Produkcja nanokropelek dekafluorobutanu z filtrem membranowym z przesunięciem fazowym z wstępnie uformowanych mikropęcherzyków

Protokół ten jest łatwą metodą zmniejszania polidyspersyjności kropelek parujących o niskiej temperaturze wrzenia do stosowania w zastosowaniach biomedycznych. Technika ta kondensuje wstępnie uformowane mikropęcherzyki gazu i filtruje powstałe kropelki cieczy według wielkości w sposób, który jest kontrolowany, skalowalny i stosunkowo opłacalny. Metodę tę można zastosować do różnych mikropęcherzyków lipidowych o różnej powłoce i materiale gazowym przy użyciu różnych filtrów do kontrolowania końcowej wielkości kropli.

Procedurę zademonstruje Darrah Merillat, badaczka z laboratorium dr Sirsi. Włącz wyłącznik zasilania sonikatora i ustaw amplitudę na maksymalną dozwoloną za pomocą nasadki z mikrokońcówką i upewnij się, że czas sonikacji jest ustawiony na 10 sekund. Umieść ciepły, uwodniony roztwór lipidowy w obudowie dźwiękowej tak, aby mikrokońcówka znajdowała się tuż pod powierzchnią.

Podłączyć rurkę o odpowiedniej długości do szyjki fiolki, aby poprowadzić gaz z wylotu zbiornika DFB do ciepłego roztworu lipidów znajdującego się w obudowie. Powoli otwieraj zawór zbiornika, aż zacznie być widać, jak gaz przepływa przez roztwór lipidowy, powodując lekkie zmarszczki na powierzchni cieczy. Jeśli przepływ gazu jest zbyt duży, roztwór przeleje się podczas tworzenia mikropęcherzyków.

Uruchom sonikator i uruchom go przez 10 sekund w sposób ciągły, aby wytworzyć mikropęcherzyki. Po zakończeniu sonikacji natychmiast zamknij zawór zbiornika DFB. Szybko zakryj roztwór mikropęcherzyków i zanurz fiolkę w łaźni lodowej, aby schłodzić próbkę poniżej 55 stopni Celsjusza.

Użyj 200-nanometrowego filtra ceramicznego, aby zmontować wytłaczarkę wysokociśnieniową zgodnie z instrukcją obsługi i umieść ją na środku wodoszczelnego pojemnika, tak aby rurka wylotowa próbki nie była dociśnięta do boku ani zaciśnięta. Podłącz ekstruder do zbiornika azotu za pomocą adaptera dostarczonego przez producenta. Umieścić koniec rurki wylotowej w fiolce scyntylacyjnej, aby pobrać wytłaczaną próbkę, przymocowując probówkę do pojemnika taśmą, aby pozostała w fiolce.

Otwórz i zamknij zawór spustowy, aby upewnić się, że w ekstruderze nie ma ciśnienia. Zdejmij pokrywę komory. I dodaj pięć mililitrów PBS do komory wytłaczarki.

Załóż pokrywę, upewniając się, że zatrzasnęła się z powrotem na swoim miejscu. Otwórz zbiornik azotu tak, aby manometr wskazywał 250 PSI, upewniając się, że zawór regulacji ciśnienia jest w pozycji zamkniętej. Zamknij zbiornik gazu i otwórz zawór wlotowy komory wytłaczarki, powodując przepchnięcie roztworu PBS przez system i wyprowadzenie rurki wylotowej próbki do fiolki scyntylacyjnej.

Gdy z rurki wydostaje się tylko gaz, otwórz zawór spustowy i pozwól, aby ciśnienie spadło do zera PSI. Następnie wyjąć fiolkę scyntylacyjną. Otwórz i zamknij zawór spustowy, aby upewnić się, że nie ma ciśnienia w wytłaczarce, a następnie umieść nową fiolkę scyntylacyjną na końcu rurki wylotowej.

