Name: Analiza funkcji mitochondriów u Drosophila melanogaster PINK1B9-Null mutant przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T12:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Poznaj metodę respirometrii o wysokiej rozdzielczości do analizy bioenergetyki u mutantów PINK1 B9-null Drosophila melanogaster. Ta technika pozwala badać funkcję mitochondriów w kontekście choroby Parkinsona.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy uznają, że brazylijska agencja Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) i T.D. (#88887.512883/2020-00) są stypendystami badawczymi.

Użyliśmy szczepów w1118 (biały) i w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (określany jako Pink1B9) (ID FlyBase: FBgn0029891) z centrum zapasowego Bloomington Drosophila (numer identyfikacyjny: 34749). W tym badaniu porównano samce mutantów D. melanogaster PINK1B9-null z samcami D. melanogaster ze szczepu w1118, który jest używany jako grupa kontrolna (tło genetyczne). Inne parametry muszą być analizowane równocześnie z eksperymentami respirometrycznymi, aby upewnić się, że muszki mają prawidłowy genotyp (Pink1B9/Y), takie jak deformacje klatki piersiowej i problemy z poruszaniem się, które są dobrze opisane dla zmutowanych much pink1B924,25,26.
1. Zwierzęta i pomieszczenia
<ol>
	<li>Muchy należy przechowywać w szklanych butelkach zawierających 10 ml standardowej diety (drożdże 1,73%, mąka sojowa 0,9%, mąka kukurydziana 7,3%, agar 0,5%, syrop kukurydziany 7,6% i kwas propionowy 0,48%) w stałej temperaturze i wilgotności (odpowiednio 25 °C i 60%), w cyklu 12 godzin: 12 godzin światła/ciemności.</li>
	<li>Do każdego eksperymentu użyj dwóch much w wieku 1-3 dni po ekluzji. 
	UWAGA: Zmutowane dziewicze samice much PINK1B9 o zerowym zeru skrzyżowano z samcami w 1118 w celu uzyskania samców F1 o genotypie Pink1B9/Y.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Przygotować bufor MiR05 zgodnie z opisem w tabeli 1.</li>
	<li>Znieczulij muchy na lodzie i przenieś je do probówek do mikrowirówek (dwie muchy na probówkę).</li>
	<li>Do każdej probówki dodać 200 μl schłodzonego buforu MiR05 i homogenizować muchy. Homogenizować ręcznie, wywierając delikatny nacisk (około 4-6 uderzeń tłuczkiem), aby zapobiec rozpadowi mitochondriów.</li>
</ol>
3. Kalibracja respirometryczna o wysokiej rozdzielczości polarograficznych czujników tlenu
UWAGA: Komory OROBOROS mają całkowitą objętość około 2 ml. Kalibracja jest wymagana, aby upewnić się, że strumień tlenu jest bliski 0 pmol, aby rozpocząć test.
<ol>
	<li>Rozpoczynając kalibrację, dodaj 2 ml MiR05 do komory. Przykryj komorę korkiem, nie pozostawiając pęcherzyków powietrza; Następnie ostrożnie pociągnij korek, aby utworzyć jeden pojedynczy pęcherzyk powietrza.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie OROBOROS Dat.Lab. Wprowadź temperaturę 25 °C w polu Temperatura bloku i kliknij Połącz z Oxygraph-2k (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Kliknij i wybierz folder, w którym ma zostać zapisana kalibracja, a następnie kliknij Zapisz.</li>
	<li>Gdy otworzy się nowe okno, nazwij eksperyment i próbki (jeśli przeprowadzasz kalibrację, po prostu wprowadź nazwę kalibracji) i kliknij Zapisz.</li>
	<li>Przejdź do menu Layout i wybierz pierwszą opcję: 01 Calibration Exp. Gr.3 - Temp, jak pokazano na Rysunek 1B.</li>
	<li>Poczekaj, aż program przekieruje do układu kalibracji, poczekaj, aż czerwona linia pokaże standardową linię prostą z punktami w okolicach 0 pmol. Następnie wybierz dwa punkty: jeden dla komory A, a drugi dla komory B (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C), gdy czerwona linia znajduje się dokładnie na zero. 
	UWAGA: Wybrane punkty muszą mieć strumień tlenu (czerwona linia) około 0.
	<ol>
		<li>Aby zaznaczyć punkty obu komór, wybierz stężenie O2 po prawej stronie ekranu, wybierz zaznaczony punkt i skopiuj zarówno wartości temperatury, jak i ciśnienia atmosferycznego względem punktu. Wklej te wartości w poniższe pola i kliknij Kalibruj i kopiuj do schowka w prawym dolnym rogu ekranu, jak pokazano na Rysunek 2.</li>
		<li>Wykonaj ten proces dla obu komór (A i B), a następnie przejdź do menu Plik i wybierz Zapisz i rozłącz. 
		UWAGA: Po procesie kalibracji program przekieruje użytkownika na ekran główny, dzięki czemu oprogramowanie będzie gotowe do rozpoczęcia testu HRR. Do tego testu użyjemy protokołu SUIT.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Protokół SUIT
<ol>
	<li>Po zakończeniu kalibracji wyjmij korki i otwórz komory.</li>
