Name: Oparte na fluorescencji pomiary wymiany fosfatydyloseryny/4-fosforanu fosfatydyloinozytolu między błonami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Poznaj fluorescencyjne metody pomiaru transferu fosfatydyloseryny i PI(4)P przez białka Osh6p między sztucznymi błonami. Technika ta umożliwia badanie kinetyki wymiany lipidów w komórkach eukariotycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni dr A. Cuttriss za staranną korektę manuskryptu. Prace te są finansowane z grantu Francuskiej Narodowej Agencji Badawczej ExCHANGE (ANR-16-CE13-0006) oraz przez CNRS.

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów.

Wyniki tych testów opierają się bezpośrednio na sygnałach fluorescencyjnych czujników lipidowych. W związku z tym oczyszczenie tych sond znakowanych w stosunku 1:1 za pomocą NBD i bez zanieczyszczenia wolnym fluoroforem NBD jest krytycznym krokiem w tym protokole. Obowiązkowe jest również sprawdzenie, czy badany LTP jest prawidłowo złożony i nie jest zagregowany. Ilość LTP badana w testach ekstrakcji musi być równa lub wyższa niż ilość dostępnych cząsteczek PS lub PI(4)P, aby prawidłowo zmierzyć, czy LTP skutecznie ekstr...

