Name: Efektywny czasowo test oparty na spektroskopii fluorescencji do oceny stanu polimeryzacji aktyny w tkankach mózgu gryzoni i ludzi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Poznaj szybką metodę fluorescencyjną do oceny polimeryzacji aktyny w tkankach mózgu gryzoni i ludzi. Test wykorzystuje falloidynę do ilościowego oznaczania F-aktyny w homogenatach i synaptosomach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Neurological Foundation of New Zealand (1835-PG), New Zealand Health Research Council (#16-597) oraz Department of Anatomy, University of Otago, Nowa Zelandia. Jesteśmy zadłużeni w Banku Tkanek Neurologicznych HCB-IDIBAPS BioBank (Hiszpania) za ludzkie tkanki mózgowe. Dziękujemy Jiaxian Zhang za pomoc w nagraniu i montażu filmu.

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami Komitetu ds. Etyki w Opiece i Użytkowaniu Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu Otago (Protokół Etyczny No. AUP95/18 i AUP80/17) oraz legislatura Nowej Zelandii. Ludzkie tkanki mózgowe pozyskano z Banku Tkanek Neurologicznych Szpitala Clínic-IDIBAPS BioBank w Barcelonie w Hiszpanii. Wszystkie protokoły pobierania tkanek zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną Szpitala Clínic w Barcelonie i uzyskano świadomą zgodę rodzin.
1. Przygotowanie i odczynników
<ol>
	<li>Przygotować następujące do homogenizacji tkanki mózgowej i przygotowania wzbogaconej frakcji zakończeń synaptycznych: 
	Bufor homogenizacyjny: 5 mM HEPES, pH 7,4 uzupełniony 0,32 M sacharozy 
	Bufor do redukcji: 5 mM Tris, pH 7,4 uzupełniony 0,32 M sacharozy 
	Bufor myjący: 5 mM Tris, pH 8,1 
	1,2 M sacharoza 
	1,0 M sacharoza 
	0,85 M sacharozy</li>
	<li>Dodaj domową lub komercyjną mieszankę inhibitorów proteazy i fosfatazy. 
	UWAGA: Użyliśmy wersji Complete Protease Inhibitor Mix bez EDTA (1 tabletka na 10 ml buforu) i koktajlu inhibitorów fosfatazy IV (1:100; objętość: objętość).</li>
	<li>Przygotować następujące i odczynniki do utrwalania, przepuszczalności i wiązania falloidyny: 
	Bufor Krebsa: 118,5 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0,1 mM KH2PO4, 5 mM NaHCO3, 10 mM glukozy, 20 mM HEPES, pH 7,4 
	1 M KCl 
	25% aldehyd glutarowy (roztwór podstawowy) 
	Bufor Krebsa zawierający 0,1 % Triton X-100 i 1 mg/ml NaBH4 
	400x Alexa Fluor 647 Phalloidyna w DMSO 
	Bufor Krebsa zawierający 0,32 M sacharozy 
	50 μM latrunkuliny A w DMSO (roztwór podstawowy) 
	1 M KCl (roztwór podstawowy) 
	UWAGA: Falloidyna jest toksyczna (LD50 = 2 mg/kg) i należy obchodzić się z nią ostrożnie. Wdychanie aldehydu glutarowego jest toksyczne i powinno być przenoszone pod wyciąg.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C, a falloidynę i latrunkulinę A w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania. 
	UWAGA: Nie zaleca się długotrwałego przechowywania. W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
</ol>
2. Homogenizacja tkanki mózgowej
<ol>
	<li>Homogenizować kriokonserwowaną lub świeżo wypreparowaną tkankę mózgową szczura w 10 objętościach buforu homogenizacyjnego w szklanej probówce Pottera-Elvehjema i tłuczku na lodzie. 
	UWAGA: Optymalna homogenizacja uzyskuje się poprzez 15-20 ręcznych uderzeń tłuczka dla tkanek mózgowych. Pomyślną homogenizację można potwierdzić poprzez płynny przepływ zawiesiny przez szklaną rurkę. W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
	<li>Określić stężenie białka w homogenacie za pomocą testu Bradforda31. 
	UWAGA: Można również zastosować alternatywne domowe lub komercyjne testy do oceny białka.</li>
	<li>Rozcieńczyć próbki homogenatu w buforze Krebsa w stężeniu 2-3 mg białka/ml w objętości 50 μl, 
	UWAGA: W niektórych naszych eksperymentach inkubujemy homogenaty z 2 μM latrunkuliną A lub DMSO (kontrole) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. W tym celu homogenaty zawiesza się w 48 μl buforu Krebsa i dodaje 2 μl 50 μM latrunkuliny A lub 2 μl DMSO. Ponadto w celu immunoblottingu po inkubacji pobiera się niewielką ilość próbki (10 μg).</li>
	<li>Utrwalić próbki homogenatu (sekcja 5).</li>
</ol>
3. Przygotowanie izolowanych zakończeń nerwowych
<ol>
	<li>Przygotowanie synaptosomów 
	UWAGA: Można również użyć alternatywnych protokołów32,33 dla synaptosomów.
	<ol>
		<li>Odwirować homogenat mózgu w temperaturze 1 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wyrzuć granulkę, która jest surową frakcją jądrową.</li>
		<li>Następnie odwirować supernatant (S1) otrzymany w kroku 3.1.1 przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Usuń supernatant (S2), który jest rozpuszczalną frakcją cytozolową.</li>
