Name: Produkcja dużej liczby sferoid guza o kontrolowanej wielkości przy użyciu płytek mikrodołkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-18T20:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Odkryj metodę produkcji dużej liczby jednorodnych sferoid guza o kontrolowanej wielkości przy użyciu płytek mikrodołkowych. Technika ta umożliwia równoczesne tworzenie tysięcy sferoid dla badań onkologicznych i biologii komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Uniwersytet w Calgary, w ramach grantu dla nowego badacza dla dr. Ungrina.

UWAGA: Płytki Microwell są dostępne w różnych formatach, w zależności od pożądanych rezultatów. Specyfikacje, jak również przybliżone wytyczne dotyczące minimalnej i maksymalnej liczby komórek, które powinny być używane w każdym formacie, przedstawiono w tabeli 1. Mniejsze mikrostudzienki zwężają się do ostrego punktu, a zatem nie ma dolnej granicy rozmiaru, chociaż zmienność między sferoidami staje się bardziej znacząca przy mniejszych rozmiarach. Rutynowa produkcja sferoid z zaledwie 20 komórek każda jest prosta8. Większy rozmiar mikrostudzienki nie jest w pełni zwężany, dlatego próby utworzenia sferoid z niewielkiej liczby komórek mogą skutkować wieloma mniejszymi sferoidami w każdej mikrostudzince. Ze względu na niewielkie różnice we właściwościach powierzchni, przygotowanie roztworem środka powierzchniowo czynnego (krok 1.2) nie jest opcjonalne w przypadku stosowania płytek AggreWell 400Ex.
Ten protokół opiera się na użyciu płytek AggreWell 400 - inne formaty znajdują się w Tabeli 1. Liczbę komórek, które należy załadować do każdej studzienki, określa się poprzez pomnożenie liczby zawartych w nim mikrostudzienek przez liczbę komórek, które mają być zgrupowane dla każdej sferoidy. Na przykład, aby wygenerować sferoidy z 1000 komórek każda, każda studzienka musi być załadowana (1,200 sferoidami razy 1,000 komórek każda = ) 1,2 x 106 komórek. Gęstość komórek należy obliczyć, biorąc pod uwagę, że komórki zostaną załadowane w objętości 0,4 ml. Tak więc dla przykładu sferoid utworzonych z 1000 komórek każda, 1,2 x 106 komórek w 0,4 ml przekłada się na gęstość 3 x 106 komórek na ml.
1. Przygotowanie mikrostudzienek do odbioru komórek
<ol>
	<li>Płytki mikrodołkowe są sterylne zgodnie z opisem i należy je wyjmować z opakowania wyłącznie w sterylnym środowisku, takim jak komora bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym. Sterylność powinna być zachowana przez cały czas trwania protokołu. W przypadku naruszenia sterylności, studzienki są ponownie sterylizowane przy użyciu 70% etanolu w wodzie, wykonując następujące opcjonalne czynności.
	<ol>
		<li>Dodać 0,5 ml 70% etanolu do każdej niewykorzystanej studzienki. Niektóre mikrostudzienki zatrzymują pęcherzyki powietrza, chociaż można to zmniejszyć, dodając płyn z jednej strony i pozwalając mu rozprzestrzenić się po powierzchni, zamiast upuszczać go pionowo na powierzchnię. Załóż pokrywę.</li>
		<li>Podczas gdy opary etanolu powinny szybko przenikać przez wszelkie pęcherzyki, jeśli jest ich dużo, pożądane może być ich usunięcie. Wirować przez 2 minuty przy 2 000 x g. Należy pamiętać, że ważne jest, aby upewnić się, że wirnik jest odpowiednio wyważony przy tej prędkości.</li>
		<li>Używając odwróconego mikroskopu o małym powiększeniu, sprawdź, czy pęcherzyki zostały usunięte z mikrostudzienek.</li>
		<li>Inkubować przez 5 minut pod przykryciem w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Aspirat etanolu. Płytkę można teraz umyć sterylną wodą lub PBS do natychmiastowego użycia lub wysuszyć na powietrzu do przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zapewnić, że komórki nie wchodzą w interakcje z powierzchnią mikrostudzienki, można ją przygotować przy użyciu środka powierzchniowo czynnego. Ogólnie rzecz biorąc, zaleca się wykonanie tego kroku na początku, a następnie porównanie sferoid wygenerowanych z mikrostudzienkami pokrytymi środkiem powierzchniowo czynnym i bez nich.
	<ol>
		<li>Dodać 0,5 ml roztworu płuczącego do każdej studzienki. Niektóre mikrostudzienki zatrzymują pęcherzyki powietrza, chociaż można to zmniejszyć, dodając płyn z jednej strony i pozwalając mu rozprzestrzenić się po powierzchni, zamiast upuszczać go pionowo na powierzchnię. Załóż pokrywę.</li>
		<li>Wirować przez 2 minuty przy 2,000 x g w celu usunięcia pęcherzyków. Należy pamiętać, że ważne jest, aby upewnić się, że wirnik jest odpowiednio wyważony przy tej prędkości.</li>
		<li>Używając odwróconego mikroskopu o małym powiększeniu, sprawdź, czy pęcherzyki zostały usunięte z mikrostudzienek.</li>
		<li>Inkubować przez co najmniej trzydzieści minut pod pokrywką w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Płytki mogą być przechowywane w temperaturze czterech stopni z roztworem środka powierzchniowo czynnego w studzienkach do czasu, gdy będą potrzebne, jeśli są odpowiednio zamknięte, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
		<li>Płytkę należy umyć sterylną wodą lub PBS bezpośrednio przed użyciem. Nie dopuścić do wyschnięcia płytek po nałożeniu powłoki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek
UWAGA: Szczegóły przygotowania komórek będą się nieco różnić w zależności od konkretnego typu badanej komórki. Zaobserwowaliśmy jednak, że warunki te są skuteczne w przypadku szerokiego zakresu komórek, w tym omawianych tutaj linii, a także ludzkich i mysich embrionalnych komórek macierzystych (ESC), ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), fibroblastów, przypuszczalnej pierwotnej endodermy i komórek zrębu. Inne grupy z powodzeniem wykorzystały ten system w szerokim zakresie zastosowań, w tym w chondrogenezie z mezenchymalnych komórek macierzystych9, standaryzowanym wytwarzaniu prekursorów nerwowych z pluripotencjalnych komórek macierzystych10, analizach toksykologicznych w hepatocytach11 i ocenie regeneracji rdzenia kręgowego u salamander12. Szczegółowy protokół pracy z komórkami HT29 jest pokazany tutaj.
<ol>
	<li>Zacznij od kolby T75 z komórkami HT29, hodowanymi w DMEM + 10% FBS</li>
	<li>Odessać pożywkę wzrostową z kolby i dodać 3 ml trypsyny.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zatrzymaj trawienie trypsyny, dodając 3 ml pożywki wzrostowej. Pobrać podwielokrotność do zliczania komórek i przenieść pozostałą część do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 200 x g.</li>
	<li>Podczas wirowania policz komórki.</li>
	<li>Odessać mieszaninę trypsyny/pożywki i zastąpić świeżą pożywką wzrostową, objętość określoną przez wymaganą gęstość komórek, jak obliczono powyżej.</li>
	<li>(OPCJONALNIE) Przepuścić zawiesinę komórek przez sitko w celu usunięcia wszelkich grudek. UWAGA: Warunki pobierania komórek będą się nieco różnić w zależności od linii. Jeśli dostępny jest protokół dysocjacji, na przykład do przekazywania komórek będących przedmiotem zainteresowania, należy go wykorzystać jako punkt wyjścia. W przypadku wrażliwych linii komórkowych stosowanie trypsyny może powodować nadmierną śmierć komórek. W tych przypadkach zaobserwowaliśmy dobre wyniki przy użyciu TrypLE jako alternatywnego odczynnika dysocjacyjnego8. Jeśli komórki zbrylą się podczas dysocjacji i stracą żywotność, dodanie DNAzy do roztworu enzymu może rozwiązać ten problem. Skrócenie czasu dysocjacji i zastosowanie etapu rozcierania w celu rozbicia grudek komórek może również zwiększyć żywotność.</li>
</ol>
3. Formacja sferoidalna
UWAGA: Sferoidy mogą być generowane w różnych formułach pożywki, jednak początkowe próby powinny być przeprowadzone przy użyciu pożywki, w której komórki były hodowane, aby odróżnić konsekwencje przejścia na 3-wymiarowy system hodowli od konsekwencji zmiany składu pożywki.
<ol>
	<li>Dodaj 0,4 ml pożywki wzrostowej do każdej studzienki.</li>
	<li>Wirować przez 2 minuty przy 2,000 x g w celu usunięcia pęcherzyków. Należy pamiętać, że ważne jest, aby przed wirowaniem upewnić się, że wirnik jest odpowiednio wyważony przy tej prędkości.</li>
	<li>Używając odwróconego mikroskopu o małym powiększeniu, sprawdź, czy pęcherzyki zostały usunięte z mikrostudzienek.</li>
	<li>Dodać 0,4 ml zawiesiny komórek o wymaganej gęstości (obliczonej powyżej). Delikatnie mieszać, pipetując w górę i w dół, bez wprowadzania pęcherzyków powietrza do mikrostudzienek. Ważne jest, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w całej studni, aby uzyskać spójne sferoidy.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 200 x g. Jeśli płytka nie wypoziomuje się samoczynnie podczas wirowania, mogą powstać prądy konwekcyjne, które powodują nierównomierne rozmieszczenie komórek w mikrostudzienkach. Dlatego płyta powinna być wyważona wewnętrznie, a także względem drugiej płyty, tak aby ciężar był równomiernie rozłożony po obu stronach nośnika płyty.</li>
</ol>
UWAGA: Jeśli widoczne są dowody na nierównomierne rozmieszczenie komórek, może być konieczne nałożenie niewielkiej ilości smaru na punkty obrotu na nośniku płyty - skonsultuj się z producentem wirówki w celu uzyskania instrukcji.
UWAGA: Po odwirowaniu komórek do mikrostudzienek, są one dość odporne na wymywanie przez drobne ruchy płytki. Należy unikać gwałtownych ruchów, które powodują chlupotanie podłoża, ale przeniesienie płytki z wirówki do mikroskopu lub inkubatora nie powinno spowodować znacznego przemieszczenia komórek.
<ol start="6">
	<li>Za pomocą odwróconego mikroskopu sprawdź, czy komórki skupiły się w mikrostudzienkach i czy są równomiernie rozmieszczone w studzience.</li>
	<li>Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Za pomocą odwróconego mikroskopu obserwuj proces powstawania sferoid. Niektóre linie komórkowe utworzą zwarte sferoidy w ciągu 24 godzin, inne mogą potrzebować więcej czasu. Progresję od klastra do agregacji w komórkach HT29 pokazano na rysunku 2.</li>
	<li>Odzyskaj sferoidy z mikrostudzienek i przenieś je do kultury zawiesinowej, delikatnie wypryskując je pipetą. Alternatywnie, utrzymuj sferoidy in situ z wymianą pożywki8 - czas trwania zależy od ich początkowej wielkości i tempa wzrostu, które określają czas, w którym wyrosną z mikrostudzienek, w których zostały uformowane.