Precyzyjny rozkład lipidów pomiędzy różnymi błonami oraz w obrębie błon komórek eukariotycznych1,2 ma głębokie implikacje biologiczne. Odszyfrowanie sposobu działania LTP jest ważną kwestią w biologii komórki3,4,5,6, a podejścia in vitro mają wielką wartość w rozwiązywaniu tego problemu7,8,9,10,11. W tym miejscu przedstawiono strategię opartą na fluorescencji in vitro, która odegrała zasadniczą rolę w ustaleniu, że kilka białek ORP/Osh wpływa na wymianę PS/PI(4)P między błonami komórkowymi12, a tym samym stanowi nową klasę LTPs. PS jest anionowym glicerofosfolipidem, który stanowi 2-10% całkowitych lipidów błonowych w komórkach eukariotycznych13,14,16. Jest on rozprowadzany wzdłuż gradientu między ER a PM, gdzie stanowi odpowiednio 5-7% i do 30% glicerofosfolipidów17,18,19. Co więcej, PS jest zasadniczo skoncentrowany w cytozolowej ulotce PM. To nagromadzenie i nierównomierny podział PS w PM mają kluczowe znaczenie dla procesów sygnalizacji komórkowej19. Ze względu na ujemny ładunek cząsteczek PS, ulotka cytozolowa PM jest znacznie bardziej anionowa niż ulotka cytozolowa innych organelli1,2,19,20. Umożliwia to rekrutację, za pomocą sił elektrostatycznych, białek sygnałowych, takich jak mirystoylowany substrat kinazy C bogaty w alaninę (MARCKS)21, mięsak (Src)22, onkogen wirusa mięsaka szczura Kirsten (K-Ras)23 i substrat toksyny botulinowej C3 związany z Ras 1 (Rac1)24, które zawierają odcinek dodatnio naładowanych aminokwasów i ogon lipidowy.
PS jest również rozpoznawany przez konwencjonalną kinazę białkową C w sposób stereoselektywny za pośrednictwem domeny C225. Jednak PS jest syntetyzowany w klasie ER<sup="xref">26, co oznacza, że musi zostać wyeksportowany do PM, zanim będzie mógł odegrać swoją rolę. Nie było wiadomo, w jaki sposób zostało to osiągnięte19 aż do stwierdzenia, że w drożdżach Osh6p i Osh7p przenoszą PS z ER do PM27. Te LTP należą do ewolucyjnie konserwatywnej rodziny eukariontów, której członkiem założycielem jest OSBP i która zawiera białka (ORP u ludzi, białka Osh u drożdży) integrujące domenę związaną z OSBP (ORD) z kieszenią do przechowywania cząsteczki lipidu. Osh6p i Osh7p składają się tylko z ORD, którego cechy strukturalne są przystosowane do specyficznego wiązania PS i przenoszenia go między membranami. Niemniej jednak nie było jasne, w jaki sposób białka te kierunkowo przenosiły PS z ER do PM. Osh6p i Osh7p mogą wychwytywać PI(4)P jako alternatywny ligand lipidowy12. W drożdżach PI(4)P jest syntetyzowany z fosfatydyloinozytolu (PI) w Golgiego i PM przez kinazy PI 4, odpowiednio Pik1p i Stt4p. W przeciwieństwie do tego, w błonie ER nie ma PI(4)P, ponieważ ten lipid jest hydrolizowany do PI przez fosfatazę Sac1p. W związku z tym gradient PI(4)P występuje zarówno na interfejsie ER/Golgiego, jak i ER/PM. Osh6p i Osh7p przenoszą PS z ER do PM poprzez cykle wymiany PS/PI(4)P przy użyciu gradientu PI(4)P, który istnieje między tymi dwiema membranami12.
W ciągu jednego cyklu, Osh6p ekstrahuje PS z ER, wymienia PS na PI(4)P w PM i przenosi PI(4)P z powrotem do ER, aby wyodrębnić inną cząsteczkę PS. Osh6p/Osh7p oddziałuje z Ist2p28, jednym z niewielu białek, które łączą i zbliżają błonę ER i PM do siebie, tworząc miejsca kontaktu ER-PM w drożdżach29,30,31. Ponadto związek Osh6p z ujemnie naładowanymi błonami staje się słaby, gdy tylko białko ekstrahuje jeden ze swoich ligandów lipidowych z powodu zmiany konformacyjnej, która modyfikuje jego cechy elektrostatyczne32. Wspomaga to Osh6p, skracając czas przebywania jego błony, utrzymując w ten sposób wydajność jego aktywności transferu lipidów. W połączeniu z wiązaniem z Ist2p, mechanizm ten może pozwolić Osh6p/7p zarówno na szybką, jak i dokładną wymianę lipidów na granicy ER / PM. W komórkach ludzkich białka ORP5 i ORP8 wykonują wymianę PS/PI(4)P w miejscach kontaktu ER-PM za pomocą różnych mechanizmów33. Mają centralny ORD, podobny do Osh6p, ale są bezpośrednio zakotwiczone w ER za pośrednictwem C-końcowego segmentu transbłonowego33 i dokują do PM za pośrednictwem N-końcowej domeny homologii Pleckstrin (PH), która rozpoznaje PI(4)P i PI(4,5)P233,34,35. ORP5/8 wykorzystuje PI(4)P do przenoszenia PS i wykazano, że ORP5/8 dodatkowo reguluje poziomy PM PI(4,5)P2 i przypuszczalnie moduluje szlaki sygnałowe. Z kolei spadek poziomów PI(4)P i PI(4,5)P2 obniża aktywność ORP5 / ORP8, ponieważ białka te wiążą się z PM w sposób zależny od. Nienormalnie wysoka synteza PS, która prowadzi do zespołu Lenza-Majewskiego, wpływa na poziomy PI(4)P poprzez ORP5/836. Gdy aktywność obu białek jest zablokowana, PS staje się mniej obfity w PM, obniżając onkogenną zdolność białek sygnałowych37.
