Name: Produkcja nanokropelek dekafluorobutanu z filtrem membranowym z przesunięciem fazowym z wstępnie uformowanych mikropęcherzyków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Naucz się produkcji nanokropelek dekafluorobutanu z filtrem membranowym i przesunięciem fazowym. Metoda zapewnia kontrolę wielkości, skalowalność i niską polidyspersyjność do zastosowań biomedycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Dominique James z laboratorium dr Kena Hoyta za dostarczenie analizy TRSP waporyzowalnych nanokropel z przesunięciem fazowym

1. Przygotowanie filmów lipidowych
<ol>
	<li>Przygotuj filmy lipidowe do generowania mikropęcherzyków, używając 90% DSPC i 10% DSPE-PEG2K, mieszając lipidy w odpowiednim stosunku zgodnie z poniższymi instrukcjami:
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwory zapasowe lipidów DSPC i DSPE-PEG2K w chloroformie. Odważ 50 mg każdego z proszków lipidowych do oddzielnych fiolek. Do każdej fiolki dodaj 1 mL chloroformu, używając szklanej strzykawki o pojemności 1 mL.</li>
		<li>Za pomocą szklanej strzykawki dodaj 287 µL roztworu zapasowego DSPC oraz 113 µL roztworu zapasowego DSPE-PEG2K (oba o stężeniu 50 mg/mL) do 20 mL fiolki scyntylacyjnej.</li>
		<li>Wysusz zmieszane lipidy w celu usunięcia chloroformu, używając azotu. Przy użyciu odpowiedniej długości rurki podłączonej do sieci azotowej, delikatnie przedmuchuj przestrzeń nad próbką w fiolce podczas mieszania. Kontynuuj proces do momentu, aż chloroform całkowicie odparuje, a pozostały film lipidowy zacznie bieleć. Użyj polipropylenowych zakrętek; przykrywaj próbkę podczas wprowadzania azotu do przestrzeni nad nią.</li>
		<li>Umieść fiolki w suszarce próżniowej na całą noc, aby usunąć wszelkie pozostałości chloroformu. Na dnie fiolki pozostanie cienka, półprzezroczysta warstwa.</li>
		<li>Przechowuj fiolki w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Generowanie mikropęcherzyków z filmów lipidowych
<ol>
	<li>Aby przygotować mikropęcherzyki, dodaj 10 mL 1x buforu fosforanowo-solnego (PBS) zawierającego 20% v/v glikolu propylenowego i 20% v/v glicerolu (końcowe pH 7.2-7.4) do suchego filmu lipidowego.</li>
	<li>Zakręć próbkę i ogrzewaj ją w temperaturze 65 °C przez 30 min na bloku grzewczym (lub w łaźni wodnej).</li>
	<li>Podczas ogrzewania próbki przygotuj sonicator kąpielowy, zwiększając temperaturę kąpieli do 65 °C. 
	UWAGA: Proces ten przebiega szybciej, jeśli woda zostanie wstępnie podgrzana w kuchence mikrofalowej lub na płycie grzewczej przed wlaniem jej do sonicatora kąpielowego.</li>
	<li>Umieść fiolkę scyntylacyjną z ogrzaną próbką w sonicatorze kąpielowym w taki sposób, aby w łaźni wodnej zanurzona była tylko ta część fiolki, w której znajduje się roztwór lipidowy.</li>
	<li>Sonikuj ciepły roztwór lipidowy przez minimum 15 min. Upewnij się, że temperatura wody utrzymuje się na poziomie 65 °C. Kontynuuj sonikację w odstępach 10-15 min, aż roztwór stanie się całkowicie klarowny (Rycina 2). 
	UWAGA: Jeśli sonicator kąpielowy jest niedostępny, roztwór można sonikować za pomocą sonikatora z końcówką (tip sonication) przy mocy 10%, aż stanie się klarowny. Należy jednak pamiętać, że mikrokońcówka zużywa się szybciej i jej wymiana jest droższa.</li>
</ol>
<img alt="Proces sonikacji w kąpieli ultradźwiękowej, schemat porównania wyników, przed i po poprawie dyspersji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62203/62203fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przykład uwodnionych filmów lipidowych. Przykład uwodnionego filmu lipidowego (A) przed i (B) po sonikacji w kąpieli ultradźwiękowej w celu utworzenia pęcherzyków jednowarstwowych. Po sonikacji roztwór lipidowy powinien zmienić się z bardziej mętnego w przezroczysty. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62203/62203fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="6">
	<li>Gdy próbka jest jeszcze ciepła, należy zdjąć zakrętkę i przymocować fiolkę w wygłuszonej komorze sonikatora w taki sposób, aby końcówka mikrosondy była zanurzona tuż poniżej granicy fazy powietrze-ciecz (Rysunek 3).</li>
	<li>Zbiornik z decafluorobutanem należy umieścić obok wygłuszonej komory sonikatora.</li>
	<li>Należy przygotować łaźnię lodową i ustawić ją obok wygłuszonej komory. Będzie ona wykorzystana później w kroku 2.14.</li>
	<li>Należy włączyć wyłącznik zasilania sonikatora.</li>
	<li>Po uruchomieniu systemu należy ustawić poziom mocy na 70%. Przy zastosowaniu mikrosondy nie wolno przekraczać amplitudy 70%. Na tym etapie nie należy jeszcze uruchamiać sonikatora.</li>
	<li>Należy podłączyć odpowiedniej długości wężyk, aby doprowadzić gaz z wylotu zbiornika DFB do ciepłego roztworu lipidów znajdującego się w komorze. Wężyk powinien być umieszczony tuż w szyjce fiolki, aby gaz mógł wpływać do przestrzeni nad cieczą podczas sonikacji (Rysunek 3).</li>
	<li>Należy powoli otwierać zawór zbiornika, aż do momentu, gdy gaz zacznie przepływać nad roztworem lipidów. Spowoduje to powstanie lekkich zmarszczek na powierzchni cieczy. Jeśli przepływ gazu będzie zbyt silny, roztwór może się przelać podczas formowania mikropęcherzyków.</li>
	<li>Należy uruchomić sonikator i prowadzić proces w sposób ciągły przez 10 s w celu wygenerowania mikropęcherzyków. Jeśli roztwór z pęcherzykami zacznie się przelewać podczas sonikacji, należy natychmiast zatrzymać sonikator.</li>
	<li>Należy wyłączyć sonikator i natychmiast zamknąć zawór zbiornika DFB.</li>
	<li>Należy szybko zakręcić fiolkę z roztworem mikropęcherzyków i zanurzyć ją w łaźni lodowej, aby schłodzić próbkę poniżej 55 °C (temperatura przejścia szklistego DSPC).</li>
	<li>Próbki mikropęcherzyków należy pozostawić w łaźni lodowej do momentu ich użycia.</li>
</ol>
<img alt="Konfiguracja wlotu gazu w laboratoryjnym aparacie do refluksu; stosowana do kontrolowanych reakcji i transferu gazów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62203/62203fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Umieszczenie końcówki sondy w roztworze lipidów w celu optymalizacji tworzenia mikropęcherzyków. Należy uważać, aby końcówka sondy nie dotykała szkła. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62203/62203fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
