Wieloczasowe metody mikroskopowe do charakterystyki mikropęcherzyków znakowanych fluorescencyjnie do uwalniania leków wywołanego ultradźwiękami
12 czerwca 2021
Przedstawione protokoły mogą być użyte do scharakteryzowania reakcji znakowanych fluorescencyjnie mikropęcherzyków przeznaczonych do zastosowań związanych z dostarczaniem leków wyzwalanych ultradźwiękami, w tym ich mechanizmów aktywacji, jak również ich efektów biologicznych. W artykule omówiono szereg technik mikroskopii in vitro i in vivo wykonanych w celu uchwycenia odpowiednich długości i skal czasowych.
Protokół ten można wykorzystać do scharakteryzowania odpowiedzi znakowanych fluorescencyjnie mikropęcherzyków, które są przeznaczone do zastosowań związanych z dostarczaniem leków wyzwalanych ultradźwiękami, w tym mechanizmów aktywacji i efektów biologicznych. Kluczem jest połączenie technik obrazowania, które pozwala nam rozwikłać wieloskalowy problem dostarczania leków za pomocą pęcherzyków za pomocą ultradźwięków, zarówno w różnych skalach przestrzennych, jak i w różnych skalach czasowych. W przypadku obrazowania pojedynczych pęcherzyków za pomocą mikroskopii Brightfield, umieść igłę odpowietrzającą o rozmiarze 19 i użyj jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 19, aby usunąć niewielką ilość zawiesiny mikropęcherzyków ze szklanej fiolki do małej probówki, aby ułatwić pipetowanie w następnym kroku.
Za pomocą pipety rozcieńczyć roztwór mikropęcherzyków w przefiltrowanym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem. Użyj strzykawki o pojemności 10 mililitrów, aby wstrzyknąć próbkę do jednego wylotu uchwytu na próbkę, aż uchwyt będzie pełny bez tworzenia pęcherzyków powietrza, w razie potrzeby wstrzykując więcej próbki. Zamknij oba zawory uchwytu próbki i umieść uchwyt próbki prostopadle do osi optycznej mikroskopu.
Przed analizą próbki ustaw żądaną częstotliwość sterowania ultradźwiękami i ciśnienie akustyczne na arbitralnym generatorze przebiegów i zaczynając od pola widzenia w jednym rogu uchwytu próbki, użyj stolika XYZ, aby przesunąć uchwyt, aby zlokalizować pojedyncze mikropęcherzyki w polu widzenia mikroskopu, a następnie podłącz światłowód podłączony do łaźni wodnej do światła stroboskopowego i rozpocznij nagrywanie. Powtórz obrazowanie tyle razy, ile jest to pożądane dla każdego ustawienia ultradźwięków, przesuwając uchwyt próbki o co najmniej dwa milimetry do pola widzenia zawierającego niesonizowane mikropęcherzyki dla każdej analizy. W przypadku obrazowania mikropęcherzyków pod mikroskopem fluorescencyjnym, po rozcieńczeniu roztworu mikropęcherzyków w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem, jak pokazano, należy ustawić żądaną częstotliwość sterowania ultradźwiękami i ciśnienie akustyczne na generatorze przebiegów arbitralnych i ustawić opóźnienie wyzwalania lasera na generatorze opóźnienia impulsów w celu wzbudzenia fluorescencyjnego nanocząstek z mikropęcherzyków, a następnie użyć stolika XYZ, aby przesunąć uchwyt próbki w celu zlokalizowania pojedynczych mikropęcherzyków i doprowadzenia ich do ogniska celu, a następnie uruchom nagrywanie.
Powtórz obrazowanie zgodnie z potrzebami, zmieniając ustawienia ultradźwięków i przesuwając uchwyt próbki do nowego pola widzenia, jak pokazano. W przypadku obrazowania za pomocą mikroskopii przyżyciowej należy najpierw umieścić podgrzany uchwyt zwierzęcia na stoliku pozycjonującym XY między falowodowem a obiektywem i dodać żel sprzęgający do falowodu. Wprowadzić cewnik do żyły ogonowej do żyły ogonowej znieczulonej myszy z guzem i umieścić mysz wyposażoną w komorę okienną w podgrzewanym uchwycie.