Na odwrót, nadekspresja ORP5 wydaje się sprzyjać inwazji komórek rakowych i procesom przerzutowym38. Tak więc zmiany w aktywności ORP5/8 mogą poważnie modyfikować zachowanie komórek poprzez zmiany w homeostazie lipidów. Co więcej, ORP5 i ORP8 zajmują miejsca kontaktu ER-mitochondriów i zachowują niektóre funkcje mitochondrialne, prawdopodobnie poprzez dostarczanie PS39. Dodatkowo, ORP5 lokalizuje się w miejscach kontaktu kropelek ER-lipidów, aby dostarczyć PS do kropelek lipidów przez PS/PI(4)P exchange40. Opisana w niniejszym dokumencie strategia pomiaru (i) ekstrakcji PS i PI(4)P z liposomów oraz (ii) transportu PS i PI(4)P między liposomami została opracowana w celu ustalenia i analizy aktywności wymiany PS/PI(4)P Osh6p/Osh7p12,32 i stosowana przez inne grupy do analizy aktywności ORP5/ORP835 i innych LTP10, 41. Opiera się na wykorzystaniu czytnika płytek fluorescencyjnych, standardowego spektrofluorometru w formacie L oraz dwóch czujników fluorescencyjnych, NBD-C2Lact i NBD-PHFAPP, które mogą wykrywać odpowiednio PS i PI(4)P.
NBD-C2Lact odpowiada domenie C2 glikoproteiny, laktadheryny, która została przeprojektowana tak, aby zawierała unikalną cysteinę wystawioną na działanie rozpuszczalnika w pobliżu przypuszczalnego miejsca wiązania PS; wrażliwy na polarność fluorofor NBD (7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol) jest kowalencyjnie połączony z tą resztą (Rysunek 1A)12. Mówiąc dokładniej, domena C2 laktadheryny (Bos taurus, UniProt: Q95114, reszty 270-427) została sklonowana do wektora pGEX-4T3, który ulega ekspresji w fuzji z S-transferazą glutationu (GST) w Escherichia coli. Sekwencja C2Lact została następnie zmutowana w celu zastąpienia dwóch dostępnych w rozpuszczalniku reszt cysteiny (C270, C427) resztami alaniny i wprowadzenia reszty cysteiny do regionu w pobliżu domniemanego miejsca wiązania PS (mutacja H352C), która może być następnie znakowana N,N'-dimetylo-N-(jodoacetylo)-N'-(7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-ylo) etylenodiamina (IANBD) 12. Miejsce rozszczepienia trombiny znajduje się między białkiem GST a N-końcem domeny C2. Główną zaletą jest to, że ta domena selektywnie rozpoznaje PS w sposób niezależny od Ca2+, w przeciwieństwie do innych znanych domen C2 lub Annexin A542. NBD-PHFAPP pochodzi z domeny pH ludzkiego białka adaptora czterofosforanowego 1 (FAPP1), które zostało przeprojektowane tak, aby zawierało pojedynczą cysteinę wystawioną na działanie rozpuszczalnika, którą można znakować grupą NBD w pobliżu miejsca wiązania PI(4)P (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A)43. Sekwencja nukleotydowa domeny PH ludzkiego białka FAPP (UniProt: Q9HB20, segment [1-100]) została sklonowana do wektora pGEX-4T3, który ulega ekspresji w połączeniu ze znacznikiem GST. SekwencjaPH FAPP została zmodyfikowana w celu wstawienia unikalnej reszty cysteiny do interfejsu wiążącego błonę białka43. Co więcej, między miejscem rozszczepienia trombiny a N-końcem domeny PH wprowadzono łącznik z dziewięcioma resztami, aby zapewnić dostęp do proteazy.
Aby zmierzyć ekstrakcję PS z liposomów, NBD-C2Lact jest mieszany z liposomami wykonanymi z fosfatydylocholiny (PC) zawierającymi śladowe ilości PS. Ze względu na swoje powinowactwo do PS, konstrukt ten wiąże się z liposomami, a fluorofor NBD doświadcza zmiany polarności, gdy wchodzi w kontakt z hydrofobowym środowiskiem błony, co wywołuje przesunięcie ku błękitowi i wzrost fluorescencji. Jeśli PS jest prawie całkowicie ekstrahowany przez stechiometryczną ilość LTP, sonda nie kojarzy się z liposomami, a sygnał NBD jest niższy (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1B) 32. Ta różnica w sygnale jest używana do określenia, czy LTP (np. Osh6p) wyodrębnia PS. Podobna strategia jest stosowana w przypadku NBD-PHFAPP do pomiaru ekstrakcji PI(4)P (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B), jak opisano wcześniej12,32. Zaprojektowano dwa testy oparte na FRET, aby (i) zmierzyć transport PS z liposomów LA do LB, które naśladują odpowiednio błonę ER i PM, oraz (ii) transport PI(4)P w odwrotnym kierunku. Testy te przeprowadza się w tych samych warunkach (tj. w tym samym buforze, temperaturze i stężeniu lipidów) w celu pomiaru wymiany PS/PI(4)P. Aby zmierzyć transport PS, NBD-C2Lact miesza się z liposomami LA złożonymi z PC i domieszkuje 5% mol PS i 2 mol% fluorescencyjnego gliposomów fosfatydyloetanoloaminy znakowanej rodaminą (Rhod-PE) i LB zawierających 5% mol PI (4) P.