	<ol>
		<li>Aby zastąpić pożywkę bez utraty sferoid, należy zassać pożywkę na krawędzi studzienki za pomocą pipety Pasteura. Powoli opuść końcówkę, aż zacznie wyciągać płyn z łąkotki i podążaj za łąkotką w dół, gdy opada. Następnie dodaj świeże podłoże do ściany studzienki w tym samym miejscu. Kilka sferoid może zostać utraconych, jednak jeśli podłoże jest zawsze zasysane i umieszczane w tej samej pozycji, liczba ta pozostanie mała w porównaniu z dużymi liczbami w studni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+An+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li>
<li>Sherar, M. D., Noss, M. B., Foster, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+backscatter+microscopy+images+the+internal+structure+of+living+tumour+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasound backscatter microscopy images the internal structure of living tumour spheroids.</a> Nature. 330 (6147), 493-495 (1987).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), 2720(2011).</li>
<li>Naber, H. P. H., Wiercinska, E., Ten Dijke, P., Van Laar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+Assay+to+Measure+TGF-%CE%B2-induced+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Spheroid Assay to Measure TGF-β-induced Invasion.</a> J. Vis. Exp. (57), e3337(2011).</li>
<li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Reproducible Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565(2008).</li>
<li>Bauwens, C. L., Song, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+control+of+cardiomyogenic+induction+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (15-16), 1901-1909 (2011).</li>
<li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., Ungrin, M. D., Zandstra, P. W., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+biomaterials+in+multicellular+aggregates+modulates+pluripotent+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Incorporation of biomaterials in multicellular aggregates modulates pluripotent stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 32 (1), 48-56 (2011).</li>
<li>Ungrin, M. D., Clarke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+bioprocess+design+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+endoderm+differentiation+based+on+cellular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109 (4), 853-866 (2012).</li>
<li>Markway, B. D., Tan, G. K., Brooke, G., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+chondrogenic+differentiation+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+low+oxygen+environment+micropellet+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Enhanced chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in low oxygen environment micropellet cultures.</a> Cell Transplantation. 19 (1), 29-42 (2010).</li>
<li>Kozhich, O., Hamilton, R., Mallon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+Generation+and+Differentiation+of+Neural+Precursor+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , 1-6 (2012).</li>
<li>Fey, S. J., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Drug+Toxicity+Using+3D+Spheroids+Constructed+from+an+Immortal+Human+Hepatocyte+Cell+Line%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Determination of Drug Toxicity Using 3D Spheroids Constructed from an Immortal Human Hepatocyte Cell Line.</a> Toxicological Sciences. , (2012).</li>
<li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+central+and+peripheral+nervous+system+during+salamander+tail+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the central and peripheral nervous system during salamander tail regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).</li>
<li>Butler, C. M., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Aggregate+Cohesion+by+Tissue+Surface+Tensiometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry.</a> J. Vis. Exp. (50), e2739(2011).</li>
<li>Xu, K., Buchsbaum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Mammary+Epithelial+Cells+from+Three-dimensional+Mixed-cell+Spheroid+Co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture.</a> J. Vis. Exp. (62), e3760(2012).</li>
<li>Baraniak, P. R., Cooke, M. T., Saeed, R., Kinney, M. A., Fridley, K. M., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffening+of+human+mesenchymal+stem+cell+spheroid+microenvironments+induced+by+incorporation+of+gelatin+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanical+Behavior+of+Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Stiffening of human mesenchymal stem cell spheroid microenvironments induced by incorporation of gelatin microparticles.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 11, 63-71 (2012).</li>
<li>Purpura, K. A., Bratt-Leal, A. M., Hammersmith, K. A., McDevitt, T. C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+engineering+of+3D+pluripotent+stem+cell+niches+to+guide+blood+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Systematic engineering of 3D pluripotent stem cell niches to guide blood development.</a> Biomaterials. , (2012).</li>
</ol>