	<li>Umyj korki (trzymając końcówkę, która nie dotyka próbki) i komory 100% etanolem, 70% etanolem i wodą destylowaną, w tej kolejności. 
	UWAGA: Powtórz ten proces dla każdej zmiany próbki.</li>
	<li>Homogenizować muszki w 200 μl buforu, umieścić całą zawartość próbki w komorze za pomocą mikropipety i przenieść korek w komorze, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków powietrza. 
	UWAGA: Jeśli utworzą się pęcherzyki powietrza, delikatnie zdejmij korek i dodaj 100 μl buforu MIR05.</li>
	<li>Kliknij menu Układ i wybierz opcję 05 Przepływ według skorygowanej objętości, jak pokazano na Rysunek 1B.</li>
	<li>Poczekaj na przekierowanie do nowego okna. Kliknij przycisk Zapisz, aby wybrać folder, w którym eksperyment ma zostać zapisany.</li>
	<li>Poczekaj, aż otworzy się kolejne nowe okno. Nazwij eksperyment w przestrzeni Kod eksperymentalny. Następnie nazwij każdą próbkę w odpowiedniej komorze A i B w polu Próbka i ustaw pole Jednostka na unit. 
	UWAGA: Można również wybrać inne jednostki, na przykład Miliony komórek lub mg.</li>
	<li>Biorąc pod uwagę, że w tym protokole używane są dwie muchy (2 jednostki), a objętość komory wynosi 2 ml, w polu Stężenie zdefiniuj 1 na ml (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D). 
	UWAGA: W tym przypadku ilość próbki została znormalizowana przez liczbę much; jednak normalizacja ta może być przeprowadzona przez zawartość białka w próbce, kwantyfikację mitochondrialnego DNA lub aktywność syntazy cytrynianu.</li>
	<li>Gdy sygnał strumienia tlenu (czerwona linia) jest stabilny na wartości dodatniej, rozpocznij protokół HRR od miareczkowania substratów, inhibitorów i rozprzęgaczy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3). Wszystkie kolejne odczynniki i wyposażenie przedstawiono w tabeli 1.
	<ol>
		<li>Dodaj digitoninę (5 μg/ml), aby przepuszczalność błony mitochondrialnej.</li>
		<li>Dodaj substraty pirogronianu (5 mM), jabłczanu (2 mM) i proliny (10 mM) i poczekaj, aż strumień tlenu wzrośnie i ustabilizuje się. Aby oznaczyć zdarzenie dla każdego dodania odczynnika, naciśnij F4 na klawiaturze i wprowadź nazwę każdego odczynnika.</li>
		<li>Dodaj ADP (5mM), aby sprzęgnąć mitochondrialny łańcuch oddechowy i poczekaj na wzrost i stabilizację strumienia tlenu.</li>
		<li>Dodać bursztynian (10 mM) i poczekać na wzrost i stabilizację strumienia tlenu.</li>
		<li>Dodaj oligomycynę (2,5 μM), aby zahamować syntazę ATP i poszukać spadku strumienia tlenu.</li>
		<li>Poczekaj, aż czerwona linia ustabilizuje się i rozprzęgnij mitochondrialny transfer elektronów za pomocą cyjanku karbonylo-4-(trifluorometoksy)fenylohydrazonu (FCCP) o mianie 0,25 μM, aż zostanie osiągnięte maksymalne zużycie tlenu, wykazane przez wzrost czerwonej linii. Po ustabilizowaniu strumienia tlenu zacznij dodawać inhibitory każdego kompleksu, pojedynczo.</li>
		<li>Dodać rotenon (0,5 μM), inhibitor kompleksu I. Poczekaj na spadek i stabilizację strumienia tlenu, aby dodać następny inhibitor.</li>
		<li>Dodać malonian (5 mM), inhibitor kompleksu II. Poczekaj na spadek i stabilizację strumienia tlenu, aby dodać następny inhibitor.</li>
		<li>Na koniec dodaj antymycynę (2,5 μM), inhibitor kompleksu III. Poczekaj na spadek, a następnie wzrost i stabilizację strumienia tlenu. 
		UWAGA: Strumień tlenu powinien ustabilizować się na wartości dodatniej, ale poniżej wartości dla ostatniego hamowania mitochondrialnych kompleksów białkowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na zakończenie analizy usunąć całą zawartość komór za pomocą mikropipety. Przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszej analizy, jeśli zajdzie taka potrzeba.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Wykorzystaj odpowiedni pakiet oprogramowania statystycznego do analizy danych.</li>
	<li>Wykonaj testy t, aby ocenić różnice między dwiema grupami. W sytuacjach obejmujących wiele zabiegów użyj analizy wariancji (ANOVA) jako testu statystycznego 27.</li>
	<li>Wyodrębnij wartości strumieniaO2 z wykresu wygenerowanego przez oprogramowanie. OXPHOS CI odnosi się do wartości strumieniaO2 po dodaniu ADP. OXPHOS CII otrzymuje się przez odjęcie OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI. OXPHOS CI&CII to wartość topnikaO2 ekstrahowanego po dodaniu bursztynianu. ETS CI&CII to wartość strumienia O2 po dodaniu FCCP. ETS CI = FCCP - Rotenon i ETS CII = Rotenon - Malonian.</li>
	<li>Oblicz syntezę ATP jako różnicę między OXPHOS (P) a LEAK (L) (P - L)28.</li>
	<li>Określ współczynnik kontroli oddechu (RCR), obliczając stosunek OXPHOS/LEAK, gdzie RCR = P/L.11</li>
</ol>

