Name: Badanie przesiewowe fragmentów oparte na NMR w minimalnym trybie próbki, ale maksymalnym trybie automatyzacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Poznaj zautomatyzowane przesiewanie fragmentów oparte na NMR w celu identyfikacji małych cząsteczek wiążących się z białkami i RNA. Ta metoda przyspiesza odkrywanie leków poprzez zwiększenie przepustowości i jakości danych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez iNEXT-Discovery, projekt numer 871037, finansowany z programu Horyzont 2020 Komisji Europejskiej.

<ol><li>Yanamala, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR-Based+Screening+of+Membrane+Protein+Ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Biology+%26+Drug+Design%22%5BJournal%5D)">NMR-Based Screening of Membrane Protein Ligands.</a> Chemical Biology & Drug Design. 75, 237-256 (2010).</li>
<li>Souers, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABT-199%2C+a+potent+and+selective+BCL-2+inhibitor%2C+achieves+antitumor+activity+while+sparing+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets.</a> Nature Medicine. 19, 202-208 (2013).</li>
<li>Su, M. C., Te Chang, C., Chu, C. H., Tsai, C. H., Chang, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atypical+RNA+pseudoknot+stimulator+and+an+upstream+attenuation+signal+for+-1+ribosomal+frameshifting+of+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">An atypical RNA pseudoknot stimulator and an upstream attenuation signal for -1 ribosomal frameshifting of SARS coronavirus.</a> Nucleic Acids Research. 33, 4265-4275 (2005).</li>
<li>Perera, T. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+%26+pharmacological+characterization+of+JNJ-42756493+%28Erdafitinib%29%2C+a+functionally+selective+small-molecule+FGFR+family+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Discovery & pharmacological characterization of JNJ-42756493 (Erdafitinib), a functionally selective small-molecule FGFR family inhibitor.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 16, 1010-1020 (2017).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+pharmacology+of+a+highly+specific+dual+FMS+and+KIT+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Design and pharmacology of a highly specific dual FMS and KIT kinase inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 5689-5694 (2013).</li>
<li>Lipinski, C. A., Lombardo, F., Dominy, B. W., Feeney, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+and+computational+approaches+to+estimate+solubility+and+permeability+in+drug+discovery+and+development+settings%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 23, 3-25 (1997).</li>
<li>Congreve, M., Carr, R., Murray, C., Jhoti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%27Rule+of+Three%27+for+fragment-based+lead+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">A 'Rule of Three' for fragment-based lead discovery.</a> Drug Discovery Today. 8, 876-877 (2003).</li>
<li>Chávez-Hernández, A. L., Sánchez-Cruz, N., Medina-Franco, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fragment+Library+of+Natural+Products+and+its+Comparative+Chemoinformatic+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Informatics%22%5BJournal%5D)">A Fragment Library of Natural Products and its Comparative Chemoinformatic Characterization.</a> Molecular Informatics. 39, 2000050(2020).</li>
<li>Sreeramulu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+quality+control+of+fragment+libraries+for+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">NMR quality control of fragment libraries for screening.</a> Journal of Biomolecular NMR. , 00327-00329 (2020).</li>
<li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+NMR+Fragment+Based+Screening+Identified+a+Novel+Interface+Blocker+to+the+LARG%2FRhoA+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated NMR Fragment Based Screening Identified a Novel Interface Blocker to the LARG/RhoA Complex.</a> PLoS One. 9, 88098(2014).</li>
<li>Peng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+Efficient+Fragment-Based+Lead+Generation+by+Fully+Automated+Processing+and+Analysis+of+Ligand-Observed+NMR+Binding+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fast and Efficient Fragment-Based Lead Generation by Fully Automated Processing and Analysis of Ligand-Observed NMR Binding Data.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59, 3303-3310 (2016).</li>
<li>Cox, O. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+poised+fragment+library+enables+rapid+synthetic+expansion+yielding+the+first+reported+inhibitors+of+PHIP%282%29%2C+an+atypical+bromodomain%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain.</a> Chemical Science. 7, 2322-2330 (2016).</li>
<li>Hwang, T. L., Shaka, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+Suppression+That+Works.+Excitation+Sculpting+Using+Arbitrary+Wave-Forms+and+Pulsed-Field+Gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%2C+Series+A%22%5BJournal%5D)">Water Suppression That Works. Excitation Sculpting Using Arbitrary Wave-Forms and Pulsed-Field Gradients.</a> Journal of Magnetic Resonance, Series A. 112, 275-279 (1995).</li>
<li>Gossert, A. D., Jahnke, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+in+drug+discovery%3A+A+practical+guide+to+identification+and+validation+of+ligands+interacting+with+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Nuclear+Magnetic+Resonance+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">NMR in drug discovery: A practical guide to identification and validation of ligands interacting with biological macromolecules.</a> Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 97, 82-125 (2016).</li>
<li>Sklenar, V., Bax, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+water+suppression+technique+for+generating+pure-phase+spectra+with+equal+excitation+over+a+wide+bandwidth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">A new water suppression technique for generating pure-phase spectra with equal excitation over a wide bandwidth.</a> Journal of Magnetic Resonance. 75, 378-383 (1987).</li>
<li>Binas, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((19F+NMR-Based+Fragment+Screening+for+14+Different+Biologically+Active+RNAs+and+10+DNA+and+Protein+Counter-Screens%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">19F NMR-Based Fragment Screening for 14 Different Biologically Active RNAs and 10 DNA and Protein Counter-Screens.</a> ChemBioChem. , (2020).</li>
</ol>

