Oparte na fluorescencji pomiary wymiany fosfatydyloseryny/4-fosforanu fosfatydyloinozytolu między błonami

Metoda ta wykorzystuje fluorescencję do określenia, czy białko przenosi się do biologicznie ważnych płynów między błoną syntetyczną, a tym samym przyczynia się do dystrybucji tych lipidów w komórkach eukariotycznych. Technika ta umożliwia ekstrakcję i transport naturalnego lipidu przez białko, wymaga komórek fluorescencyjnych i liposomów, które są łatwe do wykonania. Metoda ta może być stosowana i modyfikowana w celu uzyskania wglądu w biologię komórkową za pomocą białek odpowiedzialnych za dystrybucję niektórych niezbędnych lipidów między narządami a błonami.

Demonstracja wizualna ma kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia, jak wykonywać pomiary transferu lipidów w czasie rzeczywistym za pomocą fluorescencji. Tak więc procedurę zademonstruje również Maud Magdeleine, inżynier z mojego laboratorium. Rozpocznij od przygotowania świeżo przefiltrowanego i odgazowanego buforu octanu potasu HEPES, uzupełnionego jednym milimolowym chlorkiem magnezu w celu utworzenia buforu HKM.

Następnie należy przygotować liposomy wykonane wyłącznie z PC lub dodatkowo domieszkowane dwoma procentami molowymi PS lub PI(4)P. Teraz umieść kolbę na wyparce obrotowej, aby wysuszyć lipid w próżni. W jednym dołku wymieszaj liposomy zawierające dwa molowe procent PS z czujnikiem lipidowym, NBD-C2 Lact, do końcowego stężenia 250 nanomolów i objętości 100 mikrolitrów.

Napełnij drugą studzienkę taką samą ilością liposomu i laktu NBD-C2 zmieszanego z trzema mikromolowymi białkami przenoszącymi lipidy lub LTP. Napełnij trzecią studzienkę 250 nanomolowymi laktami NBD-C2 zmieszanymi z czystymi 80 mikromolowymi liposomami PC, a czwartą studzienką czystymi 80 mikromolowymi liposomami PC. Powtórz te kroki, aby przygotować trzy dodatkowe serie po cztery dołki.

Następnie umieść płytkę wielodołkową w czytniku fluorescencji. Dla każdej studzienki zapisz widmo NBD od 505 do 650 nanometrów z szerokością pasma pięciu nanometrów po wzbudzeniu na 490 nanometrach w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Dla każdej serii odejmij widmo zarejestrowane tylko za pomocą liposomów od innych widm.

Do testu ekstrakcji PI(4)P należy przygotować liposomy domieszkowane dwuprocentowym procentem molowym fosfatydyloinozytolo-4-fosforanu i przeprowadzić pomiary za pomocą sondy NBD-PH FAPP. Wykonaj eksperymenty kontrolne i określ procent ekstrakcji. Po zakończeniu wytłaczania liposomów napełnij rurkę tymi wytłaczanymi liposomami.

Przygotować świeżo odgazowany i przefiltrowany bufor HKM i przechowywać probówki zawierające wytłaczane liposomy w temperaturze pokojowej. Owiń probówki zawierające liposomy z fosfatydyloetanoloaminą znakowaną rodaminą w folię aluminiową i przechowuj je w nieprzezroczystym pudełku, aby zapobiec wybielaniu zdjęć. Ustaw temperaturę w zakresie od 25 do 37 stopni Celsjusza i dostosuj monochromatyczne wzbudzenie do 460 nanometrów z krótkim pasmem od jednego do trzech nanometrów i emisją do 530 nanometrów przy dużej szerokości pasma większej niż 10 nanometrów.

Ustaw czas akwizycji na dwadzieścia pięć minut z rozdzielczością co najwyżej jednej sekundy. W kuwecie kwarcowej rozcieńczyć 30 mikrolitrów zawiesiny liposomów LA i roztworu podstawowego laktu NBD-C2 oraz podgrzać bufor HKM, aby przygotować próbkę o pojemności 570 mikrolitrów, która zawiera 200 mikromolowych lipidów całkowitych i 250 laktów nanomolowych lub NBD-C2. Dodaj małe mieszadło magnetyczne i umieść kuwetę w uchwycie fluorometru.

Gdy próbka zostanie zrównoważona termicznie, rozpocznij pomiar. Po jednej minucie dodać do próbki 30 mikrolitrów zawiesiny liposomów LB. Po trzech minutach wstrzyknij LTP do próbki tak, aby końcowe stężenie LTP wynosiło 200 nanomolowych, a następnie uzyskaj sygnał przez pozostałe 21 minut.