3. Przygotowanie ekstrudera do kondensacji mikropęcherzyków
<ol>
	<li>Zmontować ekstruder wysokociśnieniowy zgodnie z instrukcją obsługi, używając ceramicznego filtra 200 nm (dostarczonego przez producenta).</li>
	<li>Umieścić ekstruder na środku szczelnego pojemnika w taki sposób, aby rurka wylotowa próbki nie była przyciśnięta do ścianki ani zagięta.</li>
	<li>Podłączyć ekstruder do butli z azotem, korzystając z adaptera dostarczonego przez producenta.</li>
	<li>Przygotować w szczelnym pojemniku wokół ekstrudera kąpiel solno-lodową o temperaturze -2 °C, używając 400 mL wody i 10 g chlorku sodu.</li>
	<li>Umieścić koniec rurki wylotowej w fiolce scyntylacyjnej w celu zebrania ekstrudowanej próbki. 
	UWAGA: Jeśli rurka nie przylega płasko lub nie pozostaje wewnątrz fiolki, należy przymocować ją do pojemnika taśmą.</li>
</ol>
4. Przygotowanie wytłaczarki do kondensacji mikropęcherzyków
<ol>
	<li>Otwórz i zamknij zawór spustowy, aby upewnić się, że w ekstruderze nie ma ciśnienia.</li>
	<li>Zdejmij pokrywę komory i dodaj 5 mL 1x PBS do komory ekstrudera.</li>
	<li>Załóż pokrywę, upewniając się, że została bezpiecznie zatrzaśnięta na miejscu.</li>
	<li>Otwórz butlę z azotem tak, aby manometr wskazywał 250 psi. Upewnij się, że zawór regulacji ciśnienia jest w pozycji zamkniętej.</li>
	<li>Zamknij butlę z gazem i otwórz zawór wlotowy komory ekstrudera. Roztwór PBS zostanie przepchnięty przez system i wyprowadzony rurką wylotową próbki do fiolki scyntylacyjnej.</li>
	<li>Gdy z rurki będzie wydostawał się już tylko gaz, otwórz zawór spustowy i pozwól ciśnieniu spaść do 0 psi.</li>
	<li>Wyjmij fiolkę scyntylacyjną.</li>
</ol>
5. Wychładzanie mikropęcherzyków przed ekstruzją
<ol>
	<li>Otwórz i zamknij zawór spustowy, aby upewnić się, że w ekstruderze nie ma ciśnienia. Umieść nową fiolkę scyntylacyjną na końcu rurki wylotowej.</li>
	<li>Napełnij stalowy pojemnik 2-metylobutanem i dodaj suchy lód, aby obniżyć temperaturę do -18 °C.</li>
	<li>Zanurz roztwór mikropęcherzyków w schłodzonym 2-metylobutanie tak, aby próbka była zanurzona przez 2 min. Przez te 2 min delikatnie poruszaj fiolką scyntylacyjną, aby wymieszać pęcherzyki. W razie potrzeby dodawaj suchy lód, aby utrzymać temperaturę między -15 a -18 °C. Należy uważać, aby nie przekroczyć -20 ˚C, ponieważ roztwór substancji pomocniczych zamarznie, co zniszczy próbkę pęcherzyków. 
	UWAGA: Kroki 5.2 i 5.3 można również zrealizować poprzez chłodzenie próbki pęcherzyków w zamrażarce laboratoryjnej przez dłuższy czas. Należy jednak zachować ostrożność i uważnie monitorować temperaturę zamrażarki, aby uniknąć zamrożenia próbki.</li>
	<li>Po 2 min wyjmij mikropęcherzyki ze schłodzonego 2-metylobutanu, delikatnie potrząśnij fiolką, aby wymieszać mikropęcherzyki, a następnie za pomocą schłodzonej strzykawki 10 mL przenieś roztwór do ekstrudera.</li>
	<li>Zdejmij pokrywę komory ekstrudera i wprowadź roztwór mikropęcherzyków do komory, powoli naciskając tłok strzykawki. Nałóż pokrywę ekstrudera, upewniając się, że została bezpiecznie zablokowana.</li>
	<li>Upewnij się, że zawór regulacji ciśnienia oraz zawór spustowy ekstrudera są w pozycji zamkniętej.</li>
	<li>Otwórz butlę z azotem, aż manometr wskaże 250 psi, zamknij butlę i przekręć zawór regulacji ciśnienia do pozycji otwartej.</li>
	<li>Gdy roztwór wypełni fiolkę scyntylacyjną przy rurce wylotowej i z rurki będzie wydobywał się już tylko gaz, powoli otwórz zawór spustowy i pozwól, aby ciśnienie spadło do 0 psi.</li>
	<li>Umieść fiolkę scyntylacyjną w łaźni lodowej lub w lodówce w celu przechowywania.</li>
	<li>Aby zapewnić długoterminowe przechowywanie i zminimalizować spontaniczne odparowanie, przechowuj próbkę w standardowej zamrażarce. Upewnij się, że temperatura wynosi -20 °C lub więcej, aby uniknąć zamrożenia próbki (roztwór substancji pomocniczych składający się z 20% PPG i 20% glicerolu zapobiegnie zamarznięciu próbki w większości zamrażarek laboratoryjnych).</li>
</ol>
6. Oddzielanie kropli od liposomów metodą wirowania
<ol>
	<li>Przenieś 10 mL roztworu wyciśniętych kropel do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL.</li>
	<li>Wirować wyciśniętą próbkę z prędkością 1,500 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Na dnie probówki pojawi się osad składający się z nanokropel DFB (Rysunek 4). Spontanicznie odparowane krople pojawią się na powierzchni roztworu i należy je usunąć.</li>
</ol>
<img alt="Probówka wirówkowa z widocznym osadem komórkowym, zestaw do eksperymentu oczyszczania białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62203/62203fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Przykład osadzania się kropli DFB z przesunięciem fazowym po wirowaniu. Nanokrople DFB są gęstsze niż liposomy i gromadzą się na dnie probówki wirówkowej w postaci osadu (czerwona ramka). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62203/62203fig04large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="3">
	<li>Usunąć nadsącz i resuspender osad w 2 mL 1x PBS z dodatkiem 20% glicerolu i 20% glikolu propylenowego.</li>
	<li>Delikatnie wymieszać zawartość probówki, aby uzyskać jednorodny roztwór, a następnie przenieść krople do mniejszej probówki wirówkowej o pojemności 2 mL.</li>
	<li>Przemyć próbkę jeszcze dwa razy w probówce wirówkowej 2 mL.</li>
	<li>Po ostatnim przemyciu resuspender osad w 100 µL 1x PBS z dodatkiem 20% glicerolu i 20% glikolu propylenowego i przechowywać na lodzie lub w zamrażarce do momentu użycia.</li>
</ol>
7. Weryfikacja mikroskopowa odparowania kropli
<ol start="1">
	<li>Przygotować rozcieńczony roztwór kropel, dodając 2,5 µl stężonych kropel do 7,5 µl 1x PBS.</li>
	<li>Przygotować szkiełko przedmiotowe z 10 µl rozcieńczonej próbki. Obserwować próbkę za pomocą obiektywu 40x i zapisać obrazy.</li>
	<li>Zdjąć szkiełko z mikroskopu i umieścić je na płycie grzewczej o temperaturze 65 ˚C na 1 min, aby odparować nanokrople do postaci mikropęcherzyków.</li>
	<li>Użyć tego samego obiektywu 40x do obserwacji próbki po podgrzaniu w celu weryfikacji odparowania kropel.</li>
</ol>