Wszechstronność badań przesiewowych fragmentów/leków opartych na NMR. W ramach projektu BMRZ z powodzeniem wdrożono najnowocześniejsze zautomatyzowane oprzyrządowanie NMR, a także eksperymenty STD-NMR, waterLOGSY i relaksacyjne w celu identyfikacji fragmentów w szerokim zakresie powinowactwa do odkrywania leków. Zainstalowany sprzęt obejmuje wysokowydajnego robota do przygotowywania próbek oraz wysokowydajną jednostkę do przechowywania próbek, zmieniacza i akwizycji danych powiązaną ze spektrometrem 600 MHz. Niedawno zakupiona sonda kriogeniczna dla 1H, 19F, 13C i 15N zapewnia wymaganą czułość dla proponowanych pomiarów i umożliwia odsprzężenie 1H (1) podczas detekcji 19F. Sonda ta jest podłączona do najnowszej generacji konsoli NMR, która oferuje możliwość korzystania z zaawansowanych narzędzi programowych firmy Bruker, w tym CMC-q, CMC-assist, CMC-se i FBS (zawartych w TopSpin). Narzędzie do badań przesiewowych opartych na fragmentach (FBS) jest zawarte w najnowszej wersji TopSpin i pomaga analizować dane o wysokiej przepustowości, na które składają się eksperymenty z r-relaksacją STD, waterLOGSY, T2/T1. Płynny zbiór próbek 1D 1H może być napełniany do probówek NMR w sposób zautomatyzowany za pomocą robota do napełniania próbek. Zazwyczaj blok 96 probówek (3 mm) jest napełniany w ciągu około dwóch godzin. 96-dołkowe stojaki na płytki są umieszczone bezpośrednio w podajniku próbek HT, który odczytuje kod kreskowy bloku i przypisuje probówki NMR do eksperymentów sterowanych przez oprogramowanie automatyzacji (IconNMR). W podajniku próbek HT można jednocześnie przechowywać i programować pięć 96-dołkowych stojaków na płytki. Temperatura każdego z poszczególnych regałów może być kontrolowana i regulowana oddzielnie. Dodatkowo, każda pojedyncza próbka może być wstępnie kondycjonowana (podgrzewanie wstępne i suszenie rurki w celu usunięcia skondensowanej wilgoci) do żądanej temperatury przed pomiarem.
Nadaje się do szerokiego zakresu zastosowań. Jednym z szerokich zastosowań tego zautomatyzowanego badania przesiewowego opartego na NMR jest identyfikacja i opracowanie nowych ligandów wiążących się z celem biomakromolekularnym (DNA/RNA/białka). Te ligandy mogą zawierać inhibitory ortosteryczne i allosteryczne, które zazwyczaj wiążą się niekowalencyjnie. Co więcej, FBDD metodą NMR jest zwykle stosowany jako pierwszy krok do wyboru obiecujących związków, wymagania, które należy spełnić, to dostępność celu biomolekularnego w wystarczających ilościach. Cel ten dzieli się na dwa główne zadania.
Zadanie pierwsze polega na opracowaniu i scharakteryzowaniu własnej biblioteki fragmentów z następujących powodów: wstępna i okresowa kontrola jakości, charakterystyka i kwantyfikacja ponad 1000 fragmentów; oznaczanie rozpuszczalności fragmentów w zoptymalizowanych dla każdego celu, w szczególności dla docelowych białek; oraz utworzenie kilku bibliotek w celu dostosowania do różnych rusztowań i rozszerzenia na inne klasy makrocząsteczek. Zadanie drugie polega na zintegrowaniu przepływów pracy w zakresie projektowania leków opartych na fragmentach (FBDD) za pomocą NMR z wykorzystaniem: zautomatyzowanych badań przesiewowych obserwowanych ligandów 1D (obserwowano 1H i 19F); zautomatyzowane testy zastępcze (eksperymenty konkurencyjne z (naturalnym) ligandem) w celu rozróżnienia wiązania ortosterycznego i allosterycznego; zautomatyzowane wtórne badania przesiewowe z wieloma fragmentami; zautomatyzowane badania przesiewowe białek 2D oraz wtórne badania przesiewowe zestawu pochodnych wokół początkowego trafienia z wykorzystaniem biblioteki EU-OPENSCREEN lub dowolnej innej biblioteki; oraz ponowne profilowanie badań przesiewowych biblioteki FDA pod kątem wybranych celów.
Ponadto można przeprowadzić metabotypowanie różnych linii komórkowych (istotnych dla choroby) w celu rozwikłania mechanizmów regulacyjnych, które łączą kontrolę cyklu komórkowego i metabolizm. Istnieje również funkcjonalna charakterystyka elementów regulacyjnych RNA/DNA/białka in vivo i in vitro w celu optymalizacji konstruktu/domeny (optymalizacja stabilności dla badań strukturalnych (badanie przesiewowe bufora, pH, temperatury i soli) oraz rozszerzenie badań przesiewowych fragmentów opartych na NMR na białka błonowe i białka wewnętrznie nieuporządkowane, które są na ogół niedostępne dla innych technik.
Ograniczenia. Korzystanie z bibliotek fragmentów 19F i 1H ma swoje plusy i minusy, z których kilka zostanie wymienionych w dalszej części. Największą zaletą pomiarów 19F w porównaniu z 1H jest szybkość zarówno rzeczywistego czasu pomiaru, jak i późniejszej analizy, ponieważ mieszaniny zawierają prawie dwukrotnie więcej fragmentów i trzeba przeprowadzić mniej eksperymentów. Dalsza analiza jest również łatwiejsza w przypadku przesiewania 19F, ponieważ nie ma zakłóceń ze strony, a dodatkowo oferuje szerszy zakres przesunięć chemicznych przy prawie zerowym nakładaniu się sygnałów dla optymalnie zaprojektowanej mieszaniny fragmentów. Same widma są znacznie uproszczone, zwykle mają tylko jeden lub dwa sygnały na fragment, w zależności od liczby atomów fluoru. Analiza tych widm może być zatem zautomatyzowana, co ponownie skraca czas. Odbywa się to kosztem różnorodności chemicznej, przynajmniej w przypadku biblioteki wykorzystanej w tym badaniu. Ponieważ tylko ~13% biblioteki zawiera 19F, ale oczywiście wszystkie z nich nadają się do wykorzystaniaw 1 H screeningu, różnorodność fragmentów 19F będzie mniejsza. Można to obejść za pomocą specjalnie zaprojektowanych bibliotek 19F z większą liczbą fragmentów i większą różnorodnością chemiczną. Kolejną wadą ekranowania 19F jest mała liczba sygnałów na fragment. Fragmenty na ogół składają się z więcej niż jednego atomu wodoru. W związku z tym eksperymenty przesiewowe obserwowane przez 1godzinę mogą opierać się na różnych sygnałach dla tego samego fragmentu w celu wykrycia wiązania. Daje to większy stopień pewności przy identyfikowaniu trafień dla przesiewania 1H, podczas gdy badanie 19F musi opierać się na jednym lub dwóch sygnałach podawanych na fragment.
Przedstawiono szczegółowy opis nowoczesnego, zautomatyzowanego oprzyrządowania do badań przesiewowych fragmentów opartego na NMR, oprogramowania i metod analizy oraz ich protokołów. Zainstalowany sprzęt obejmuje wysokowydajnego robota do przygotowywania próbek oraz wysokowydajną jednostkę do przechowywania, zmieniania i akwizycji próbek powiązaną ze spektrometrem 600 MHz. Niedawno zainstalowana kriogeniczna głowica sondy dla 1H, 19F, 13C i 15N zapewnia wymaganą czułość dla proponowanych pomiarów i umożliwia 1H odsprzężenia podczas detekcji 19F. Co więcej, najnowsza generacja konsoli NMR oferuje możliwość korzystania z zaawansowanego oprogramowania analitycznego wspomagającego akwizycję i analizę w locie. Wyżej omówiona technologia, przepływy pracy i opisane protokoły powinny przyczynić się do niezwykłego sukcesu użytkowników realizujących FBS przez NMR.

