Produkcja dużej liczby sferoid guza o kontrolowanej wielkości przy użyciu płytek mikrodołkowych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wygenerowanie dużej liczby sferoid guza o kontrolowanych rozmiarach o jednolitym rozmiarze. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie płytek mikrodołkowych w celu zgrupowania komórek, które mają zostać uformowane w sterydy. W drugim etapie pobierana jest hodowla pożądanego typu komórek, która zapewnia zawiesinę komórkową, która określa wielkość i skład OID.

Zawiesina komórkowa jest następnie odwirowywana do mikro studzienek i inkubowana, aby umożliwić utworzenie się steroidu Po inkubacji. Powstałe steroidy są wysoce jednorodne i mogą być zbierane lub hodowane w mikrostudzienkach, w których zostały utworzone. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że jednocześnie można wytwarzać bardzo dużą liczbę jednorodnych agregatów.

Osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, mogą stwierdzić, że ich paliwo jest bardzo duże. Ważne jest, aby upewnić się, że zawiesina ogniw jest równomiernie rozłożona na płycie, a wahadłowe nośniki płyt w centralnym Fuge poruszają się swobodnie, tak aby siła była prostopadła do powierzchni. Na początek przygotuj sterylną płytkę agro well 400, dodając do każdej studzienki 0,5 mililitra roztworu płuczącego zawierającego środek powierzchniowo czynny.

Stosowanie środka powierzchniowo czynnego zapewnia, że komórki nie wchodzą w interakcje z powierzchnią mikrostudzienki. Aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza w mikrostudzienkach, dodaj płyn z jednej strony i pozwól mu rozprzestrzenić się po powierzchni, zamiast upuszczać go pionowo na powierzchnię. Po dodaniu roztworu do studzienek załóż pokrywkę.

Upewnij się, że wirnik jest odpowiednio wyważony przed odwirowaniem płytek przez dwie minuty 2000 razy G.To usunąć pęcherzyki za pomocą mikroskopu odwróconego o małym powiększeniu, sprawdź, czy pęcherzyki zostały usunięte z mikrodołków. Inkubować płytkę przez co najmniej 30 minut pod przykryciem w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Bezpośrednio przed użyciem odessać roztwór płuczący ze studzienek i umyć płytkę sterylną wodą lub PBS.

Nie dopuścić do wyschnięcia płytek po zakodowaniu. Szczegóły przygotowania komórek będą się różnić w zależności od konkretnego typu badanej komórki. Jednak zaobserwowaliśmy, że ten warunek jest skuteczny dla szerokiego zakresu komórek, w tym linii, które tutaj omówiliśmy, a także ludzkich i neuronalnych embrionalnych komórek macierzystych, ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, fibroblastów, przypuszczalnych, prymitywnych komórek endonowych i komórek zrębu Aby przygotować komórki, zacznij od kolby T 75 komórek HT 29.

Odessać pożywkę wzrostową z kolby i dodać trzy mililitry trypsyny. Inkubować komórki przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zatrzymaj trawienie trypsyny, dodając trzy mililitry pożywki wzrostowej.

Pozostałą część przenieś do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie z 15-mililitrowej probówki weź porcję do liczenia komórek. Odwirowywać komórki przez pięć minut w temperaturze 200 razy G podczas wirowania.

Policz komórki. Następnie odessaj mieszaninę pożywki próbnej i zastąp ją świeżym wzrostem. Pożywka o objętości określonej przez wymaganą gęstość komórek obliczoną wcześniej zgodnie z opisem w protokole tekstowym jako krok opcjonalny.

Przepuścić zawiesinę komórkową przez sitko w celu usunięcia wszelkich grudek. Sferoidy mogą być wytwarzane w różnych preparatach pożywki, jednak wstępne próby należy przeprowadzić przy użyciu pożywki, w której hodowano komórki. Aby odróżnić konsekwencje przejścia do trójwymiarowego systemu hodowli od konsekwencji zmiany składu pożywki, zacznij od dodania 0,4 mililitra pożywki wzrostowej do każdej odwirówki studzienkowej przez dwie minuty po 2000 razy G.To usuń pęcherzyki za pomocą odwróconego mikroskopu o małym powiększeniu, sprawdź, czy pęcherzyki zostały usunięte z mikrostudzienek.

