Badanie przesiewowe fragmentów oparte na NMR w minimalnym trybie próbki, ale maksymalnym trybie automatyzacji
June 4th, 2021
Badania przesiewowe oparte na fragmentach za pomocą NMR to solidna metoda szybkiej identyfikacji małych cząsteczek wiążących biomakromolekuły (DNA, RNA lub białka). Przedstawiono protokoły opisujące przygotowanie próbek w oparciu o automatyzację, eksperymenty NMR i warunki akwizycji oraz przepływy pracy analizy. Technika ta pozwala na optymalne wykorzystanie do detekcji jąder aktywnych zarówno 1H, jak i 19F NMR.
Prowadzimy badania magnetycznego rezonansu jądrowego. Dzięki temu możemy określić struktury białek, RNA i DNA w roztworze. Te biomolekuły są składnikami, są składnikami naszych komórek, a nasze protokoły, które tutaj prezentujemy, dotyczą badań przesiewowych małych cząsteczek i ich wiązania z tymi celami.
Z tych cząsteczek nasza chemia medyczna i biologia strukturalna mogą uzyskać nowe leki, które zwalczają choroby. Główną zaletą naszej techniki jest to, że mamy pełną kontrolę nad jakością celów molekularnych, takich jak białka, a także mamy pełną kontrolę nad jakością fragmentów małych cząsteczek i leków, a także możemy badać białka pod kątem wiązania w szerokim zakresie powinowactwa, co jest zaletą w porównaniu z innymi metodologiami. Aby przygotować próbki sitowe do pomiaru NMR, użyj robota do przygotowywania próbek, aby rozprowadzić 768 związków na ośmiu 96-dołkowych płytkach, aby uzyskać 64 mieszaniny zawierające 12 fragmentów do końcowego stężenia 4,2 milimola na mieszaninę.
Przenieś interesujący nas cel biomolekularny, rozcieńczony w odpowiednim buforze przesiewowym, do odpowiedniej liczby trzymilimetrowych probówek do zmieniania próbek NMR o wysokiej przepustowości z kodem kreskowym i użyj robota do przeniesienia 10 mikrolitrów każdej mieszaniny ligandów do każdej probówki docelowej biomolekuły. Następnie poproś robota, aby dokładnie wymieszał roztwory. W celu akwizycji NMR załaduj próbkę do spektrometru.
Otwórz oprogramowanie spektrometru, a następnie wybierz zestaw parametrów i sekwencje impulsów do eksperymentów opartych na ligandach. Dla wszystkich wymienionych eksperymentów wybierz rzeźbienie wzbudzenia jako tłumienie wody. W przypadku badań przesiewowych fluoru-19 wybierz zarówno eksperymenty 1D, jak i T2.
Wybierz szerokość widmową do 220 części na milion, częstotliwość wzbudzenia na 140 części na milion, a czas analizy od jednej do pięciu godzin. W przypadku T2 czas CPMG powinien wynosić od 5 do 100 milisekund. Nagraj eksperymenty T1r i T2.
Zapisz różnicę transferu nasycenia jako pseudo 2D. Aby przetworzyć dwa pojedyncze widma 1D, użyj funkcji ProcStd programu AU, z opcją relaksu lub bez niej. WaterLOGSY to pojedynczy sygnał 1D, który powinien być fazowany z ujemnym sygnałem rozpuszczalnika.
Aby przeanalizować dane dotyczące badań przesiewowych wodoru, postępuj zgodnie z instrukcjami narzędzia do badań przesiewowych opartego na fragmentach, które przechowuje dane biomolekularnego rezonansu magnetycznego NMR z kampanii przesiewowych, tak aby każda mieszanina przesiewowa miała swój katalog, w którym podkatalog zawiera różne eksperymenty zmierzone na próbce. Widma referencyjne należy przechowywać z zapisem wszystkich danych z próbek bez celu biomolekularnego, ale z mieszaninami i pojedynczym związkiem w różnych katalogach. Utwórz bezpośrednią ścieżkę do katalogu zawierającego uzyskane dane i wybierz katalog NMR, w którym wszystkie mieszaniny powinny mieć odrębny katalog.
Upewnij się, że pliki CSV, ekran fragmentów, dokument XML i BAC są również skopiowane do katalogu NMR danych. Aby użyć narzędzia do klasyfikowania na podstawie fragmentów dla próbki przesiewowej, przeciągnij symbol projektu klasyfikowania opartego na fragmentach na środek okna analizy. Symbol powinien się pojawić, jeśli wcześniej zapisane zestawy danych zostały do niego skopiowane.
