Uzupełnienie aktywności splicingu przez kompleks galektyny-3 - U1 snRNP na kulkach

Niniejszy raport dostarcza dowodów eksperymentalnych na dokumentację, że kompleks snRNP galektyny-3 U1 wiąże się z substratem pre mRNA, tworzy kompleks funkcjonalny i prowadzi do produktów reakcji splicingu. Protokół ten wykorzystuje galektynę-3 U1 snRNP immunoselekcjonowaną na kulkach kowalencyjnie sprzężonych z przeciwciałami anty-gal3 w celu zainicjowania reakcji splicingu, która może przejść do zakończenia. Krytycznym krokiem w protokole jest staranne usunięcie cieczy po granulowaniu kulek zawierających kompleks galektyny-3 U1 snRNP i natychmiastowe jej użycie w zainicjowaniu reakcji splicingu.

Aby zubożyć U1 snRNP z ekstraktu jądrowego, inkubuj 200 mikrolitrów ekstraktu jądrowego ze 100 mikrolitrami kulek anty-U1. Dodaj pięć mikrolitrów RNA do mieszaniny i obracaj mikrorurkę głową nad ogonem w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę. Mieszaninę należy otoczkować przez odwirowanie i zebrać niezwiązany materiał za pomocą strzykawki Hamiltona.

Dializować całą objętość ekstraktu jądrowego zubożonego w U1 wraz z oddzielną 50 mikrolitrową podwielokrotnością oryginalnego, niezubożonego ekstraktu jądrowego w oddzielnych komorach mikrodializatora, mieszając przez 75 minut w stosunku do 60% buforu D w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Użyj membrany dializacyjnej z odciętą masą cząsteczkową 8K. Bezpośrednio po dializie należy podzielić preparaty na 20 mikrolitrowych podwielokrotności, a następnie zamrozić je w kąpieli etanolowej z suchym lodem i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Tuż przed użyciem umyj kulki anty-gal3 dwukrotnie 0,5 mililitra bufora myjącego TX. Do każdego płukania dodać bufor do płukania i odwirówkę. Usunąć supernatant najpierw za pomocą mikropipety, a następnie za pomocą strzykawki Hamiltona, aby usunąć płyn z kulek.

Frakcjonować ekstrakt jądrowy w gradiencie glicerolu od 12% do 32%. Połącz i wymieszaj frakcje gradientu glicerolu trzecie, cztery i pięć, które znajdują się w pobliżu obszaru 10S. Przygotuj dwie 150-mikrolitrowe porcje połączonych frakcji gradientowych od trzeciej do piątej i umieść je w 50 mikrolitrach kulek anty-gal3.

Równolegle przygotuj dwie próbki, każda po 150 mikrolitrów frakcji pierwszej i umieść je w 50 mikrolitrach kulek anty-gal3. Jako kontrolę umieść 150 mikrolitrów 60% buforu D w 50 mikrolitrach kulek anty-gal3. Wymieszaj delikatnie, stukając w rurki, a następnie obracaj je głową nad ogonem w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę.

Próbki należy osadzać przez delikatne odwirowanie. Usunąć większość supernatantu za pomocą mikropipety. Usunąć supernatant za pomocą strzykawki Hamiltona, ostrożnie wkładając końcówkę igły do dolnej części kulek.

Użyj koralików natychmiast do reakcji splicingu. Zbierz reakcję splicingu zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym i dodaj ją do jednego zestawu próbek kulek. Zbierz identyczny zestaw reakcji splicingu w całkowitej objętości 24 mikrolitrów, ale bez ekstraktu jądrowego zubożonego w U1 i dodaj go do drugiego zestawu kulek.

Przygotować kontrolną reakcję splicingu, która ma być przeprowadzona przy braku jakichkolwiek kulek w całkowitej objętości 12 mikrolitrów. Ta reakcja kontrolna zawiera ekstrakt jądrowy, 60% bufor D i radioaktywny substrat do splicingu. Delikatnie wymieszaj probówki, stukając i obracając je głową w ogon w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 90 minut, a następnie peletki mieszaniny przez delikatne odwirowanie.

Zatrzymaj reakcję i wymyj białka z kulek, dodając 24 mikrolitry buforu do próbek 2X SDS do probówek zawierających kulki i 12 mikrolitrów buforu do próbki 2X SDS do probówki kontrolnej zawierającej ekstrakt jądrowy, ale bez kulek. Wiruj każdą rurkę. Podgrzej rurki w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez siedem minut.

Odwirować probówki pod ciśnieniem 1 000 razy G w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 sekund. Przenieść supernatanty do świeżych mikroprobówek. Dodaj 20 miligramów na mililitr proteinazy K, aby strawić i rozpuścić białka.

Inkubować probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 40 minut. Po inkubacji delikatnie odwirować probówki. Rozcieńczyć eluacje kulek 39,5 mikrolitrami TE i 10 mikrolitrami trzech molowych octanu sodu.

Rozcieńczyć kontrolę ekstraktu jądrowego 63,5 mikrolitrami TE i 10 mikrolitrami octanu sodu. Wyodrębnij i przeanalizuj RNA zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Ekstrakty jądrowe pozbawione kompleksów U1 snRNP i gal3 U1 snRNP z regionu 10S gradientu glicerolu immunoprecypitowanego przez anty-gal3 zmieszano w reakcji splicingu.

Ta mieszanina reakcyjna zawierała U1 snRNA, a także białko specyficzne dla U1 U1-70K. Zgodnie z oczekiwaniami, anty-gal3 wytrącił gal3. U1 snRNA, białko U1-70K i gal3 nie zostały znalezione w pre-immunologicznej kontroli wytrącającej.

W porównaniu z niezubożonym ekstraktem jądrowym przeprowadzonym jako kontrola pozytywna, ekstrakt jądrowy zubożony z U1 snRNP nie wykazywał aktywności splicingowej. Aktywność splicingu w ekstrakcie jądrowym zubożonym w U1 może zostać odtworzona przez związany z kulkami kompleks snRNP gal3 U1. Stwierdzono zarówno produkty reakcji splicingu, zligowane eksony i wycinany intron lariat, jak i w produktach pośrednich.

Składniki frakcji od trzeciej do piątej miały kluczowe znaczenie w przywróceniu splicingu do ekstraktu jądrowego zubożonego w U1. Gdy frakcje te zostały zastąpione samym buforem, nie można było zaobserwować żadnej aktywności splicingu, co wskazuje, że kulki anty-gal3 nie były odpowiedzialne za przywrócenie aktywności splicingu w ekstrakcie jądrowym zubożonym w U1. Bardziej przekonująco, gdy frakcje od trzeciego do piątego zastąpiono frakcją pierwszą w procedurze immunoprecypitacji, a następnie dodano do ekstraktu jądrowego zubożonego w U1, nie znaleziono żadnych produktów pośrednich ani produktów reakcji splicingu. Próbując tego protokołu, jedna osoba powinna zakończyć immunoprecypitację, podczas gdy druga osoba przygotowuje reakcję splicingu z jak najmniejszym opóźnieniem.

Bardzo interesująca byłaby analiza proteomiczna składu polipeptydowego galektyny-3 U1 SNRP, który przywraca aktywność splicingową ekstraktowi jądrowemu zubożonemu w U1.