Name: Wizualizacja i ilościowe określanie uszkodzeń DNA specyficznych dla miejsca na podstawie endonukleazy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Poznaj metody immunofluorescencji i chromatynowej immunoprecypitacji do wizualizacji i ilościowego określania uszkodzeń DNA w komórkach U2OS. Te techniki umożliwiają badanie mechanizmów naprawy genomu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez grant Narodowego Biura Badań, Rozwoju i Innowacji GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, stypendium badawcze Jánosa Bolyai Węgierskiej Akademii Nauk BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, krótkoterminowe stypendium EMBO 8513, oraz Fundację Tempus.

1. Immunodetekcja specyficznych białek
<ol>
	<li>Przygotowanie hodowli komórkowej i konfiguracja doświadczalna
	<ol>
		<li>Utrzymuj komórki U2OS w monowarstwach w pożywce hodowlanej DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą, 2 mM glutaminą i 1% roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym. 
		UWAGA: Do indukcji uszkodzeń DNA na podstawie endonukleazy należy użyć pożywki poddanej działaniu węgla drzewnego lub bezsteroidowej, aby uniknąć nieszczelności systemu.</li>
		<li>Hoduj komórki w nawilżonym środowisku o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C aż do 80% konfluencji, odnawiając podłoże co 2-3 dni.</li>
		<li>Odessać pożywkę i przemyć komórki 1x PBS. Odłącz komórki roztworem Trypsyna-EDTA. Kiedy komórki odłączają się, zatrzymaj aktywność trypsyny, dodając pożywkę hodowlaną do komórek, uzyskując zawiesinę komórkową.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą komory do liczenia komórek. Płytka 2 x 104 komórki/ml/basenik na 24-dołkowej płytce, ze sterylnymi okrągłymi szkiełkami nakrywkowymi o średnicy 12 mm w każdym dołku.</li>
		<li>Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w celu umożliwienia przyłączenia do szkiełek nakrywkowych.</li>
		<li>Potraktuj komórki 10 ng/ml neokarzynotatyny (NCS), bezpośrednio pipetując czynnik uszkadzający do hodowanej pożywki. Inkubować komórki z pożywką zawierającą NCS przez 15 minut, a następnie przemyć je 1x PBS i dodać do komórek świeżą, uzupełnioną pożywkę hodowlaną. W przeciwnym razie należy użyć odpowiedniego środka (tj. 4-OHT) do indukowania DSB za pośrednictwem systemów opartych na endonukleazie bez odświeżania medium22. 
		UWAGA: Alternatywnie, użyj napromieniowania do wywołania uszkodzenia DNA, w zakresie od 30 minut do 8 godzin czasu rekonwalescencji, używając strumienia neutronów w zakresie 2-20 Gy23.</li>
		<li>Inkubować komórki przez 1-8 godzin w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 , aby śledzić kinetykę naprawy DNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalanie komórek 
	UWAGA: W poniższych krokach (kroki 1.2-1.5) należy użyć 300-500 μl roztworów/studzienkę, aby odpowiednio pokryć wszystkie komórki. Każdy etap inkubacji i przemywania (z wyjątkiem inkubacji przeciwciał) powinien być wykonywany na wytrząsarce orbitalnej z delikatnym mieszaniem.
	<ol>
		<li>Po indukcji DSB i inkubacji komórek, usuń pożywkę z dołączonych komórek i umyj komórki raz 1x PBS.</li>
		<li>Utrwalić komórki 4% roztworem formaldehydu-PBS przez 20 minut w temperaturze 25 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przepuszczalność komórek
	<ol>
		<li>Usuń roztwór utrwalający i umyj komórki trzy razy 1x PBS przez 5 minut każda.</li>
		<li>Usunąć PBS i dodać 0,2% Triton X-100 rozpuszczony w PBS. Inkubować próbki przez 20 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blokowanie niespecyficznych stron wiążących
	<ol>
		<li>Umyj komórki trzy razy 1x PBS.</li>
		<li>Zablokować niespecyficzne miejsca wiązania za pomocą 5% albuminy BSA (albumina frakcji V surowicy bydlęcej) rozcieńczonej w PBST (1x PBS uzupełniony 0,1% Tween-20) i inkubować permeabilizowane próbki przez co najmniej 20 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunofluorescencyjne
	<ol>
		<li>Dodać odpowiednią ilość przeciwciała pierwszorzędowego (tj. anty-γH2AX, anty-DNA-PKcs) rozcieńczonego w 1% roztworze BSA-PBST. Umieść każde szkiełko nakrywkowe do góry nogami na folii parafinowej na 10 μl kropli rozcieńczonego przeciwciała anty-γH2AX. 
		UWAGA: W przypadku barwienia koimmunologicznego należy odpowiednio rozcieńczyć oba przeciwciała w tym samym 1% roztworze BSA-PBST.</li>
		<li>Próbki inkubować w komorze wilgotnościowej przez 1,5 godziny w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Inkubację można również przeprowadzić w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Umieść szkiełka nakrywkowe z powrotem do góry na płytce 24-dołkowej i umyj trzy razy przez 5 minut 1x PBS.</li>
		<li>Dodać odpowiednią ilość przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w 1% BSA-PBST. Umieść każde szkiełko nakrywkowe do góry nogami na folii parafinowej na 10 μl kropli rozcieńczonego przeciwciała.</li>
		<li>Próbki należy inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Umieść szkiełka nakrywkowe z powrotem do góry na płytce 24-dołkowej i umyj trzy razy przez 5 minut 1x PBS.</li>
		<li>Przed usunięciem ostatniego roztworu myjącego PBS należy delikatnie wyjąć szkiełka nakrywkowe za pomocą pęsety i igły, a następnie umieścić je do góry nogami na szkiełkach podstawowych z kropelkami podłoża montażowego (uzupełnionego DAPI). 
		UWAGA: Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza. Po wyschnięciu podłoża montażowego zaleca się uszczelnienie krawędzi szkiełek nakrywkowych lakierem do paznokci, aby zapobiec marszczeniu się próbek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Immunoprecypitacja chromatyny
<ol>
	<li>Zbieranie komórek, sieciowanie, liza komórkowa i jądrowa oraz fragmentacja DNA
	<ol>
		<li>Hodowla około 5 x 106 komórek/ml w naczyniu o średnicy 150 mm dla każdej próbki.</li>
		<li>Usuń pożywkę hodowlaną i umyj komórki dwukrotnie lodowatym 1x PBS.</li>
		<li>Utrwalić komórki 1% roztworem formaldehydu-PBS, umieścić płytki na wytrząsarce orbitalnej i delikatnie mieszać przez 20 min. 
		UWAGA: Formaldehyd jest lotny; Zawsze przygotowuj świeże roztwór roboczy. W niektórych przypadkach roztwór formaldehydu zawiera metanol w celu jego stabilizacji, ale lepiej jest użyć roztworu bez metanolu, aby uniknąć zakłóceń w dalszych reakcjach.</li>
		<li>Przerwać utrwalanie glicyną o stężeniu 125 mM i inkubować na wytrząsarce orbitalnej z delikatnym mieszaniem przez 5 minut w temperaturze 25 °C.</li>
		<li>Umieść talerze na lodzie i umyj dwukrotnie lodowatym 1x PBS.</li>
		<li>Zeskrob komórki w lodowato zimnym 1x PBS i przenieś je do stożkowych probówek o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Odwirować komórki przy 2 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 2 ml buforu do lizy komórek [5 mM RURY pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40, 1x (koktajl inhibitorów proteazy)] i inkubować na lodzie przez 10 min.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 2 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ostrożnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500-1 500 μl buforu do lizy jądrowej (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,8% SDS, 1x) i inkubować na lodzie przez 30-60 min. Przenieść lizat do polistyrenowej stożkowej rurki odpowiedniej do sonikacji. 
		UWAGA: Ponieważ bufor do lizy jądrowej zawiera SDS, wytrąci się na lodzie, a roztwór zmieni kolor na biały. Roztwór powinien stać się przezroczysty po sonikacji.</li>
		<li>Sonikacja lizatu w celu ścinania DNA do średniej wielkości fragmentu 300-1,000 p. 