<ol><li>Sirsi, S., Borden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbubble+compositions%2C+properties+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Bubble+Science+Engineering+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Microbubble compositions, properties and biomedical applications.</a> Bubble Science Engineering and Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).</li>
<li>Sheeran, P. S., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase-change+contrast+agents+for+imaging+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Phase-change contrast agents for imaging and therapy.</a> Current Pharmaceutical Design. 18 (15), 2152-2165 (2012).</li>
<li>Mountford, P. A., Smith, W. S., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorocarbon+nanodrops+as+acoustic+temperature+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%3A+The+ACS+Journal+of+Surfaces+and+Colloids%22%5BJournal%5D)">Fluorocarbon nanodrops as acoustic temperature probes.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (39), 10656-10663 (2015).</li>
<li>Mountford, P. A., Thomas, A. N., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+activation+of+superheated+lipid-coated+perfluorocarbon+drops%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%3A+The+ACS+Journal+of+Surfaces+and+Colloids%22%5BJournal%5D)">Thermal activation of superheated lipid-coated perfluorocarbon drops.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (16), 4627-4634 (2015).</li>
<li>Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formulation+and+acoustic+studies+of+a+new+phase-shift+agent+for+diagnostic+and+therapeutic+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%3A+The+ACS+Journal+of+Surfaces+and+Colloids%22%5BJournal%5D)">Formulation and acoustic studies of a new phase-shift agent for diagnostic and therapeutic ultrasound.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 27 (17), 10412-10420 (2011).</li>
<li>Sheeran, P. S., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+performance+of+phase-change+perfluorocarbon+droplets+for+medical+ultrasonography%3A+current+progress%2C+challenges%2C+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Scientifica%22%5BJournal%5D)">Improving the performance of phase-change perfluorocarbon droplets for medical ultrasonography: current progress, challenges, and prospects.</a> Scientifica. 2014, 579684(2014).</li>
<li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+generating+submicrometer+phase-shift+perfluorocarbon+droplets+for+applications+in+medical+ultrasonography%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Ultrasonics%2C+Ferroelectrics%2C+and+Frequency+Control%22%5BJournal%5D)">Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2017).</li>
<li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decafluorobutane+as+a+phase-change+contrast+agent+for+low-energy+extravascular+ultrasonic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging.</a> Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1518-1530 (2011).</li>
<li>de Gracia Lux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+the+formation+of+monodisperse+superheated+perfluorocarbon+nanodroplets+as+activatable+ultrasound+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Novel method for the formation of monodisperse superheated perfluorocarbon nanodroplets as activatable ultrasound contrast agents.</a> RSC Advances. 7 (77), 48561-48568 (2017).</li>
<li>Mountford, P. A., Sirsi, S. R., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condensation+phase+diagrams+for+lipid-coated+perfluorobutane+microbubbles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%3A+The+ACS+Journal+of+Surfaces+and+Colloids%22%5BJournal%5D)">Condensation phase diagrams for lipid-coated perfluorobutane microbubbles.</a> Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 30 (21), 6209-6218 (2014).</li>
<li>Feshitan, J. A., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbubble+size+isolation+by+differential+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Microbubble size isolation by differential centrifugation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).</li>
<li>Wu, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound-facilitated+brain+drug+delivery+using+optimized+nanodroplets%3A+vaporization+efficiency+dictates+large+molecular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets: vaporization efficiency dictates large molecular delivery.</a> Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002(2018).</li>
<li>Li, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+Nucleation+of+stable+perfluorocarbon+emulsions+for+ultrasound+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Spontaneous Nucleation of stable perfluorocarbon emulsions for ultrasound contrast agents.</a> Nano Letters. 19 (1), 173-181 (2019).</li>
<li>Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+ultrasonically-activatable+nanoparticles+using+low+boiling+point+perfluorocarbons%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons.</a> Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).</li>
<li>Kawabata, K., Sugita, N., Yoshikawa, H., Azuma, T., Umemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+with+multiple+perfluorocarbons+for+controllable+ultrasonically+induced+phase+shifting%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles with multiple perfluorocarbons for controllable ultrasonically induced phase shifting.</a> Japanese Journal of Applied Physics. 44 (6), 4548-4552 (2005).</li>
<li>Shakya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaporizable+endoskeletal+droplets+via+tunable+interfacial+melting+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Vaporizable endoskeletal droplets via tunable interfacial melting transitions.</a> Science Advances. 6 (14), 7188(2020).</li>
<li>Kopechek, J. A., Zhang, P., Burgess, M. T., Porter, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+phase-shift+nanoemulsions+with+narrow+size+distributions+for+acoustic+droplet+vaporization+and+bubble-enhanced+ultrasound-mediated+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Synthesis of phase-shift nanoemulsions with narrow size distributions for acoustic droplet vaporization and bubble-enhanced ultrasound-mediated ablation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4308(2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dostępna jest obszerna literatura, która omawia formułę, fizykę i potencjalne zastosowania mikropęcherzyków i kropel z przesunięciem fazowym w obrazowaniu i terapii in vivo. Dyskusja ta dotyczy wyraźnie generowania mikropęcherzyków lipidowych i przekształcania ich w submikronowe kropelki przesunięcia fazowego przy użyciu gazu DFB o niskiej temperaturze wrzenia i wytłaczania pod wysokim ciśnieniem. Opisana tutaj metoda ma na celu zapewnienie stosunkowo prostej metody wytwarzania dużych ilości mikropęcherzyków lipidowych i...