O godzinie zero, FRET z Rhod-PE wygasza fluorescencję NBD. Jeśli PS jest transportowany z liposomów LA do LB (np. Po wstrzyknięciu Osh6p), następuje szybkie wygaszenie z powodu translokacji cząsteczekLact NBD-C2 z liposomów LA do LB (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C). Biorąc pod uwagę ilość dostępnego PS, NBD-C2Lact pozostaje zasadniczo w stanie związanym z błoną w trakcie eksperymentu12. Tak więc intensywność sygnału NBD bezpośrednio koreluje z dystrybucjąlaktu NBD-C2 między liposomami LA i LB i można ją łatwo znormalizować w celu określenia, ile PS jest przenoszone. Aby zmierzyć przenoszenie PI(4)P w przeciwnym kierunku, NBD-PHFAPP miesza się z liposomami LA i LB; biorąc pod uwagę, że wiąże się tylko z liposomami LB, które zawierają PI(4)P, ale nie Rhod-PE, jego fluorescencja jest wysoka. Jeśli PI(4)P zostanie przeniesiony do liposomówLA, przemieszcza się do tych liposomów, a sygnał zmniejsza się z powodu FRET z Rhod-PE (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C). Sygnał jest normalizowany w celu określenia, ile PI(4)P jest przesyłane43.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; L-cysteina &ge; 97 % (FG)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>W326305-100G</td><td>Przygotuj 10 mM roztwór podstawowy L-cysteiny w wodzie. Podwielokrotności są przechowywane w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>2 ml Bursztynowa fiolka, PTFE/Rub Lnr, do przechowywania lipidów w CHCL3</td><td>Wheaton</td><td>W224681</td><td></td></tr><tr><td>kulki szklane o średnicy 4 mm</td><td>Sigma</td><td>Z265934-1EA</td><td></td></tr><tr><td>50 mL stożkowa probówka wirówkowa</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml; Oczyszczacz KTA</td><td>GE healthcare</td><td></td><td>FPLC</td></tr><tr><td>Folia</td><td></td><td></td><td></td>aluminiowa</tr><tr><td>Amicon Ultra-15 o MWCO 3 i 10 kDa</td><td>Merck</td><td>UFC900324, UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 o MWCO 3 i 10 kDa</td><td>Merck</td><td>UFC800324, UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td></td><td></td><td>Przygotuj roztwór podstawowy o stężeniu 50 mg/ml z przefiltrowaną i wysterylizowaną wodą i przechowuj go w temperaturze -20 & stopień C.</td></tr><tr><td>Bestatin</td><td>Sigma</td><td>B8385-10mg</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Złote kompetentne komórki</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C16:0 Liss&nbsp; (Rhod-PE) w CHCl3 (1 mg/ml)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810158C-5MG</td><td></td></tr><tr><td>C16:0/C16:0-PI(4)P&nbsp; &nbsp;</td><td>Echelon Lipids</td><td>P-4016-3</td><td>Rozpuść 1 mg proszku C16:0/C16:0-PI(4)P w 250 &mikro; L MeOH i 250 &mikro; L z CHCl3. Następnie uzupełnij CHCl3 do 1 ml. Rozwiązanie musi stać się jasne.</td></tr><tr><td>C16:0/C18:1-PS (POPS) w CHCl3 (10 mg/ml)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840034C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>C18:1/C18:1-PC (DOPC) w CHCl3 (25 mg/mL)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C-500mg</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td>Przygotować 10 mM roztworu podstawowego CaCl2 w wodzie.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td></td><td></td><td></td></tr> (<tr><td>CHCl3) RPE-ISO</td><td>Carlo Erba</td><td>438601</td><td></td></tr><tr><td>Kompletny koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA</td><td></td> Roche <td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Dejonizowana (Milli-Q) woda</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetyloformamid (DMF), bezwodny, >99% czystości</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAzya I Rekombinowana, wolna od RNAzy, w proszku</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Euromedex</td><td>EU0006-B</td><td>Przygotować 1 M roztwór podstawowy DTT w wodzie Milli-Q.&nbsp; Przygotować 1 ml porcji i przechowywać je w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Kolumny chromatograficzne Econo-Pac (1,5 i razy 12 cm).</td><td>Biorad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta do elektroporacji 2 mm</td><td>Ozyme</td><td>EP102</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator Eppendorf 2510</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor o stałym kącie nachylenia Rurki Ti45 i Ti45</td><td>Beckman</td><td>Wirowanie lizatów</td><td></td>batcerialnych</tr><tr><td>Szklane strzykawki (10, 25 i 50 &mikro; L) do eksperymentu fluorescencyjnego</td><td>Szklane</td> strzykawki Hamilton <td></td><td></td></tr><tr><td>(25 , 100, 250, 500 i 1000 &mikro; L) do obsługi podstawowych roztworów lipidowych</td><td>Hamilton</td><td>1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN</td><td></td></tr><tr><td>Glutation Sepharose 4B Beads</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0756-05</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol (99% czystości)</td><td>Sigma</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Rurki do hemolizy z nakrętką</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES, >99% czystej</td><td>Sigma</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Illustra Kolumna odsalająca NAP 10</td><td>GE healthcare</td><td>GE17-0854-02</td><td></td></tr><tr><td>Izopropyl &beta;-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)&nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>EU0008-B</td><td>Przygotować 1 M roztwór podstawowy IPTG w Milli-Qwater. Przygotować 1 ml porcji i przechowywać je w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>K-Acetate</td><td>Prolabo</td><td>26664.293</td><td></td></tr><tr><td>Lennox LB Pożywka bulionowa bez glukozy</td><td></td><td></td><td>Przygotowana z wodą mili-Q i autoklawowana.