		UWAGA: Odpowiednie cykle i warunki sonikacji powinny być ustawione w zależności od typu komórki i sprzętu do sonikacji. Fragmenty mniejsze niż 200 pz nie są odpowiednie dla ChIP, ponieważ interakcje nukleosom-DNA mogą zostać zakłócone.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwrócenie sieciowania, wyznaczanie wielkości fragmentów poddanych sonikacji
	<ol>
		<li>Pobrać 100 μl próbki poddanej sonikacji, aby sprawdzić wielkość fragmentu chromatyny poddanej sonikacji. Pozostałą chromatynę należy przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Dodać 0,5 mg/ml RNazy A do każdych 100 μl próbki i inkubować je w temperaturze 37 °C przez 20 minut w celu aktywacji RNazy.</li>
		<li>Próbki należy inkubować w temperaturze 65 °C przez noc.</li>
		<li>Następnego dnia dodać 500 μg/ml proteinazy K i 0,5% SDS i inkubować próbki w temperaturze 50 °C przez 3 godziny.</li>
		<li>Do każdej próbki dodać 0,5 objętości fenolu i 0,5 objętości mieszaniny chloroformu i alkoholu izoamylowego (24:1).</li>
		<li>Wirować przez 1 min.</li>
		<li>Wirować przy 13 000 x g przez 10 min.</li>
		<li>Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki do mikrowirówki.</li>
		<li>Dodać 1 objętość mieszaniny chloroformu i alkoholu izoamylowego (24:1) do każdej próbki.</li>
		<li>Wirować przez 1 min.</li>
		<li>Wirować przy 13 000 x g przez 10 min.</li>
		<li>Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki do mikrowirówki.</li>
		<li>Dodać 2,5 objętości 96% etanolu i 0,1 objętości 3 M Na-octanu pH 5,2.</li>
		<li>Inkubować przez co najmniej 20 minut w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Odwirować próbki o masie 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Usuń etanol i umyj granulat 400 μl 70% etanolu.</li>
		<li>Odwirować próbki o masie 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Usuń etanol i wysusz granulki na powietrzu.</li>
		<li>Zawiesić osad w 10 μl TE.</li>
		<li>Próbki należy umieścić w 0,8% żelu agarozowym. Wielkość chromatyny po sonikacji powinna wynosić około 500 pz. 
		UWAGA: Należy stosować bufor ładujący wolny od błękitu bromofenolowego, ponieważ wielkość tego barwnika wynosi około 500 pz, co może zakłócić prawidłowe wykrywanie fragmentów chromatyny. Zamiast tego zaleca się stosowanie buforu załadowczego uzupełnionego cyjanolem ksylenowym, który wynosi około 3 000 pz.</li>
		<li>Jeżeli wielkość chromatyny jest dopuszczalna, rozcieńczyć zamrożone próbki chromatyny z kroku 2.1. w 3 objętościach buforu rozcieńczającego (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EGTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 140 mM NaCl, 1x) i mieszać próbki przez obracanie przez 10 minut w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Ten krok jest konieczny do rozcieńczenia SDS obecnego w buforze do lizy jądrowej, aby uniknąć zakłóceń w dalszych reakcjach, w tym pomiarze stężenia chromatyny.</li>
		<li>Zmierzyć stężenie DNA w próbkach chromatyny przy 260/280 nm za pomocą spektrofotometru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie kulek, wstępne oczyszczanie i immunoprecypitacja
	<ol>
		<li>Przygotuj kulki (owcze, anty-królicze lub mysie IgG) do etapów wstępnego oczyszczania i immunoprecypitacji. Umyć kulki dwukrotnie przez 10 minut w temperaturze 4 °C z buforem RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% Na-DOC, 0,1% SDS, 150 mM NaCl i 1X).</li>
		<li>Ponownie zawieś koraliki w tej samej objętości bufora RIPA, co w kroku 2.3.1.</li>
		<li>Wstępnie oczyścić 25-30 μg chromatyny z każdej próbki za pomocą 4 μl kulek poprzez obracanie przez 1-2 godziny w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Dodaj bufor RIPA do każdej próbki chromatyny do 500 μl końcowej objętości, aby umożliwić prawidłowe wymieszanie próbek podczas rotacji. Nie zapomnij wyjąć chromatyny dla NAC (No Antibody Control) i TIC (Total Input Control) w przypadku każdego zestawu próbek. TIC wymagają tylko końcowej objętości do 200 μl.</li>
		<li>Wytrącić kulki za pomocą magnesu i przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki.</li>
		<li>Dodać odpowiednią ilość przeciwciała do każdej próbki chromatyny (z wyjątkiem NAC i TIC) i obracać przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Następnego dnia dodać 40 μl umytych kulek do każdej próbki (z wyjątkiem TIC) i inkubować je przez noc, obracając w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>mycie
	<ol>
		<li>Przemyć raz 300 μl buforu o niskiej zawartości soli (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 1x) przez 10 minut obracając w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przemyć raz 300 μl buforu o wysokiej zawartości soli (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 1x) przez 10 minut obracając się w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przemyć raz 300 μl buforu LiCl (250 mM LiCl, 1% NP-40, 1% Na-DOC, 1 mM EDTA pH 8,0, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1x) przez 10 minut obracając w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umyć dwukrotnie 300 μl TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0) przez 10 minut na zmianę, do pierwszego prania w temperaturze 4 °C, a drugiego prania w temperaturze 25 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elucji
	<ol>
		<li>Dodać 200 μl buforu elucyjnego (1% SDS i 100 mM NaHCO3) do kulek i inkubować w temperaturze 65 °C w termowytrząsarce przez 15 minut z ciągłym wytrząsaniem (ok. 400 obr./min). Przenieść supernatant do nowej probówki i ponownie wymyć kulki w 200 μl buforu elucyjnego. Połączyć eluaty (400 μl końcowej objętości).</li>
		<li>Dodać NaCl do końcowego stężenia 200 mM w każdej próbce. Uzupełnij próbki TIC 200 μl buforu elucyjnego i dodaj również NaCl. 
		UWAGA: Na tym etapie z TIC należy obchodzić się w takich samych warunkach, jak z innymi próbkami.</li>
		<li>Próbki należy inkubować w temperaturze 65 °C (bez wstrząsania) przez co najmniej 6 godzin.</li>
		<li>Dodać 1 ml zimnego 100% etanolu do każdej próbki, obrócić probówki dwukrotnie, aby wymieszać, i wytrącić DNA przez noc w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Następnego dnia wirować przez 30 minut w temperaturze 13 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wyrzucić supernatant i przemyć osad 70% EtOH.</li>
		<li>Odwirować próbki o masie 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wyrzucić supernatant i wysuszyć granulki na powietrzu.</li>
		<li>Zawiesić granulki w 100 μl TE i dodać 0,5 mg/ml RNazy A do każdej próbki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut w celu aktywacji RNazy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwrócenie sieciowania
	<ol>
		<li>Dodać 500 μg/ml proteinazy K i 0,5% SDS, a następnie inkubować próbki w temperaturze 50 °C przez 2 godziny 
		UWAGA: W przypadku przechodzenia do sekwencji ChIP-należy unikać ekstrakcji fenolowo-chloroformowej, ponieważ hamuje ona dalszy proces NGS. Zamiast tego zaleca się użycie dostępnego w handlu zestawu (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Do każdej próbki dodać 0,5 objętości fenolu i 0,5 objętości mieszaniny chloroformu i alkoholu izoamylowego (24:1).</li>
		<li>Wirować przez 1 min.</li>
		<li>Wirować przy 13 000 x g przez 10 min.</li>
		<li>Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki do mikrowirówki.</li>
		<li>Dodać 1 objętość mieszaniny chloroformu i alkoholu izoamylowego (24:1) do każdej próbki.</li>
		<li>Wirować przez 1 min.</li>
		<li>Wirować przy 13 000 x g przez 10 min.</li>
		<li>Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki do mikrowirówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja DNA