Środki kontrastowe do badań ultrasonograficznych (UCA) zyskują na popularności w zastosowaniach obrazowych i terapeutycznych. Mikropęcherzyki, pierwotne UCA, są obecnie głównymi środkami stosowanymi w diagnostyce klinicznej. Mikropęcherzyki to wypełnione gazem sfery, zazwyczaj o średnicy 1-10 µm, otoczone powłokami lipidowymi, białkowymi lub polimerowymi1. Jednak ich rozmiar i stabilność in vivo mogą ograniczać ich funkcjonalność w wielu zastosowaniach. Nanokrople przesunięcia fazowego, zawierające rdzeń z przegrzanej cieczy, mogą przezwyciężyć niektóre z tych ograniczeń dzięki mniejszym rozmiarom i wydłużonemu czasowi krążenia2. Pod wpływem ciepła lub energii akustycznej przegrzany rdzeń ciekły paruje, tworząc gazowy mikropęcherzyk2,3,4,5. Ponieważ próg parowania jest bezpośrednio powiązany z rozmiarem kropli5,6, opracowanie zawiesin kropli o jednorodnym rozmiarze byłoby wysoce pożądane dla uzyskania spójnych progów aktywacji. Metody formulacji pozwalające na uzyskanie jednolitych rozmiarów kropli są często złożone i kosztowne, podczas gdy bardziej ekonomiczne podejścia prowadzą do powstania roztworów polidyspersyjnych7. Kolejnym ograniczeniem jest możliwość generowania stabilnych kropli przesunięcia fazowego z gazami perfluorowęglowymi (PFC) o niskiej temperaturze wrzenia, co jest kluczowe dla efektywnej aktywacji in vivo8. W niniejszej pracy opisano protokół generowania stabilnych, filtrowanych, parowalnych kropli przesunięcia fazowego o niskiej temperaturze wrzenia do zastosowań w obrazowaniu i terapii in vivo.
Istnieje wiele metod wytwarzania monodyspersyjnych submikronowych kropli z przesunięciem fazowym7. Jedną z najskuteczniejszych metod kontroli rozmiaru jest zastosowanie urządzeń mikroprzepływowych. Urządzenia te mogą być kosztowne, charakteryzować się niską szybkością produkcji kropli (~104-106 kropli/s)7 i wymagać specjalistycznego przeszkolenia. Urządzenia mikroprzepływowe zazwyczaj wymagają również gazów o wysokiej temperaturze wrzenia, aby uniknąć spontanicznego odparowania i zapychania systemu7. Jednakże niedawne badanie przeprowadzone przez de Gracia Lux i współpracowników9 wykazuje, że chłodzenie mikrofluidyzera może być wykorzystane do generowania wysokich stężeń submikronowych kropli z przesunięciem fazowym (1010-1012/mL) przy użyciu niskowrzących związków takich jak decafluorobutan (DFB) lub octafluoropropan (OFP).
Ogólnie rzecz biorąc, gazy o niskiej temperaturze wrzenia, takie jak DFB lub OFP, są łatwiejsze w obsłudze przy użyciu preformowanych pęcherzyków gazu. Krople podatne na odparowanie mogą być wytwarzane z prekursorowych pęcherzyków stabilizowanych lipidami poprzez skraplanie gazu przy użyciu niskich temperatur i podwyższonego ciśnienia5,10. Stężenie kropli wytwarzanych tą metodą zależy od stężenia prekursorowych mikropęcherzyków oraz wydajności konwersji pęcherzyków w krople. W literaturze zgłoszono uzyskanie stężeń mikropęcherzyków z sonikacji końcówkowej osiągających &gt; 1010 MB/mL11, podczas gdy w oddzielnym badaniu zgłoszono stężenia kropli w zakresie ~1-3 x1011 kropli/mL z kondensowanych pęcherzyków OFP i DFP12. Gdy monodyspersyjność kropli nie jest kluczowa, metody kondensacji są najprostszym i najtańszym sposobem generowania stabilizowanych lipidami kropli zmiany fazy przy użyciu PFC o niskiej temperaturze wrzenia. Metody generowania pęcherzyków o jednolitym rozmiarze przed kondensacją mogą pomóc w stworzeniu bardziej monodyspersyjnych populacji kropli. Jednak generowanie monodyspersyjnych pęcherzyków prekursorowych jest również trudne i wymaga bardziej kosztownych podejść, takich jak mikroprzepływy lub powtarzane techniki różnicowego wirowania11. Alternatywne podejście do produkcji nanokropli DFB i OFB zostało niedawno opublikowane, wykorzystując spontaniczną nukleację kropli w liposomach13. Metoda ta, wykorzystująca efekt „Ouzo”, jest prostym sposobem generowania kropli PFC o niskiej temperaturze wrzenia bez konieczności kondensacji pęcherzyków. Rozkład wielkości kropli PFC można kontrolować poprzez precyzyjne miareczkowanie i mieszanie komponentów PFC, lipidów i etanolu używanych do zainicjowania nukleacji kropli. Warto również zauważyć, że mieszanie perfluorowęglowodorów może być wykorzystywane do kontrolowania stabilności i progów aktywacji nanokropli14,15. Nowsze prace Shakyi i wsp. demonstrują, jak można dostroić aktywację nanokropli poprzez emulgowanie PFC o wysokiej temperaturze wrzenia w obrębie węglowodorowego endoszkieletu, aby ułatwić heterogenną nukleację w rdzeniu kropli16, co jest podejściem, które można rozważyć wraz z innymi formami filtracji rozmiaru kropli.
Po utworzeniu, kropelki przesunięcia fazowego mogą zostać wyciśnięte w celu uzyskania bardziej monodyspersyjnych populacji. W rzeczywistości podobny protokół do metody opisanej w niniejszej pracy został opublikowany wcześniej przez Kopecheka i wsp. 17, przy zastosowaniu dodecafluoropentanu (DDFP) o wysokiej temperaturze wrzenia jako rdzenia kropelki. Czytelnicy chcący wykorzystać kropelki przesunięcia fazowego z perfluorowęglowodorami o wysokiej temperaturze wrzenia (stabilnymi w temperaturze pokojowej) powinni odnieść się do powyższego artykułu. Generowanie i wyciskanie kropelek z gazów o niskiej temperaturze wrzenia, takich jak DFB i OFP, jest bardziej skomplikowane i najlepiej przeprowadzić je poprzez kondensację wcześniej utworzonych pęcherzyków gazu.