		<li>Zawiesić osad (P2) otrzymany w kroku 3.1.3, który jest surową frakcją synaptosomalną w buforze do rezawieszania. 
		UWAGA: Objętość buforu do resuspensji zależy od ilości tkanki wyjściowej i ilości uzyskanego osadu. Na przykład, zaczynając od 150-300 mg tkanek mózgowych, otrzymany osad można ponownie zawiesić w 200 μl buforu do rezawieszania.</li>
		<li>Załadować zawieszone surowe synaptosomy na nieciągły gradient sacharozy złożony z równych objętości 0,85-1,0-1,2 M sacharozy. 
		UWAGA: Zazwyczaj używamy 1 ml każdego roztworu sacharozy (na 150-300 mg tkanki). Można to zmienić w zależności od większych ilości tkanek. Nieciągłe gradienty można uzyskać za pomocą strzykawki 25G dociśniętej do wewnętrznej ścianki probówki ultrawirówki i delikatnego nakładania warstw sacharozy.</li>
		<li>Wirować przy 85 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Ze względu na dużą prędkość wirowania wymagana jest ultrawirówka zdolna do wytworzenia próżni w celu zmniejszenia nagrzewania.</li>
		<li>Zebrać frakcję synaptosomalną na granicy faz między 1,0 a 1,2 M sacharozy za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl.</li>
		<li>Przemyć frakcję synaptosomalną lodowatym buforem płuczącym przez odwirowanie w temperaturze 18 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Do przemywania frakcję synaptosomalną otrzymaną na granicy faz 1,0 i 1,2 M sacharozy zbiera się do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml i dodaje się równą objętość buforu do przemywania zapewniającego usunięcie wysokiej zawartości sacharozy z pożywki.</li>
		<li>Ponownie przepłukać osad synaptosomalny lodowatym buforem homogenizacyjnym o stężeniu 12 000 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zawiesić synaptosomy w buforze homogenizacyjnym na lodzie. 
		UWAGA: W tym miejscu można na krótko wstrzymać działanie protokołu.</li>
		<li>Określ stężenie białka za pomocą testu Bradforda.</li>
		<li>Zawiesić synaptosomy w buforze Krebsa w stężeniu 2-3 mg białka/ml w objętości 50 μl (47,5 μl, jeśli synaposomy mają być depolaryzowane przez KCl; patrz punkt 4). 
		UWAGA: W celu ponownego wymieszania, frakcja synaptosomalna jest najpierw wirowana w temperaturze 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a następnie supernatant (bufor) jest usuwany. Osad synaptosomalny jest następnie ponownie zawieszany w buforze Krebsa poprzez delikatne pipetowanie za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl.</li>
		<li>Kontynuuj depolaryzację (sekcja 4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie synaptoneurosomów 
	UWAGA: Można również stosować alternatywne protokoły34,35 dla synaptoneurosomów.
	<ol>
		<li>Przepuścić homogenat mózgu przez wstępnie zwilżony filtr siatkowy o wielkości porów 100 μm w uchwycie filtra za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. 
		UWAGA: Wstępne zwilżanie wszystkich filtrów jest ważne, aby uniknąć utraty próbki i powinno być wykonywane przy użyciu bufora homogenizacyjnego. W tym celu bufor homogenizacyjny przepuszcza się przez filtry w uchwycie filtra za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml, aż bufor wypłynie.</li>
		<li>Zebrać filtrat (F1) do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml na lodzie.</li>
		<li>Powtórzyć proces (etapy 3.2.1 i 3.2.2) dla frakcji F1 w celu uzyskania drugiego filtratu (F2).</li>
		<li>Przepuścić filtrat F2 przez filtr siatkowy o wielkości porów 5 μm.</li>
		<li>Zebrać filtrat (F3) w wstępnie schłodzonej probówce o pojemności 1,5 ml na lodzie.</li>
		<li>Odwirować filtrat F3 przy 1 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zawiesić osad (synaptoneurosomy) w buforze Krebsa na lodzie w stężeniu 2-3 mg białka/ml w objętości 50 μl (47,5 μl, jeśli synaptosomy mają być depolaryzowane przez KCl; patrz punkt 4). 
		UWAGA: W tym miejscu można na krótko wstrzymać działanie protokołu.</li>
		<li>Oszacuj stężenie białka za pomocą testu Bradforda.</li>
		<li>Kontynuuj depolaryzację (sekcja 4).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Depolaryzacja izolowanych końców synaptycznych za pośrednictwem KCl
<ol>
	<li>Równoważyć synaptosomy/synaptoneurosomy w temperaturze 37 °C przez 5-10 min.</li>
	<li>Stymulować synaptosomy/synaptoneurosomy przez dodanie KCl, aby zwiększyć zewnątrzkomórkowe K+ do 50 mM przez 30 s w temperaturze 37 °C i dodać równą objętość buforu Krebsa do odpowiedniego niestymulowanego zestawu kontrolnego. 