	<ol>
		<li>Dodać 2,5 objętości 96% etanolu i 0,1 objętości 3 M Na-octanu pH 5,2.</li>
		<li>Inkubować przez co najmniej 20 minut w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Odwirować próbki o masie 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Usuń etanol i umyj granulat 400 μl 70% etanolu.</li>
		<li>Odwirować próbki o masie 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Usuń etanol i wysusz granulki na powietrzu.</li>
		<li>Zawiesić osad w 50 μl TE.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitylation-Mediated+Fine-Tuning+of+DNA+Double-Strand+Break+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair.</a> Cancers (Basel). 12 (6), (2020).</li>
<li>Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Roles+of+Post-Translational+Modifications+in+Nucleotide+Excision+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair.</a> Cells. 9 (6), (2020).</li>
<li>Stephens, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+cancer+genes+and+mutational+processes+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer.</a> Nature. 486 (7403), 400-404 (2012).</li>
<li>Turnbull, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-gene+interactions+in+breast+cancer+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene-gene interactions in breast cancer susceptibility.</a> Human Molecular Genetics. 21 (4), 958-962 (2012).</li>
<li>Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((8-Oxoguanine-mediated+transcriptional+mutagenesis+causes+Ras+activation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18877-18882 (2008).</li>
<li>Jiricny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+mismatch-repair+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The multifaceted mismatch-repair system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 335-346 (2006).</li>
<li>Hanawalt, P. C., Spivak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-coupled+DNA+repair%3A+two+decades+of+progress+and+surprises%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (12), 958-970 (2008).</li>
<li>Kanaar, R., Wyman, C., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+of+DNA+break+metabolism%3A+in+the+%27end%27%2C+it%27s+a+good+thing%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Quality control of DNA break metabolism: in the 'end', it's a good thing.</a> EMBO Journal. 27 (4), 581-588 (2008).</li>
<li>Lemaitre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+position+dictates+DNA+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Nuclear position dictates DNA repair pathway choice.</a> Genes & Development. 28 (22), 2450-2463 (2014).</li>
<li>Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+double-strand+DNA+break+repair+by+the+nonhomologous+DNA+end-joining+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway.</a> Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).</li>
<li>Lambert, S., Lopez, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mammalian+RAD51+double+strand+break+repair+using+non-lethal+dominant-negative+forms%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterization of mammalian RAD51 double strand break repair using non-lethal dominant-negative forms.</a> EMBO Journal. 19 (12), 3090-3099 (2000).</li>
<li>Xu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p300-mediated+acetylation+of+histone+demethylase+JMJD1A+prevents+its+degradation+by+ubiquitin+ligase+STUB1+and+enhances+its+activity+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">p300-mediated acetylation of histone demethylase JMJD1A prevents its degradation by ubiquitin ligase STUB1 and enhances its activity in prostate cancer.</a> Cancer Research. , (2020).</li>
<li>Kastan, M. B., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle+checkpoints+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle checkpoints and cancer.</a> Nature. 432 (7015), 316-323 (2004).</li>
<li>Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+and+BRCA2%3A+different+roles+in+a+common+pathway+of+genome+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).</li>
<li>Krenning, L., vanden Berg, J., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+or+Death+after+a+Break%3A+What+Determines+the+Choice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Life or Death after a Break: What Determines the Choice.</a> Molecular Cell. 76 (2), 346-358 (2019).</li>
<li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li>
<li>Caron, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WWP2+ubiquitylates+RNA+polymerase+II+for+DNA-PK-dependent+transcription+arrest+and+repair+at+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">WWP2 ubiquitylates RNA polymerase II for DNA-PK-dependent transcription arrest and repair at DNA breaks.</a> Genes & Development. 33 (11-12), 684-704 (2019).</li>
<li>Caron, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesin+protects+genes+against+gammaH2AX+Induced+by+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cohesin protects genes against gammaH2AX Induced by DNA double-strand breaks.</a> PLoS Genetics. 8 (1), 1002460(2012).</li>
<li>Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+protein+dynamics+and+DNA+repair+following+generation+of+DNA+double-strand+breaks+at+defined+genomic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites.</a> Nature Protocols. 3 (5), 915-922 (2008).</li>
<li>Paques, F., Duchateau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meganucleases+and+DNA+double-strand+break-induced+recombination%3A+perspectives+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).</li>
<li>Pankotai, T., Bonhomme, C., Chen, D., Soutoglou, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNAPKcs-dependent+arrest+of+RNA+polymerase+II+transcription+in+the+presence+of+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DNAPKcs-dependent arrest of RNA polymerase II transcription in the presence of DNA breaks.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 19 (3), 276-282 (2012).</li>
<li>Iacovoni, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+gammaH2AX+around+DNA+double+strand+breaks+in+the+mammalian+genome%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome.</a> EMBO Journal. 29 (8), 1446-1457 (2010).</li>
<li>Poinsignon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+Artemis+following+irradiation-induced+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of Artemis following irradiation-induced DNA damage.</a> European Journal of Immunology. 34 (11), 3146-3155 (2004).</li>
<li>Varga, D., Majoros, H., Ujfaludi, Z., Erdelyi, M., Pankotai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+DNA+damage+induced+repair+focus+formation+via+super-resolution+dSTORM+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Quantification of DNA damage induced repair focus formation via super-resolution dSTORM localization microscopy.</a> Nanoscale. 11 (30), 14226-14236 (2019).</li>
<li>Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+is+refractory+to+gamma-H2AX+modification+in+yeast+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals.</a> Journal of Cell Biology. 178 (2), 209-218 (2007).</li>
<li>Daniels, D. L., Urh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+intracellular+protein--DNA+complexes+using+HaloCHIP%2C+an+antibody-free+alternative+to+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of intracellular protein--DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation.</a> Methods in Molecular Biology. 977, 111-124 (2013).</li>
</ol>