W niniejszym protokole opisano powszechną metodę generowania gotowych mikropęcherzyków lipidowych z rdzeniem gazowym DFB przy użyciu sonikacji końcówką sondy. Następnie wykorzystano komercyjny ekstruder do kondensacji gotowych mikropęcherzyków w submikronowe nanokrople zmiany fazy (Rysunek 1). Powstałe krople są następnie aktywowalne za pomocą ciepła i ultradźwięków. Metoda ta pozwala na wytwarzanie większych objętości roztworu nanokropli niż konwencjonalne metody kondensacji, zapewniając jednocześnie węższy rozkład wielkości bez konieczności stosowania kosztownych urządzeń mikrofluidycznych. Produkcja roztworów nanokropli o wąskim rozkładzie wielkości może prawdopodobnie zapewnić bardziej jednorodne progi parowania. Maksymalizuje to ich potencjał w licznych zastosowaniach, takich jak obrazowanie, ablacja, dostarczanie leków oraz embolizacja1,3,4,6.
<img alt="Schemat procesu filtracji mikropęcherzyków z systemem ciśnieniowym, pokazujący separację mikropęcherzyków i kropel." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62203/62203fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat układu do ekstruzji wysokociśnieniowej w celu kondensacji gotowych mikropęcherzyków do nanokropli zmieniających fazę. Roztwór mikropęcherzyków jest dodawany do komory ekstrudera i w niej zawarty, a następnie przez zawór wlotowy komory przyłożone jest ciśnienie 250 psi z butli z azotem. Gaz azotowy przepchnie roztwór mikropęcherzyków przez filtr u podstawy komory, kondensując próbkę do postaci nanokropli. Roztwór zostaje ostatecznie wypchnięty z ekstrudera przez rurkę wylotową próbki i zebrany. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62203/62203fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>15 ml Probówki wirówkowe</td><td>Falcon</td><td>352095</td><td>Zbieranie i odwirowywanie kropel</td></tr><tr><td>Filtr poliwęglanowy 200 nm</td><td>Whatman</td><td>110606</td><td>Filtry do wytłaczarki</td></tr><tr><td>2-metylobutan</td><td>Fisher Chemical</td><td>03551-4</td><td>Szybkie wstępne chłodzenie roztworu mikropęcherzyków przed wytłaczaniem</td></tr><tr><td>3-bolcowe zaciski X2</td><td>Fisher</td><td>02-217-002</td><td>Utrzymywanie fiolek do scyntylacji na miejscu do sonikacji końcówki sondy</td></tr><tr><td>400W Analogowy sonator końcówki sondy z klaksonem</td><td>Branson</td><td>101-063-198R</td><td>Służy do generowania mikropęcherzyków lipidowych z roztworu lipidowego</td></tr><tr><td>Sonicator do kąpieli</td><td>Fisher Scientific</td><td>15337402</td><td>Służy do pomocy w rozkładzie liposomów na pęcherzyki jednowarstwowe</td></tr><tr><td>Bioresole Fisher</td><td>Chloroform C298-4</td><td>Służy do wytwarzania filmu lipidowego do przygotowania mikropęcherzyków</td><td></td></tr><tr><td>Dekafluorobutan (perfluorobutan) Gaz</td><td>FluoroMed L.P.</td><td>1 kg</td><td>generujący mikropęcherzyki za pomocą sonikacji końcówki sondy</td></tr><tr><td>Suchy lód</td> <td>-</td><td></td> <td>szybkie wstępne chłodzenie roztworu mikropęcherzyków przed wytłaczaniem</td></tr><tr><td>DSPC Lipid Powder</td><td>NOF America</td><td>COATSOME MC-8080</td><td>Składnik filmu lipidowego</td></tr><tr><td>DSPE-PEG-2K Lipid Powder</td><td>NOF America</td><td>SUNBRIGHT DSPE-020CN</td><td>Składnik filmu lipidowego</td></tr><tr><td>Termometr ogólny</td> <td>-</td><td>-</td><td>Służy do pomiaru temperatury łaźni lodowej i temperatury 2-metylobutanu (musi dostosować się do temperatur -20C)</td></tr><tr><td>Szklane strzykawki</td><td>Hamilton</td><td>81139</td><td>Służy do mieszania lipidów w chloroformie</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP229-1</td><td>Obniża temperaturę zamarzania roztworu PBS</td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>VWR Scientific Products</td><td></td><td>Podgrzewanie filmów lipidowych i parowanie kropelek</td></tr><tr><td>Lipex 10 wytłaczarka ml</td><td>Evonik</td><td></td><td>Komercyjny system wytłaczania wysokociśnieniowego</td></tr><tr><td>Mini Vortex Mixer</td><td>Marka Fisher</td><td>14-955-151</td><td>Służy do usuwania nadmiaru chloroformu z folii lipidowych</td></tr><tr><td>Zbiornik azotu</td> <td>-</td><td></td> <td>Używany do obsługi wytłaczarki</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Saline</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Hydrate folie lipidowe i kropelki do prania</td></tr><tr><td>Poliestrowy dysk</td> <td>spustowyWhatman</td><td>230600</td><td>Zapewnia wsparcie dla filtra poliwęglanowego</td></tr><tr><td>Nasadki polipropylenowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>298417</td><td>Służy do przechowywania roztworu</td></tr><tr><td>Glikol propylenowy</td><td>Fisher Chemical</td><td>P355-1</td><td>Obniża temperaturę zamarzania roztworu PBS</td></tr><tr><td>Fiolki do scyntylacji</td><td>DWK Nauki Przyrodnicze Wheaton</td><td>986532</td><td>Służy do tworzenia filmów lipidowych i generowania mikropęcherzyków</td></tr><tr><td>Mały młotek</td> <td>-</td><td></td> <td>służy do rozbijania suchego lodu do chłodzenia metylobutanu</td></tr><tr><td>Sonicator Nasadka do mikrokońcówek</td><td>Branson</td><td>101148070</td><td>Służy do generowania mikropęcherzyków z roztworu lipidów</td></tr><tr><td>Pojemnik stalowy</td><td>Medegen</td><td>79310</td><td>Szybkie wstępne chłodzenie roztworu mikropęcherzyków przed wytłaczaniem (będzie działał dowolny pojemnik o temperaturze -20C)</td></tr> <tr><td>Eksykator próżniowy</td><td>Bel-Art SP Scienceware</td><td>08-648-100</td><td>Usuwa nadmiar chloroformu z filmów lipidowych</td></tr><tr><td>2 ml probówka wirówkowa</td><td>Fisher</td><td>02682004</td><td>Służy do zagęszczania nanokropel </td></tr></tbody></table>