Analyzing Mitochondrial Physiology and Bioenergetics in Fruit Flies

<ol><li>Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+mitochondrial+function+and+cellular+bioenergetics+in+ageing+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease.</a> Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).</li>
<li>Ramaccini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+function+and+dysfunction+in+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardiomyopathy.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 624216(2021).</li>
<li>Zhunina, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondrial+dysfunction+in+vascular+disease%2C+tumorigenesis%2C+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondrial dysfunction in vascular disease, tumorigenesis, and diabetes.</a> Front Mol Biosci. 8, 671908(2021).</li>
<li>Prasun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in metabolic syndrome.</a> Biochim Biophys Acta. 1866 (10), 165838(2020).</li>
<li>Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+metabolic+disorders+-+A+Step+towards+mitochondria+based+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A Step towards mitochondria based therapeutic strategies.</a> Biochim Biophys Acta. 1863 (5), 1066-1077 (2017).</li>
<li>Perier, C., Vila, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+biology+and+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial biology and Parkinson's disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2), 009332(2012).</li>
<li>DeMaagd, G., Philip, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+its+management%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacy+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and its management.</a> Pharmacy and Therapeutics. 40 (8), 504-532 (2015).</li>
<li>Miyazaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-dependent+and+Parkin-independent+mitophagy+is+involved+in+reprogramming+of+glycometabolism+in+pancreatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">PINK1-dependent and Parkin-independent mitophagy is involved in reprogramming of glycometabolism in pancreatic cancer cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 625, 167-173 (2022).</li>
<li>Kopin, I. J., Markey, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPTP+toxicity%3A+implications+for+research+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">MPTP toxicity: implications for research in Parkinson's disease.</a> Annual Review of Neuroscience. 11, 81-96 (1988).</li>
<li>Connolly, N. M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+on+experimental+methods+to+assess+mitochondrial+dysfunction+in+cellular+models+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases.</a> Cell Death Differ. 25 (3), 542-572 (2018).</li>
<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem J. 435, 297-312 (2011).</li>
<li>Haynes, C. M., Fiorese, C. J., Lin, Y. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+and+responding+to+mitochondrial+dysfunction%3A+The+UPRmt+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluating and responding to mitochondrial dysfunction: The UPRmt and beyond.</a> Trends Cell Mol Biol. 23 (7), 311-318 (2013).</li>
<li>Long, Q., Huang, L., Huang, K., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+bioenergetics+in+isolated+mitochondria+from+mouse+heart+tissues+using+oroboros+2k-oxygraph%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from mouse heart tissues using oroboros 2k-oxygraph.</a> Methods Mol Biol. 1966, Clifton, N.J. 237-246 (2019).</li>
<li>Scheiber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry+in+human+endomyocardial+biopsies+shows+reduced+ventricular+oxidative+capacity+related+to+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry in human endomyocardial biopsies shows reduced ventricular oxidative capacity related to heart failure.</a> Exp Mol Med. 51 (2), 1-10 (2019).</li>
<li>Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+nine+-+use+of+safranin+for+the+assessment+of+mitochondrial+membrane+potential+by+high-resolution+respirometry+and+fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Chapter nine - use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry.</a> Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).</li>
<li>Demir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+use+of+Drosophila+as+an+in+vivo+model+organism+for+COVID-19-related+research%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Turk+J+Biol%22%5BJournal%5D)">The potential use of Drosophila as an in vivo model organism for COVID-19-related research: a review.</a> Turk J Biol. 45 (4), 559-569 (2021).</li>
<li>Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+on+the+fly%3A+a+primer+on+the+Drosophila+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system.</a> Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).</li>
<li>McBride, S. M. J., Holloway, S. L., Jongens, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+as+a+tool+to+identify+pharmacological+therapies+for+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today+Technol+Technologies%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila as a tool to identify pharmacological therapies for fragile X syndrome.</a> Drug Discov Today Technol Technologies. 10 (1), e129-e136 (2013).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods (San Diego, Calif). 68 (1), 105-115 (2014).</li>
<li>Bar, S., Prasad, M., Datta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+degeneration+and+locomotor+deficit+in+a+Drosophila+model+of+mucopolysaccharidosis+VII+is+attenuated+by+treatment+with+resveratrol%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular degeneration and locomotor deficit in a Drosophila model of mucopolysaccharidosis VII is attenuated by treatment with resveratrol).</a> Dis Model Mech. 11 (11), (2018).</li>