Dr Ungrin jako wynalazca ma interes finansowy w technologii AggreWell.

Stworzyliśmy system, w którym duża liczba jednolitych sferoid może być generowana z wielu linii komórkowych z różnych źródeł. Nie spotkaliśmy się jeszcze z przylegającą linią komórkową, która nie tworzy sferoid w tych warunkach. Wcześniej obserwowaliśmy utratę komórek w populacjach podatnych na anoikis5,8, jednak do tej pory problem ten nie pojawił się w przypadku linii nowotworowych. System jest dowolnie skalowalny w zależności od powierzchni, z zachowaniem spójnym we wszystkich mikrodołkach w formacie 24- i 6-dołkowym, a także w prototypowych bioreaktorach zawierających 50 000 mikrodołków, z których każdy jest obecnie w fazie rozwoju.
Jeśli asymetria sferoidalna jest problemem, czas inkubacji opisany w kroku 4.8 może zostać wydłużony do dwóch lub trzech dni. Sferoidy mogą być również inkubowane przez pewien czas po ekstrakcji z mikrostudzienek w celu zwiększenia symetrii, jednak w tym przypadku należy zachować ostrożność, aby utrzymać wystarczająco niską gęstość hodowli, ponieważ sferoidy stykające się ze sobą często łączą się w większe struktury. Z tego powodu wcześniej utrzymywaliśmy kultury w mikrostudzienkach, w których powstały agregaty, przy czym głównym ograniczeniem był rozmiar sferoidy. To z kolei jest funkcją zarówno szybkości wzrostu, jak i początkowej wielkości8, a jeśli planowana jest rozszerzona hodowla w płytce mikrodołkowej, należy to rozważyć z wyprzedzeniem. Opcje zapobiegania przerostowi, jeśli do niego dojdzie, obejmują rozpoczęcie od mniejszych sferoid lub zastosowanie większych mikrodołków płytki AggreWell 800.
Jeśli sferoidy nie zwiększą swojej koherencji w czasie, jedną z potencjalnych przyczyn może być śmierć komórki. Szczególnie w większych skupiskach wysoce aktywnych metabolicznie komórek, ograniczenia transportu masy w dostarczaniu tlenu i niezbędnych składników odżywczych mogą skutkować nekrotycznym rdzeniem2 - tak więc niespoiste sferoidy mogą być po prostu konsekwencją nadmiernej śmierci komórki. Alternatywnie, pomiary kohezji mechanicznej sferoid zostały wykorzystane do oceny międzykomórkowych sił wiązania w odniesieniu do potencjału przerzutowego danej linii komórkowej13. Interesujące byłoby zbadanie związku między kształtem sferoidalnym a potencjałem przerzutowym, być może przy użyciu parametrów morfometrycznych, takich jak okrągłość i stosunek obwodu do powierzchni.
Oprócz badania właściwości mechanicznych i morfometrycznych sferoid, montaż w systemie mikrostudzienki pozwala na produkcję sferoid o mieszanym składzie na dużą skalę, składających się z kombinacji wielu typów komórek i / lub biomateriałów6,7. Interakcje komórek nowotworowych z innymi typami komórek są ważne dla dokładniejszego modelowania zachowania nowotworów in vivo14, dlatego interesujące może być generowanie sferoid z komórek nowotworowych w połączeniu na przykład z fibroblastami i komórkami śródbłonka. Mikrocząstki różnych biomateriałów mogą być również włączane i mogą wpływać na właściwości sferoidalne zarówno bezpośrednio poprzez ich interakcje z komórkami7,15, jak i jako rezerwuary kontrolowanego uwalniania czynników wzrostu i cytokin do wnętrza sferoidy16.
Jeśli istnieje jakakolwiek obawa co do sterylności, na przykład podczas pracy z płytką mikrodołkową, w której wcześniej używano niektórych studzienek, które mogły spędzić trochę czasu w inkubatorze w ramach poprzedniego eksperymentu, studzienki można ponownie wysterylizować przy użyciu 70% etanolu w wodzie.
Po uformowaniu sferoid można je również oddzielić od pozostałych komórek nieinkorporowanych, przepuszczając zawiesinę przez sitko do komórek. Poszczególne komórki przejdą, podczas gdy sferoidy zostaną zachowane. Jeśli istnieje podejrzenie, że sferoida wydziela komórki potencjalnie przerzutowe w trakcie hodowli, pożądane może być wielokrotne wykonanie tej procedury - początkowo w celu usunięcia komórek nieinkorporowanych, a następnie w celu wyizolowania oczyszczonych populacji komórek wydzielanych przez sferoidy.

Istnieje coraz więcej dowodów na to, że komórki nowotworowe zachowują się inaczej w kulturach trójwymiarowych niż podczas hodowli na plastiku, oraz że środki terapeutyczne zidentyfikowane na konwencjonalnych platformach hodowli tkankowej mogą stracić skuteczność po przejściu do bardziej fizjologicznie istotnego systemu1. Dlatego pożądane jest zbadanie zachowania komórek nowotworowych w tych warunkach, zarówno w celu uzyskania wglądu w ich biologię, jak i w celu zwiększenia wskaźnika sukcesu w przenoszeniu nowych środków terapeutycznych z placówki przesiewowej do kliniki. Jeden z użytecznych systemów modelowych o długiej historii wykorzystuje trójwymiarowe klastry komórek nowotworowych znane jako sferoidy nowotworowe1,2. Idealnie byłoby, gdyby techniki tworzenia sferoidów pozwoliły na produkcję dużej liczby jednorodnych sferoid, których rozmiar i skład są kontrolowane przez eksperymentatora. Podczas gdy podejścia wiszące i studzienne3,4 są w stanie spełnić niektóre z tych wymagań, przepustowość jest na ogół ograniczona, a generowanie dużej liczby sferoid staje się pracochłonnym zadaniem.
Niedawno opracowaliśmy system do rozwiązywania podobnych problemów w dziedzinie medycyny regeneracyjnej5. Wykorzystując wymuszoną agregację w szeregu gęsto upakowanych studzienek w skali mikronowej (patrz rysunek 1), podejście to pozwala na generowanie sferoid z dowolnej liczby komórek, w tym mieszanin wielu typów komórek6, a także na wprowadzanie różnych biomateriałów7. Sferoidy powstają w dużych ilościach - od tysięcy do setek tysięcy lub więcej - i mogą być natychmiast ekstrahowane lub utrzymywane w mikrostudzienkach, w których zostały utworzone, z wymianą pożywki przez co najmniej jeden od8 do dwóch (niepublikowana obserwacja) tygodni. System ten jest zatem dobrze przystosowany do generowania dużej liczby jednorodnych i odtwarzalnych sferoid nowotworowych w celu oceny skuteczności nowych środków przeciwnowotworowych lub podstawowych badań biologicznych.

<table><tbody><tr><td>Płytka AggreWell 400</td><td>firmy StemCell Technologies Inc.</td><td>27845/27945</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do płukania</td><td>StemCell Technologies Inc.</td><td>07010</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek (37 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa3d-bddd-2a36-2ae1901f1604" style="font-size:15px; rodzina czcionek:Arial; Kolor:#000000; kolor tła:#ffffff; grubość czcionki:normalna; styl czcionki:normalny; wariant czcionki:normalny; dekoracja tekstu: brak; wyrównanie w pionie:linia bazowa; ">&mikro; m)</td><td>StemCell Technologies Inc.</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR / LONZA</td><td>CA12001-676</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-Versene (EDTA)</td><td>VWR / LONZA</td><td>CA12001-660</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR / LONZA</td><td>CA12002-212</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR / LONZA</td><td>CA-95042-112</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen / Life Technologies</td><td>12605010</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>VWR / Motic</td><td>Wirówka CA19000-610</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X15R z nośnikami do standardowych płytek studziennych</td><td>VWR / Beckman</td><td>CABKA99465, CABK369704, CABK392806</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym</td><td>ESBE / Baker</td><td>BKR-SG603AHEUVSP</td><td></td></tr></tbody></table>

produkcja dużej liczby sferoid guza o kontrolowanej wielkości przy użyciu płytek mikrodołkowych

