Wizualizacja i ilościowe określanie uszkodzeń DNA specyficznych dla miejsca na podstawie endonukleazy

Ten film metodologiczny przedstawia kluczowe etapy protokołów immunobarwienia i immunoprecypitacji chromatyny, regularnie stosowanych do badania procesów komórkowych związanych z uszkodzeniem DNA oraz do wizualizacji i ilościowego określenia rekrutacji białek zaangażowanych w naprawę DNA. Technika ta dostarcza naukowcom potężnych narzędzi do identyfikacji nowych białek związanych z uszkodzonym locus genomu, a także ich modyfikacji potranslacyjnych niezbędnych do precyzyjnej regulacji podczas naprawy DNA. Ponieważ techniki te mogą być stosowane do badania różnych procesów komórkowych, mają one potencjalne znaczenie, jeśli zastosuje się mikronapromienianie laserowe lub systemy indukujące DNA uszkadzające DNA oparte na jądrze.

Ostatnio opracowano kilka potężnych narzędzi do wywoływania specyficznych dla miejsca uszkodzeń DNA, które można wykorzystać do poszerzenia naszej wiedzy na temat naprawy DNA. Stosując podejścia biochemiczne i genetyczne, przybory te są niezbędne do ujawnienia zdarzeń komórkowych związanych z rekrutacją i składaniem kompleksów naprawczych DNA w miejscu uszkodzenia DNA. Co więcej, techniki te pozwalają na badanie tych procesów w rozdzielczości pojedynczej komórki przy użyciu zarówno komórek stałych, jak i żywych.

Utrzymuj komórki U2OS w monowarstwach w pożywce hodowlanej DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą, 2 milimolową glutaminą i 1% roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym. Hoduj komórki w nawilżonym środowisku z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni, aż do osiągnięcia 80% konfluencji, odnawiając podłoże co dwa do trzech dni. Odessać pożywkę i przemyć komórki PBS.

Odłącz komórki roztworem Trypsyna-EDTA. Kiedy komórki odłączają się, zatrzymaj aktywność trypsyny, dodając pożywkę hodowlaną do komórek, uzyskując zawiesinę komórkową. Policz komórki za pomocą komory do liczenia komórek.

Płytka 20 000 komórek na mililitr na studzienkę na płytce 24-dołkowej ze sterylnymi 12-milimetrowymi okrągłymi szkiełkami nakrywkowymi w każdym dołku. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni w nawilżonym środowisku z 5% dwutlenkiem węgla, aby umożliwić przymocowanie do szkiełek nakrywkowych. Potraktuj komórki 10 nanogramami na mililitr neokarzynotatyny lub użyj odpowiedniej metody, aby wywołać pęknięcia dwuniciowych za pomocą systemów opartych na endojądrze.

Inkubuj komórki przez jedną do ośmiu godzin w temperaturze 37 stopni w nawilżonym środowisku 5% dwutlenku węgla, aby śledzić kinetykę naprawy DNA. Napraw komórki 4% roztworem PBS formaldehydu przez 20 minut w temperaturze 25 stopni. Usunąć roztwór utrwalający i przemyć komórki trzykrotnie PBS przez pięć minut każda.

Usunąć PBS i dodać 0,2% Triton X rozpuszczony w PBS. Inkubować próbki przez 20 minut. Umyj komórki trzykrotnie PBS.

Zablokować niespecyficzne wiązanie za pomocą 5% BSA rozcieńczonego w BSA-PBST i inkubować próbki przez co najmniej 20 minut. Dodać odpowiednią ilość przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w 1% roztworze BSA-PBST. Umieść każdy szkiełko nakrywkowe do góry nogami na parafilmie lub kropli 10 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała.

Inkubować próbki w komorze wilgotnościowej przez półtorej godziny w temperaturze czterech stopni. Umieść szkiełka pokrywy z powrotem do góry na płytce 24-dołkowej i umyj trzykrotnie PBS. Dodać odpowiednią ilość przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w 1% BSA-PBST.

Umieść każde szkiełko nakrywkowe do góry nogami na parafolii nad 10 mikrolitrami kropli rozcieńczonego przeciwciała. Próbki należy inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze czterech stopni przez godzinę. Umieść szkiełka pokrywy z powrotem na 24-dołkowej płytce i umyj trzykrotnie PBS.

Przed usunięciem ostatniego roztworu myjącego PBS należy delikatnie wyjąć szkiełka nakrywkowe połową pęsety i igłą, a następnie położyć je do góry nogami na szkiełkach z kropelkami podłoża montażowego. Immunoprecypitacja chromatyny jest szeroko stosowaną techniką identyfikacji wzorców wiązania białek z DNA. Aby ujawnić zajęcie białka naprawy pragnienia wokół DSB, stosuje się specyficzne przeciwciało do immunoprecypitacji białka będącego przedmiotem zainteresowania z preparatu chromatyny wraz z regionem DNA, z którym jest związane.

Co więcej, ChIP jest powszechnie stosowany do mapowania obecności specyficznej modyfikacji potranslacyjnej używanej przez DSB w danym locus genomowym. Około 20 milionów komórek na mililitr powinno być hodowanych w 15-centymetrowym naczyniu dla każdej próbki. Usuń pożywkę hodowlaną i dwukrotnie umyj komórki lodowatym PBS.