	UWAGA: Na przykład dodaj 2,5 μl 1 M KCl do synaptosomów zawieszonych w 47,5 μl buforu Krebsa; i dodać 2,5 μl buforu Krebsa do odpowiedniego niestymulowanego synaptosmu kontrolnego. W przypadku eksperymentów, w których bierze udział duża liczba próbek, należy postępować z nie więcej niż 2 próbkami na raz, tak aby czas depolaryzacji nie przekraczał 30 s.</li>
	<li>Zakończ stymulację, dodając aldehyd glutarowy (sekcja 5).</li>
</ol>
5. Utrwalanie i barwienie falloidyny próbek
<ol>
	<li>Dodać aldehyd glutarowy do próbek homogenatów/synaptosomalnych/synaptoneurosomalnych do końcowego stężenia 2,5% przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Dodaliśmy 6 μL 25% roztworu aldehydu glutarowego, tak aby końcowe stężenie aldehydu glutarowego w próbkach 50 μL (homogenaty/synaptosomy/synaptoneurosomy) wyniosło ok. 2,5%. Utrwalanie ma kluczowe znaczenie i powinno być szybkie, dlatego natychmiast po dodaniu aldehydu glutarowego próbka powinna być energicznie wirowana.</li>
	<li>Osadzać próbki w temperaturze 20 000 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Usuń supernatant. 
	UWAGA: Wyrzuć supernatant do dygestoria, ponieważ aldehyd glutarowy jest toksyczny.</li>
	<li>Przepuszczalność osadu przez ponowne zawieszenie w 100 μl buforu Krebsa zawierającego 0,1% Triton X-100 i 1 mg/ml NaHB4 przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Osadzać próbki w temperaturze 20 000 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć bufor przepuszczalny.</li>
	<li>Przemyć osad 200 μl buforu Krebsa przez odwirowanie przy 20 000 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Ponownie zawiesić i zabarwić granulat 1x Alexa Fluor 647 Phalloidin (odpowiadający 500 μU) w 100 μL buforu Krebsa przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Inne odmiany fluorescencyjnych analogów falloidyny są dostępne w handlu i można je zastąpić w teście. Stężenie falloidyny i całkowita objętość próbki w inkubacji mogą wymagać modyfikacji w zależności od ilości i rodzaju badanej tkanki/próbki, a optymalne warunki powinny być odpowiednio znormalizowane.</li>
	<li>Odwirować zabarwione próbki o masie 20 000 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć niezwiązaną falloidynę (supernatant).</li>
	<li>Przemyć próbkę 200 μl buforu Krebsa przez odwirowanie przy 20 000 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Zawiesić w 200 μl buforu Krebsa zawierającego 0,32 M sacharozy. 
	UWAGA: W tym miejscu można na krótko wstrzymać działanie protokołu.</li>
</ol>
6. Analiza fluorometryczna i rozpraszanie światła
<ol>
	<li>Dozuj próbki Alexa Fluor 647 barwione falloidyną na czarnej 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Zmierzyć intensywność fluorescencji przy długości fali wzbudzenia 645 nm i długości fali emisji 670 nm w czytniku płytek w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieść próbki z czarnej płytki 96-dołkowej na przezroczystą płytkę 96-dołkową za pomocą końcówek do pipet o pojemności 200 μl.</li>
	<li>Zmierz rozproszenie światła przy długości fali 540 nm, aby skorygować wszelkie straty, które mogły wystąpić podczas poprzednich etapów utrwalania, przepuszczalności i barwienia. 
	UWAGA: Różnice w materiale biologicznym zachowanym w barwionych próbkach mogą być bardziej widoczne w przypadku mniejszych ilości materiału wyjściowego (patrz Dyskusja).</li>
	<li>Dołącz zestaw falloidyny Alexa Fluor 647 w buforze Krebsa w różnych stężeniach (0,05x, 0,1x, 0,25x, 0,35x, 0,75x, 0,5x i 1x odpowiadających 25, 50, 125, 175, 250, 375 i 500 μU) dla każdej partii testu jako krzywa standardowa. 
	UWAGA: Jest to etap opcjonalny i nie ma wpływu na wyniki testu, zwłaszcza gdy poziomy F-aktyny są wyrażane w sposób względny (sekcja 7). W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
</ol>
7. Analiza danych
<ol>
	<li>Ilość F-aktyny w próbkach jest wprost proporcjonalna do intensywności fluorescencji związanej falloidyny. Wyrazić w wartościach bezwzględnych jednostki związane falloidyną obliczone na podstawie krzywej liniowej oznaczonego wzorca falloidyny. 
	UWAGA: Jako przykład patrz rysunki 2A-B, 3A, 4A-B i rysunek uzupełniający 2.</li>
	<li>Wyraż poziomy F-aktyny jako ułamek próbek kontrolnych. 
	UWAGA: Jako example, patrz rysunki 5A-B.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj test, zasadniczo zaadaptowany z poprzedniego badania30 z modyfikacjami, wykorzystuje fallotoksynę, falloidynę oznaczoną znacznikiem fluorescencyjnym. Fluorescencyjne analogi falloidyny są uważane za złoty standard barwienia włókien aktynowych w utrwalonych tkankach 47,48,49. W rzeczywistości są to najstarsze narzędzia do specyficznej identyfikacji filamentów aktynowych50</s...