Badanie przesiewowe oparte na fragmentach jest obecnie powszechnie stosowaną metodą identyfikacji raczej prostych cząsteczek o niskiej masie cząsteczkowej (MW <250 Da), które wykazują słabe wiązanie z celami makromolekularnymi, w tym białkami, DNA i RNA. Początkowe trafienia z głównych ekranów służą jako podstawa do przeprowadzenia wtórnego badania przesiewowego dostępnych na rynku większych analogów trafień, a następnie do wykorzystania opartych na chemii strategii wzrostu fragmentów lub łączenia. Ogólnie rzecz biorąc, aby platforma do odkrywania leków w oparciu o fragmenty (FBDD) odniosła sukces, potrzebna jest solidna metoda biofizyczna do wykrywania i charakteryzowania słabych trafień, biblioteka fragmentów, cel biomolekularny oraz strategia chemii kontrolnej. Cztery powszechnie stosowane metody biofizyczne w kampaniach odkrywania leków to testy przesunięcia termicznego, powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), krystalografia i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR).
Spektroskopia NMR pełniła różne role na różnych etapach FBDD. Oprócz zapewnienia czystości chemicznej i rozpuszczalności fragmentów w bibliotece fragmentów rozpuszczonych w zoptymalizowanym systemie buforowym, eksperymenty NMR obserwowane za pomocą ligandów mogą wykrywać wiązanie fragmentu z celem o niskim powinowactwie, a obserwowane w celu eksperymenty NMR mogą wyznaczyć epitop wiążący fragment, umożliwiając w ten sposób szczegółowe badania zależności struktura-aktywność. W ramach mapowania epitopów, zmiany przesunięcia chemicznego oparte na NMR mogą nie tylko zidentyfikować ortosteryczne miejsca wiązania, ale także miejsca allosteryczne, które mogą być tajemnicze i dostępne tylko w tak zwanych wzbudzonych stanach konformacyjnych celu biomolekularnego. Jeśli cel biomolekularny wiąże już endogenny ligand, zidentyfikowane uderzenia fragmentów można łatwo sklasyfikować jako allosteryczne lub ortosteryczne, wykonując eksperymenty konkursowe oparte na NMR. Określenie stałej dysocjacji (KD) oddziaływania ligand-cel jest ważnym aspektem w procesie FBDD. Miareczkowanie chemiczne oparte na NMR, obserwowane ligand lub cel, można łatwo przeprowadzić w celu określenia KD. Główną zaletą NMR jest to, że badania interakcji są wykonywane w roztworze i w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. W ten sposób można badać wszystkie stany konformacyjne do analizy interakcji ligand/fragment z jego celem. Co więcej, podejścia oparte na NMR są nie tylko ograniczone do badań przesiewowych dobrze sfałdowanych rozpuszczalnych białek, ale są również stosowane w celu dostosowania do większej przestrzeni docelowej, w tym DNA, RNA, białek związanych z błoną i wewnętrznie nieuporządkowanych1.
Biblioteki fragmentów są nieodzowną częścią procesu FBDD. Ogólnie rzecz biorąc, fragmenty działają jako początkowe prekursory, które ostatecznie stają się częścią (podstrukturą) nowego inhibitora opracowanego dla celu biologicznego. Kilka leków (Venetoclax2, Vemurafenib3, Erdafitinib4, Pexidartnib5) zostało zgłoszonych jako fragmenty i obecnie są z powodzeniem stosowane w klinikach. Zazwyczaj fragmenty są cząsteczkami organicznymi o niskiej masie cząsteczkowej (<250 Da) o wysokiej rozpuszczalności i stabilności w wodzie. Starannie przygotowana biblioteka fragmentów, zawierająca zazwyczaj kilkaset fragmentów, już teraz może obiecywać efektywną eksplorację przestrzeni chemicznej. Ogólny skład bibliotek fragmentów ewoluował z biegiem czasu i najczęściej był uzyskiwany poprzez rozbiór znanych leków na mniejsze fragmenty lub projektowany obliczeniowo. Te zróżnicowane biblioteki fragmentów zawierają głównie płaskie aromatyczne lub heteroatomy i są zgodne z regułą Lipińskiego 5 6 lub z aktualnym trendem komercyjnym Reguła 3 7, ale unikaj grup reaktywnych. Niektóre biblioteki fragmentów zostały również wyprowadzone lub złożone z wysoce rozpuszczalnych metabolitów, produktów naturalnych i/lub ich pochodnych8. Ogólnym wyzwaniem stawianym przez większość bibliotek fragmentów jest łatwość dalszego procesu chemicznego.
Centrum Biomolekularnego Rezonansu Magnetycznego (BMRZ) na Uniwersytecie Goethego we Frankfurcie jest partnerem iNEXT-Discovery (Infrastructure for NMR, EM and X-rays for Translational research-Discovery), konsorcjum na rzecz strukturalnych infrastruktur badawczych dla wszystkich europejskich badaczy ze wszystkich dziedzin badań biochemicznych i biomedycznych. W ramach poprzedniej inicjatywy iNEXT, która zakończyła się w 2019 roku, stworzono bibliotekę fragmentów składającą się z 768 fragmentów, której celem było "minimum fragmentów i maksymalna różnorodność" obejmująca dużą przestrzeń chemiczną. Ponadto, w przeciwieństwie do innych bibliotek fragmentów, biblioteka fragmentów iNEXT została również zaprojektowana w oparciu o koncepcję "zrównoważonych fragmentów" w celu ułatwienia dalszej syntezy złożonych ligandów o wysokim powinowactwie i odtąd znana jako biblioteka wewnętrzna (Diamond, Structural Genomic Consortium i iNEXT).
Ustanowienie FBDD przez NMR wymaga siły roboczej, wiedzy i oprzyrządowania. W BMRZ opracowano zoptymalizowane przepływy pracy w celu wsparcia pomocy technicznej w zakresie przesiewania fragmentów za pomocą NMR. Obejmują one kontrolę jakości i ocenę rozpuszczalności biblioteki fragmentów 9, optymalizację buforu dla wybranych celów, badania przesiewowe oparte na ligandach 1D obserwowanych przez 1H lub 19F, eksperymenty konkurencyjne w celu rozróżnienia między wiązaniem ortosterycznym i allosterycznym, eksperymenty NMR z obserwacją docelową w 2D do mapowania epitopów oraz do charakteryzowania interakcji z wtórnym zestawem pochodnych początkowych uderzeń fragmentu. BMRZ opracowało zautomatyzowane procedury analizy, które zostały również wcześniej omówione w literaturze 10,11, interakcji małych cząsteczek z białkami i posiada całą niezbędną zautomatyzowaną infrastrukturę do badań przesiewowych fragmentów opartych na NMR. Zaimplementowano różnicę nasycenia NMR (STD-NMR), ligand wodny obserwowany za pomocą spektroskopii gradientowej (waterLOGSY) oraz eksperymenty relaksacyjne oparte na Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) w celu identyfikacji fragmentów w szerokim zakresie reżimów powinowactwa, a także najnowocześniejsze zautomatyzowane oprzyrządowanie NMR i oprogramowanie do odkrywania leków. Podczas gdy badania przesiewowe fragmentów oparte na NMR są dobrze znane w przypadku białek, podejście to jest rzadziej stosowane do znajdowania nowych ligandów oddziałujących z RNA i DNA. W ramach projektu BMRZ opracowano dowód słuszności koncepcji nowych protokołów umożliwiających identyfikację interakcji małych cząsteczek RNA/DNA. W kolejnych sekcjach tego wkładu przedstawiono zastosowanie procedur przesiewowych na próbkach białek i RNA w celu uświadomienia sobie ustalonych protokołów dla szerokiej bazy użytkowników w badaniach biomakromolekularnych.

