Wieloczasowe metody mikroskopowe do charakterystyki mikropęcherzyków znakowanych fluorescencyjnie do uwalniania leków wywołanego ultradźwiękami

Protokół ten można wykorzystać do scharakteryzowania odpowiedzi znakowanych fluorescencyjnie mikropęcherzyków, które są przeznaczone do zastosowań związanych z dostarczaniem leków wyzwalanych ultradźwiękami, w tym mechanizmów aktywacji i efektów biologicznych. Kluczem jest połączenie technik obrazowania, które pozwala nam rozwikłać wieloskalowy problem dostarczania leków za pomocą pęcherzyków za pomocą ultradźwięków, zarówno w różnych skalach przestrzennych, jak i w różnych skalach czasowych. W przypadku obrazowania pojedynczych pęcherzyków za pomocą mikroskopii Brightfield, umieść igłę odpowietrzającą o rozmiarze 19 i użyj jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 19, aby usunąć niewielką ilość zawiesiny mikropęcherzyków ze szklanej fiolki do małej probówki, aby ułatwić pipetowanie w następnym kroku.

Za pomocą pipety rozcieńczyć roztwór mikropęcherzyków w przefiltrowanym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem. Użyj strzykawki o pojemności 10 mililitrów, aby wstrzyknąć próbkę do jednego wylotu uchwytu na próbkę, aż uchwyt będzie pełny bez tworzenia pęcherzyków powietrza, w razie potrzeby wstrzykując więcej próbki. Zamknij oba zawory uchwytu próbki i umieść uchwyt próbki prostopadle do osi optycznej mikroskopu.

Przed analizą próbki ustaw żądaną częstotliwość sterowania ultradźwiękami i ciśnienie akustyczne na arbitralnym generatorze przebiegów i zaczynając od pola widzenia w jednym rogu uchwytu próbki, użyj stolika XYZ, aby przesunąć uchwyt, aby zlokalizować pojedyncze mikropęcherzyki w polu widzenia mikroskopu, a następnie podłącz światłowód podłączony do łaźni wodnej do światła stroboskopowego i rozpocznij nagrywanie. Powtórz obrazowanie tyle razy, ile jest to pożądane dla każdego ustawienia ultradźwięków, przesuwając uchwyt próbki o co najmniej dwa milimetry do pola widzenia zawierającego niesonizowane mikropęcherzyki dla każdej analizy. W przypadku obrazowania mikropęcherzyków pod mikroskopem fluorescencyjnym, po rozcieńczeniu roztworu mikropęcherzyków w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem, jak pokazano, należy ustawić żądaną częstotliwość sterowania ultradźwiękami i ciśnienie akustyczne na generatorze przebiegów arbitralnych i ustawić opóźnienie wyzwalania lasera na generatorze opóźnienia impulsów w celu wzbudzenia fluorescencyjnego nanocząstek z mikropęcherzyków, a następnie użyć stolika XYZ, aby przesunąć uchwyt próbki w celu zlokalizowania pojedynczych mikropęcherzyków i doprowadzenia ich do ogniska celu, a następnie uruchom nagrywanie.

Powtórz obrazowanie zgodnie z potrzebami, zmieniając ustawienia ultradźwięków i przesuwając uchwyt próbki do nowego pola widzenia, jak pokazano. W przypadku obrazowania za pomocą mikroskopii przyżyciowej należy najpierw umieścić podgrzany uchwyt zwierzęcia na stoliku pozycjonującym XY między falowodowem a obiektywem i dodać żel sprzęgający do falowodu. Wprowadzić cewnik do żyły ogonowej do żyły ogonowej znieczulonej myszy z guzem i umieścić mysz wyposażoną w komorę okienną w podgrzewanym uchwycie.

Dodaj kroplę wody do szkiełka nakrywkowego. Aby uwidocznić unaczynienie tkanki nowotworowej, wstrzyknij dożylnie 30 mikrolitrów czterech miligramów na mililitr fluorescencyjnie znakowanego 2 megadaltonowego dekstranu do cewnika żyły ogonowej i użyj etapu translacji XY, aby przesunąć mysz, aż będzie można zlokalizować pole widzenia z odpowiednimi naczyniami krwionośnymi. Dostosuj liczbę klatek na sekundę, pole widzenia i długość nagrania zgodnie z parametrami eksperymentu i zapisz podstawowe obrazy naczyń.

Po uzyskaniu obrazów linii bazowej ustaw częstotliwość sterowania ultradźwiękami, długość impulsu i amplitudę ciśnienia akustycznego na arbitralnym generatorze przebiegów i dożylnie wstrzyknij 50 mikrolitrów próbki mikropęcherzyków do żyły ogonowej. Następnie zobrazuj układ naczyniowy, jak pokazano. Analiza mikropęcherzyków za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej ujawnia nierównomierny rozkład cząstek w otoczce mikropęcherzyków.

Ogólna struktura mikropęcherzyków może być dodatkowo zwizualizowana za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Analiza dynamiki radialnej i zachowania fenomenologicznego mikropęcherzyków insonizowanych za pomocą mikroskopii Brightfield pozwala na ocenę względnej zmiany promienia mikropęcherzyków w czasie. W tym miejscu pokazano sekwencję obrazu typowego udanego dostarczenia fluorescencyjnie znakowanych nanocząstek.

Można zaobserwować, że nanocząstki osadzone w otoczce mikropęcherzyków fluoryzują, gdy światło lasera dociera do pęcherzyka. Jednak, jak zaobserwowano w tym nieudanym dostarczeniu, fluorescencyjne nanocząstki świecą na powłokę mikropęcherzyka, która pozostaje nienaruszona podczas ekspozycji na ultradźwięki. Przyżyciowe obrazowanie wielofotonowe można wykorzystać do określenia przestrzennego i czasowego wynaczynienia nanocząstek podczas ekspozycji na ultradźwięki, co może być korzystne dla zrozumienia i optymalizacji mechanizmów leżących u podstaw dostarczania nanocząstek za pośrednictwem ultradźwięków.

Dzięki idealnemu dopasowaniu ścieżek optycznych i akustycznych we wszystkich skalach długości i czasu, uzyskuje się kompleksowy wgląd w dostarczanie leków wyzwalane ultradźwiękami. Odpowiedzi uzyskane w naszych wieloskalowych eksperymentach zostaną teraz przełożone na praktykę kliniczną. Wyniki dostarczą cennych informacji dla szeregu zastosowań terapeutycznych, w tym w terapii nowotworów.