Chociaż naprawa DNA jest stosunkowo nową dziedziną badań, nasza wiedza szybko się poszerza za pomocą różnych metod biochemicznych i mikroskopowych. Zachowanie informacji genetycznej ma kluczowe znaczenie dla komórek, ponieważ mutacje zachodzące w genach biorących udział w procesach naprawczych są jedną z głównych przyczyn nowotworzenia, a zatem niezbędne jest wyjaśnienie kluczowych etapów szlaków naprawy DNA.
Techniki biochemiczne (tj. western blot, immunoprecypitacja, spektrometria mas itp.) ...

Nasz genom jest nieustannie kwestionowany przez różne czynniki uszkadzające DNA. Ataki te mogą pochodzić ze źródeł środowiskowych, takich jak światło UV lub napromieniowanie, a także ze źródeł endogennych, takich jak produkty uboczne przemiany materii spowodowane stresem oksydacyjnym lub błędami replikacji1,2. Zmiany te mogą wpływać na integralność jednej lub obu nici DNA, a jeśli wygenerowane błędy staną się trwałe, często prowadzi to do translokacji i niestabilności genomu, co może skutkować nowotworzeniem 3,4. Aby zachować integralność genomu, podczas ewolucji opracowano wiele systemów naprawczych. W zależności od właściwości chemicznych i fizycznych określonych rodzajów uszkodzeń DNA, można aktywować wiele mechanizmów naprawczych. Niedopasowania, miejsca podstawowe, pęknięcia pojedynczej nici i 8-oksoguanina (8-oxoG) mogą być usunięte przez naprawę niedopasowania lub ścieżkę naprawy przez wycinanie zasady5,6. Zmiany spowodowane przez fotoprodukty wywołane promieniowaniem UV i masywne addukty mogą być naprawione przez naprawę przez wycinanie nukleotydów (NER) lub proces naprawy podwójnej nici DNA (DSBR) 7,8. NER składa się z dwóch głównych podszlaków: NER SPRZĘŻONEGO Z TRANSKRYPCJĄ (TC-NER) i globalnego genomowego NER (GG-NER). Jeśli chodzi o fazę cyklu komórkowego, po indukcji pęknięcia podwójnej nici DNA mogą zostać aktywowane dwie podścieżki: niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) i rekombinacja homologiczna (HR)1,9. NHEJ, który jest dominującym szlakiem w komórkach w stanie spoczynku, może być aktywowany we wszystkich fazach cyklu komórkowego, reprezentując szybszą, ale podatną na błędy ścieżkę10. Z drugiej strony, HR jest ścieżką wolną od błędów, w której DSB są naprawiane w oparciu o wyszukiwanie homologii sekwencji chromatyd siostrzanych, dlatego występuje głównie w fazach cyklu komórkowego S i G211. Co więcej, łączenie końców za pośrednictwem mikrohomologii (MMEJ) jest kolejnym mechanizmem naprawy DSB, odrębnym od wyżej wymienionych, opartym na niezależnym od KU70/80 i RAD51 sposobie religacji wcześniej wyciętych sekwencji mikrohomologicznych flankujących uszkodzone końce DNA. W związku z tym MMEJ jest uważany za podatny na błędy i wysoce mutagenny12. Podczas naprawy DNA DSB mogą indukować odpowiedź na uszkodzenie DNA (DDR), co powoduje aktywację kinaz punktów kontrolnych, które zatrzymują cykl komórkowy podczas naprawy13,14,15. DDR jest aktywowany w odpowiedzi na rekrutację i rozległe rozprzestrzenianie się kluczowych czynników inicjujących proces naprawy wokół zmian, przyczyniając się do powstania ogniska naprawy. W tej wczesnej kaskadzie sygnalizacyjnej kinaza ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) odgrywa kluczową rolę, katalizując fosforylację wariantu histonu H2AX w Ser139 (określanym jako γH2AX) wokół lesion16. To wczesne zdarzenie jest odpowiedzialne za rekrutację dodatkowych czynników naprawczych i zainicjowanie dalszych procesów naprawczych. Chociaż dokładna funkcja rekrutowanych białek w ognisku naprawy nie została jeszcze w pełni scharakteryzowana, powstawanie i dynamika ognisk naprawy zostały zbadane przez kilka laboratoriów. Markery te są szeroko stosowane do śledzenia kinetyki naprawy, ale ich dokładna rola podczas procesu naprawy pozostaje nieuchwytna. Ze względu na ogromne znaczenie, ale słabe zrozumienie procesów komórkowych związanych z naprawą DNA, do tej pory opracowano kilka metod indukcji i wizualizacji DDR.
Różne metody i systemy zostały stworzone w celu wywołania pożądanego rodzaju uszkodzenia DNA. Na przykład niektóre czynniki [takie jak neokarzynostatyna (NCS), fleomycyna, bleomycyna, promieniowanie γ, UV] mogą indukować dużą liczbę losowych pęknięć DNA w niepredykcyjnych pozycjach genomowych, podczas gdy inne (endonukleazy, takie jak AsiSI, I-PpoI lub I-SceI, a także paski laserowe) mogą indukować pęknięcia DNA w znanych loci genomowych17,18,19,20,21. W tym miejscu skupiamy się na technikach opartych na endonukleazie stosowanych obecnie do badania DDR w komórkach ssaków i drożdży. Oprócz podkreślenia zasad tych technik, podkreślamy zarówno ich zalety, jak i wady.

