną, co pozwala na niezawodne jednoczesne wykrywanie.

Protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki wieloznaczny do badania chromatyny w gęstym środowisku jądrowym

Monitoring Actin Demontaż z poklatkowy Mikroskopia

Poznaj metodę specyficznego znakowania nukleoidów mitochondrialnych w żywych komórkach HeLa przy użyciu barwnika SYBR Gold i mikroskopii SR-SIM. Technika umożliwia śledzenie dynamiki mitochondrialnej bez artefaktów ekspresji białkowej.

Specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych dla poklatkowej mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Przeglądaj więcej filmów