Aktyna białka cytoszkieletu bierze udział w wielu funkcjach komórkowych, w tym w wsparciu strukturalnym, transporcie komórkowym, ruchliwości i podziale komórek. Aktyna występuje w równowadze w dwóch formach: monomerycznej aktyny globularnej (G-aktyna) i spolimeryzowanej aktyny nitkowatej (F-aktyna). Gwałtowne zmiany w statusie polimeryzacji aktyny (wzajemna konwersja między jej formami G i F) powodują szybkie składanie i rozkładanie włókien oraz leżą u podstaw ich regulacyjnych ról w fizjologii komórki. Aktyna stanowi główny składnik neuronalnej struktury cytoszkieletu i wpływa na szeroki zakres funkcji neuronalnych1,2. Warto zauważyć, że cytoszkielet aktynowy stanowi integralną część platformy strukturalnej zakończeń synaptycznych. W związku z tym jest głównym wyznacznikiem morfogenezy i fizjologii synaps oraz odgrywa fundamentalną rolę w kontroli wielkości, liczby i morfologii synaps3,4,5. W szczególności dynamiczna polimeryzacja i depolimeryzacja aktyny jest kluczowym wyznacznikiem przebudowy synaps związanej z plastycznością synaptyczną leżącą u podstaw procesów pamięci i uczenia się. Rzeczywiście, zarówno funkcje presynaptyczne (takie jak uwalnianie neuroprzekaźników6,7,8,9,10), jak i postsynaptyczne (dynamiczne przebudowywanie związane z plastycznością11,12,13,14) krytycznie polegają na dynamicznych zmianach stanu polimeryzacji cytoszkieletu aktynowego.
W warunkach fizjologicznych, poziomy F-aktyny są dynamicznie i ściśle regulowane przez multimodalny szlak obejmujący modyfikację potranslacyjną4,15,16 oraz białka wiążące aktynę (ABPs)4,17. ABP mogą wpływać na dynamikę aktyny na wielu poziomach (takich jak inicjowanie lub hamowanie polimeryzacji, indukowanie rozgałęziania się włókien, odcinanie włókien na mniejsze kawałki, promowanie depolimeryzacji i ochrona przed depolimeryzacją), a z kolei podlegają ścisłej kontroli modulacyjnej, wrażliwej na różne sygnały zewnątrz- i wewnątrzkomórkowe18,19,20. Takie kontrole regulacyjne na wielu poziomach dyktują ścisłą regulację dynamiki aktyny w cytoszkielecie synaptycznym, dostrajając pre- i postsynaptyczne aspekty fizjologii neuronów zarówno w stanie podstawowym, jak i indukowanym aktywnością.
Biorąc pod uwagę ważną rolę aktyny w fizjologii neuronów, nie jest zaskakujące, że kilka badań dostarczyło dowodów na zmiany w dynamice aktyny jako krytyczne zdarzenia patogenne związane z szerokim zakresem zaburzeń neurologicznych, w tym neurodegeneracją, chorobami psychicznymi, a także dolegliwościami neurorozwojowymi3,21,22,23,24,25,26,27. Pomimo bogactwa danych badawczych wskazujących na kluczową rolę aktyny w fizjologii i patofizjologii neuronów, nadal istnieją znaczne luki w zrozumieniu dynamiki aktyny, szczególnie w cytoszkielecie synaptycznym. Potrzebne są dalsze badania naukowe, aby lepiej zrozumieć aktynę neuronalną i jej zmiany w warunkach patologicznych. Jednym z głównych obszarów zainteresowania w tym kontekście jest ocena stanu polimeryzacji aktyny. Istnieją komercyjne zestawy oparte na Western blotting (zestaw biochemiczny do testów in vivo G-aktyna/F-aktyna; Cytoszkielet SKU BK03728,29) i domowe testy do oceny poziomów F-aktyny6. Ponieważ jednak wymagają one biochemicznej izolacji F-aktyny i G-aktyny, a ich późniejsza kwantyfikacja opiera się na protokołach immunoblottingu, mogą być czasochłonne. W niniejszym dokumencie przedstawiamy test oparty na spektroskopii fluorescencji zaadaptowany z poprzedniego badania30 z modyfikacjami, które można wykorzystać do oceny zarówno podstawowych poziomów F-aktyny, jak i dynamicznych zmian w jej składaniu-demontażu. Warto zauważyć, że skutecznie zmodyfikowaliśmy pierwotny protokół, który wymaga próbek odpowiednich do kuwety o pojemności 1 ml do obecnego formatu płytki 96-dołkowej. W związku z tym zmodyfikowany protokół znacznie zmniejszył ilość tkanki/próbki wymaganą do testu. Ponadto dostarczamy dowodów na to, że protokół jest odpowiedni nie tylko dla homogenatów tkanki mózgowej, ale także dla frakcji subkomórkowych, takich jak izolowane zakończenia synaptyczne (synaptosomy i synaptoneurosomy). Wreszcie, test można zastosować do świeżo wypreparowanych tkanek mózgowych gryzoni i długotrwale przechowywanych próbek ludzkiego mózgu po śmierci. Warto zauważyć, że chociaż test jest prezentowany w kontekście neuronalnym, można go odpowiednio rozszerzyć na inne typy komórek i związane z nimi procesy fizjologiczne.