<table><tbody><tr><td>Bruker Avance III HD Matryca</td><td></td><td>spektrometru NMR Bruker 600 MHz</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczyste polipropylenowe probówki do przechowywania z kodem kreskowym 2D</td><td>3731-11 0,75 ml V-DOLNA PROBÓWKA/STOJAK NA ZATRZASK</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Probówki z kodami kreskowymi</td></tr><tr><td>Matrix SepraSeal i DuraSeal&</td><td>4463 Mata do nasadek, SeptraSeal 10/CS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>SampleJet</td><td></td><td>Bruker</td><td>HT Podajnik próbek</td></tr><tr><td>SamplePro Tube</td><td></td><td>Robot do pipetowania</td> <td>Bruker</td></tr></tbody></table>

badanie przesiewowe fragmentów oparte na nmr w minimalnym trybie próbki, ale maksymalnym trybie automatyzacji

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

Badania przesiewowe oparte na fragmentach (FBS) to dobrze zweryfikowana i akceptowana koncepcja w procesie odkrywania leków, zarówno w środowisku akademickim, jak i przemysłowym. Największą zaletą badań przesiewowych fragmentów opartych na NMR jest ich zdolność nie tylko do wykrywania spoiw powyżej 7-8 rzędów wielkości powinowactwa, ale także do monitorowania czystości i jakości chemicznej fragmentów, a tym samym do uzyskiwania wysokiej jakości wyników i minimalnej liczby wyników fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych. Warunkiem wstępnym w ramach FBS jest przeprowadzanie wstępnej i okresowej kontroli jakości biblioteki fragmentów, określanie rozpuszczalności i integralności chemicznej fragmentów w odpowiednich oraz tworzenie wielu bibliotek obejmujących różne rusztowania, aby pomieścić różne klasy docelowe makrocząsteczek (białka/RNA/DNA). Ponadto wymagana jest szeroko zakrojona optymalizacja protokołu przesiewowego opartego na NMR w odniesieniu do ilości próbek, szybkości akwizycji i analizy na poziomie konstruktu biologicznego/przestrzeni fragmentów, w przestrzeni warunków (bufor, dodatki, jony, pH i temperatura) oraz w przestrzeni ligandów (analogi ligandów, stężenie ligandów). Przynajmniej w środowisku akademickim te badania przesiewowe były do tej pory podejmowane ręcznie w bardzo ograniczony sposób, co prowadziło do ograniczonej dostępności infrastruktury do badań przesiewowych nie tylko w procesie opracowywania leków, ale także w kontekście opracowywania sond chemicznych. Aby sprostać wymaganiom w sposób ekonomiczny, przedstawiono zaawansowane przepływy pracy. Korzystają one z najnowszego, najnowocześniejszego, zaawansowanego sprzętu, za pomocą którego pobieranie próbek cieczy może być napełniane w sposób kontrolowany temperaturą do probówek NMR w sposób zautomatyzowany. 1Widma oparte na ligandach H/19F NMR są następnie zbierane w określonej temperaturze. Wysokowydajny podajnik próbek (podajnik próbek HT) może obsłużyć ponad 500 próbek w blokach o kontrolowanej temperaturze. To, w połączeniu z zaawansowanymi narzędziami programowymi, przyspiesza gromadzenie i analizę danych. Ponadto opisano zastosowanie procedur badań przesiewowych na próbkach białek i RNA w celu uświadomienia sobie ustalonych protokołów dla szerokiej bazy użytkowników w badaniach biomakromolekularnych.