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Sferoidy nowotworowe są coraz częściej uznawane za ważny model in vitro dla zachowania komórek nowotworowych w trzech wymiarach. Bardziej fizjologicznie istotne niż konwencjonalne hodowle z przylegającymi arkuszami, dokładniej podsumowują złożoność i interakcje obecne w prawdziwych nowotworach. Aby wykorzystać ten model do lepszej oceny biologii nowotworów lub skuteczności nowych środków terapeutycznych, konieczne jest generowanie sferoidów w sposób powtarzalny, kontrolowany i w znacznej liczbie.
System AggreWell składa się z zestawu mikrostudzienek o dużej gęstości w kształcie piramidy, do których odwirowywana jest zawiesina pojedynczych komórek. Liczba komórek grupujących się na dnie każdej mikrostudzienki oraz liczba i stosunek różnych typów komórek zależą tylko od właściwości zawiesiny wprowadzonej przez eksperymentatora. W ten sposób jesteśmy w stanie generować sferoidy guza o dowolnej wielkości i składzie bez konieczności modyfikowania podstawowej technologii platformy. Setki mikrostudzienek na centymetr kwadratowy powierzchni hodowli zapewniają z kolei osiągnięcie niezwykle wysokich poziomów produkcji w prostym, niepracochłonnym procesie. Dlatego spodziewamy się, że protokół ten będzie szeroko przydatny dla badaczy zajmujących się sferoidalną dziedziną nowotworów.

Sferoidy z wielu linii nowotworowych o różnym pochodzeniu anatomicznym mogą być łatwo generowane i przenoszone do hodowli w zawiesinie. Rycina 3 ilustruje spójną kontrolę wielkości uzyskiwalną za pomocą tej metody, z wysoce jednorodnymi populacjami sferoidów w każdym z warunków. Widoczne są również wyraźne różnice w zachowaniu między liniami: komórki raka jelita grubego HT29 oraz komórki raka przełyku TE6 tworzyły gęsto upakowane sferoidy o ostro zarysowanych granicach, podczas gdy komórki raka prostaty LNCaP dawały sferoidy o mniejszej spójności i nieregularnych granicach (możliwe przyczyny opisano w sekcji Dyskusja). Silniejsze siły wewnętrzne w bardziej spójnych agregatach doprowadziły również do zapadnięcia się do formy bardziej symetrycznej jeszcze w mikrodofkach, w których powstały, podczas gdy agregaty LNCaP, szczególnie o większym rozmiarze, wyraźnie zachowują kwadratowo-piramidalną geometrię mikrodofek. Zależność między liczbą wprowadzonych komórek a fizyczną wielkością powstałego sferoidu będzie zależeć od szeregu zmiennych. Objętości teoretyczne, oparte na iloczynie objętości jednej komórki i liczby użytych komórek, mogą być zmniejszone przez utratę komórek, co z kolei może obejmować utratę komórek na etapie przygotowania zawiesiny jednokomórkowej, a także utratę z nadmiernie małych agregatów z powodu niewystarczającej liczby sąsiednich komórek oraz z nadmiernie dużych agregatów z powodu ograniczeń w transporcie i martwicy w jądrze. Na wielkość będzie wpływać również jakakolwiek proliferacja, która może wystąpić podczas procesu agregacji. Ponieważ parametry te będą różnić się w zależności od linii komórkowej, w przypadku chęci uzyskania sferoidów o określonych wymiarach fizycznych, odpowiednią liczbę wprowadzanych komórek należy ustalić eksperymentalnie. Jako pierwsze przybliżenie można założyć, że średnica sferoidu będzie wzrastać proporcjonalnie do pierwiastka trzeciego stopnia z liczby włączonych komórek – np. 8-krotny wzrost liczby komórek powinien skutkować dwukrotnym zwiększeniem średnicy sferoidu.
<img alt="Układ nanostrukturalnej siatki z procesem osadzania nanocząsteczek; schemat metody wytwarzania." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat produkcji sferoidów. System mikrowycieków składa się z macierzy gęsto rozmieszczonych mikrowycieków o kształcie ostrosłupa kwadratowego (625 na cm2 dla rozmiaru 400 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa35-f9c7-69a1-8c5aa197db53" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">µm), do których można wirować komórki. Komórki są gromadzone przez skośne ściany boczne, a rozmiar powstałego sferoidu jest kontrolowany poprzez zmianę gęstości zastosowanej zawiesiny komórkowej.
<img alt="Analiza mikrostrukturalna; obrazy SEM pokazujące przejścia wzorów w krystalografii materiałów." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Agregacja skupisk komórek w sferoidy. Sferoidy utworzono z siedmiuset komórek HT29 każda. Bezpośrednio po wirowaniu (A) komórki tworzą luźne skupiska na dnie każdego mikrodobka. Należy zauważyć, że w tym przypadku skupiska są jednolicie przesunięte w prawy dolny róg. Jest to dopuszczalne, pod warunkiem że wielkość skupisk pozostaje spójna w całej matrycy. Jeśli zaobserwowane zostaną znaczące różnice w wielkości skupisk między jedną a drugą stroną matrycy, należy zapoznać się z Uwagą w kroku 3.5. Po inkubacji przez 24 hr (B) międzykomórkowe siły adhezyjne spowodowały agregację skupisk i utworzenie spójnych sferoidów, które mogą zostać następnie wyekstrahowane (C).
<img alt="Mikroskopia agregatów komórkowych, skala szarości, ocena kohezji komórkowej, wyniki eksperymentalne." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Sferoidy wygenerowane w płytkach z mikrodofkami. Sferoidy utworzono z siedmiuset (A, C, E) lub tysiąca pięciuset (B, D, F) komórek raka jelita grubego HT29 (A, B), komórek raka prostaty LNCaP (C, D) lub komórek raka przełyku TE6 (E, F). Należy zwrócić uwagę na jednolitość sferoidów w obrębie jednej preparacji, a także na różnice między liniami komórkowymi – w szczególności na luźne agregaty LNCaP w porównaniu do bardziej gęsto upakowanych komórek HT29 i TE6. Pasek skali reprezentuje 200 μm.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Format mikropłytek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>AggreWell 400</td>
			<td>AggreWell 40EX</td>
			<td>AggreWell 800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szerokość mikrododatku (<span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa38-43ed-6004-6ff57626f41a" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">µm)</td>
			<td>400</td>
			<td>400</td>
			<td>800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba mikrododatków na cm2</td>
			<td>625</td>
			<td>625</td>
			<td>156.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba mikrodofków na dołek</td>
			<td>1,200</td>
			<td>4,700</td>
			<td>300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimalna liczba komórek na mikrodopalec*</td>
			<td>Nie dotyczy</td>
			<td>Nie dotyczy</td>
			<td>2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maksymalna liczba komórek na mikrodopalec*</td>
			<td>2,000</td>
			<td>2,000</td>
			<td>10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimalna liczba komórek na dołek*</td>
			<td>Nie dotyczy</td>
			<td>Brak danych</td>
			<td>6 x 105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maksymalna liczba komórek na dołek*</td>
			<td>2,4 x 106</td>
			<td>9,4 x 106</td>
			<td>3 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1.1 - Objętość 70% etanolu (ml)</td>
			<td>0.5</td>
			<td>2.0</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2.1 - Objętość roztworu płuczącego (ml)</td>
			<td>0.5</td>
			<td>2.0</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 - Objętość preloadu medium (ml)</td>
			<td>0.4</td>
			<td>1.6</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 - Objętość załadowanych komórek (ml)</td>
			<td>0.4</td>
			<td>1.6</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">*Liczba komórek na mikrodopalec jest jedynie wartością przybliżoną, ponieważ zależy ona od wielkości zastosowanych komórek i powinna zostać określona empirycznie</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Opcje AggreWell i modyfikacje protokołu.