</td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td>Linde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol (MeOH) &ge; 99,8%</td><td>VWR</td><td>20847.24</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td></td><td>Przygotować roztwór 2 M MgCl2. Przefiltrować roztwór za pomocą 0,45 &mikro; Filtr M.&nbsp;</td></tr><tr><td>Microplate 96 Well PS F-Botom niewiążący</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655900</td><td></td></tr><tr><td>Mini-ekstruder z dwiema gazoszczelnymi strzykawkami Hamilton o pojemności 1 ml</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>Monochromatorowy czytnik płytek fluorescencyjnych</td><td>TECAN</td><td>M1000 Pro</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-dimetylo-N-(jodoacetylo)-N'-(7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-ylo)etylenodiamina) (amid IANBD)</td><td>Sondy molekularne</td><td></td><td>Rozpuścić 25 mg IANBD w 2,5 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) i przygotować 25 podwielokrotności 100 &mikro; L w probówkach z nakrętką 1,5 ml. Nie zakręcaj całkowicie nakrętki. Następnie należy usunąć DMSO z liofilizatora, aby uzyskać 1 mg suchego IANBD na probówkę. Probówki są zamykane i przechowywane w temperaturze -20 &deg; C w ciemności.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1,8 mM KH2PO4, autoklawowane i przechowywane w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Szklane kolby w kształcie gruszki (25 mL, 14/23, szkło Duran)</td><td>Grupa</td><td></td><td></td>Duran</tr><tr><td>Pepstatyna</td><td>Sigma</td><td>p5318-25mg</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-C2LACT&nbsp; plazmid</td><td>Dostępne na życzenie w naszym laboratorium</td>plazmid <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>pGEX-PHFAPP</td><td>Dostępne na życzenie w naszym laboratorium</td></tr><tr><td>Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) &ge; 98,5% (GC)</td><td>Sigma</td><td>P7626-25g</td><td>Przygotować 200 mM roztwór podstawowy PMSF w izopropanolu</td></tr><tr><td>Phosphoramidon</td><td>Sigma</td><td>R7385-10mg</td><td></td></tr><tr><td>Filtry poliwęglanowe (o średnicy 19 mm) o wielkości porów 0,2 i mikro; m</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610006</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna chromatograficzna Poly-Prep (o objętości złoża 0-2 ml i zbiorniku 10 ml)</td><td>Filtry wstępne Biorad</td><td>7311550</td><td></td></tr><tr><td>(o średnicy 10 mm).</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610014</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>http://pymol.org/</td><td></td> <td>Budowa modeli 3D białek (Rysunek 1A)</td></tr><tr><td>Kuweta kwarcowa do fluorescencji UV/widzialnej (minimalna objętość 600 &mikro; L)</td>Kuwety kwarcowe <td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> Wirówka z chłodzeniem Hellma<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Eppendorf 5427R</td><td>Parownik obrotowy Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Buchi</td><td>B-100</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek z nakrętką (1,5 ml)</td><td>Sarsted</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Małe magnetyczne mieszadło PFTE (5 i razy; 2 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek zatrzaskowe (0,5, 1 i 2 ml)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYPRO pomarańczowy</td><td></td><td></td><td>barwienie fluorescencyjne do wykrywania białka w żelu SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TROMBINA, Z LUDZKIEGO OSOCZA</td><td>Sigma</td><td>10602400001</td><td>Rozpuść 20 jednostek w 1 ml wody mili-Q i przygotuj 25 &mikro; L porcji w probówkach Eppendorfa o pojemności 0,5 ml. Następnie zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Tris, ultra czysty</td><td>MP</td><td>819623</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka L90K</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV/absorpcji światła widzialnego</td><td>SAFAS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofluorometr UV/widzialny z uchwytem na kuwetę o kontrolowanej temperaturze i urządzeniem mieszającym</td><td>Jasco lub Shimadzu</td><td>Jasco FP-8300 lub Shimadzu RF-5301PC</td><td></td></tr><tr><td>Komora</td><td></td><td></td> <td>próżniowa</td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>Julabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XK 16/70 kolumna wypełniona Sephacryl S200HR</td><td>GE healthcare</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