<li>Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-Parkin+signaling+in+Parkinson%27s+disease%3A+Lessons+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">PINK1-Parkin signaling in Parkinson's disease: Lessons from Drosophila.</a> Neurosci Res. 159, 40-46 (2020).</li>
<li>Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., Hodge, J. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+PINK1+and+parkin+loss-of-function+mutants+display+a+range+of+non-motor+Parkinson%27s+disease+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson's disease phenotypes.</a> Neurobiol Dis. 104, 15-23 (2017).</li>
<li>Biswas, S., Bagchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+structural+dynamics+of+the+mutations+in+the+kinase+domain+of+PINK1+protein+associated+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Analysis of the structural dynamics of the mutations in the kinase domain of PINK1 protein associated with Parkinson's disease.</a> Gene. 857, 147183(2023).</li>
<li>Koh, H., Chung, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1+and+Parkin+to+control+mitochondria+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PINK1 and Parkin to control mitochondria remodeling.</a> Anat Cell Biol. 43 (3), 179-184 (2010).</li>
<li>Zhu, M., Li, X., Tian, X., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mask+loss-of-function+rescues+mitochondrial+impairment+and+muscle+degeneration+of+Drosophila+pink1+and+parkin+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants.</a> Hum Mol Genet. 24 (11), 3272-3285 (2015).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+Drosophila+PINK1+mutants+is+complemented+by+parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin.</a> Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).</li>
<li>Dytham, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDytham%2C+C+%22Choosing+and+using+statistics%3A+a+biologist%27s+guide%22">Choosing and using statistics: a biologist's guide</a>. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. (2011).</li>
<li>Bonora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+synthesis+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Purinergic+Signal%22%5BJournal%5D)">ATP synthesis and storage.</a> Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).</li>
<li>Gonçalves, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+improves+mitochondrial+function+in+PINK1B9-null+mutant+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Caffeine improves mitochondrial function in PINK1B9-null mutant Drosophila melanogaster.</a> J Bioenerg Biomembr. 55 (1), 1-13 (2023).</li>
<li>Gonçalves, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+function+and+cellular+energy+maintenance+during+aging+in+a+Drosophila+melanogaster+model+of+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial function and cellular energy maintenance during aging in a Drosophila melanogaster model of Parkinson disease.</a> Mitochondrion. 65, 166-175 (2022).</li>
<li>Janowska, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+complex+I+dysfunction+induced+by+N-methyl+carbamate+ex+vivo+can+be+alleviated+with+a+cell-permeable+succinate+prodrug%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain complex I dysfunction induced by N-methyl carbamate ex vivo can be alleviated with a cell-permeable succinate prodrug.</a> Toxicol In Vitro. 65, 104794(2020).</li>
<li>Ngo, D. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+modifications+of+mitochondrial+complex+II+are+associated+with+insulin+resistance+of+visceral+fat+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Oxidative modifications of mitochondrial complex II are associated with insulin resistance of visceral fat in obesity.</a> Physiol Endocrinol Metab. 316 (2), E168-E177 (2019).</li>
<li>Stroud, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessory+subunits+are+integral+for+assembly+and+function+of+human+mitochondrial+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I.</a> Nature. 538 (7623), 123-126 (2016).</li>
<li>Senyilmaz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mitochondrial+morphology+and+function+by+stearoylation+of+TFR1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1.</a> Nature. 525 (7567), 124-128 (2015).</li>
<li>Poddighe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucuna+pruriens+%28Velvet+bean%29+rescues+motor%2C+olfactory%2C+mitochondrial+and+synaptic+impairment+in+PINK1B9+Drosophila+melanogaster+genetic+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson's disease.</a> PloS One. 9 (10), e110802(2014).</li>
<li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry%3A+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).</li>
<li>Winer, L. S. P., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+glycolytic+and+oxidative+substrate+flux+of+cancer+cells+in+a+microplate%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate.</a> PloS One. 9 (10), e109916(2014).</li>
<li>Plitzko, B., Loesgen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+oxygen+consumption+rate+%28OCR%29+and+extracellular+acidification+rate+%28ECAR%29+in+culture+cells+for+assessment+of+the+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism.</a> Bio Protoc. 8 (10), e2850(2018).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+for+the+analysis%2C+standardization+and+interpretation+of+oxygen+consumption+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements.</a> Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).</li>
<li>Bingol, B., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mitophagy%3A+PINK1%2C+Parkin%2C+USP30+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond.</a> Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