Kontrola jakości biblioteki fragmentów 
Fragmenty z wewnętrznej biblioteki dostarczono jako 50 mM roztwory zapasowe w 90% d6-DMSO i 10% D2O (dodatek 10% D2O zapewnia zminimalizowanie degradacji związków podczas wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania14). Pojedyncze próbki związków składały się z 1 mM liganda w 50 mM buforze fosforanowym (25 mM KPi pH 6,2 + 50 mM KCl + 5 mM MgCl2), pH 6,0 w 90% H2O/9% D2O/1% d6-DMSO. Eksperymenty 1H-NMR fragmentów z biblioteki iNEXT przeprowadzono na spektrometrze NMR 50/60 MHz. Dane te wykorzystano następnie do identyfikacji pojedynczych związków w kampaniach screeningu 1H przy użyciu oprogramowania CMC-q, które umożliwia w pełni zautomatyzowaną akwizycję widm, a za pomocą dodatku analitycznego CMC-a oceniono jakość (rozpuszczalność i integralność) fragmentów. Wyniki zautomatyzowanej analizy z CMC-a przedstawiono w formie graficznej, podobnej do tej ukazanej na Rysunku 3. Wyświetlony obraz przedstawia płytkę 96-dołkową. Czerwone koło oznacza, że fragment wykazuje niespójność struktury lub stężenia. Zielone dołki wskazują, że fragment jest spójny.
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig03.jpg" /> 
Rysunek 3Kontrola jakości biblioteki fragmentów. Schematyczne przedstawienie zautomatyzowanego wyniku opartego na CMC-a. Oceniając właściwości fragmentów, takie jak stężenie i integralność strukturalna. Kolor zielony oznacza spójność, natomiast kolor pomarańczowy w tym przypadku oznacza niespójność. Niespójne fragmenty są poprawiane ręcznie zgodnie z przedstawionym schematem postępowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Około 65% i 35% fragmentów sklasyfikowano odpowiednio jako zgodne i niezgodne, zarówno w DMSO, jak i w buforze. Co więcej, 30% ligandów zaklasyfikowanych jako niezgodne stało się zgodnymi po dokładnej manualnej inspekcji widm9.
19Projekt mieszanin F 
Sto trzy fragmenty zawierające jedną lub kilka grup fluorowych z wewnętrznej biblioteki podzielono na 5 mieszanin (A, B, C, D, E). Każda mieszanina składa się z 20 do 21 fragmentów. W tym przypadku mieszaniny musiały zostać starannie zaprojektowane, aby uniknąć nakładania się sygnałów. 19W celu pomiaru eksperymentów relaksacji poprzecznej F dla każdej z mieszanin zastosowano sekwencje impulsów CPMG. Eksperymenty te można modyfikować poprzez zmianę czasów opóźnienia relaksacji. 19Przesunięcia chemiczne jądra F dla mieszanin A-E przedstawiono w Rysunek 4.
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig04.jpg" /> 
Rysunek 4: 19Widma 1D-NMR próbek mieszanin z wewnętrznej biblioteki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig04large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Przygotowanie próbek 
Przygotowanie próbek w procedurze przesiewowej 19F przeprowadzano ręcznie lub za pomocą automatycznego pipetowania z wykorzystaniem robota pipetującego&#160;. Fragmenty w każdej mieszaninie miały stężenie 2,5 mM w 90% d6-DMSO i 10% D2O. Końcowa objętość próbki przesiewowej wynosiła 170 µL z dodatkiem 5% D2O jako czynnika blokującego. Każdą mieszaninę pipetowano dwukrotnie: raz do roztworu buforowego (bez celu) i raz do roztworu buforowego zawierającego cel. Stosunek celu do fragmentu ustawiono na 1:1, co skutkowało końcowym stężeniem celu/liganda wynoszącym 50 µM. Dodatkowo przygotowano próbki kontrolne składające się z biomolekuły celu w buforze przesiewowym bez mieszaniny w celu zapewnienia integralności celu, a także próbkę kontrolną zawierającą tylko bufor i D2O w celu sprawdzenia jakości buforu.
Dane przesiewowe NMR dla 19F-1D oraz 19F-CPMG-T2 zostały&#160;wyznaczone zgodnie z opisem w sekcji 3.1. Na przykład w przypadku RNA dla pojedynczej próbki celu w buforze zastosowano sekwencję echo z powrotem po skoku (pp = zggpjrse,15).
Analiza danych 
The 19Zastosowano procedurę przesiewową dla ryboswicza TPP thiM z E. coli oraz kinazę tyrozynową białek (PtkA) z *M. tuberculosis* spośród kilku innych celów16. The 19Biblioteka przesiewowa F zawiera 103 fragmenty podzielone na 5 mieszanin (Mixes) oznaczonych od Mix A do E. Przygotowanie próbek do przesiewu można przeprowadzić ręcznie, bez użycia robota do pipetowania próbek. 