<table><tbody><tr><td>4-OHT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H7904</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (100& razy;), Stabilizowany</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Anty-gamma H2A. Przeciwciało X (fosfo S139)</td><td>Abcam</td><td>ab26350</td><td></td></tr><tr><td>Frakcja V surowicy bydlęcej</td><td>Albumina Biosurowica</td><td>PM-T1725</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt&trade; Cyjan/Żółty Bufor Załadowczy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10482035</td><td></td></tr><tr><td>DMEM z 1,0 g/L glukozy, bez L-Glutaminy</td><td>Lonza</td><td>12-707F</td><td></td></tr><tr><td>Doksycyklina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads&trade; M-280 Owca Przeciw myszom IgG</td><td>Invitrogen</td><td>11202D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads&handel; M-280 Owca IgG przeciw królikom</td><td>Invitrogen</td><td>11204D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>Aldrich E3889</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>molowy Chemikalia</td><td>02910-101-340</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (pochodzenie z Ameryki Południowej), zatwierdzona przez UE</td><td>Gibco</td><td>ECS0180L</td><td></td></tr><tr><td>formaldehyd 37% roztwór wolny od kwasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.03999</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&handel; Suplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>IPure kit v2</td><td>Diagenode</td><td>C03010015</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izoamylowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W205702</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Na-DOC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Neokarzynostatyna ze Streptomyces carzinostaticus</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N9162</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>PBS Proszek bez Ca2+, Mg2+</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L182-50-BC</td><td></td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>RURY</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1851</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbate 20 (Tween 20)</td><td>Molar Chemicals</td><td>09400-203-190</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>ProLong&trade; Złoty uchwyt zapobiegający blaknięciu z DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific P36935</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw koktajli inhibitorów proteazy I</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>P-S2056 Przeciwciało DNAPKcs</td><td>Abcam</td><td>ab18192</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Roche</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>CH3COONa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Tris Bufor octanowo-EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6025</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>91228</td><td></td></tr><tr><td>TRITON X-100</td><td>Molar Chemicals</td><td>09370-006-340</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna z trzustki świni</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,5%), bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja i ilościowe określanie uszkodzeń dna specyficznych dla miejsca na podstawie endonukleazy

Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage

Komórki są stale narażone na działanie różnych czynników uszkadzających DNA, wywołując różne reakcje komórkowe. Zastosowanie podejść biochemicznych i genetycznych jest niezbędne do ujawnienia zdarzeń komórkowych związanych z rekrutacją i składaniem kompleksów naprawczych DNA w miejscu uszkodzenia DNA. W ciągu ostatnich kilku lat opracowano kilka potężnych narzędzi do indukowania uszkodzeń DNA specyficznych dla danego miejsca. Co więcej, nowatorskie techniki nasienne pozwalają nam badać te procesy na poziomie rozdzielczości pojedynczej komórki, zarówno przy użyciu komórek stałych, jak i żywych. Chociaż techniki te zostały wykorzystane do badania różnych procesów biologicznych, w niniejszym artykule przedstawiamy najczęściej stosowane protokoły w dziedzinie naprawy DNA, barwienie immunologiczne fluorescencji (IF) i immunoprecypitację chromatyny (ChIP), które w połączeniu z uszkodzeniami DNA specyficznymi dla miejsca na podstawie endonukleazy umożliwiają wizualizację i ilościowe określenie zajętości genomu czynników naprawy DNA w sposób ukierunkowany i regulowany, odpowiednio. Techniki te dostarczają naukowcom potężnych narzędzi do identyfikacji nowych białek związanych z uszkodzonym locus genomu, a także ich modyfikacji potranslacyjnych niezbędnych do ich precyzyjnej regulacji podczas naprawy DNA.

Badanie procesów naprawy indukowanych celowanymi pęknięciami dwuniciowymi (DSB) w komórkach można przeprowadzić za pomocą transfekcji stabilnej lub przejściowej. Należy jednak zauważyć, że transfekcja stabilna zapewnia jednorodną populację komórek, co daje ujednoliconą, a tym samym bardziej wiarygodną odpowiedź komórkową. W przypadku transfekcji przejściowej tylko niewielka część populacji komórek pobiera i utrzymuje plazmid, co wprowadza różnorodność do eksperymentu. Tworzenie systemów komórkowych opartych na endonuklea...

Ten artykuł przedstawia podstawowe etapy immunobarwienia i immunoprecypitacji chromatyny. Protokoły te są powszechnie stosowane do badania procesów komórkowych związanych z uszkodzeniem DNA oraz do wizualizacji i ilościowego określenia rekrutacji białek zaangażowanych w naprawę DNA.

Wizualizacja i ilościowe określanie uszkodzeń DNA specyficznych dla miejsca na podstawie endonukleazy

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is ...