Okno opcji ekranowania opartego na fragmentach powinno otworzyć się automatycznie. Wybierz plik koktajlowy CSV zawierający nazwy miksów, nazwy każdego fragmentu oraz podział każdego fragmentu na mieszanki. Zdefiniuj folder widm ligandów referencyjnych ze wszystkimi zmierzonymi widmami pojedynczych fragmentów i zdefiniuj referencyjny pusty folder eksperymentu, który zwykle zawiera zestawy danych mieszanin bez badanego celu.
Aby zdefiniować badane widma i kolory wyświetlania widm, otwórz zakładkę Typy widm i ustaw typ specyfikacji zgodnie z danymi procesowymi. Na karcie Układ wyświetlania zdefiniuj widma, które będą porównywane zgodnie z typami specyfikacji. Następnie kliknij przycisk OK, aby rozpocząć projekt.
Podczas przetwarzania danych otworzy się osobne okno z tabelą podsumowującą wszystkie mieszanki koktajlowe i ligandy każdej mieszanki. Kliknij dwukrotnie komórkę, aby otworzyć odpowiednie zestawy danych. Przed przypisaniem spoiw upewnij się, że piki odniesienia pasują do siebie i mają takie samo przesunięcie chemiczne.
Jeśli zaobserwujesz różnice, otwórz kartę Proces i użyj opcji przetwarzania szeregowego, aby je poprawić. Do pierwszej analizy mieszanin fluoru-19 otwórz zakładkę Analiza i wybierz funkcję całkowania. Upewnij się, że dla każdego fragmentu mieszaniny zdefiniowany jest wyraźny obszar integracji dla odpowiedniego sygnału fluoru-19.
Zapisz eksportowanie regionów integracji, aby wyeksportować plik integracji do wykorzystania w przyszłości, a następnie zapisz wszystkie używane pliki integracji w odpowiednim katalogu instalacyjnym. W przypadku danych fluoru-19 otwórz zestaw danych z badanym celem lub bez niego, a następnie na karcie Analizuj kliknij opcję Integruj i odczytuj importowane regiony integracji, aby załadować odpowiedni plik integracji do bieżącego spektrum. Następnie kliknij przycisk Zapisz i wróć, aby znaleźć listę zintegrowanych regionów na karcie Całki i skopiować te informacje do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy.
Struktura molekularna lub budowa ligandów w bibliotece fragmentów jest analizowana przy użyciu oprogramowania do pomiaru pewności molekularnej, jak pokazano, a wyniki są prezentowane jako graficzne dane wyjściowe. Kolor pomarańczowy wskazuje, że fragment wykazuje niespójność w strukturze lub stężeniu. Zielone studzienki wskazują, że fragment jest spójny.
W tej reprezentatywnej analizie 103 fragmenty zawierające jedną lub kilka grup fluorowych z własnej biblioteki podzielono na pięć mieszanin po 20 do 21 fragmentów na mieszaninę. Eksperymenty z relaksacją poprzeczną fluoru-19 mierzono dla każdej mieszaniny, w której zastosowano ciągi impulsów CPMG. Progi są przydatne do definiowania spoiwa, słabego lub niewiążącego w mieszaninie, jak zaobserwowano w tych typowych widmach kinazy tyrozynowej A i RNA białka tiaminy.
W tej reprezentatywnej analizie pierwsze trafienie wykazało spadek T2 o około 50% i przesunięcie chemiczne większe lub równe sześciu herców. WaterLOGSY nie wykazał znaczącej zmiany sygnału, aby można go było uznać za dodatni. Ponieważ jednak dwa z trzech eksperymentów były pozytywne, ten fragment został zaliczony jako trafienie.
W przypadku drugiego trafienia T2 wykazał spadek intensywności sygnału o około 80%. Wyraźną zmianę sygnału zaobserwowano również w przypadku WaterLOGSY. Przesunięcie chemiczne nie było wystarczające w tym eksperymencie, ale ponieważ dwa poprzednie kryteria były pozytywne, nadal było liczone jako trafienie.
Ostatecznym celem takich metod jest opracowanie nowych leków lub inhibitorów o wysokim powinowactwie, na przykład enzymów, a w tym przypadku chemia medyczna przejmuje i syntetyzuje te nowe cząsteczki, ale biologia struktury, techniki, które tutaj stosujesz, mogą kierować chemią medyczną i sprawić, że to podejście będzie znacznie szybsze.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia solidną metodę do selekcji fragmentowej za pomocą rezonansu magnetycznego jąder (NMR) do identyfikacji małych cząsteczek łączących się z biomakrocząsteczkami. Protokoły obejmują automatyczną przygotowanie próbek, eksperymenty NMR oraz przepływy pracy do analizy, optymalizując użycie zarówno jąder 1H, jak i 19F aktywnych w NMR.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Rezonans magnetyczny jąder (NMR)
- Chemia leków
Tło
- Badania NMR pomagają w określaniu struktur białek, RNA i DNA w roztworze.