40 &#181;M roztwór zawierający RNA (warunki buforowe) zmieszano z 3.2 &#181;L z mieszanin. Przygotowano dodatkowe próbki kontrolne składające się z samego buforu, buforu z 5% DMSO (wcześniej należy upewnić się co do stabilności biomakrocząsteczki w obecności pożądanego stężenia DMSO) oraz buforu z RNA. Te 13 próbek przesiewowych przygotowano i przeniesiono do probótek NMR o średnicy 3 mm. Kody kreskowe probótek NMR zostały zeskanowane, a każda mieszanina w obecności i w nieobecności RNA, jak również próbki kontrolne, zostały zmierzone zgodnie z wyżej wymienioną 19Eksperymenty NMR z wykorzystaniem 19F przeprowadzono w temperaturze 298 K. Przesiewanie RNA thiM przeciwko wewnętrznej bibliotece wykonano poprzez przeprowadzenie T2 pomiary z wykorzystaniem CPMG o czasie 0 ms i 200 ms dla każdej z różnych próbek. Prawidłowe shimowanie oraz tłumienie sygnału wody monitorowano po zakończeniu pomiarów, porównując wszystkie piki DMSO pod kątem poszerzenia linii oraz utraty intensywności dodatkowo zmierzonych 1Eksperymenty 1D H dla wszystkich próbek. Przetwarzanie uzyskanych danych T CPMG2&#160;19Spektra relaksacji F przeprowadzono odpowiednio przy użyciu wcześniej przygotowanego i zautomatyzowanego makra w programie TopSpin. Analizę danych wykonano zgodnie z instrukcjami zawartymi w sekcji protokołu. Dane całkowe uzyskane z TopSpin (zgodnie z instrukcjami w protokole) można szybko i łatwo ocenić za pomocą gotowego arkusza kalkulacyjnego lub dowolnego podobnego programu, ustawiając odpowiednie warunki i progi. Jak opisano wcześniej, progi są przydatne w definiowaniu silnych ligandów, słabych ligandów lub substancji nie wiążących. Rycina 5 przedstawia typowe wyniki widm CPMG odpowiednio dla RNA thiM oraz PtkA. W niektórych przypadkach wymagana była dalsza korekta ekspercka.
<img alt="Rycina 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig05.jpg" /> 
Rysunek 5Wytnij z 19Widma CPMG NMR ukazujące zmiany intensywności uzyskane dla różnych czasów opóźnienia w eksperymentach opartych na sekwencji CPMG. (A) Przedstawienie związku wiążącego (hit) i związku niewiążącego w 19Przesiewanie oparte na fragmentach (FBS) przeprowadzone na rybosprzełączniku TPP RNA genu thiM pochodzącego z *E. coli*(B) Przedstawienie wiązacza i związku niewiążącego w 19Przesiewanie oparte na fragmentach przeprowadzone na PtkA z M. tuberculosis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
1Przesiewowe badanie H
Projekt mieszanin 
Wykorzystana biblioteka wewnętrzna jest na tyle zróżnicowana, że na potrzeby skreningu 1H nie opracowano projektu mieszanin. Oznacza to, że przygotowano 64 mieszaniny poprzez losowy wybór 12 składników do każdej z nich.
Przygotowanie próbek 
W celu przeprowadzenia przesiewu 1H dla przykładowego RNA SARS-CoV-2, do przygotowania próbek wykorzystano automatyczne pipetowanie za pomocą robota pipetującego. Fragmenty w każdej mieszaninie miały stężenie 4,2 mM w 90% d6-DMSO i 10% D2O. Końcowa objętość próbki przesiewowej wynosiła 200 µL z dodatkiem 5% D2O jako środka blokującego. Pipetowano 64 próbki, z których każda zawierała inną mieszaninę w 25 mM KPi i 50 mM KCl o pH 6,2, bez dodatku docelowego RNA. Analogicznie pipetowano 64 próbki z docelowym RNA, z których każda zawierała inną mieszaninę. Stosunek RNA:ligand ustalono na 1:20, co przełożyło się na stężenie RNA wynoszące 10 µM i stężenie ligandu wynoszące 20 µM.
Analiza danych 
Do analizy 1H wykorzystano narzędzie FBS w programie TopSpin. Aby określić, czy dany fragment jest trafieniem (hit), przeprowadzono eksperymenty 1D przesunięcia chemicznego, waterLOGSY oraz relaksacji T2. W przypadku relaksacji T2 za trafienie uznawano spadek intensywności przekraczający 30%, natomiast dla przesunięcia chemicznego wartość graniczną ustalono na przesunięcie większe niż 6 Hz. Eksperyment waterLOGSY musiał wykazać znaczną zmianę sygnału (w tym przypadku z ujemnego na dodatni). Jeśli spełnione zostały dwa z trzech wymienionych kryteriów, fragment uznawano za trafienie. Dwa takie przykłady przedstawiono na Ryc. 6.
<img alt="Rysunek 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig06.jpg" /> 
Rycina 6: 1Przesiewowe badanie H wykonane na przykładowym RNA SARS-CoV-2, przedstawiające kryteria wyznaczania trafień. Pozyskanie danych z trzech różnych eksperymentów (1H T2 CPMG (5/10 ms), waterLOGSY oraz 1D 1H).&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Hit-1 wykazuje spadek T2 o ok. 50% oraz CSP ≥ 6 Hz. W eksperymencie waterLOGSY nie zaobserwowano zmiany sygnału wystarczająco znaczącej, aby uznać go za pozytywny. Ponieważ dwa z trzech eksperymentów są pozytywne, fragment ten uznano za hit. W przypadku Hit-2 T2 wykazuje spadek intensywności sygnału o ok. 80%, a w badaniu waterLOGSY widoczna jest wyraźna zmiana sygnału. W tym przypadku CSP nie jest wystarczające, jednak ze względu na pozytywne spełnienie dwóch poprzednich kryteriów, fragment ten nadal uznaje się za hit.