Ten film metodologiczny przedstawia kluczowe etapy protokołów immunobarwienia i immunoprecypitacji chromatyny, regularnie stosowanych do badania procesów komórkowych związanych z uszkodzeniem DNA oraz do wizualizacji i ilościowego określenia rekrutacji białek zaangażowanych w naprawę DNA. Technika ta dostarcza naukowcom potężnych narzędzi do identyfikacji nowych białek związanych z uszkodzonym locus genomu, a także ich modyfikacji potranslacyjnych niezbędnych do precyzyjnej regulacji podczas naprawy DNA. Ponieważ techniki te mogą być stosowane do badania różnych procesów komórkowych, mają one potencjalne znaczenie, jeśli zastosuje się mikronapromienianie laserowe lub systemy indukujące DNA uszkadzające DNA oparte na jądrze.Ostatnio opracowano kilka potężnych narzędzi do wywoływania specyficznych dla miejsca uszkodzeń DNA, które można wykorzystać do poszerzenia naszej wiedzy na temat naprawy DNA. Stosując podejścia biochemiczne i genetyczne, przybory te są niezbędne do ujawnienia zdarzeń komórkowych związanych z rekrutacją i składaniem kompleksów naprawczych DNA w miejscu uszkodzenia DNA. Co więcej, techniki te pozwalają na badanie tych procesów w rozdzielczości pojedynczej komórki przy użyciu zarówno komórek stałych, jak i żywych.Utrzymuj komórki U2OS w monowarstwach w pożywce hodowlanej DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą, 2 milimolową glutaminą i 1% roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym. Hoduj komórki w nawilżonym środowisku z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni, aż do osiągnięcia 80% konfluencji, odnawiając podłoże co dwa do trzech dni. Odessać pożywkę i przemyć komórki PBS.Odłącz komórki roztworem Trypsyna-EDTA. Kiedy komórki odłączają się, zatrzymaj aktywność trypsyny, dodając pożywkę hodowlaną do komórek, uzyskując zawiesinę komórkową. Policz komórki za pomocą komory do liczenia komórek.Płytka 20 000 komórek na mililitr na studzienkę na płytce 24-dołkowej ze sterylnymi 12-milimetrowymi okrągłymi szkiełkami nakrywkowymi w każdym dołku. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni w nawilżonym środowisku z 5% dwutlenkiem węgla, aby umożliwić przymocowanie do szkiełek nakrywkowych. Potraktuj komórki 10 nanogramami na mililitr neokarzynotatyny lub użyj odpowiedniej metody, aby wywołać pęknięcia dwuniciowych za pomocą systemów opartych na endojądrze.Inkubuj komórki przez jedną do ośmiu godzin w temperaturze 37 stopni w nawilżonym środowisku 5% dwutlenku węgla, aby śledzić kinetykę naprawy DNA. Napraw komórki 4% roztworem PBS formaldehydu przez 20 minut w temperaturze 25 stopni. Usunąć roztwór utrwalający i przemyć komórki trzykrotnie PBS przez pięć minut każda.Usunąć PBS i dodać 0,2% Triton X rozpuszczony w PBS. Inkubować próbki przez 20 minut. Umyj komórki trzykrotnie PBS.Zablokować niespecyficzne wiązanie za pomocą 5% BSA rozcieńczonego w BSA-PBST i inkubować próbki przez co najmniej 20 minut. Dodać odpowiednią ilość przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w 1% roztworze BSA-PBST. Umieść każdy szkiełko nakrywkowe do góry nogami na parafilmie lub kropli 10 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała.Inkubować próbki w komorze wilgotnościowej przez półtorej godziny w temperaturze czterech stopni. Umieść szkiełka pokrywy z powrotem do góry na płytce 24-dołkowej i umyj trzykrotnie PBS. Dodać odpowiednią ilość przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w 1% BSA-PBST.Umieść każde szkiełko nakrywkowe do góry nogami na parafolii nad 10 mikrolitrami kropli rozcieńczonego przeciwciała. Próbki należy inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze czterech stopni przez godzinę. Umieść szkiełka pokrywy z powrotem na 24-dołkowej płytce i umyj trzykrotnie PBS.Przed usunięciem ostatniego roztworu myjącego PBS należy delikatnie wyjąć szkiełka nakrywkowe połową pęsety i igłą, a następnie położyć je do góry nogami na szkiełkach z kropelkami podłoża montażowego. Immunoprecypitacja chromatyny jest szeroko stosowaną techniką identyfikacji wzorców wiązania białek z DNA. Aby ujawnić zajęcie białka naprawy pragnienia wokół DSB, stosuje się specyficzne przeciwciało do immunoprecypitacji białka będącego przedmiotem zainteresowania z preparatu chromatyny wraz z regionem DNA, z którym jest związane.Co więcej, ChIP jest powszechnie stosowany do mapowania obecności specyficznej modyfikacji potranslacyjnej używanej przez DSB w danym locus genomowym. Około 20 milionów komórek na mililitr powinno być hodowanych w 15-centymetrowym naczyniu dla każdej próbki. Usuń pożywkę hodowlaną i dwukrotnie umyj komórki lodowatym PBS.Napraw komórki 1% roztworem formaldehydu-PBS. Umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej i delikatnie mieszaj przez 20 minut. Zatrzymaj utrwalanie glicyną, aby osiągnąć końcowe stężenie 125 milimolów i inkubuj na wytrząsarce orbitera z delikatnym mieszaniem przez pięć minut w temperaturze 25 stopni.Umieść talerz na lodzie i umyj dwukrotnie lodowatym PBS. Zeskrob komórki w lodowatym PBS i przenieś je do 15-mililitrowych stożkowych probówek. Odwirować komórki z prędkością 5 000 obr./min przez pięć minut w temperaturze czterech stopni.Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w dwumililitrowym buforze do lizy komórek i inkubować na lodzie przez 10 minut. Wirować z prędkością 5 000 obr./min przez pięć minut w temperaturze czterech stopni. Ostrożnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w buforze do lizy jądrowej o pojemności 500 do 1 500 mikrolitrów i inkubować na lodzie przez 30 do 60 minut.Przenieść lizat do polistyrenowej stożkowej rurki odpowiedniej do sonikacji. Sonikować lizat, aby ścinać DNA do średniej wielkości fragmentu od 300 do 1000 par zasad. Przygotuj Dynabeads do etapów czyszczenia wstępnego i immunoprecypitacji.Umyj koraliki dwukrotnie przez 10 minut w czterech stopniach za pomocą bufora RIPA. Zawiesić Dynabeads w tej samej objętości bufora RIPA, jaką wyjęto z oryginalnego roztworu podstawowego w krokach 3.1. Wstępnie oczyścić chromatynę o grubości od 25 do 30 mikrogramów z każdej próbki za pomocą czterech mikrolitrowych kulek Dynabeads poprzez obracanie przez jedną do dwóch godzin pod czterema stopniami.Wytrącić Dynabeads za pomocą magnesu i przenieść supernatant do nowej probówki Eppendorfa. Dodaj odpowiednią ilość przeciwciała do każdej próbki chromatyny i obracaj przez noc o cztery stopnie. Następnego dnia dodaj 40 mikrolitrów umytych Dynabeads do każdej próbki i inkubuj je przez noc, obracając się pod kątem czterech stopni.Umyć raz 300 mikrolitrami buforu o niskiej zawartości soli przez 10 minut z obrotem o cztery stopnie. Przemyć raz 300 mikrolitrami buforu o wysokiej zawartości soli przez 10 minut z obrotem o czterech stopniach. Przemyć raz 300 mikrolitrami buforu chlorku litu przez 10 minut z obrotem o cztery stopnie.Umyć dwukrotnie 300 mikrolitrami TE przez 10 minut z rotacją dla pierwszego prania w czterech stopniach i drugiego prania w 25 stopniach. Dodaj 200 mikrolitrów buforu elucyjnego do kulek i inkubuj je w temperaturze 65 stopni w wytrząsarce termicznej przez 15 minut z ciągłym wytrząsaniem. Przenieść supernatant do nowej probówki i ponownie eluować kulki w buforze elucyjnym o pojemności 200 mikrolitrów.Dodać 500 mikrogramów na mililitr proteinazy-K i pół procenta SDS i inkubować próbki w temperaturze 50 stopni przez dwie godziny. Przeprowadzić ekstrakcję chloroformem i przenieść górną fazę wodną do nowej probówki Eppendorfa. Dodać dwie i pół objętości absolutnego etanolu i 0,1 objętości trzymolowego octanu sodu o pH 5,2.Inkubować przez co najmniej 20 minut w temperaturze minus 80 stopni. Usuń etanol i wysusz granulki na powietrzu. Zawiesić osad w 50 mikrolitrach TE.To zbadać ich specjalny rozkład na DNA, należy zastosować immunoprecypitację chromatyny.Typowe wyniki eksperymentalne uzyskane za pomocą ChIP-qPCR przedstawiono na tym rysunku, który pokazuje czasowe wzbogacenie histonu gamma AX w odpowiedzi na indukowane przez I-PpoI uszkodzenie DNA. W lewej części obrazu wykryty w odpowiednim czasie sygnał AX histonu gamma jest pokazany po stronie pęknięcia, podczas gdy po prawej stronie rozkład AX histonu gamma jest prezentowany w regionie genu kontrolnego, w którym nie zostały wywołane wykazane przerwy. Chociaż naprawa DNA jest stosunkowo nową dziedziną badań, nasza wiedza szybko się rozwija dzięki metodom biochemicznym i mikroskopowym.Niemniej jednak techniki biochemiczne, takie jak Western blot, immunoprecypitacja i spektrometria mas, wymagają dużej liczby komórek. Procesy naprawy w badaniu stanowią migawkę pożądanej populacji komórek. Pole mikroskopowe zostało zrewolucjonizowane przez techniki o wysokiej rozdzielczości, takie jak mikroskop o wysokiej rozdzielczości, który umożliwia wizualizację procesów komórkowych wywołanych uszkodzeniem DNA na poziomie nukleosomalnym, a także zapewnia dokładne mapowanie kolokalizacji białek.Z drugiej strony, immunoprecypitacja chromatyny jest potężnym narzędziem, zwłaszcza poprzez połączenie jej z metodami sekwencjonowania w celu wizualizacji jej wzorca wiązania w całym genomie pożądanych białek związanych z naprawą DNA i podwójnych pęknięć nici w regionach chromatyny lub heterochromatyny.