oparte na fluorescencji pomiary wymiany fosfatydyloseryny/4-fosforanu fosfatydyloinozytolu między błonami

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Ostatnio odkryto, że kilku członków rodziny ewolucyjnie zachowanych białek wiążących oksysterol (OSBP) (ORP)/homologów OSBP (Osh) reprezentuje nową grupę białek przenoszących lipidy (LTP) w komórkach drożdży i ludzi. Przenoszą one fosfatydyloserynę (PS) z retikulum endoplazmatycznego (ER) do błony plazmatycznej (PM) poprzez cykle wymiany PS / fosfatydyloinozytolu 4-fosforanu (PI(4)P). Odkrycie to pozwala lepiej zrozumieć, w jaki sposób PS, który ma kluczowe znaczenie dla procesów sygnalizacyjnych, jest rozprowadzany w komórce oraz zbadać związek między tym procesem a metabolizmem fosfoinozytolu (). Opracowanie nowych protokołów opartych na fluorescencji odegrało zasadniczą rolę w odkryciu i scharakteryzowaniu tego nowego mechanizmu komórkowego in vitro na poziomie molekularnym. W artykule opisano produkcję i zastosowanie dwóch znakowanych fluorescencyjnie czujników lipidowych, NBD-C2Lact i NBD-PHFAPP, do pomiaru zdolności białka do ekstrakcji PS lub PI(4)P i przenoszenia tych lipidów między sztucznymi błonami. Po pierwsze, protokół opisuje, w jaki sposób produkować, znakować i uzyskiwać próbki tych dwóch konstruktów o wysokiej czystości. Po drugie, w artykule wyjaśniono, jak używać tych czujników z czytnikiem mikropłytek fluorescencyjnych w celu określenia, czy białko może wyekstrahować PS lub PI(4)P z liposomów, wykorzystując Osh6p jako studium przypadku. Wreszcie, protokół ten pokazuje, jak dokładnie zmierzyć kinetykę wymiany PS / PI (4) P między liposomami o określonym składzie lipidowym i określić szybkość transferu lipidów za pomocą transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) przy użyciu standardowego fluorometru.