produkcja nanokropelek dekafluorobutanu z filtrem membranowym z przesunięciem fazowym z wstępnie uformowanych mikropęcherzyków

Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

Istnieje wiele metod, które mogą być użyte do produkcji parowalnych kropelek przesunięcia fazowego do obrazowania i terapii. Każda metoda wykorzystuje różne techniki i różni się ceną, materiałami i przeznaczeniem. Wiele z tych metod wytwarzania prowadzi do powstania populacji polidyspersyjnych o niejednorodnych progach aktywacji. Ponadto kontrolowanie wielkości kropel zazwyczaj wymaga stabilnych cieczy perfluorowęglowodorowych o wysokich progach aktywacji, które nie są praktyczne in vivo. Wytwarzanie jednolitych rozmiarów kropel przy użyciu gazów o niskiej temperaturze wrzenia byłoby korzystne dla eksperymentów z obrazowaniem i terapią in vivo. W artykule opisano prostą i ekonomiczną metodę tworzenia filtrowanych pod względem wielkości, stabilizowanych lipidowo nanokropel przesunięcia fazowego z dekafluorobutanem o niskiej temperaturze wrzenia (DFB). Opisano powszechną metodę generowania mikropęcherzyków lipidowych, a także nowatorską metodę ich kondensacji za pomocą wytłaczania pod wysokim ciśnieniem w jednym kroku. Metoda ta ma na celu zaoszczędzenie czasu, maksymalizację wydajności i generowanie większych objętości roztworów mikropęcherzyków i nanokropel do szerokiej gamy zastosowań przy użyciu powszechnego sprzętu laboratoryjnego znajdującego się w wielu laboratoriach biologicznych.

Reprezentatywne wyniki rozkładu wielkości uzyskano przy użyciu dynamicznego rozpraszania światła (DLS) oraz analizy pomiaru impulsu rezystancyjnego z regulowaną aperturą (TRPS). Rysunek 5 przedstawia rozkład wielkości kondensowanych roztworów bąbelków z ekstruzją i bez niej. W przypadku braku ekstruzji protokół kończy się na kroku 5.3. Schłodzone bąbelki kondensuje się poprzez wystawienie próbki na ciśnienie atmosferyczne w niskiej temperaturze. Próbka poddana jedynie kondensacji wykazuje zn...

Ten protokół opisuje metodę generowania dużych ilości mikropęcherzyków dekafluorobutanu zamkniętych w lipidach za pomocą sonikacji końcówki sondy, a następnie kondensacji ich w nanokropelki z przesunięciem fazowym za pomocą wytłaczania wysokociśnieniowego i filtracji mechanicznej.