Badania przesiewowe oparte na fragmentach za pomocą NMR to solidna metoda szybkiej identyfikacji małych cząsteczek wiążących biomakromolekuły (DNA, RNA lub białka). Przedstawiono protokoły opisujące przygotowanie próbek w oparciu o automatyzację, eksperymenty NMR i warunki akwizycji oraz przepływy pracy analizy. Technika ta pozwala na optymalne wykorzystanie do detekcji jąder aktywnych zarówno 1H, jak i 19F NMR.

Badanie przesiewowe fragmentów oparte na NMR w minimalnym trybie próbki, ale maksymalnym trybie automatyzacji

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

Prowadzimy badania magnetycznego rezonansu jądrowego. Dzięki temu możemy określić struktury białek, RNA i DNA w roztworze. Te biomolekuły są składnikami, są składnikami naszych komórek, a nasze protokoły, które tutaj prezentujemy, dotyczą badań przesiewowych małych cząsteczek i ich wiązania z tymi celami.Z tych cząsteczek nasza chemia medyczna i biologia strukturalna mogą uzyskać nowe leki, które zwalczają choroby. Główną zaletą naszej techniki jest to, że mamy pełną kontrolę nad jakością celów molekularnych, takich jak białka, a także mamy pełną kontrolę nad jakością fragmentów małych cząsteczek i leków, a także możemy badać białka pod kątem wiązania w szerokim zakresie powinowactwa, co jest zaletą w porównaniu z innymi metodologiami. Aby przygotować próbki sitowe do pomiaru NMR, użyj robota do przygotowywania próbek, aby rozprowadzić 768 związków na ośmiu 96-dołkowych płytkach, aby uzyskać 64 mieszaniny zawierające 12 fragmentów do końcowego stężenia 4,2 milimola na mieszaninę.Przenieś interesujący nas cel biomolekularny, rozcieńczony w odpowiednim buforze przesiewowym, do odpowiedniej liczby trzymilimetrowych probówek do zmieniania próbek NMR o wysokiej przepustowości z kodem kreskowym i użyj robota do przeniesienia 10 mikrolitrów każdej mieszaniny ligandów do każdej probówki docelowej biomolekuły. Następnie poproś robota, aby dokładnie wymieszał roztwory. W celu akwizycji NMR załaduj próbkę do spektrometru.Otwórz oprogramowanie spektrometru, a następnie wybierz zestaw parametrów i sekwencje impulsów do eksperymentów opartych na ligandach. Dla wszystkich wymienionych eksperymentów wybierz rzeźbienie wzbudzenia jako tłumienie wody. W przypadku badań przesiewowych fluoru-19 wybierz zarówno eksperymenty 1D, jak i T2.Wybierz szerokość widmową do 220 części na milion, częstotliwość wzbudzenia na 140 części na milion, a czas analizy od jednej do pięciu godzin. W przypadku T2 czas CPMG powinien wynosić od 5 do 100 milisekund. Nagraj eksperymenty T1r i T2.Zapisz różnicę transferu nasycenia jako pseudo 2D. Aby przetworzyć dwa pojedyncze widma 1D, użyj funkcji ProcStd programu AU, z opcją relaksu lub bez niej. WaterLOGSY to pojedynczy sygnał 1D, który powinien być fazowany z ujemnym sygnałem rozpuszczalnika.Aby przeanalizować dane dotyczące badań przesiewowych wodoru, postępuj zgodnie z instrukcjami narzędzia do badań przesiewowych opartego na fragmentach, które przechowuje dane biomolekularnego rezonansu magnetycznego NMR z kampanii przesiewowych, tak aby każda mieszanina przesiewowa miała swój katalog, w którym podkatalog zawiera różne eksperymenty zmierzone na próbce. Widma referencyjne należy przechowywać z zapisem wszystkich danych z próbek bez celu biomolekularnego, ale z mieszaninami i pojedynczym związkiem w różnych katalogach. Utwórz bezpośrednią ścieżkę do katalogu zawierającego uzyskane dane i wybierz katalog NMR, w którym wszystkie mieszaniny powinny mieć odrębny katalog.Upewnij się, że pliki CSV, ekran fragmentów, dokument XML i BAC są również skopiowane do katalogu NMR danych. Aby użyć narzędzia do klasyfikowania na podstawie fragmentów dla próbki przesiewowej, przeciągnij symbol projektu klasyfikowania opartego na fragmentach na środek okna analizy. Symbol powinien się pojawić, jeśli wcześniej zapisane zestawy danych zostały do niego skopiowane.Okno opcji ekranowania opartego na fragmentach powinno otworzyć się automatycznie. Wybierz plik koktajlowy CSV zawierający nazwy miksów, nazwy każdego fragmentu oraz podział każdego fragmentu na mieszanki. Zdefiniuj folder widm ligandów referencyjnych ze wszystkimi zmierzonymi widmami pojedynczych fragmentów i zdefiniuj referencyjny pusty folder eksperymentu, który zwykle zawiera zestawy danych mieszanin bez badanego celu.Aby zdefiniować badane widma i kolory wyświetlania widm, otwórz zakładkę Typy widm i ustaw typ specyfikacji zgodnie z danymi procesowymi. Na karcie Układ wyświetlania zdefiniuj widma, które będą porównywane zgodnie z typami specyfikacji. Następnie kliknij przycisk OK, aby rozpocząć projekt.Podczas przetwarzania danych otworzy się osobne okno z tabelą podsumowującą wszystkie mieszanki koktajlowe i ligandy każdej mieszanki. Kliknij dwukrotnie komórkę, aby otworzyć odpowiednie zestawy danych. Przed przypisaniem spoiw upewnij się, że piki odniesienia pasują do siebie i mają takie samo przesunięcie chemiczne.Jeśli zaobserwujesz różnice, otwórz kartę Proces i użyj opcji przetwarzania szeregowego, aby je poprawić. Do pierwszej analizy mieszanin fluoru-19 otwórz zakładkę Analiza i wybierz funkcję całkowania. Upewnij się, że dla każdego fragmentu mieszaniny zdefiniowany jest wyraźny obszar integracji dla odpowiedniego sygnału fluoru-19.Zapisz eksportowanie regionów integracji, aby wyeksportować plik integracji do wykorzystania w przyszłości, a następnie zapisz wszystkie używane pliki integracji w odpowiednim katalogu instalacyjnym. W przypadku danych fluoru-19 otwórz zestaw danych z badanym celem lub bez niego, a następnie na karcie Analizuj kliknij opcję Integruj i odczytuj importowane regiony integracji, aby załadować odpowiedni plik integracji do bieżącego spektrum. Następnie kliknij przycisk Zapisz i wróć, aby znaleźć listę zintegrowanych regionów na karcie Całki i skopiować te informacje do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy.Struktura molekularna lub budowa ligandów w bibliotece fragmentów jest analizowana przy użyciu oprogramowania do pomiaru pewności molekularnej, jak pokazano, a wyniki są prezentowane jako graficzne dane wyjściowe. Kolor pomarańczowy wskazuje, że fragment wykazuje niespójność w strukturze lub stężeniu. Zielone studzienki wskazują, że fragment jest spójny.W tej reprezentatywnej analizie 103 fragmenty zawierające jedną lub kilka grup fluorowych z własnej biblioteki podzielono na pięć mieszanin po 20 do 21 fragmentów na mieszaninę. Eksperymenty z relaksacją poprzeczną fluoru-19 mierzono dla każdej mieszaniny, w której zastosowano ciągi impulsów CPMG. Progi są przydatne do definiowania spoiwa, słabego lub niewiążącego w mieszaninie, jak zaobserwowano w tych typowych widmach kinazy tyrozynowej A i RNA białka tiaminy.W tej reprezentatywnej analizie pierwsze trafienie wykazało spadek T2 o około 50% i przesunięcie chemiczne większe lub równe sześciu herców. WaterLOGSY nie wykazał znaczącej zmiany sygnału, aby można go było uznać za dodatni. Ponieważ jednak dwa z trzech eksperymentów były pozytywne, ten fragment został zaliczony jako trafienie.W przypadku drugiego trafienia T2 wykazał spadek intensywności sygnału o około 80%. Wyraźną zmianę sygnału zaobserwowano również w przypadku WaterLOGSY. Przesunięcie chemiczne nie było wystarczające w tym eksperymencie, ale ponieważ dwa poprzednie kryteria były pozytywne, nadal było liczone jako trafienie.Ostatecznym celem takich metod jest opracowanie nowych leków lub inhibitorów o wysokim powinowactwie, na przykład enzymów, a w tym przypadku chemia medyczna przejmuje i syntetyzuje te nowe cząsteczki, ale biologia struktury, techniki, które tutaj stosujesz, mogą kierować chemią medyczną i sprawić, że to podejście będzie znacznie szybsze.