<img alt="Oddziaływanie białko-lipid; wiązanie białek znakowanych NBD z PS/PI(4)P; schemat przedstawiający eksperyment fluorescencyjny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62177/62177fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1Opis fluorescencyjnych sensorów lipidowych oraz in vitro analizy (A) Trójwymiarowe modele NBD-C2Laktaza oraz NBD-PHFAPP na podstawi...

Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące fluorescencyjne czujniki lipidowe i liposomy do określenia, czy białko ekstrahuje i transportuje fosfatydyloserynę czy fosfatydyloinozytol 4-fosforan in vitro.

Oparte na fluorescencji pomiary wymiany fosfatydyloseryny/4-fosforanu fosfatydyloinozytolu między błonami

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Metoda ta wykorzystuje fluorescencję do określenia, czy białko przenosi się do biologicznie ważnych płynów między błoną syntetyczną, a tym samym przyczynia się do dystrybucji tych lipidów w komórkach eukariotycznych. Technika ta umożliwia ekstrakcję i transport naturalnego lipidu przez białko, wymaga komórek fluorescencyjnych i liposomów, które są łatwe do wykonania. Metoda ta może być stosowana i modyfikowana w celu uzyskania wglądu w biologię komórkową za pomocą białek odpowiedzialnych za dystrybucję niektórych niezbędnych lipidów między narządami a błonami.Demonstracja wizualna ma kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia, jak wykonywać pomiary transferu lipidów w czasie rzeczywistym za pomocą fluorescencji. Tak więc procedurę zademonstruje również Maud Magdeleine, inżynier z mojego laboratorium. Rozpocznij od przygotowania świeżo przefiltrowanego i odgazowanego buforu octanu potasu HEPES, uzupełnionego jednym milimolowym chlorkiem magnezu w celu utworzenia buforu HKM.Następnie należy przygotować liposomy wykonane wyłącznie z PC lub dodatkowo domieszkowane dwoma procentami molowymi PS lub PI(4)P. Teraz umieść kolbę na wyparce obrotowej, aby wysuszyć lipid w próżni. W jednym dołku wymie

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie demonstrujemy interakcje białko-fosfoinozytyd we wzorcu mikroprzepływowym za pomocą testu modulacji pH, używając wrażliwego na pH barwnika fluorescencyjnego oznaczonego lipidem fosfatydyloetanoloaminy w dwuwarstwie lipidowej, zwanej platformą mikroprzepływową. Modulacje pH po związaniu białka z fosfolipidem powodują wygaszanie fluorescencji.

Test modulacji pH na podpartych dwuwarstwach lipidowych w celu wykrycia interakcji białko-fosfoinozytyd

Mikroskopia fluorescencyjna z pełnym wewnętrznym odbiciem (pTIRFM) oparta na polaryzacji umożliwia wykrywanie dynamiki błony komórkowej w czasie rzeczywistym. W artykule opisano implementację pTIRFM do badania przebudowy błony podczas regulowanej egzocytozy. Technikę tę można uogólnić na inne procesy w biologii komórki, które bezpośrednio lub pośrednio wiążą się ze zmianami kształtu błony.

Obrazowanie deformacji błony plazmatycznej za pomocą pTIRFM

Przestrzenny rozkład i czasowa dynamika białek błony komórkowej i lipidów to gorący temat w biologii. W tym przypadku problem ten został rozwiązany za pomocą czasoprzestrzennej analizy fluktuacji obrazu, która zapewnia koncepcyjnie te same fizyczne wielkości śledzenia pojedynczych cząstek, ale wykorzystuje małe znaczniki molekularne i standardowe konfiguracje mikroskopowe.