Wprowadzamy protokół generowania dużych liczb (od tysięcy do setek tysięcy) sferoid guza o jednakowej wielkości i składzie, używając dostępnych na rynku płytek mikrodołkowych.

Produkcja dużej liczby sferoid guza o kontrolowanej wielkości przy użyciu płytek mikrodołkowych

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wygenerowanie dużej liczby jednorodnych, kontrolowanych rozmiarowo sferoidów nowotworowych. Osiąga się to poprzez przygotowanie w pierwszej kolejności płytek z mikrootworami w celu zagrupowania komórek, z których mają powstać sferoidy. W drugim kroku przeprowadza się zbiór hodowli pożądanego typu komórek, co pozwala uzyskać zawiesinę komórkową determinującą rozmiar i skład organoidów (OIDs).Następnie zawiesinę komórkową wiruje się do mikrodofków i inkubuje, aby umożliwić formowanie się sferoidów. Po inkubacji otrzymane sferoidy są wysoce jednorodne i mogą być zbierane lub hodowane w mikrodofkach, w których powstały. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest możliwość jednoczesnego wytworzenia bardzo dużej liczby jednolitych agregatów.Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą zauważyć duże różnice w wielkości paliwa. Ważne jest, aby upewnić się, że zawiesina komórek jest równomiernie rozłożona na płytce oraz że ruchome uchwyty płytek w centralnej wirówce poruszają się swobodnie, tak aby siła była prostopadła do powierzchni. W celu rozpoczęcia przygotuj sterylną płytkę agro well 400, dodając 0,5 milliliters roztworu płuczącego zawierającego surfaktant do każdego dołka.Zastosowanie surfaktantu zapewnia, że komórki nie wchodzą w interakcje z powierzchnią mikrootworów. Aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza w mikrootworach, należy dodawać ciecz z jednej strony i pozwolić jej rozprzestrzenić się po powierzchni, zamiast nanosić ją pionowo w dół. Po dodaniu roztworu do otworów należy założyć pokrywkę.Przed wirowaniem płytek przez dwie minuty przy 2000 ×g należy upewnić się, że wirnik jest odpowiednio zrównoważony. Aby usunąć pęcherzyki powietrza, należy zweryfikować ich brak w mikrodofkach za pomocą inwertowanego mikroskopu o małym powiększeniu. Płytkę należy inkubować przez co najmniej 30 minut z zamkniętą pokrywą w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Bezpośrednio przed użyciem należy odessać roztwór płuczący z dofków i przemyć płytkę sterylną wodą lub PBS.Po kodowaniu nie wolno dopuścić do wyschnięcia płytek. Szczegóły przygotowania komórek będą się różnić w zależności od badanego typu komórek. Zaobserwowaliśmy jednak, że warunki te są skuteczne dla szerokiego zakresu komórek, w tym dla linii omówionych w niniejszym opracowaniu, a także dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych neuronów, ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, fibroblastów, domniemanych pierwotnych komórek endodermy oraz komórek zrębu. Aby przygotować komórki, należy zacząć od kolby T 75 z komórkami HT 29.Odssać pożywkę wzrostową z kolby i dodać trzy mililitry trypsyny. Inkubować komórki przez pięć minut w temperaturze 37 °C. Zatrzymać trawienie trypsyną poprzez dodanie trzech mililitrów pożywki wzrostowej.Przenieś pozostałą część do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Następnie z probówki 15 ml pobierz alikwot do zliczenia komórek. Wiruj komórki przez pięć minut przy 200 ×g.Policz komórki. Następnie odessaj mieszaninę medium z trypsyną i zastąp ją świeżym medium wzrostowym w objętości określonej przez wymaganą gęstość komórek, obliczoną wcześniej zgodnie z opisem w protokole tekstowym jako krok opcjonalny.Przefiltruj zawiesinę komórkową przez sitko w celu usunięcia grudek. Sferoidy można generować w różnych składach pożywki, jednak wstępne próby należy przeprowadzić z użyciem pożywki, w której hodowano komórki. Aby odróżnić skutki przejścia na trójwymiarowy system hodowli od skutków zmiany składu pożywki, zacznij od dodania 0,4 milliliters pożywki wzrostowej do każdej studni, a następnie wiruj przez dwie minuty przy 2000 ×g. W celu usunięcia pęcherzyków powietrza, przy użyciu mikroskopu odwróconego z małym powiększeniem, sprawdź, czy pęcherzyki zostały usunięte z mikrostudni.Następnie do mikrodofków należy dodać 0,4 milliliters zawiesiny komórkowej o wymaganym zagęszczeniu. Następnie delikatnie wymieszać zawartość, pipetując w górę i w