visualizing-quantifying-endonuclease-based-site-specific-dna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy metodę ilościowego pomiaru aktywności glikozylazy DNA oraz endonukleazy AP w czasie rzeczywistym w lizatach jąder komórkowych. Analiza ta pozwala na wyznaczenie szybkości aktywności naprawy DNA umożliwiającej analizę kinetyczną i może być dostosowana do ilościowego oznaczania aktywności naprawy DNA w lizatach tkanek i nowotworów lub z użyciem oczyszczonych białek.

Ilościowa analiza w czasie rzeczywistym aktywności naprawy przez wycinanie zasad w lizatach komórkowych z wykorzystaniem specyficznych dla uszkodzeń sond molekularnych (molecular beacons)

Obrazowanie spektroskopowe elektronów może obrazować i odróżniać kwas nukleinowy od białka z rozdzielczością nanometrów. Można go połączyć z systemem miniSOG, który jest w stanie specyficznie znakować znakowane białka w próbkach z transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Zastosowanie tych technologii ilustrujemy na przykładzie dwuniciowych ognisk naprawy pęknięć.

Wizualizacja białek naprawczych DNA oznaczonych tagami miniSOG w połączeniu z obrazowaniem spektroskopowym elektronów (ESI)

Celem tego protokołu jest opisanie, jak używać mikronapromieniowania laserowego do wywoływania różnych rodzajów uszkodzeń DNA, w tym stosunkowo prostych pęknięć nici i złożonych uszkodzeń, do badania sygnalizacji uszkodzeń DNA i montażu czynników naprawczych w miejscach uszkodzenia in vivo.

Mikronapromienianie laserowe do badania in vivo odpowiedzi komórkowych na proste i złożone uszkodzenia DNA

Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna i mikropromieniowanie laserowe oferują narzędzia do indukowania uszkodzeń DNA i monitorowania odpowiedzi białek naprawy DNA w wybranych obszarach subjądrowych. Technika ta znacznie poszerzyła naszą wiedzę na temat wykrywania uszkodzeń, sygnalizacji i rekrutacji. Niniejszy manuskrypt demonstruje te technologie do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych.

Zastosowanie mikronapromieniania laserowego do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych w komórkach ssaków

Badanie kinetyki naprawy uszkodzeń DNA wymaga systemu do wywoływania uszkodzeń w określonych regionach subjądrowych. Opisujemy metodę tworzenia zlokalizowanych dwuniciowych pęknięć za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser 405 nm i zapewniamy zautomatyzowane procedury ilościowego określania dynamiki czynników naprawczych w tych zmianach.

Badanie rekrutacji białek do zmian DNA za pomocą mikropromieniowania laserowego 405 nm

Celem tego protokołu jest ilościowe określenie naprawy zdefiniowanych wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidowym DNA. Uszkodzone plazmidy są transfekowane do linii komórkowych ssaków biorcy i zbierane o niskiej masie cząsteczkowej w wielu punktach czasowych po transfekcji. Kinetykę naprawy DNA określa się ilościowo za pomocą specyficznego dla nici wydłużania startera, a następnie qPCR.

Prosty, szybki i ilościowy test do pomiaru naprawy wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidach transfekowanych do komórek ssaków

Naprawa pęknięć dwuniciowego DNA jest procesem dynamicznym, wymagającym nie tylko tworzenia kompleksów naprawczych w miejscach pęknięć, ale także ich rozwiązania po usunięciu zmiany. W tym przypadku używamy mikroskopii immunofluorescencyjnej do przejściowych i długotrwałych pęknięć dwuniciowych jako narzędzia do analizy tego mechanizmu utrzymania genomu.

Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

Po uszkodzeniu DNA, ludzkie komórki aktywują niezbędne szlaki naprawcze, aby przywrócić integralność swojego genomu. W tym miejscu opisujemy metodę immunofluorescencji pośredniej jako sposób na wykrycie białek naprawy DNA, analizę ich przestrzennej i czasowej rekrutacji oraz pomoc w badaniu interakcji białko-białko w miejscach uszkodzenia DNA.

Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

Przedstawiono tutaj endonukleazę sgRNA/CAS9 oraz protokół sekwencjonowania nowej generacji, który może być wykorzystany do identyfikacji mutacji związanych z naprawą pęknięć podwójnej nici w pobliżu promotora CD4.

Wykorzystanie sekwencjonowania nowej generacji do identyfikacji mutacji związanych z naprawą wywołanego przez CAS9 pęknięcia podwójnej nici w pobliżu promotora CD4

Tutaj prezentujemy prosty i szybki protokół wykrywania oddziaływań białek w miejscach uszkodzenia DNA.

Test ligandów zbliżeniowych do lokalizacji białek w miejscach uszkodzenia DNA

Poznaj metody immunofluorescencji i chromatynowej immunoprecypitacji do wizualizacji i ilościowego określania uszkodzeń DNA w komórkach U2OS. Te techniki umożliwiają badanie mechanizmów naprawy genomu.

Wizualizacja i ilościowe określanie uszkodzeń DNA specyficznych dla miejsca na podstawie endonukleazy

Przeglądaj więcej filmów