<table><tbody><tr><td>3,5 mL, grubościenna rurka poliwęglanowa</td><td>Beckman Coulter</td><td>349622</td><td>Do wirowania gradientowego (przygotowanie synaptosomu)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A22287</td><td>Ligand specyficzny dla F-aktyny</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko &nbsp; b-aktyna</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-47778</td><td>Do oceny całkowitych poziomów aktyny za pomocą immunoblottingu</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko GAPDH</td><td>Abcam</td><td>Ab181602</td><td>Do oceny poziomów GAPDH za pomocą immunoblottingu</td></tr><tr><td>Bio-Rad Test białkowy Koncentrat odczynnika</td><td>barwnika Bio-Rad</td><td>5000006</td><td>Oszacowanie białka na podstawie Bradford</td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2&middot; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td>Składnik buforowy Krebsa</td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma-Aldrich 4693159001</td><td></td><td>Do hamowania endogennej aktywności proteazy podczas przygotowywania próbki</td></tr><tr><td>Corning 96-well Clear Flat Bottom Polistyren</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>Do pomiarów rozpraszania światła</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Składnik buforowy Krebsa</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td>Rozpuszczalnik do falloidyny i latrunkuliny A</td></tr><tr><td>Fluorescencyjny skaner płaski (skaner na podczerwień Odyssey)</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td></td><td>Do wykrywania sygnałów immunoreaktywnych na immunoblotach</td></tr><tr><td>Roztwór aldehydu glutarowego (25% w wodzie)</td><td>Utrwalacz</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td> stopnia II</tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Składnik buforowy do przygotowania próbki i składnik buforowy Krebsa</td></tr><tr><td>Latrunkulina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5163</td><td>Depolimeryzator włókien aktynowych</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny (MgCl2&middot; 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>Składnik buforowy Krebsa</td></tr><tr><td>Mikropłytki Filtr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>membranowy Mitex 5 mm</td><td>Millipore</td><td>LSWP01300</td><td>Przygotowanie synaptoneurosomów</td></tr><tr><td>Nunc F96 MicroWell Black Plate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>237105</td><td>Do pomiarów fluorometrycznych</td></tr><tr><td>Filtr siatkowy nylonowy 100 mm</td><td>Millipore</td><td>NY1H02500</td><td>Przygotowanie koktajlu inhibitorów fosfatazy synaptoneurosomów</td></tr><tr><td>IV</td><td>Abcam</td><td>ab201115</td><td>Do hamowania aktywności endogennej fosfatazy podczas przygotowywania próbki</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>Składnik buforowy Krebsa i do depolaryzacji zakończeń synaptycznych</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy ((KH2PO4 )</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>Składnik buforowy Krebsa</td></tr><tr><td>Borowodorek sodu (NaBH4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71320</td><td>Składnik buforu permeabilizacji</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>LabServ (Thermo Fisher Scientific)</td><td>BSPSL944</td><td>Składnik buforowy Krebsa</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>LabServ (Thermo Fisher Scientific)</td><td>BSPSL900</td><td>Składnik buforowy Krebsa</td></tr><tr><td>SpectraMax i3x</td><td>Urządzenia molekularne</td><td></td><td>Do pomiarów fluorometrycznych</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/8600/60</td><td>Składnik buforowy do przygotowania próbki</td></tr><tr><td>Uchwyt filtra Swimnex</td><td>Millipore</td><td>Sx0001300</td><td>Przygotowanie synaptoneurosomów</td></tr><tr><td>Młynek do tkanek 5 ml Potter-Elvehjem</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>358034</td><td>Do homogenizacji tkanek</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>Składnik buforu permeabilizacyjnego</td></tr><tr><td>Baza Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td>Składnik buforowy do przygotowania próbki</td></tr></tbody></table>