nmr-based-fragment-screening-minimum-sample-but-maximum-automation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Profil metabolomiczny Mycobacterium tuberculosis jest określany po hodowli w pożywkach płynnych. Warunki mogą być modyfikowane w celu zbadania wpływu suplementów odżywczych, utleniaczy oraz leków przeciwgruźliczych na profil metaboliczny tego mikroorganizmu. Procedura przygotowania ekstraktu jest odpowiednia zarówno dla analiz NMR 1D 1H, jak i 2D 1H-13C.

Przygotowanie próbek ekstraktów z Mycobacterium tuberculosis do metabolomicznych badań metodą rezonansu magnetycznego jądra

W tym filmie analizujemy rozkład wielkości bezkomórkowego DNA lub fragmentów cfDNA za pomocą automatycznej elektroforezy kapilarnej. Technika ta pomaga uzyskać wgląd w profil fragmentów DNA uwalnianych przez komórki nowotworowe podczas apoptozy.

Zautomatyzowana analiza rozkładu wielkości fragmentów cfDNA oparta na elektroforezie kapilarnej: metoda oparta na mikroprocesorze DNA do badania rozkładu wielkości fragmentów DNA wyizolowanych z płynów biologicznych

Ten manuskrypt opisuje zautomatyzowane podejście do wyboru rozmiaru żelu do oczyszczania fragmentów DNA do sekwencjonowania nowej generacji. Technologia Ranger zapewnia pełną automatyzację całego procesu ładowania żelem agarozowym, analizy elektroforetycznej i odzyskiwania docelowych fragmentów DNA, co pozwala na uzyskanie wysokiej przepustowości i wysokiej jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji.

Zautomatyzowany wybór wielkości żelu w celu poprawy jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji przygotowanych na podstawie próbek wody środowiskowej

Opisany jest zintegrowany system do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji próbek onkologicznych. Ten wieloplatformowy system jest zoptymalizowany pod kątem biopsji guza o niskiej jakości i małej ilości, obsługuje niskie dane wejściowe DNA, zawiera dobrze scharakteryzowane wielowariantowe kontrole i zawiera nowatorski wariant wywołujący, który jest informowany o ilościowych przedanalitycznych środkach kontroli jakości.

Integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości

Wysokoprzepustowe testowanie patogenów opartych na DNA i RNA za pomocą nanoskalowego PCR jest opisane za pomocą syndromicznego panelu PCR na psach i koniach.

Wysokoprzepustowe wykrywanie patogenów układu oddechowego w próbkach zwierzęcych metodą nanoscale PCR

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) to potężne narzędzie do charakterystyki genomu, które jest ograniczone przez wysoki poziom błędów platformy (~0,5–2,0%). Opisujemy nasze metody sekwencjonowania z korekcją błędów, które pozwalają nam wyeliminować wskaźnik błędów NGS i wykryć mutacje przy frakcjach alleli wariantów tak rzadkich, jak 0,0001.

Wykrywanie rzadkich zdarzeń za pomocą sekwencjonowania DNA i RNA z korekcją błędów

Tutaj prezentujemy molekularną charakterystykę ekspresji dystrofiny 38 za pomocą sekwencjonowania Sangera, RT-PCR i western blottingu w badaniu klinicznym.

Charakterystyka skuteczności pomijania eksonów w próbkach pacjentów z DMD w badaniach klinicznych oligonukleotydów antysensownych

Monitorowanie zmian temperatury topnienia docelowego białka (np. test przesunięcia termicznego, TSA) jest efektywną metodą badania bibliotek fragmentów kilkuset związków. Przedstawiamy protokół TSA implementujący wspomaganą robotyką nanoróżnicową fluorymetrię skaningową (nano-DSF) do monitorowania wewnętrznej fluorescencji tryptofanu i rozpraszania wstecznego światła w celu badania przesiewowego fragmentów.

Nanoróżnicowa fluorymetria skaningowa do badań przesiewowych w wykrywaniu odprowadzeń na podstawie fragmentów

Ten protokół opisuje proces od hodowli komórkowych ex vivo lub in vitro do wstępnego przetwarzania danych transkryptomicznych w celu opłacalnego badania przesiewowego leków opartego na transkryptomie.

Ekonomiczne badania przesiewowe leków oparte na transkryptomii

Nanomaszyny oparte na DNAzyme mogą być używane do wysoce selektywnego i czułego wykrywania kwasów nukleinowych. W artykule opisano szczegółowy protokół projektowania nanomaszyn opartych na DNAzyme z rdzeniem 10-23 przy użyciu wolnego oprogramowania i ich zastosowania w wykrywaniu fragmentu wirusa Epsteina-Barr jako przykładu.

DNAzyme 10-23 - Nanomaszyny do rozpoznawania kwasów nukleinowych

Protokół ten zapewnia metodę systematycznej globalnej optymalizacji genetycznie kodowanych bioczujników poprzez wspomagane automatyzacją generowanie i ocenę bibliotek genetycznych. Jest to połączone z metodologiami projektowania eksperymentów w celu usprawnienia eksperymentów i umożliwienia selekcji komponentów genetycznych w celu dostrojenia bioczujników do określonych wyników projektu.

Efektywne pobieranie próbek z genetycznie zakodowanej przestrzeni projektowej biosensorów możliwe dzięki projektowaniu eksperymentów i automatyzacji przepływu pracy

Poznaj zautomatyzowane przesiewanie fragmentów oparte na NMR w celu identyfikacji małych cząsteczek wiążących się z białkami i RNA. Ta metoda przyspiesza odkrywanie leków poprzez zwiększenie przepustowości i jakości danych.

Badanie przesiewowe fragmentów oparte na NMR w minimalnym trybie próbki, ale maksymalnym trybie automatyzacji

Przeglądaj więcej filmów