HRR jest potężną techniką badania oddychania mitochondrialnego i metabolizmu energetycznego u D. melanogaster i innych organizmów. Zapewnia szczegółową i ilościową ocenę funkcji mitochondriów, umożliwiając naukowcom uzyskanie wglądu w bioenergetykę komórek. Przedstawiony tutaj protokół opisuje ocenę funkcji mitochondrialnego łańcucha oddechowego i aktywności określonych kompleksów mitochondrialnych przy użyciu protokołu SUIT u D. melanogaster. Protokół SUIT polega na systematycznym manipulowaniu różnymi...

Mitochondria to organelle komórkowe, które kontrolują ważne funkcje, w tym regulację apoptozy, homeostazę wapnia i udział w szlakach biosyntezy. Posiadając autonomiczny materiał genetyczny, są w stanie przyczyniać się do procesów utrzymania i naprawy komórek. Ich struktura obejmuje łańcuch transportu elektronów i fosforylację oksydacyjną, które mają kluczowe znaczenie dla energii komórkowej1,2,3. W szczególności kontrolę energii osiąga się poprzez produkcję trifosforanu adenozyny (ATP) poprzez fosforylację oksydacyjną (OXPHOS)2. Zakłócenie metabolizmu energetycznego z upośledzeniem funkcji mitochondriów występuje zarówno w przypadku przeżycia, jak i śmierci komórki4,5, często związane z szerokim zakresem patologii człowieka, takich jak rak, i chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Parkinsona (PD)3,6.
PD jest chronicznym, postępującym i neurologicznym zaburzeniem. Główną przyczyną tej choroby jest śmierć komórek mózgowych, zwłaszcza istoty czarnej, które są odpowiedzialne za produkcję neuroprzekaźnika dopaminy, który kontroluje ruch6,7,8. Najwcześniejsza obserwacja, która powiązała parkinsonizm z dysfunkcją mitochondriów, została dokonana w 1988 roku, w eksperymentalnych modelach wykorzystujących toksyny hamujące łańcuch oddechowy Complex I9.
Obecnie istnieje kilka metod oceny dysfunkcji mitochondriów10,11,12,13; jednakże, w porównaniu z konwencjonalnymi metodami, respirometria o wysokiej rozdzielczości (HRR) charakteryzuje się większą czułością i zaletami13,14. Na przykład protokoły HRR pozwalają na ocenę funkcji całego mitochondrialnego łańcucha oddechowego lub aktywności określonych kompleksów mitochondrialnych14,15. Dysfunkcje mitochondriów można ocenić w nienaruszonych komórkach, izolowanych mitochondriach, a nawet ex vivo10,11,13,14.
Dysfunkcje mitochondriów są ściśle związane z wieloma patologicznymi i fizjologicznymi procesami. Dlatego ważne jest, aby badać fizjologię mitochondriów i bioenergetykę przy użyciu genetycznie i eksperymentalnie sterowalnych systemów modelowych. W związku z tym badania nad Drosophila melanogaster, muszką owocową, mają kilka zalet. Model ten ma podstawowe cechy i procesy komórkowe z ludźmi, w tym wykorzystanie DNA jako materiału genetycznego, wspólnych organelli i konserwatywnych szlaków molekularnych zaangażowanych w rozwój, odporność i sygnalizację komórkową. Ponadto muszki owocowe charakteryzują się szybkim cyklem życia, łatwą konserwacją, niskimi kosztami, wysoką przepustowością i mniejszą liczbą problemów etycznych, stanowiąc tym samym nieocenione narzędzie do analizowania złożonych procesów komórkowych16,17,18,19,20.
Ponadto, homolog genu kinazy 1 (pink1) indukowanego przez PTEN ulega ekspresji w D. melanogaster. Odgrywa kluczową rolę w usuwaniu uszkodzonych mitochondriów w procesie mitofagii8. U ludzi mutacje w tym genie predysponują osoby do autosomalnej recesywnej rodzinnej postaci PD związanej z dysfunkcją mitochondriów8,21,22,23. W związku z tym muszka owocowa jest potężnym modelem zwierzęcym do badań nad patofizjologią choroby Parkinsona i badań przesiewowych kandydatów na leki, koncentrując się na dysfunkcji mitochondriów i bioenergetyce. W związku z tym w niniejszej pracy wyjaśniono, w jaki sposób można analizować funkcję mitochondriów w modelu PD z D. melanogaster przy użyciu techniki HRR w OROBOROS z protokołem SUIT (Substrate-Uncouplingr-Inhibitor-Titration).

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td>5&-difosforan sodu adenozyny (numer CAS 72696-48-1); &ge; 95%; Masa cząsteczkowa = 501.31 g/mol.</td></tr><tr><td>&Aaostry; gar</td><td>Kasv</td><td>K25-1800</td><td>Do stosowania bakteriologicznego</td></tr><tr><td>Antimycin-A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>Antymycyna A firmy Streptomyces sp. (numer CAS 1397-94-0); masa cząsteczkowa &nbsp; 540 g/mol;</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>Albumina surowicy bydlęcej (numer CAS 9048-46-8); pH 7,0 &ge; 98%</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Datlab</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td><td>20700</td><td>Oprogramowanie do akwizycji i analizy danych</td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D 5628</td><td>Numer CAS 11024-24-1</td></tr><tr><td>Woda</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>destylowanaDrosophila melanogaster szczep w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3</td><td></td><td></td><td>Uzyskany z centrum zapasów Bloomington Drosophila</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster szczep&nbsp; w1118</td><td></td><td></td><td>Uzyskane&nbsp; z Uniwersytetu Federalnego Santa Maria</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8145</td><td>Kwas bis(2-aminoetylowy)-glikolu etylenowego (numer CAS 13638-13-3); &ge; 97%; masa cząsteczkowa = 468,28 g / mol</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>4- (trifluorometoksy)fenylohydrazon cyjanku karbonylu&nbsp; (numer CAS 370-86-5); &ge; 98% (TLC), proszek&nbsp;</td></tr><tr><td>GraphPad Prism w wersji 8.0.1.</td><td></td><td></td><td>Oprogramowanie do akwizycji i analizy danych</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy (numer CAS 7365-45-9); &ge; 99,5% (miareczkowanie), testowane na hodowlach komórkowych; masa cząsteczkowa = 238.30 g/mol</td></tr><tr><td>Respirometr o wysokiej rozdzielczości Oxygraph O2K</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td><td>10022-02</td><td>Zestaw respirometru Startup O2K</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td>Fosforan monopotasowy (numer CAS 7778-77-0); Reagente Plus, waga molekularna = 136,09 g/mol</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>211473</td><td>Wodorotlenek potasu (numer CAS 1310-58-3); odczynnik ACS, &ge; 85%, granulki</td></tr><tr><td>Jabłczan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1296</td><td>Kwas malonowy (numer CAS 141-82-2); 99%, masa cząsteczkowa = 104,06 g/mol). Roztwór ma pH dostosowane do około 7,0.</td></tr><tr><td>Kwas jabłkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td>(S)-(&minus;)-2-hydroksybursztynowy kwas (numer CAS 97-67-6); &ge; 95% ; masa cząsteczkowa = 134.09 g/mol</td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td>Kwas 2-(N-Morfolino)etanosulfonowy (numer CAS 4432-31-9); &ge; 99% (miareczkowanie); masa cząsteczkowa = 195.24 g/mol</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Chlorek magnezu (numer CAS 7786-30-3); bezwodny, &ge; 98%, masa cząsteczkowa = 95.21 g/mol</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>O2K-Titration</td><td>Set Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td><td>20820-03</td><td>Strzykawki Hamilton o różnych objętościach</td></tr><tr><td>Oligomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O 4876</td><td>Oligomycyna z&nbsp; Streptomyces diastatochromogenes (numer CAS &nbsp; 1404-19-9); &ge; 90% całkowita baza oligomycyn (HPLC)</td></tr><tr><td>Słupek do homogenizacji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380</td><td>L-prolina (numer CAS 147-85-3); proszek; 99%; masa cząsteczkowa = 115.13 g/mol</td></tr><tr><td>Pirogronian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>Pirogronian sodu (numer CAS 113-24-6), &ge; 99%; masa cząsteczkowa = 110.04 g/mol</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>Rotetone (numer CAS 83-79-4); &ge; 95%, masa cząsteczkowa 394,42 g/mol</td></tr><tr><td>Bursztynian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S 2378</td><td>Bursztynian sodu dwuzasadowy sześciowodny (numer CAS 6106-21-4); &ge; 99%</td></tr> <tr><td>Sacharoza</td><td>Merck</td><td>107,651,000</td><td>Sacharoza do stosowania w mikrobiologii (numer CAS 57-50-1)</td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td>Numer CAS 107-35-7</td></tr></tbody></table>