Napraw komórki 1% roztworem formaldehydu-PBS. Umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej i delikatnie mieszaj przez 20 minut. Zatrzymaj utrwalanie glicyną, aby osiągnąć końcowe stężenie 125 milimolów i inkubuj na wytrząsarce orbitera z delikatnym mieszaniem przez pięć minut w temperaturze 25 stopni.

Umieść talerz na lodzie i umyj dwukrotnie lodowatym PBS. Zeskrob komórki w lodowatym PBS i przenieś je do 15-mililitrowych stożkowych probówek. Odwirować komórki z prędkością 5 000 obr./min przez pięć minut w temperaturze czterech stopni.

Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w dwumililitrowym buforze do lizy komórek i inkubować na lodzie przez 10 minut. Wirować z prędkością 5 000 obr./min przez pięć minut w temperaturze czterech stopni. Ostrożnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w buforze do lizy jądrowej o pojemności 500 do 1 500 mikrolitrów i inkubować na lodzie przez 30 do 60 minut.

Przenieść lizat do polistyrenowej stożkowej rurki odpowiedniej do sonikacji. Sonikować lizat, aby ścinać DNA do średniej wielkości fragmentu od 300 do 1000 par zasad. Przygotuj Dynabeads do etapów czyszczenia wstępnego i immunoprecypitacji.

Umyj koraliki dwukrotnie przez 10 minut w czterech stopniach za pomocą bufora RIPA. Zawiesić Dynabeads w tej samej objętości bufora RIPA, jaką wyjęto z oryginalnego roztworu podstawowego w krokach 3.1. Wstępnie oczyścić chromatynę o grubości od 25 do 30 mikrogramów z każdej próbki za pomocą czterech mikrolitrowych kulek Dynabeads poprzez obracanie przez jedną do dwóch godzin pod czterema stopniami.

Wytrącić Dynabeads za pomocą magnesu i przenieść supernatant do nowej probówki Eppendorfa. Dodaj odpowiednią ilość przeciwciała do każdej próbki chromatyny i obracaj przez noc o cztery stopnie. Następnego dnia dodaj 40 mikrolitrów umytych Dynabeads do każdej próbki i inkubuj je przez noc, obracając się pod kątem czterech stopni.

Umyć raz 300 mikrolitrami buforu o niskiej zawartości soli przez 10 minut z obrotem o cztery stopnie. Przemyć raz 300 mikrolitrami buforu o wysokiej zawartości soli przez 10 minut z obrotem o czterech stopniach. Przemyć raz 300 mikrolitrami buforu chlorku litu przez 10 minut z obrotem o cztery stopnie.

Umyć dwukrotnie 300 mikrolitrami TE przez 10 minut z rotacją dla pierwszego prania w czterech stopniach i drugiego prania w 25 stopniach. Dodaj 200 mikrolitrów buforu elucyjnego do kulek i inkubuj je w temperaturze 65 stopni w wytrząsarce termicznej przez 15 minut z ciągłym wytrząsaniem. Przenieść supernatant do nowej probówki i ponownie eluować kulki w buforze elucyjnym o pojemności 200 mikrolitrów.

Dodać 500 mikrogramów na mililitr proteinazy-K i pół procenta SDS i inkubować próbki w temperaturze 50 stopni przez dwie godziny. Przeprowadzić ekstrakcję chloroformem i przenieść górną fazę wodną do nowej probówki Eppendorfa. Dodać dwie i pół objętości absolutnego etanolu i 0,1 objętości trzymolowego octanu sodu o pH 5,2.

Inkubować przez co najmniej 20 minut w temperaturze minus 80 stopni. Usuń etanol i wysusz granulki na powietrzu. Zawiesić osad w 50 mikrolitrach TE.To zbadać ich specjalny rozkład na DNA, należy zastosować immunoprecypitację chromatyny.

Typowe wyniki eksperymentalne uzyskane za pomocą ChIP-qPCR przedstawiono na tym rysunku, który pokazuje czasowe wzbogacenie histonu gamma AX w odpowiedzi na indukowane przez I-PpoI uszkodzenie DNA. W lewej części obrazu wykryty w odpowiednim czasie sygnał AX histonu gamma jest pokazany po stronie pęknięcia, podczas gdy po prawej stronie rozkład AX histonu gamma jest prezentowany w regionie genu kontrolnego, w którym nie zostały wywołane wykazane przerwy. Chociaż naprawa DNA jest stosunkowo nową dziedziną badań, nasza wiedza szybko się rozwija dzięki metodom biochemicznym i mikroskopowym.

Niemniej jednak techniki biochemiczne, takie jak Western blot, immunoprecypitacja i spektrometria mas, wymagają dużej liczby komórek. Procesy naprawy w badaniu stanowią migawkę pożądanej populacji komórek. Pole mikroskopowe zostało zrewolucjonizowane przez techniki o wysokiej rozdzielczości, takie jak mikroskop o wysokiej rozdzielczości, który umożliwia wizualizację procesów komórkowych wywołanych uszkodzeniem DNA na poziomie nukleosomalnym, a także zapewnia dokładne mapowanie kolokalizacji białek.

Z drugiej strony, immunoprecypitacja chromatyny jest potężnym narzędziem, zwłaszcza poprzez połączenie jej z metodami sekwencjonowania w celu wizualizacji jej wzorca wiązania w całym genomie pożądanych białek związanych z naprawą DNA i podwójnych pęknięć nici w regionach chromatyny lub heterochromatyny.