Dodaj kroplę wody do szkiełka nakrywkowego. Aby uwidocznić unaczynienie tkanki nowotworowej, wstrzyknij dożylnie 30 mikrolitrów czterech miligramów na mililitr fluorescencyjnie znakowanego 2 megadaltonowego dekstranu do cewnika żyły ogonowej i użyj etapu translacji XY, aby przesunąć mysz, aż będzie można zlokalizować pole widzenia z odpowiednimi naczyniami krwionośnymi. Dostosuj liczbę klatek na sekundę, pole widzenia i długość nagrania zgodnie z parametrami eksperymentu i zapisz podstawowe obrazy naczyń.
Po uzyskaniu obrazów linii bazowej ustaw częstotliwość sterowania ultradźwiękami, długość impulsu i amplitudę ciśnienia akustycznego na arbitralnym generatorze przebiegów i dożylnie wstrzyknij 50 mikrolitrów próbki mikropęcherzyków do żyły ogonowej. Następnie zobrazuj układ naczyniowy, jak pokazano. Analiza mikropęcherzyków za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej ujawnia nierównomierny rozkład cząstek w otoczce mikropęcherzyków.
Ogólna struktura mikropęcherzyków może być dodatkowo zwizualizowana za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Analiza dynamiki radialnej i zachowania fenomenologicznego mikropęcherzyków insonizowanych za pomocą mikroskopii Brightfield pozwala na ocenę względnej zmiany promienia mikropęcherzyków w czasie. W tym miejscu pokazano sekwencję obrazu typowego udanego dostarczenia fluorescencyjnie znakowanych nanocząstek.
Można zaobserwować, że nanocząstki osadzone w otoczce mikropęcherzyków fluoryzują, gdy światło lasera dociera do pęcherzyka. Jednak, jak zaobserwowano w tym nieudanym dostarczeniu, fluorescencyjne nanocząstki świecą na powłokę mikropęcherzyka, która pozostaje nienaruszona podczas ekspozycji na ultradźwięki. Przyżyciowe obrazowanie wielofotonowe można wykorzystać do określenia przestrzennego i czasowego wynaczynienia nanocząstek podczas ekspozycji na ultradźwięki, co może być korzystne dla zrozumienia i optymalizacji mechanizmów leżących u podstaw dostarczania nanocząstek za pośrednictwem ultradźwięków.
Dzięki idealnemu dopasowaniu ścieżek optycznych i akustycznych we wszystkich skalach długości i czasu, uzyskuje się kompleksowy wgląd w dostarczanie leków wyzwalane ultradźwiękami. Odpowiedzi uzyskane w naszych wieloskalowych eksperymentach zostaną teraz przełożone na praktykę kliniczną. Wyniki dostarczą cennych informacji dla szeregu zastosowań terapeutycznych, w tym w terapii nowotworów.
Overview
Artykuł przedstawia protokoły dotyczące charakteryzacji odpowiedzi mikrobaniek oznaczonych fluorescencyjnie, używanych w dostarczaniu leków wyzwalanych ultradźwiękami. Szczegółowo opisuje różne techniki mikroskopowe do analizy mechanizmów aktywacji i efektów biologicznych w różnych skalach przestrzennych i czasowych.
Key Study Components
Area of Science
- Dostarczanie leków wyzwalane ultradźwiękami
- Techniki mikroskopowe
- Obrazowanie fluorescencyjne
Background
- Mikrobańki mogą wzmacniać dostarczanie leków za pomocą ultradźwięków.
- Zrozumienie ich zachowania jest kluczowe dla optymalizacji zastosowań terapeutycznych.
- Różne techniki obrazowania dostarczają informacji na temat dynamiki mikrobaniek.
- Łączenie analizy przestrzennej i czasowej jest niezbędne do kompleksowych badań.
Purpose of Study
- Charakteryzacja mechanizmów aktywacji mikrobaniek.