analiza funkcji mitochondriów u drosophila melanogaster pink1b9-null mutant przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry

Choroby neurodegeneracyjne, w tym choroba Parkinsona (PD), oraz zaburzenia komórkowe, takie jak rak, to tylko niektóre z zaburzeń, które zakłócają metabolizm energetyczny z upośledzeniem funkcji mitochondriów. Mitochondria to organelle, które kontrolują zarówno metabolizm energetyczny, jak i procesy komórkowe zaangażowane w przetrwanie i śmierć komórki. Z tego powodu podejścia do oceny funkcji mitochondriów mogą dostarczyć ważnych informacji na temat warunków komórkowych w procesach patologicznych i fizjologicznych. W związku z tym protokoły respirometrii o wysokiej rozdzielczości (HRR) umożliwiają ocenę funkcji całego mitochondrialnego łańcucha oddechowego lub aktywności określonych kompleksów mitochondrialnych. Co więcej, badanie fizjologii mitochondriów i bioenergetyki wymaga genetycznie i eksperymentalnie wykonalnych modeli, takich jak Drosophila melanogaster.
Ten model ma kilka zalet, takich jak podobieństwo do ludzkiej fizjologii, szybki cykl życia, łatwa konserwacja, opłacalność, wysoka przepustowość i zminimalizowana liczba problemów etycznych. Te cechy łącznie sprawiają, że jest to nieocenione narzędzie do analizowania złożonych procesów komórkowych. Niniejsza praca wyjaśnia, jak analizować funkcję mitochondriów przy użyciu mutanta Drosophila melanogaster PINK1B9-null. Gen pink1 jest odpowiedzialny za kodowanie przypuszczalnej kinazy 1 indukowanej przez PTEN w procesie rozpoznawanym jako mitofagia, który ma kluczowe znaczenie dla usunięcia dysfunkcyjnych mitochondriów z sieci mitochondrialnej. Mutacje w tym genie są związane z autosomalną recesywną rodzinną postacią choroby Parkinsona o wczesnym początku. Model ten może być wykorzystany do badania dysfunkcji mitochondriów zaangażowanych w patofizjologię choroby Parkinsona.

Wykazano tutaj, że strumień O2 w stanach OXPHOS CI (P = 0,0341) oraz OXPHOS CI&amp;II (P = 0,0392) jest zredukowany u much PINK1B9 null w porównaniu z muchami kontrolnymi (Rysunek 4). Wynik ten zaobserwowano również we wcześniejszych badaniach naszej grupy29,30.
CI i CII są kluczowymi komponentami łańcucha transportu elektronów (ETS), w którym CI odpowiada za...

Tutaj prezentujemy protokół respirometrii o wysokiej rozdzielczości do analizy bioenergetyki u zmutowanych muszek owocowych PINK1B9-null. W metodzie wykorzystuje się protokół SUIT (Substrate-Uncouplingr-Inhibitor-Titration).

Analiza funkcji mitochondriów u Drosophila melanogaster PINK1B9-Null mutant przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s Disease (PD), and cellular disturbances such as cancer are some of the disorders that disrupt energy ...