Napełnij stalowy pojemnik 2-metylobutanem i dodaj suchy lód, aby obniżyć temperaturę do minus 18 stopni Celsjusza. Wprowadzić roztwór mikropęcherzyków do schłodzonego 2-metylobutanu, zanurzając próbkę na dwie minuty. Przesuwaj fiolkę scyntylacyjną przez dwie minuty, aby delikatnie wymieszać bąbelki.

W razie potrzeby dodaj suchy lód, aby utrzymać temperaturę między minus 15 a minus 18 stopni Celsjusza. Po dwóch minutach usuń mikropęcherzyki ze schłodzonego 2-metylobutanu. Delikatnie zakręć fiolką, aby wymieszać mikropęcherzyki i przenieś bąbelki do schłodzonej 10-mililitrowej strzykawki.

Zdejmij pokrywę komory ekstrudera i dodaj roztwór mikropęcherzyków do komory, powoli naciskając tłok na strzykawkę. Załóż nasadkę ekstrudera, upewniając się, że zatrzasnęła się bezpiecznie na swoim miejscu. Sprawdź, czy zawór regulacji ciśnienia i zawór spustowy ekstrudera są w pozycji zamkniętej.

Otwórz zbiornik azotu gazowego, aż manometr wskaże 250 PSI. Zamknij zbiornik gazu i przekręć zawór regulacji ciśnienia do pozycji otwartej. Gdy roztwór napełni fiolkę scyntylacyjną na rurce wyjściowej, a z rurki wydostaje się tylko gaz, powoli otwórz zawór spustowy ciśnienia i pozwól, aby ciśnienie spadło do zera PSI.

Przenieś 10 mililitrów wytłaczanego roztworu kropel do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwirować wytłaczaną próbkę w temperaturze 1 500 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i spontanicznie odparowane kropelki pojawiające się na wierzchu roztworu.

Ponownie zawiesić osad zawierający nanokropelki DFP w 10 mililitrach PBS z 20% glicerolem i 20% glikolem propylenowym. Rozkład wielkości skondensowanych roztworów bąbelkowych z ekstruzją i bez niej pokazuje, że skondensowana próbka ma znacznie szerszy rozkład wyśrodkowany w pobliżu 400 nanometrów, podczas gdy wytłaczana próbka ma węższy rozkład wyśrodkowany na 200 nanometrach. Analiza przestrajalnego impulsu rezystancyjnego stosowana do analizy kropelek przesunięcia fazowego, gdy zostały one przemyte przez wirowanie w celu usunięcia nadmiaru liposomów, pokazuje, że rozmiary kropel są bliskie 200 nanometrów.

Dane mikroskopowe dotyczące parowania nanokropel po podgrzaniu pokazują, że niektóre spontanicznie odparowane mikropęcherzyki są widoczne w polu widzenia przed podgrzaniem, a większa liczba mikropęcherzyków gazu jest obserwowana po podgrzaniu. Przedstawiono tutaj obrazy mikroskopowe nanokropel wprowadzanych do wytłaczarki bezpośrednio bez wstępnego chłodzenia, skondensowanych w temperaturze zero stopni Celsjusza i minus 18 stopni Celsjusza. Reprezentatywne obrazy skondensowanych kropelek oktafluoropropanu przed i po odparowaniu pokazują również większą liczbę mikropęcherzyków gazu po podgrzaniu, podobnie jak kropelki DFB.

Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas tej procedury, jest to, że wydajność kropel jest w dużym stopniu zależna od temperatury i ciśnienia podczas kondensacji, a niewielkie różnice będą miały wpływ na wyniki. Po wygenerowaniu kropelek do odparowania można je wykorzystać do optymalizacji obrazowania in vivo i dostarczania leków za pomocą ultradźwięków, a także innych zastosowań in vivo i ex vivo. Po opracowaniu tej techniki, wpływ wielkości nanokropel i zawartości rdzenia gazowego na progi waporyzacji in vivo został zbadany przy użyciu niewielkich modyfikacji tego protokołu.