- Ocena efektów biologicznych ultradźwięków na dostarczanie leków.
- Wykorzystanie technik obrazowania wieloskalowych do szczegółowej analizy.
Methods Used
- Mikroskopia jasnopola do obrazowania pojedynczych baniek.
- Mikroskopia fluorescencyjna do obserwacji zachowania nanocząstek.
- Mikroskopia intravital do wizualizacji naczyń krwionośnych guza.
- Mikroskopia konfokalna fluorescencyjna do analizy rozkładu cząstek.
Main Results
- Zauważono nierównomierny rozkład powłok mikrobaniek.
- Zaprojektowano udane dostarczanie nanocząstek pod wpływem ultradźwięków.
- Obrazowanie intravital ujawniło przestrzenną i czasową dynamikę ekstrawazacji nanocząstek.
- Uzyskane wnioski mogą informować o zastosowaniach klinicznych w terapii nowotworów.
Conclusions
- Osiągnięto kompleksowe zrozumienie mechanizmów dostarczania leków wyzwalanych ultradźwiękami.
- Wyniki dostarczają cennych informacji dla zastosowań terapeutycznych.
- Przyszłe badania przełożą wyniki na praktykę kliniczną.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Understanding ultrasound-triggered drug delivery requires multi-scale characterization of microbubble behavior to de-risk therapeutic mechanisms. This protocol enables predictive confidence in nanoparticle release dynamics across spatial and temporal scales, supporting go/no-go decisions in early discovery. The approach addresses a critical inflection point in portfolio advancement by linking mechanistic insights to translational outcomes in cancer therapy applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses by visualizing nanoparticle distribution within microbubble shells to clarify payload localization mechanisms.
- Operational Value: Enable biological de-risking through direct observation of shell integrity and payload retention under controlled ultrasound exposure.
- Predictive Value: Support target validation by correlating ultrasound parameters with nanoparticle release efficiency for mechanistic de-risking.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepare validated microbubble-nanoparticle systems for standardized ultrasound response testing using fluorescence and bright-field microscopy.
- Quantitative Outputs: Generate measurable radial dynamics and fluorescence intensity readouts to enable compound or formulation screening.
- Platform Scalability: Establish reproducible imaging workflows across 10 million fps bright-field and 500,000 fps fluorescence modalities for high-content analysis.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Model tumor vasculature response using intravital microscopy in dorsal skinfold window chambers to study extravasation over several minutes.
- Translational Continuity: Bridge in vitro release mechanisms to in vivo nanoparticle distribution in vasculature and perivascular space.
- Risk-Adjusted Advancement: Inform preclinical go/no-go decisions by quantifying nanoparticle extravasation kinetics as a biomarker of delivery efficiency.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical assessment by providing multi-scale imaging data that informs mechanistic understanding and formulation optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of ultrasound-triggered release by visualizing nanoparticle localization and shell dynamics at single-bubble resolution.
- Screening: Enables assay readiness through standardized preparation and imaging of microbubble suspensions under defined ultrasound parameters.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of radial change over time and fluorescence emission profiles to compare formulation conditions.
- Translational Research: Connects in vitro shell disruption observations to in vivo vascular extravasation events via intravital multi-photon imaging.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable across microbubble formulations and ultrasound settings for portfolio-wide de-risking.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in drug release mechanisms through direct visualization of nanoparticle distribution and shell response.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility across microscopy modalities for cross-functional team alignment.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by enabling early mechanistic de-risking of ultrasound-triggered delivery systems.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of formulations based on quantifiable release kinetics and extravasation efficiency.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ultrasound physics, microscopy operation, and nanoparticle formulation handling.
- Depends on access to high-speed bright-field (10M fps) and fluorescence (500k fps) imaging systems coupled to arbitrary waveform generators.
- Necessitates standardization of sample preparation, dilution in PBS, and holder positioning to prevent artifacts across imaging sessions.
- Involves adaptation considerations for different microbubble shell compositions, nanoparticle types, and ultrasound frequencies.
- Involves practical limitations including microbubble stability during handling and the need for precise optical-acoustical alignment at all scales.