efektywny czasowo test oparty na spektroskopii fluorescencji do oceny stanu polimeryzacji aktyny w tkankach mózgu gryzoni i ludzi

A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues

Aktyna, główny składnik cytoszkieletu, odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu struktury i funkcji neuronów. W stanach fizjologicznych aktyna występuje w równowadze w dwóch formach: monomerycznej kulistej (G-aktyna) i spolimeryzowanej nitkowatej (F-aktyna). Na zakończeniach synaptycznych cytoszkielet aktynowy stanowi podstawę krytycznych funkcji pre- i postsynaptycznych. Co więcej, dynamiczne zmiany stanu polimeryzacji aktyny (interkonwersja między globularnymi i nitkowatymi formami aktyny) są ściśle związane ze zmianami w strukturze i funkcji synaps związanymi z plastycznością. Przedstawiamy tutaj zmodyfikowaną metodologię opartą na fluorescencji do oceny stanu polimeryzacji aktyny w warunkach ex vivo. Test wykorzystuje fluorescencyjnie znakowaną falloidynę, falotoksynę, która specyficznie wiąże się z włóknami aktynowymi (F-aktyna), zapewniając bezpośrednią miarę spolimeryzowanej aktyny nitkowatej. Jako dowód zasadniczy przedstawiamy dowody na przydatność testu zarówno w homogenatach ludzkiej tkanki mózgowej gryzoni, jak i pośmiertnych. Stosując latrunkulinę A (lek depolimeryzujący filamenty aktynowe), potwierdzamy przydatność testu w monitorowaniu zmian poziomów F-aktyny. Ponadto rozszerzamy test na biochemiczne frakcje izolowanych zakończeń synaptycznych, w których potwierdzamy zwiększoną polimeryzację aktyny po stymulacji przez depolaryzację z wysokim zewnątrzkomórkowym K +.

Liniowość analizy do oceny poziomów F-aktyny 
W pierwszej kolejności wyznaczono krzywą wzorcową dla liniowego wzrostu fluorescencji fakloidyny Alexa Fluor 647, którą powtarzano dla każdego zestawu eksperymentów (Rycina 1). Aby zbadać zakres liniowości analizy, przetworzono różne ilości homogenatów mózgu gryzoni (Ryciny 2A i 2B) oraz zmarłych ludzi (Rycina 3A i 3B). Stwierdzono, że analiza jes...

Przedstawiamy prosty, efektywny czasowo i wysokoprzepustowy test oparty na spektroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania włókien aktynowych w próbkach biologicznych ex vivo z tkanek mózgowych gryzoni i ludzi.