W naszych badaniach wykorzystujemy Drosophila melanogaster jako model eksperymentalny do zrozumienia funkcji mitochondriów w chorobie i toksyczności chemicznej. Niektóre pytania, na które chcemy odpowiedzieć, to: w jaki sposób PQ u jednego pacjenta wpływa na funkcję mitochondriów i jak jest to powiązane z chorobą Parkinsona? W jaki sposób możemy zapobiec lub wyeliminować dysfunkcję mitochondriów związaną z tą mutacją?Respirometria o wysokiej rozdzielczości wymaga odpowiedniego przeszkolenia w zakresie precyzyjnej obsługi analizy danych. Ponadto użytkownik systemu nie pozwala na pracę z kilkoma próbkami jednocześnie i nie jest przeszkolony w zakresie analizy o wysokiej przepustowości. Ponieważ możliwe jest badanie tylko dwóch próbek w tym samym czasie, projekt eksperymentu musi być dobrze nakreślony.Nasze odkrycia w przypadku postępującego środowiska funkcji mitochondrialnej, z którym mamy do czynienia w różowych mutantach zerowych, które charakteryzują się spadkiem oksyfosu sprzężonego z C1 i związanego z ETS C1 i C2 oraz metabolicznym przesunięciem w produkcji ATP z oksydacyjnego wołu na szlaki. Odkrycia te są ściśle związane z patofizjologią choroby z mutacją Parkinsona. Jednym z kluczowych punktów układu oddechowego o wysokiej rozdzielczości jest jego zdolność do zapewniania bezpośrednich i dokładnych pomiarów zużycia tlenu dla funkcji mitochondriów i metabolizmu komórkowego.Ponadto jest wszechstronny. Może być stosowany do szerokiej gamy kilku typów, w tym izolowanych mitochondriów. Biorąc pod uwagę, że dysfunkcja mitochondriów jest powszechną cechą chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Parkinsona.W przyszłości skupimy się na zbadaniach, w jaki sposób funkcja mitochondriów i podniesienie energii mogą być ważnymi celami w terapiach ukierunkowanych na choroby neurodegeneracyjne. Na początek dodaj dwa mililitry buforu MIRO five do komory Arobaros. Przykryj komorę korkiem bez wprowadzania pęcherzyków powietrza.Następnie ostrożnie pociągnij korek, aby utworzyć pojedynczy pęcherzyk powietrza. Otwórz oprogramowanie Arobaros DAT Lab: W polu Block Temperature wprowadź temperaturę 25 stopni Celsjusza i kliknij Connect to XI GRA 2K. Kliknij i wybierz folder, w którym ma zostać zapisana kalibracja, a następnie kliknij Zapisz.Gdy otworzy się nowe okno, nazwij eksperyment i próbki. Następnie kliknij Zapisz. Następnie przejdź do menu układu i wybierz pierwszą opcję, jedną, eksperyment kalibracyjny.Wykres trzeci, temp. Gdy czerwona linia pokazuje standardową linię prostą z punktami wokół zera, wybierz dwa punkty, jeden dla komory A, a drugi dla komory B, wybierz stężenie tlenu po prawej stronie ekranu. Wybierz zaznaczony punkt i skopiuj wartości temperatury i ciśnienia atmosferycznego względem punktu.Wklej te wartości w poniższych polach i kliknij kalibruj i kopiuj do schowka. Następnie przejdź do menu plików i wybierz zapisz i rozłącz. Po kalibracji polarograficznych czujników tlenu usuń korki i otwórz komory.Umyj korki i komory 100% etanolem, 70% etanolem i wodą destylowaną. Przenieś muchy do mikroprobówki wirówkowej. Dodaj 200 mikrolitrów schłodzonego buforu MiRO5 do probówki i homogenizuj muchy, delikatnie uciskając czterema do sześciu pociągnięć tłuczkiem.Za pomocą mikropipety przenieść homogenizowaną zawiesinę muchową do komory. Przykryj komorę korkiem bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Następnie kliknij menu układu i wybierz opcję piątą Przepływ według skorygowanej objętości"Kolejne nowe okno otworzy się tutaj w przestrzeni Kod eksperymentalny"nazwij eksperyment w polu próbki.Nazwij każdą próbkę w odpowiedniej komorze A i B. Następnie ustaw pole jednostki na jednostkę iw polu stężenia zdefiniuj objętość komory jako jedną na mililitr. Aby rozpocząć respirometrię o wysokiej rozdzielczości, upewnij się, że sygnał strumienia tlenu jest stały na wartości dodatniej. Dodaj digitoninę, aby utrwalić błonę mitochondrialną.Następnie dodaj podłoża pirogronianowe, jabłczanowe i prolinowe, aż strumień tlenu wzrośnie i ustabilizuje się. Naciśnij F4 na klawiaturze i wprowadź nazwę odczynnika, aby oznaczyć zdarzenie. Dodaj ADP, aby sprzęgnąć mitochondrialny łańcuch oddechowy i poczekaj na wzrost i stabilizację strumienia tlenu.Następnie dodaj bursztynian i zmierz strumień tlenu, aby zahamować syntazę A TP, dodaj oligomycynę i zbadaj spadek strumienia tlenu. Po ustabilizowaniu się czerwonej linii, rozprzęgnij mitochondrialny transfer elektronów za pomocą 0,25 mikromolowego FCCP, aż do osiągnięcia maksymalnego zużycia tlenu, czego dowodem jest wzrost czerwonej linii. Następnie dodaj kompleks rotenonu jeden inhibitor i poczekaj na spadek i stabilizację strumienia tlenu.Następnie dodaj inhibitor kompleksu melanianu dwa i zmierz strumień tlenu. Na koniec dodaj inhibitor kompleksu antymycyny trzy i poczekaj na spadek, a następnie wzrost i stabilizację strumienia tlenu. Kliknij oprogramowanie Graph Pad Prism, aby wyodrębnić wartości strumienia tlenu z wykresów.Oxphos C1 odnosi się do wartości strumienia tlenu po dodaniu ADP. Następnie użyj podanego wzoru, aby obliczyć oksfos C2. Korzystając z poniższego równania, oblicz wartości tlenu ETS C1 i C2 dla rozprzęgaczy i inhibitorów. Następnie oblicz syntezę ATP jako różnicę między oksfosem a wyciekiem.Na koniec oblicz oksphos według współczynnika nieszczelności, aby określić współczynnik kontroli oddechowej. Strumień tlenu zarówno w stanach oksfosu C1, jak i oksfosu C1 i C2 był znacznie zmniejszony u much różowych 1B9-zerowych w porównaniu z muchami kontrolnymi. Dodatkowo, strumień tlenu w stanie ETS C1, ETS C2 i ETS C1 i C2 był niższy w różowych muchach zerowych 1B9, co wskazuje na upośledzony system transferu elektronów.W porównaniu do muchy kontrolnej. Zakłócenie strumienia elektronów wpływa na proces oksfosu, prowadząc do zmniejszonej syntezy A TP u różowych muszek 1B9-zerowych. Zmniejszenie współczynnika kontroli oddechowej u much zerowych sugeruje rozprzęganie mitochondriów, co wskazuje, że mitochondria były mniej wydajne w wykorzystywaniu tlenu i wytwarzaniu ATP.