Produkcja nanokropelek dekafluorobutanu z filtrem membranowym z przesunięciem fazowym z wstępnie uformowanych mikropęcherzyków

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

Protokół ten jest łatwą metodą zmniejszania polidyspersyjności kropelek parujących o niskiej temperaturze wrzenia do stosowania w zastosowaniach biomedycznych. Technika ta kondensuje wstępnie uformowane mikropęcherzyki gazu i filtruje powstałe kropelki cieczy według wielkości w sposób, który jest kontrolowany, skalowalny i stosunkowo opłacalny. Metodę tę można zastosować do różnych mikropęcherzyków lipidowych o różnej powłoce i materiale gazowym przy użyciu różnych filtrów do kontrolowania końcowej wielkości kropli.Procedurę zademonstruje Darrah Merillat, badaczka z laboratorium dr Sirsi. Włącz wyłącznik zasilania sonikatora i ustaw amplitudę na maksymalną dozwoloną za pomocą nasadki z mikrokońcówką i upewnij się, że czas sonikacji jest ustawiony na 10 sekund. Umieść ciepły, uwodniony roztwór lipidowy w obudowie dźwiękowej tak, aby mikrokońcówka znajdowała się tuż pod powierzchnią.Podłączyć rurkę o odpowiedniej długości do szyjki fiolki, aby poprowadzić gaz z wylotu zbiornika DFB do ciepłego roztworu lipidów znajdującego się w obudowie. Powoli otwieraj zawór zbiornika, aż zacznie być widać, jak gaz przepływa przez roztwór lipidowy, powodując lekkie zmarszczki na powierzchni cieczy. Jeśli przepływ gazu jest zbyt duży, roztwór przeleje się podczas tworzenia mikropęcherzyków.Uruchom sonikator i uruchom go przez 10 sekund w sposób ciągły, aby wytworzyć mikropęcherzyki. Po zakończeniu sonikacji natychmiast zamknij zawór zbiornika DFB. Szybko zakryj roztwór mikropęcherzyków i zanurz fiolkę w łaźni lodowej, aby schłodzić próbkę poniżej 55 stopni Celsjusza.Użyj 200-nanometrowego filtra ceramicznego, aby zmontować wytłaczarkę wysokociśnieniową zgodnie z instrukcją obsługi i umieść ją na środku wodoszczelnego pojemnika, tak aby rurka wylotowa próbki nie była dociśnięta do boku ani zaciśnięta. Podłącz ekstruder do zbiornika azotu za pomocą adaptera dostarczonego przez producenta. Umieścić koniec rurki wylotowej w fiolce scyntylacyjnej, aby pobrać wytłaczaną próbkę, przymocowując probówkę do pojemnika taśmą, aby pozostała w fiolce.Otwórz i zamknij zawór spustowy, aby upewnić się, że w ekstruderze nie ma ciśnienia. Zdejmij pokrywę komory. I dodaj pięć mililitrów PBS do komory wytłaczarki.Załóż pokrywę, upewniając się, że zatrzasnęła się z powrotem na swoim miejscu. Otwórz zbiornik azotu tak, aby manometr wskazywał 250 PSI, upewniając się, że zawór regulacji ciśnienia jest w pozycji zamkniętej. Zamknij zbiornik gazu i otwórz zawór wlotowy komory wytłaczarki, powodując przepchnięcie roztworu PBS przez system i wyprowadzenie rurki wylotowej próbki do fiolki scyntylacyjnej.Gdy z rurki wydostaje się tylko gaz, otwórz zawór spustowy i pozwól, aby ciśnienie spadło do zera PSI. Następnie wyjąć fiolkę scyntylacyjną. Otwórz i zamknij zawór spustowy, aby upewnić się, że nie ma ciśnienia w wytłaczarce, a następnie umieść nową fiolkę scyntylacyjną na końcu rurki wylotowej.Napełnij stalowy pojemnik 2-metylobutanem i dodaj suchy lód, aby obniżyć temperaturę do minus 18 stopni Celsjusza. Wprowadzić roztwór mikropęcherzyków do schłodzonego 2-metylobutanu, zanurzając próbkę na dwie minuty. Przesuwaj fiolkę scyntylacyjną przez dwie minuty, aby delikatnie wymieszać bąbelki.W razie potrzeby dodaj suchy lód, aby utrzymać temperaturę między minus 15 a minus 18 stopni Celsjusza. Po dwóch minutach usuń mikropęcherzyki ze schłodzonego 2-metylobutanu. Delikatnie zakręć fiolką, aby wymieszać mikropęcherzyki i przenieś bąbelki do schłodzonej 10-mililitrowej strzykawki.Zdejmij pokrywę komory ekstrudera i dodaj roztwór mikropęcherzyków do komory, powoli naciskając tłok na strzykawkę. Załóż nasadkę ekstrudera, upewniając się, że zatrzasnęła się bezpiecznie na swoim miejscu. Sprawdź, czy zawór regulacji ciśnienia i zawór spustowy ekstrudera są w pozycji zamkniętej.Otwórz zbiornik azotu gazowego, aż manometr wskaże 250 PSI. Zamknij zbiornik gazu i przekręć zawór regulacji ciśnienia do pozycji otwartej. Gdy roztwór napełni fiolkę scyntylacyjną na rurce wyjściowej, a z rurki wydostaje się tylko gaz, powoli otwórz zawór spustowy ciśnienia i pozwól, aby ciśnienie spadło do zera PSI.Przenieś 10 mililitrów wytłaczanego roztworu kropel do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwirować wytłaczaną próbkę w temperaturze 1 500 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i spontanicznie odparowane kropelki pojawiające się na wierzchu roztworu.Ponownie zawiesić osad zawierający nanokropelki DFP w 10 mililitrach PBS z 20% glicerolem i 20% glikolem propylenowym. Rozkład wielkości skondensowanych roztworów bąbelkowych z ekstruzją i bez niej pokazuje, że skondensowana próbka ma znacznie szerszy rozkład wyśrodkowany w pobliżu 400 nanometrów, podczas gdy wytłaczana próbka ma węższy rozkład wyśrodkowany na 200 nanometrach. Analiza przestrajalnego impulsu rezystancyjnego stosowana do analizy kropelek przesunięcia fazowego, gdy zostały one przemyte przez wirowanie w celu usunięcia nadmiaru liposomów, pokazuje, że rozmiary kropel są bliskie 200 nanometrów.Dane mikroskopowe dotyczące parowania nanokropel po podgrzaniu pokazują, że niektóre spontanicznie odparowane mikropęcherzyki są widoczne w polu widzenia przed podgrzaniem, a większa liczba mikropęcherzyków gazu jest obserwowana po podgrzaniu. Przedstawiono tutaj obrazy mikroskopowe nanokropel wprowadzanych do wytłaczarki bezpośrednio bez wstępnego chłodzenia, skondensowanych w temperaturze zero stopni Celsjusza i minus 18 stopni Celsjusza. Reprezentatywne obrazy skondensowanych kropelek oktafluoropropanu przed i po odparowaniu pokazują również większą liczbę mikropęcherzyków gazu po podgrzaniu, podobnie jak kropelki DFB.Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas tej procedury, jest to, że wydajność kropel jest w dużym stopniu zależna od temperatury i ciśnienia podczas kondensacji, a niewielkie różnice będą miały wpływ na wyniki. Po wygenerowaniu kropelek do odparowania można je wykorzystać do optymalizacji obrazowania in vivo i dostarczania leków za pomocą ultradźwięków, a także innych zastosowań in vivo i ex vivo. Po opracowaniu tej techniki, wpływ wielkości nanokropel i zawartości rdzenia gazowego na progi waporyzacji in vivo został zbadany przy użyciu niewielkich modyfikacji tego protokołu.