Efektywny czasowo test oparty na spektroskopii fluorescencji do oceny stanu polimeryzacji aktyny w tkankach mózgu gryzoni i ludzi

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin ...

Aktyna jest głównym składnikiem cytoszkieletu i krytycznie reguluje kilka aspektów morfologii i fizjologii komórek, w tym neuronów. Aktyna występuje w równowadze między swoimi dwiema formami, monomeryczną globularną G-aktyną lub polimeryczną nitkowatą F-aktyną. Status polimeryzacji aktyny jest rygorystycznie regulowany na wielu poziomach, zarówno przez białka wiążące aktynę, jak i jej własną regulację potranslacyjną.W międzyneuronalnych kontaktach synaptycznych dynamiczne zmiany poziomu F-aktyny są kluczowym zdarzeniem regulacyjnym, kontrolującym sygnalizację i plastyczność zarówno na końcach przed, jak i po synaptyce. Nic dziwnego, że dysfunkcja aktyny jest związana z kilkoma stanami neuropatologicznymi. Ostatnie postępy doprowadziły do powstania bogatej wiedzy na temat aktyny w fizjologii i patofizjologii neuronów.Jednak wiele jest nadal niewiadomych i należy się na nich skupić. Pod tym względem fluorescencyjne analogi falloidyny okazały się głównym narzędziem w badaniach nad aktyną. Ta fallotoksyna specyficznie wiąże się z aktyną nitkowatą, a zatem może być używana jako bezpośrednia miara ilości F-aktyny i jej zmiany w stanach patofizjologicznych.W badaniu przedstawiono szybki i wydajny test fluorometryczny do oceny stanu polimeryzacji aktyny w próbkach biologicznych ex-vivo, takich jak hurtowe homogenaty i biochemicznie izolowane zakończenia synaptyczne z tkanek mózgowych. Warto zauważyć, że test można zastosować do innych typów komórek i tkanek oraz związanych z nimi zjawisk fizjologicznych. Receptury użytych w tym badaniu znajdują się w tekście szczegółowym.Próbki tkanki mózgowej od szczurów lub ludzi homogenizowano w szklanej probówce Pottera-Elvehjema i tłuczku na lodzie w 10 objętościach buforu homogenizacyjnego. W celu przygotowania synaptosomu homogenat wirowano najpierw z małą prędkością, a następnie z większą prędkością, aby uzyskać surową synaptosomalną frakcję mitochondrialną. Wzbogacone synaptosomy z tej surowej frakcji otrzymano w wyniku nieciągłego gradientu sacharozy.W przypadku preparatu synaptoneurosomalnego homogenaty przepuszczono sekwencyjnie przez dwa filtry o wielkości 100 mikronów i jeden filtr o wielkości 5 mikronów. Ocenę białka przeprowadzono za pomocą odczynnika Bradforda, a próbki rozcieńczono w buforze Krebsa w stężeniu od dwóch do trzech miligramów na ml białka w końcowej objętości 50 mikrolitrów. Stymulację izolowanych zakończeń synaptycznych, synaptosomów lub synaptoneurosomów, przeprowadzono poprzez krótki 30-sekundowy wzrost zewnątrzkomórkowego potasu w temperaturze 37 stopni.W tym celu do próbek dodano jeden molowy chlorek potasu do końcowego stężenia 15 milimolów. Homogenaty są niestymulowane, a zdepolaryzowane fragmenty synaptyczne utrwalono za pomocą 2,5% aldehydu glutarowego, poprzez dodanie wymaganej objętości 25% roztworu podstawowego aldehydu glutarowego. Próbki inkubowano przez dwie, trzy minuty w temperaturze pokojowej.Utrwalacz usunięto przez odwirowanie w stężeniu 20 000 G przez pięć minut. Próbki następnie poddano procesowi permeabilizacji przez ponowne zawieszenie w buforze Krebsa zawierającym 0,1% Triton X-100 i 1 mg na ml borowodorku sodu przez dwie do trzech minut w temperaturze pokojowej. Bufor permeabilizacji został ponownie usunięty przez odwirowanie, a osad został powierzchownie przemyty buforem Krebsa i ponownie zawieszony w buforze Krebsa zawierającym 1X falloidynę Alexa Fluor 647, co odpowiada 500 mikrojednostkom falloidyny.Wiązanie pozostawiono na 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Nadmiar niezwiązanej falloidyny usunięto z próbek przez odwirowanie w temperaturze 20 000 G przez pięć minut, a granulki powierzchownie przemyto buforem Krebsa i ponownie zawieszono w buforze Krebsa zawierającym 0,32 molowej sacharozy w celu utrzymania wyporu synaptosomów lub synaptoneurosomów. Fluorescencyjne próbki związane falloidyną dozowano na czarnej płytce 96-dołkowej w celu odczytu fluorometrycznego w czytniku płytek.Długości fal wzbudzenia i emisji ustalono odpowiednio na 645 nanometrów i 670 nanometrów. Do każdego zestawu eksperymentów dołączyliśmy różne ilości falloidyny Alexa Fluor 647 w buforze Krebsa zawierającym 0,32 molowej sacharozy. Aby uwzględnić wszelkie ubytki próbek podczas etapów mycia, próbki przeniesiono z czarnej płytki do przezroczystej płytki 96-dołkowej.Pobieranie próbek zostało następnie zbadane przy 440 nanometrach. Retencja fluorescencyjnej falloidyny jest wprost proporcjonalna do ilości włókien aktynowych lub poziomów F-aktyny w próbkach. Liniowość wiązania falloidyny obserwowano w zakresie od 50 do 200 mikrogramów białek.Jako dowód słuszności zasady, przetestowaliśmy również skuteczność naszego testu w modelach depolimeryzacji F-aktyny przy użyciu farmakologicznego rozerwania filamentów aktyny przez latrunkulinę A, a także stymulacji tworzenia F-aktyny przez stymulację izolowanych zakończeń synaptycznych za pośrednictwem KCl. Emisja fluorescencji ze związanej falloidyny może być wyrażona jako jednostki związanej falloidyny wygenerowane ze standardowej krzywej liniowej i są względne w stosunku do próbek kontrolnych. Dla ryciny 4 poziomy F-aktyny są wyrażone jako mikrojednostki związanej falloidyny.Z drugiej strony, dla rysunku 5 poziomy F-aktyny w zdepolaryzowanych fragmentach synaptycznych są wyrażane w stosunku do kontrolnych próbek niezdepolaryzowanych. Opisujemy solidny, efektywny czasowo i wysokoprzepustowy test do analizy filamentów aktynowych lub F-aktyny oraz jej zmian w stanach fizjologicznych i patofizjologicznych odpowiednich dla formatu płytki 96-dołkowej. Test jest znacznie szybszy niż istniejące alternatywne protokoły i może służyć jako niezbędne narzędzie w badaniach związanych z aktyną, samodzielnie lub w połączeniu z istniejącymi testami immunohistochemicznymi i Western blot.