analyzing-mitochondrial-function-drosophila-melanogaster-pink1b9-null

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Mitochondria odgrywają kluczową rolę w regulacji metabolizmu i homeostazy. Subtelne zmiany w metabolizmie mitochondrialnym, które wpływają na fizjologię organizmu, mogą być trudne do wykrycia w badaniach metabolomicznych całego organizmu. Tutaj opisujemy metodę izolacji, która zwiększa wykrywanie subtelnych zmian metabolicznych u Drosophila melanogaster.

Przygotowanie frakcji wzbogaconych w mitochondria do analizy metabolicznej u Drosophila

Analiza zależności między strukturą a funkcją mitochondriów jest niezbędna do dokładnego zrozumienia mechanizmów regulacyjnych funkcjonalności mitochondriów. W artykule opisano i zademonstrowano specyficzne metody badania struktury i funkcji mitochondriów w żywych i utrwalonych jajnikach Drosophila.

Badanie struktury i funkcji mitochondriów w jajnikach Drosophila

W tym artykule opisana jest metoda pomiaru zużycia tlenu za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości w permeabilizowanych piersiach Drosophila. Technika ta wymaga minimalnej ilości tkanki w porównaniu z klasyczną techniką izolacji mitochondriów, a uzyskane wyniki są bardziej istotne fizjologicznie.

Pomiar mitochondrialnego zużycia tlenu w przepuszczalnych włóknach Drosophila przy użyciu minimalnych ilości tkanki

Przedstawiamy protokół pomiaru zużycia tlenu i pozakomórkowego zakwaszenia w mózgach larw i dorosłych Drosophila melanogaster. Analizator metaboliczny jest używany z dostosowanym i zoptymalizowanym protokołem. Ograniczenia mikrotkanek są kluczowym elementem tego protokołu i zostały zaprojektowane i stworzone specjalnie do ich wykorzystania w tej analizie.

Analiza metaboliczna larwalnych i dorosłych mózgów Drosophila melanogaster

Przedstawiamy protokół kolorymetrycznego testu aktywności syntazy cytrynianu do ilościowego oznaczania nienaruszonej masy mitochondrialnej w homogenatach tkanek Drosophila.

Test kolorymetryczny aktywności syntazy cytrynianu u Drosophila melanogaster

Kulometryczna respirometria jest idealna do pomiaru tempa metabolizmu małych organizmów. Po dostosowaniu do Drosophila melanogaster w niniejszym badaniu, zmierzone spożycieO2 mieściło się w zakresie zgłoszonym dla dzikiego typu D. melanogaster w poprzednich badaniach. Konsumpcja O2 na muchę przez mutanty CASK, które są mniejsze i mniej aktywne, była znacznie niższa niż w przypadku typu dzikiego.

Pomiar zużyciaO2 u Drosophila melanogaster za pomocą mikrorespirometrii kulometrycznej

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Ten artykuł przedstawia protokół do przetwarzania obrazów cryo-EM za pomocą pakietu oprogramowania SPHIRE. Obecny protokół może być stosowany do prawie wszystkich projektów EM pojedynczych cząstek, które są ukierunkowane na rozdzielczość bliską atomowi.

Analiza pojedynczych cząstek w wysokiej rozdzielczości na podstawie obrazów kriomikroskopii elektronowej przy użyciu SPHIRE

Ten protokół opisuje separację funkcjonalnych mitochondrialnych kompleksów łańcucha transportu elektronów (Cx) I-V i ich superkompleksów za pomocą natywnej elektroforezy w celu ujawnienia informacji o ich budowie i strukturze. Natywny żel można poddać immunoblottingowi, testom w żelu i oczyszczaniu za pomocą elektroelucji w celu dalszego scharakteryzowania poszczególnych kompleksów.

Analiza superkompleksów mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów za pomocą natywnej elektroforezy, testów w żelu i elektroelucji

Tutaj prezentujemy dwa protokoły pomiaru napływu mitochondrialnego Ca2+ w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach. W przypadku izolowanych mitochondriów szczegółowo opisujemy test importu Ca2 + oparty na czytniku płytek przy użyciu wrażliwego barwnika Ca2 + zieleni wapniowej-5N. W przypadku hodowanych komórek opisujemy metodę mikroskopii konfokalnej z użyciem barwnika Ca2+ Rhod-2/AM.

Analizy napływu wapnia w mitochondriach w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach

Poznaj metodę respirometrii o wysokiej rozdzielczości do analizy bioenergetyki u mutantów PINK1 B9-null Drosophila melanogaster. Ta technika pozwala badać funkcję mitochondriów w kontekście choroby Parkinsona.

Analiza funkcji mitochondriów u Drosophila melanogaster PINK1^B9-Null mutant przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Przeglądaj więcej filmów