Analiza funkcji mitochondriów u Drosophila melanogaster PINK1^B9-Null mutant przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości

W naszych badaniach wykorzystujemy Drosophila melanogaster jako model eksperymentalny do zrozumienia funkcji mitochondriów w chorobie i toksyczności chemicznej. Niektóre pytania, na które chcemy odpowiedzieć, to: w jaki sposób PQ u jednego pacjenta wpływa na funkcję mitochondriów i jak jest to powiązane z chorobą Parkinsona? W jaki sposób możemy zapobiec lub wyeliminować dysfunkcję mitochondriów związaną z tą mutacją?

Respirometria o wysokiej rozdzielczości wymaga odpowiedniego przeszkolenia w zakresie precyzyjnej obsługi analizy danych. Ponadto użytkownik systemu nie pozwala na pracę z kilkoma próbkami jednocześnie i nie jest przeszkolony w zakresie analizy o wysokiej przepustowości. Ponieważ możliwe jest badanie tylko dwóch próbek w tym samym czasie, projekt eksperymentu musi być dobrze nakreślony.

Nasze odkrycia w przypadku postępującego środowiska funkcji mitochondrialnej, z którym mamy do czynienia w różowych mutantach zerowych, które charakteryzują się spadkiem oksyfosu sprzężonego z C1 i związanego z ETS C1 i C2 oraz metabolicznym przesunięciem w produkcji ATP z oksydacyjnego wołu na szlaki. Odkrycia te są ściśle związane z patofizjologią choroby z mutacją Parkinsona. Jednym z kluczowych punktów układu oddechowego o wysokiej rozdzielczości jest jego zdolność do zapewniania bezpośrednich i dokładnych pomiarów zużycia tlenu dla funkcji mitochondriów i metabolizmu komórkowego.

Ponadto jest wszechstronny. Może być stosowany do szerokiej gamy kilku typów, w tym izolowanych mitochondriów. Biorąc pod uwagę, że dysfunkcja mitochondriów jest powszechną cechą chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Parkinsona.

W przyszłości skupimy się na zbadaniach, w jaki sposób funkcja mitochondriów i podniesienie energii mogą być ważnymi celami w terapiach ukierunkowanych na choroby neurodegeneracyjne. Na początek dodaj dwa mililitry buforu MIRO five do komory Arobaros. Przykryj komorę korkiem bez wprowadzania pęcherzyków powietrza.

Następnie ostrożnie pociągnij korek, aby utworzyć pojedynczy pęcherzyk powietrza. Otwórz oprogramowanie Arobaros DAT Lab: W polu Block Temperature wprowadź temperaturę 25 stopni Celsjusza i kliknij Connect to XI GRA 2K. Kliknij i wybierz folder, w którym ma zostać zapisana kalibracja, a następnie kliknij Zapisz.

Gdy otworzy się nowe okno, nazwij eksperyment i próbki. Następnie kliknij Zapisz. Następnie przejdź do menu układu i wybierz pierwszą opcję, jedną, eksperyment kalibracyjny.

Wykres trzeci, temp. Gdy czerwona linia pokazuje standardową linię prostą z punktami wokół zera, wybierz dwa punkty, jeden dla komory A, a drugi dla komory B, wybierz stężenie tlenu po prawej stronie ekranu. Wybierz zaznaczony punkt i skopiuj wartości temperatury i ciśnienia atmosferycznego względem punktu.

Wklej te wartości w poniższych polach i kliknij kalibruj i kopiuj do schowka. Następnie przejdź do menu plików i wybierz zapisz i rozłącz. Po kalibracji polarograficznych czujników tlenu usuń korki i otwórz komory.

Umyj korki i komory 100% etanolem, 70% etanolem i wodą destylowaną. Przenieś muchy do mikroprobówki wirówkowej. Dodaj 200 mikrolitrów schłodzonego buforu MiRO5 do probówki i homogenizuj muchy, delikatnie uciskając czterema do sześciu pociągnięć tłuczkiem.

Za pomocą mikropipety przenieść homogenizowaną zawiesinę muchową do komory. Przykryj komorę korkiem bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Następnie kliknij menu układu i wybierz opcję piątą Przepływ według skorygowanej objętości"Kolejne nowe okno otworzy się tutaj w przestrzeni Kod eksperymentalny"nazwij eksperyment w polu próbki.

Nazwij każdą próbkę w odpowiedniej komorze A i B. Następnie ustaw pole jednostki na jednostkę iw polu stężenia zdefiniuj objętość komory jako jedną na mililitr. Aby rozpocząć respirometrię o wysokiej rozdzielczości, upewnij się, że sygnał strumienia tlenu jest stały na wartości dodatniej. Dodaj digitoninę, aby utrwalić błonę mitochondrialną.

Następnie dodaj podłoża pirogronianowe, jabłczanowe i prolinowe, aż strumień tlenu wzrośnie i ustabilizuje się. Naciśnij F4 na klawiaturze i wprowadź nazwę odczynnika, aby oznaczyć zdarzenie. Dodaj ADP, aby sprzęgnąć mitochondrialny łańcuch oddechowy i poczekaj na wzrost i stabilizację strumienia tlenu.

Następnie dodaj bursztynian i zmierz strumień tlenu, aby zahamować syntazę A TP, dodaj oligomycynę i zbadaj spadek strumienia tlenu. Po ustabilizowaniu się czerwonej linii, rozprzęgnij mitochondrialny transfer elektronów za pomocą 0,25 mikromolowego FCCP, aż do osiągnięcia maksymalnego zużycia tlenu, czego dowodem jest wzrost czerwonej linii. Następnie dodaj kompleks rotenonu jeden inhibitor i poczekaj na spadek i stabilizację strumienia tlenu.

Następnie dodaj inhibitor kompleksu melanianu dwa i zmierz strumień tlenu. Na koniec dodaj inhibitor kompleksu antymycyny trzy i poczekaj na spadek, a następnie wzrost i stabilizację strumienia tlenu. Kliknij oprogramowanie Graph Pad Prism, aby wyodrębnić wartości strumienia tlenu z wykresów.

Oxphos C1 odnosi się do wartości strumienia tlenu po dodaniu ADP. Następnie użyj podanego wzoru, aby obliczyć oksfos C2. Korzystając z poniższego równania, oblicz wartości tlenu ETS C1 i C2 dla rozprzęgaczy i inhibitorów. Następnie oblicz syntezę ATP jako różnicę między oksfosem a wyciekiem.

Na koniec oblicz oksphos według współczynnika nieszczelności, aby określić współczynnik kontroli oddechowej. Strumień tlenu zarówno w stanach oksfosu C1, jak i oksfosu C1 i C2 był znacznie zmniejszony u much różowych 1B9-zerowych w porównaniu z muchami kontrolnymi. Dodatkowo, strumień tlenu w stanie ETS C1, ETS C2 i ETS C1 i C2 był niższy w różowych muchach zerowych 1B9, co wskazuje na upośledzony system transferu elektronów.

W porównaniu do muchy kontrolnej. Zakłócenie strumienia elektronów wpływa na proces oksfosu, prowadząc do zmniejszonej syntezy A TP u różowych muszek 1B9-zerowych. Zmniejszenie współczynnika kontroli oddechowej u much zerowych sugeruje rozprzęganie mitochondriów, co wskazuje, że mitochondria były mniej wydajne w wykorzystywaniu tlenu i wytwarzaniu ATP.