dół, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do mikrodofków, i upewnić się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w całym dofku. Ma to na celu uzyskanie spójnych wyników poziomu steroidów.Wiruj płytkę przez pięć minut przy 200 ×g. Płytka musi być zbalansowana wewnętrznie oraz względem drugiej płytki, aby ciężar był rozłożony równomiernie po obu stronach uchwytu na płytki. Zapewnia to samopoziomowanie płytki podczas wirowania, co zapobiega powstawaniu prądów konwekcyjnych i nierównomiernemu rozmieszczeniu komórek w mikrodofkach.Za pomocą mikroskopu odwróconego należy sprawdzić, czy komórki zgromadziły się w mikrowydłużeniach i czy są równomiernie rozłożone wewnątrz wgłębienia przed inkubacją komórek przez noc w temperaturze 37 °C. Proces tworzenia się sferoidów należy obserwować za pomocą mikroskopu odwróconego. Niektóre linie komórkowe utworzą zwarte sferoidy w ciągu 24 godzin.W innych przypadkach proces ten może trwać dłużej. Przedstawiono tutaj progresję od klastra do agregatu w komórkach HT 29. Najtrudniejszą częścią tej procedury jest wyjęcie steroidów z wnętrza bez naruszania struktur. Aby wyekstrahować sferoidy z mikrootworów, należy bardzo delikatnie pipetować ciecz w górę i w dół, pozwalając sferoidom wypłynąć z mikrootworów.Następnie przechyl płytkę, aby odessać mieszaninę medium i steroidów. W przypadku większych steroidów należy używać końcówek do pipet o szerokim otworze, aby uniknąć ich uszkodzenia. Po odzyskaniu steroidów z mikrododatków należy przenieść je do hodowli zawiesinowej, delikatnie wypłukując je za pomocą pipety.Alternatywnie, silnie rosnące róże można utrzymywać w pułapkach poprzez wymianę pożywki. Czas trwania zależy od początkowej wielkości oraz tempa wzrostu, co określa moment, w którym przekroczą one rozmiar mikrodofków. Projektowano je tak, aby umożliwiały wymianę pożywki bez utraty steroidów.Odssać pożywkę z krawędzi dołka. Używając pipety Pasteura, powoli obniżać końcówkę, aż zacznie pobierać ciecz z menisku, i podążać za opadającym meniskiem. Następnie dodać świeżą pożywkę, kierując strumień w stronę ścianki dołka w tym samym miejscu.Podczas dodawania świeżej pożywki należy delikatnie naciskać pipetę i trzymać końcówkę przy ściance, aby uniknąć zaburzenia PHE w mikroszybkach. Może dojść do utraty niewielkiej ilości steroidów. Jeśli jednak pożywka jest zawsze odsysana i zastępowana w tym samym miejscu, liczba ta pozostanie niewielka.W porównaniu do dużych liczb w studni, steroidy z wielu linii nowotworowych o różnym pochodzeniu anatomicznym mogą być łatwo ekstrahowane do zawiesiny. Spójna kontrola wielkości uzyskiwalna za pomocą tej metody została tutaj zademonstrowana przy użyciu wysoce jednorodnych populacji steroidów. W każdym z warunków utworzono 700 lub 1 500 komórek.Wyraźne różnice międzyliniowe w zachowaniu są widoczne również w przypadku komórek raka jelita grubego HT 29 oraz komórek raka przełyku TE six, które tworzą gęsto upakowane sferoidy o ostro zdefiniowanych granicach. Przeciwnie, komórki raka prostaty lin cap dają początek mniej spójnym sferoidom o nieregularnych granicach. Silniejsze siły wewnętrzne w bardziej spójnych agregatach doprowadziły również do zapadnięcia się do bardziej symetrycznej formy, nawet podczas przebywania w mikrododatkach, w których zostały utworzone.Jednakże agregaty czapki liniowej, szczególnie te o większym rozmiarze, widocznie zachowują kwadratową geometrię parametalną mikrododatków. Po opanowaniu techniki proces ten można przeprowadzić w około godzinę, doliczając okres inkubacji niezbędny do adhezji komórek i wydzielania płynów. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że pęcherzyki powietrza nie przemieszczają się przez mikrododatki przed dodaniem komórek.

production-large-numbers-size-controlled-tumor-spheroids-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Produkcja dużej liczby kontrolowanych pod względem wielkości sferoidów guzowych przy użyciu płytek mikrodołkowych

Ten protokół opisuje system przeszczepiania komórek za pomocą genetycznie modyfikowanych, wstrzykiwanych sferoidów. Sferoidy komórkowe są hodowane na mikrowzorcach i odzyskiwane po wprowadzeniu genów za pomocą nanomiceli polipleksowych. System ten ułatwia przedłużoną ekspresję transgenu z przeszczepionych komórek u zwierząt gospodarza, przy jednoczesnym zachowaniu wrodzonej funkcji komórek.