Przeprowadź równoległy eksperyment w celu normalizacji sygnału NBD. Wymieszaj 30 mikrolitrów zawiesiny liposomów równowagi LA z 250 nanomolowymi laktami NBD-C2 w buforze HKM w końcowej objętości 570 mikrolitrów. Po jednej minucie wstrzyknąć 30 mikrolitrów zawiesiny liposomów równowagi LB.

Przelicz krzywe kinetyczne zmierzone za pomocą LTP będącego przedmiotem zainteresowania, aby określić ilość PS przeniesionego z liposomów LA do LB w czasie. Następnie znormalizuj każdy punkt danych krzywej. Przeprowadzić eksperyment PI(4)P, używając tych samych ustawień i warunków emitera podłogowego, jak w przypadku testu transferu PS.

W kuwecie wymieszaj 30 mikrolitrów zawiesiny liposomów lb i sondy NBD-PH FAPP ze wstępnie podgrzanym buforem HKM, aby uzyskać końcową objętość 570 mikrolitrów. Po osiągnięciu równowagi termicznej próbki należy rozpocząć pomiar. Po minucie wstrzyknij 30 mikrolitrów zawiesiny liposomowej LA.

Po trzech minutach wstrzyknij interesujący Cię LTP i nagraj sygnał. Wykonaj drugi eksperyment, aby znormalizować sygnał NBD. Wymieszaj 30 mikrolitrów zawiesiny liposomów równowagi lb z 250 nanomolowymi NBD-PH FAPP i 570 mikrolitrami buforu HKM.

Po jednej minucie wstrzyknąć 30 mikrolitrów zawiesiny liposomów równowagi LA. Przekształć krzywe kinetyczne, aby określić ilość PI(4)P przeniesionego z liposomów LB do LA w czasie, a następnie znormalizuj każdy punkt danych. Ilościowe określenie zakresu, w jakim LTP jest wydajny.

Wykonaj regresję liniową pierwszych punktów danych kinetyki transferu, aby uzyskać nachylenie. Podzielić wartość nachylenia przez stężenie LTP w mieszaninie reakcyjnej, aby określić liczbę cząsteczek lipidów przenoszonych na białko w jednostce czasu. Skuteczny odzysk laktu C2 z kulek został zweryfikowany za pomocą analizy strony SDS.

Widmo absorpcyjne w ultrafiolecie widzialnym laktu C2 znakowanego NBD potwierdziło, że wszystkie cząsteczki laktu C2 były znakowane grupą NBD. Czystość laktu NBD-C2 i jego fluorescencję określono za pomocą analizy strony SDS. Fluorescencja laktu NBD-C2 lub NBD-PH FAPP była maksymalna, gdy do inkubacji użyto tylko liposomów zawierających PS lub PI(4)P, co wskazuje, że czujnik był związany z błoną.

Niską fluorescencję zaobserwowano, gdy obecny był również Osh6p, co wskazuje, że białko to skutecznie ekstrahuje PS lub PI(4)P z liposomów. Przedstawiono wyniki testu transferu PS przy użyciu Osh6p jako LTP. Obliczono średnie krzywe kinetyczne transferu PS z liposomów LA do liposomów LB, domieszkowanych lub niedomieszkowanych fosfatydyloinozytolo-4-fosforanem.

Średnia początkowa szybkość transportu PS została określona na podstawie trzech różnych eksperymentów. Podobnie, wyniki testu transferu PI(4)P przy użyciu Osh6p jako LTP są pokazane tutaj. Wraz ze średnimi krzywymi kinetycznymi uzyskanymi po normalizacji sygnału.

Średnie szybkości transferu mierzono za pomocą liposomów LA, które były domieszkowane lub nie były domieszkowane PS. Wykonując ten protokół, użyj nowego bufora i przygotuj go w tych samych dniach. Zminimalizuj ekspozycję na światło fluorescencyjnych liposomów i białek, używaj dobrze oczyszczonego białka znakowanego NBD i trzymaj je na lodzie. można potwierdzić, mierząc transfer PS i PI(4)P między organellami wewnątrz komórki prokariotycznej za pomocą genetycznie kodowanych fluorescencyjnych czujników lipidowych.

Technika ta toruje drogę do lepszego zrozumienia, że PS i PI(4) są rozmieszczone w komórce, a ich aktywność podlega swoistości kilku LTP.