- Technika ta umożliwia selekcję małych cząsteczek pod kątem wiązania się z tymi biocząsteczkami.
- Utrzymywana jest pełna kontrola nad jakością molekularnych celów oraz małych fragmentów cząsteczek.
- Ta metoda umożliwia selekcję na szeroką gamę powinowactw wiązania.
Cel badania
- Opracowanie protokołu do selekcji małych cząsteczek łączących się z biomakrocząsteczkami.
- Dostarczenie kompleksowego przepływu pracy do selekcji fragmentowej opartej na NMR.
- Ułatwienie odkrycia nowych leków zwalczających choroby.
Zastosowane metody
- Automatyczna przygotowanie próbek przy użyciu robota do dystrybucji związków do płytek.
- Rejestrowanie NMR z określonymi parametrami dla eksperymentów opartych na ligandach.
- Przetwarzanie danych przy użyciu programu AU do analizy widm NMR.
- Integracja i analiza sygnałów fluoru-19 do oceny wiązania.
Główne wyniki
- Udane zidentyfikowanie małych wiązaczy cząsteczek za pomocą selekcji NMR.
- Demonstracja efektywności metody w analizowaniu wielu fragmentów.
- Wyniki wskazywały na różne powinowactwa fragmentów dla docelowych biocząsteczek.
- Graficzne wyniki dostarczyły wglądu w strukturę molekularną ligandów.
Wnioski
- Metoda selekcji fragmentowej jest skuteczna w odkrywaniu leków.
- Kontrola jakości próbek zwiększa wiarygodność wyników.
- To podejście można zastosować do różnych biomakrocząsteczek w rozwoju terapii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
NMR-based fragment screening with automation addresses a critical bottleneck in early drug discovery by enabling high-throughput, quantitative detection of small molecule binders to diverse biomacromolecular targets. This approach enhances predictive confidence in hit identification, reduces false positives and negatives, and supports robust portfolio triage at the target validation and lead identification stages. The integration of advanced hardware and software ensures scalable, reproducible workflows essential for enterprise R&D impact.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of target-ligand interactions across proteins and RNA with high sensitivity.
- Supports functional target validation by quantifying binding affinities over a broad dynamic range.
- Reduces mechanistic ambiguity through rigorous quality control of both targets and fragments.
- Facilitates predictive confidence and efficient triage of fragment hits for downstream medicinal chemistry.
Screening & Assay Development
- Automated sample preparation and high-throughput NMR acquisition standardize assay conditions and outputs.
- Delivers reproducible, quantitative readouts for reliable compound evaluation and hit prioritization.
- Enables scalable screening of large, diverse fragment libraries with minimal manual intervention.
- Provides validated data structures and reference spectra for platform reuse and cross-project comparability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns fragment screening outputs with structural biology and medicinal chemistry for seamless lead optimization.
- Supports continuity from early discovery through preclinical validation by ensuring data integrity and traceability.
- De-risks advancement decisions by providing robust, quantitative evidence of target engagement.
Pipeline & Workflow Integration
This automated NMR-based screening method integrates at the interface of target validation, lead identification, and early preclinical research, providing a reusable capability for both protein and RNA targets.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by directly measuring fragment binding to biomacromolecules.
- Screening: Delivers standardized, high-throughput, and quantitative assay outputs for reliable hit identification.
- Analytics: Provides robust statistical outputs, including T2 relaxation changes and chemical shift thresholds, to compare binding conditions.
- Translational Research: Ensures continuity and data quality for downstream lead optimization and preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, automated workflow adaptable across multiple targets and discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic risk in fragment hit identification.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput via automation and advanced data analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by minimizing false positives and negatives.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of validated fragment hits across diverse target classes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in NMR spectroscopy, fragment library management, and data analysis.
- Demands access to automated sample preparation robots and high-throughput NMR instrumentation.
- Necessitates standardized data structures and cross-team alignment for reproducible workflows.
- Adaptation across protein and RNA targets requires protocol optimization for buffer, pH, and ligand conditions.
- Throughput and scalability are contingent on hardware capacity and software integration.