Od szybkiego obrazowania fluorescencyjnego do prawa dyfuzji molekularnej na żywych błonach komórkowych w komercyjnym mikroskopie

Prezentujemy nową technikę pomiaru bocznej dyfuzji gatunków powierzchniowo czynnych na granicy płyn-płyn poprzez połączenie monowarstwy kropelki z płaską monowarstwą.

Odzyskiwanie fluorescencji po połączeniu kropli w celu zmierzenia dwuwymiarowej dyfuzji monowarstwy fosfolipidowej

Fosfoinozydy to lipidy sygnalizacyjne, których względna obfitość szybko zmienia się w odpowiedzi na różne bodźce. W artykule opisano metodę pomiaru obfitości fosfoinozytydów poprzez metaboliczne znakowanie komórek 3 H-mio-inozytolem, a następnie ekstrakcję i deacylację. Wyekstrahowane glicero-inozytydy są następnie rozdzielane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej i oznaczane ilościowo przez scyntylację przepływową.

Znakowanie radioaktywne i oznaczanie ilościowe poziomów komórkowych fosfoinozytydów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z przepływem

PI(4,5)P2 reguluje różne funkcje komórkowe, ale jego nanoskalowa organizacja w błonie komórkowej jest słabo poznana. Znakując PI(4,5)P2 dwukolorową sondą fluorescencyjną połączoną z domeną homologii Pleckstrin, opisujemy nowatorskie podejście do badania rozkładu przestrzennego PI(4,5)P2 w błonie plazmatycznej w skali nanometrowej.

Obrazowanie pojedynczej cząsteczki w superrozdzielczości 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu w błonie plazmatycznej za pomocą nowatorskich sond fluorescencyjnych

Opisujemy test oparty na fluorescencji do pomiaru mieszania fosfolipidów w dużych liposomach jednowarstwowych odtworzonych za pomocą opsyny.

Test fluorescencyjny aktywności scramblazy fosfolipidowej

Znakowanie domeny zewnątrzkomórkowej białka błonowego za pomocą wrażliwego na pH fluoroforu, superekliptycznej pHluoryny (SEP), pozwala na określenie subkomórkowej lokalizacji, ekspresji i transportu. Obrazowanie białek znakowanych SEP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) umożliwia ilościowe określenie poziomów białek w obwodowej ER i błonie plazmatycznej.

Wykorzystanie receptorów znakowanych pHluoryną do monitorowania lokalizacji subkomórkowej i transportu

Ten protokół przedstawia metodę obrazowania fluorescencyjnego, która wykorzystuje klasę wrażliwych na pH fluoroforów lipidowych do monitorowania transportu błony lipidowej podczas egzocytozy komórkowej i cyklu endocytozy.

Pomiar obrotu lipidów w błonie za pomocą wrażliwego na pH fluorescencyjnego analogu lipidowego ND6

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii TIRF do śledzenia poszczególnych kanałów jonowych i określania ich aktywności w obsługiwanych błonach lipidowych, definiując w ten sposób wzajemne oddziaływanie między bocznym ruchem błony a funkcją kanału. Opisano w nim, jak przygotować membrany, rejestrować dane i analizować wyniki.

Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Opisujemy metodę użycia cyklodekstryny do pośredniczenia w wymianie między lipidami błony komórkowej a lipidami egzogennymi. Technikę tę można połączyć z eksperymentami badającymi białka transbłonowe, które zachowują się inaczej w środowiskach podobnych do tratw lipidowych niż w środowiskach niepodobnych do tratwy.

Test wymiany lipidów w żywych komórkach

Poznaj fluorescencyjne metody pomiaru transferu fosfatydyloseryny i PI(4)P przez białka Osh6p między sztucznymi błonami. Technika ta umożliwia badanie kinetyki wymiany lipidów w komórkach eukariotycznych.

Oparte na fluorescencji pomiary wymiany fosfatydyloseryny/4-fosforanu fosfatydyloinozytolu między błonami

Przeglądaj więcej filmów