Transfekcja genów w kierunku komórek sferoidalnych na mikromodelowanych płytkach hodowlanych do genetycznie modyfikowanego przeszczepu komórek

Przedstawiono protokół do zrobotyzowanego drukowania sferoid komórek rakowych na wysokoprzepustowej 96-dołkowej płytce przy użyciu wodnego systemu dwufazowego.

Zrobotyzowana produkcja sferoid komórek rakowych z wodnym dwufazowym systemem do testowania leków

Identyfikacja nowych celów leków, które przechodzą od testów przedklinicznych do badań na ludziach, jest priorytetem naukowym. W tym celu opisujemy tutaj podejście genomiki funkcjonalnej do badania wpływu wyczerpania genów na sferoidy linii komórek nowotworowych, które bardziej odpowiednio modelują nowotwory u ludzi in vivo.

Wykorzystanie badań przesiewowych genomiki funkcjonalnej do identyfikacji potencjalnie nowych celów leków w hodowlach sferoidalnych komórek nowotworowych

Tutaj opisujemy szybki i elastyczny protokół tworzenia sferoid 3D komórek poprzez agregację komórek. Można go łatwo dostosować do wielu typów komórek i nadaje się do stosowania w różnych zastosowaniach, w tym w testach migracji komórek, inwazji lub anoikis, a także do obrazowania i ilościowego określania interakcji komórka-macierz.

Wydajna i elastyczna metoda agregacji komórek do produkcji sferoidów 3D

Ten manuskrypt przedstawia solidną metodę wytwarzania wklęsłych mikrostudzienek bez potrzeby skomplikowanych, kosztownych urządzeń. Wykorzystując siłę magnetyczną, stalowe kulki i układ otworów przelotowych, uformowano kilkaset mikrostudzienek w podłożu z polidimetylosiloksanu (PDMS) o wymiarach 3 cm x 3 cm.

Sparowany układ ściegów i magnesów do formowania mikrostudzienek o zmiennej geometrii wklęsłej

W szerokim zakresie wskazań chorobowych, bardziej fizjologicznie istotne modele są opracowywane i wdrażane do programów odkrywania leków. Opisany tutaj nowy system modelowy pokazuje, w jaki sposób trójwymiarowe sferoidy nowotworowe mogą być hodowane i badane przesiewowo w wysokowydajnym systemie opartym na płytkach 1536-dołkowych w celu poszukiwania nowych leków onkologicznych.

Generowanie wysokoprzepustowych trójwymiarowych sferoid nowotworowych do badań przesiewowych leków

Obecny protokół opisuje technikę wytwarzania sferoidów tkankowych na dużą skalę przy użyciu wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel.

Generowanie sferoid tkankowych za pomocą wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel

Ten artykuł demonstruje ustandaryzowaną metodę konstruowania trójwymiarowych sferoid nowotworowych. Opisano również strategię obserwacji sferoidy i analizy głębokiego uczenia opartego na obrazach przy użyciu zautomatyzowanego systemu obrazowania.

Generowanie sferoid 3D guza do badań oceny leków

Tutaj prezentujemy protokół, który umożliwia szybką, solidną i tanią produkcję sferoid nowotworowych, a następnie enkapsulację hydrożelową. Ma szerokie zastosowanie, ponieważ nie wymaga specjalistycznego sprzętu. Byłoby to szczególnie przydatne do badania interakcji sferoida-matryca oraz budowania modeli fizjologii lub patologii tkanek in vitro.

Wytwarzanie i enkapsulacja sferoidów nowotworowych w hydrożelach glikolu polietylenowego do badania oddziaływań sferoida-matryca

Tutaj opisujemy różne metody tworzenia wielokomórkowych sferoidów, aby przeprowadzić następczą wieloparametrową mikroskopię żywych komórek. Wykorzystując mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM), autofluorescencję komórkową, barwniki barwiące i nanocząstki, przedstawiono podejście do analizy metabolizmu komórkowego, niedotlenienia i śmierci komórki w żywych trójwymiarowych (3D) nowotworach i sferoidach pochodzących z komórek macierzystych.

Produkcja i wieloparametrowa mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji żywych komórek (FLIM) sferoid wielokomórkowych

To badanie przedstawia opłacalną i efektywną metodologię generowania struktur komórkowych 3D za pomocą systemu opartego na stemplach do tworzenia mikrostudzienek w formach agarozowych. System sprzyja tworzeniu się jednolitych sferoidów/organoidów, poprawiając w ten sposób interakcje komórkowe. Takie podejście zmniejsza zmienność eksperymentalną i wspiera zastosowania w testowaniu leków i inżynierii tkankowej.

Generowanie trójwymiarowych sferoidów/organoidów z dwuwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu nowatorskiego urządzenia do stemplowania

Odkryj metodę produkcji dużej liczby jednorodnych sferoid guza o kontrolowanej wielkości przy użyciu płytek mikrodołkowych. Technika ta umożliwia równoczesne tworzenie tysięcy sferoid dla badań onkologicznych i biologii komórkowej.

Produkcja dużej liczby sferoid guza o kontrolowanej wielkości przy użyciu płytek mikrodołkowych

Przeglądaj więcej filmów