production-membrane-filtered-phase-shift-decafluorobutane

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Nanoemulsje przesunięcia fazowego (PSNE) mogą być waporyzowane przy użyciu wysokointensywnego skupionego ultradźwięku w celu wzmocnienia lokalnego ogrzewania i poprawy ablacji termicznej w guzach. W niniejszym raporcie opisano przygotowanie stabilnych PSNE o wąskim rozkładzie wielkości. Ponadto zademonstrowano wpływ waporyzowanych PSNE na ablację indukowaną ultradźwiękami w fantomach imitujących tkankę.

Synteza nanoemulsji przesunięcia fazowego o wąskim rozkładzie wielkości do akustycznej waporyzacji kropli i ablacji wspomaganej ultradźwiękami z wykorzystaniem pęcherzyków

Ogólnym celem protokołu jest przygotowanie ponad miliona uporządkowanych, jednolitych, stabilnych i biokompatybilnych kropel femtolitru na płaskim podłożu o powierzchni 1cm2, który może być użyty do syntezy białek bez komórek.

Femtolitrowa matryca kropelkowa do masowo równoległej syntezy białek z pojedynczych cząsteczek DNA

Przedstawione protokoły mogą być użyte do scharakteryzowania reakcji znakowanych fluorescencyjnie mikropęcherzyków przeznaczonych do zastosowań związanych z dostarczaniem leków wyzwalanych ultradźwiękami, w tym ich mechanizmów aktywacji, jak również ich efektów biologicznych. W artykule omówiono szereg technik mikroskopii in vitro i in vivo wykonanych w celu uchwycenia odpowiednich długości i skal czasowych.

Wieloczasowe metody mikroskopowe do charakterystyki mikropęcherzyków znakowanych fluorescencyjnie do uwalniania leków wywołanego ultradźwiękami

W tym protokole opisane są metody syntezy i charakterystyki kropel porfiryny o wielomodalnej przemianie fazowej.

Synteza i charakterystyka multimodalnych kropelek porfiryny zmiennofazowej

Optycznie aktywowane nanokropelki perfluorocarbonu są obiecujące w zastosowaniach obrazowania poza układem naczyniowym. W tym artykule pokażemy, jak syntetyzować te cząstki, sieciować fantomy poliakrylamidu i modulować kropelki akustycznie, aby wzmocnić ich sygnał.

Formulacja i modulacja akustyczna optycznie odparowanych nanokropel perfluorowęglowodoru

Ten protokół opisuje wytwarzanie mikropęcherzyków lipidowych i kompatybilną metodę radioznakowania mikropęcherzyków w jednym garnku z nieoczyszczającą &gt;95% skutecznością znakowania, która zachowuje właściwości fizykochemiczne mikropęcherzyków. Metoda ta jest skuteczna w przypadku różnych preparatów mikropęcherzyków lipidowych i może być dostosowana do generowania mikropęcherzyków radioaktywnych i/lub fluorescencyjnych.

Wytwarzanie i znakowanie mikropęcherzyków za pomocą znaczników fluorescencyjnych i radioaktywnych

Pomimo wyjątkowych właściwości mechanicznych i biochemicznych jedwabiu pająków, materiał ten nie może być pozyskiwany w dużych ilościach metodami konwencjonalnymi. W niniejszej pracy opisujemy efektywną strategię przędzenia sztucznych włókien jedwabiu pająka, co stanowi istotny proces dla badaczy analizujących produkcję jedwabiu pająków oraz jego zastosowanie jako biomateriałów nowej generacji.

Produkcja syntetycznego jedwabiu pajęczego w skali laboratoryjnej

Wprowadzamy protokół generowania dużych liczb (od tysięcy do setek tysięcy) sferoid guza o jednakowej wielkości i składzie, używając dostępnych na rynku płytek mikrodołkowych.

Produkcja dużej liczby sferoid guza o kontrolowanej wielkości przy użyciu płytek mikrodołkowych

Dostarczamy szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania monowalentnych docelowych kropek kwantowych (mQD) z fosforoazotanu DNA o określonej długości. Owijanie DNA odbywa się z dużą wydajnością, dlatego produkty nie wymagają oczyszczania. Demonstrujemy zastosowanie znacznika SNAP do kierowania mQD do receptorów na powierzchni komórki w zastosowaniach obrazowania żywych komórek.

Produkcja i celowanie w monowalentne kropki kwantowe

Proszek bambusowy został wstępnie potraktowany NaOH i enzymatycznie hydrolizowany. Hydrolizat bambusa został wykorzystany jako surowiec do produkcji 2,3-butanodiolu, R-acetoiny, kwasu 2-ketoglukonowego i kwasu ksylonowego przez Klebsiella pneumoniae.

Produkcja chemikaliów przez Klebsiella pneumoniae z wykorzystaniem hydrolizatu bambusa jako surowca

Naucz się produkcji nanokropelek dekafluorobutanu z filtrem membranowym i przesunięciem fazowym. Metoda zapewnia kontrolę wielkości, skalowalność i niską polidyspersyjność do zastosowań biomedycznych.

Produkcja nanokropelek dekafluorobutanu z filtrem membranowym z przesunięciem fazowym z wstępnie uformowanych mikropęcherzyków

Przeglądaj więcej filmów