Następnie dodaj 0,4 mililitra zawiesiny komórek o wymaganej gęstości do mikrostudzienek. Następnie delikatnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół bez wprowadzania pęcherzyków powietrza do mikrostudzienek, upewnij się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w całym dołku. Aby uzyskać spójne sterydy.

Odwirować płytkę przez pięć minut 200 razy. G, płyta musi być wyważona wewnętrznie, jak również względem drugiej płyty, tak aby ciężar był równomiernie rozłożony na obie strony nośnika płyty. Gwarantuje to, że płytka samoczynnie poziomuje się podczas wirowania, dzięki czemu nie powstają prądy konwekcyjne i nie powodują nierównomiernego rozmieszczenia komórek w mikrodołkach.

Za pomocą odwróconego mikroskopu sprawdź, czy komórki skupiły się w mikrostudzienkach i czy są równomiernie rozmieszczone w studzience przed inkubacją komórek przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Obserwuj proces powstawania sferoidy za pomocą odwróconego mikroskopu. Niektóre linie komórkowe utworzą zwarty steryd w ciągu 24 godzin.

W innych może to potrwać dłużej. Progresja od klastra do agregacji w komórkach HT 29 jest pokazana tutaj. Najtrudniejszą częścią tej procedury jest wyjęcie sterydów intex bez naruszania struktur Aby wydobyć sterydy z mikrostudzienek, pipetuj bardzo delikatnie w górę iw dół, aby sferoidy mogły wydostać się z mikro studzienek.

Następnie przechylić płytkę, aby zassać pożywkę steroidową. Użyj końcówek pipet z szerokim otworem dla sterydów o większym rozmiarze, aby uniknąć rozbicia sterydów. Po odzyskaniu sterydów z mikrostudzienek, przenieś do kultury zawiesiny, delikatnie wypryskując je pipetą.

Alternatywnie, ciężka róża może być utrzymana w napadzie za pomocą średniej wymiany. Czas trwania zależy od początkowej wielkości i tempa wzrostu, które określa czas, w którym wyrosną z mikrostudzienek. Cóż, zostały one utworzone W celu zastąpienia podłoża bez utraty sterydów.

Zassać pożywkę na krawędzi studzienki. Za pomocą pipety pastwiskowej powoli opuść końcówkę, aż zacznie pobierać płyn z łąkotki i podążaj za łąkotką w dół, gdy opada. Następnie dodaj świeże podłoże do ściany studzienki w tym samym miejscu.

Podczas dodawania świeżej pożywki należy pamiętać, aby delikatnie docisnąć pipeter i przytrzymać końcówkę przy ściance, aby uniknąć zakłóceń PHE w mikrostudzienkach. Kilka sterydów może zostać utraconych. Jeśli jednak podłoże jest zawsze zasysane i wymieniane w tej samej pozycji, liczba ta pozostanie niewielka.

W porównaniu do dużych liczb w studni, sterydy z wielu linii nowotworowych o różnym pochodzeniu anatomicznym mogą być łatwo ekstrahowane do zawiesiny. Konsekwentna kontrola wielkości, którą można uzyskać za pomocą tej metody, jest tutaj wykazana w przypadku wysoce ujednoliconych populacji steroidów. W każdym stanie utworzono z 700 lub 1 500 komórek.

Wyraźne różnice międzyliniowe w zachowaniu są również widoczne w komórkach raka jelita grubego HT 29 i komórkach raka przełyku TE sześć tworzących gęsto upakowane steroidy o ostro zdefiniowanych granicach. I odwrotnie, komórki raka prostaty typu lin cap powodują powstawanie mniej spójnych sterydów o nieregularnych granicach. Silniejsze siły wewnętrzne w bardziej spójnych agregatach powodowały również zapadanie się do bardziej symetrycznej formy, nawet jeszcze w mikrostudzienkach, w których zostały uformowane.

Jednak agregaty kapu liny, szczególnie przy większych rozmiarach, widocznie zachowują kwadratową geometrię parametalu mikrostudzienek Po opanowaniu proces ten można przeprowadzić w ciągu około godziny plus okres inkubacji wymagany do przylegania komórek i wytwarzania płynów. Próbując tej procedury, należy pamiętać, aby upewnić się, że pęcherzyki kolejne, podróżując po mikrodołkach przed dodaniem komórek.