a-time-efficient-fluorescence-spectroscopy-based-assay-for-evaluating

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje procedurę fluorescencyjnego barwienia neuronów korowych szczurów do mikroskopii. Jest ukierunkowany na F-aktynę i białka dendrytyczne w celu analizy integralności strukturalnej i obliczenia gęstości F-aktyny, co ma kluczowe znaczenie dla badania funkcji i zdrowia neuronów.

Kwantyfikacja nitkowatej aktyny punktowej w neuronach kory mózgowej szczura

Nitkowata aktyna (F-aktyna) odgrywa ważną rolę w spinogenezie, plastyczności synaptycznej i stabilności synaptycznej. Kwantyfikacja F-aktyny puncta jest zatem użytecznym narzędziem do badania integralności struktur synaptycznych. Protokół ten opisuje procedury ilościowego oznaczania F-aktyny puncta znakowanej falloidyną w pierwotnych kulturach neuronów korowych o niskiej gęstości.

Kwantyfikacja punkcji aktyny nitkowatej (F-aktyny) w neuronach korowych szczurów

Prezentujemy otwarty instrument do analizy wysokiej zawartości (HCA) wykorzystujący automatyczne obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) do oznaczania interakcji białek za pomocą odczytów opartych na transferze energii rezonansu Förstera (FRET). Akwizycja danych dla tego urządzenia openFLIM-HCA jest kontrolowana przez oprogramowanie napisane w μManager, a analiza danych odbywa się w FLIMfit.

Analiza Open Source o wysokiej zawartości z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Prezentowana tutaj jest zmodyfikowana metoda rolkowa do hodowli i przerywanego obrazowania w wysokiej rozdzielczości wycinków mózgu gryzoni przez wiele tygodni z precyzyjną zmianą położenia na fototrawionych szkiełkach nakrywkowych. Żywotność neuronów i morfologia warstw są dobrze zachowane. Zapewnione są zastosowania tego w pełni zamkniętego systemu wykorzystującego wirusy do ekspresji specyficznej dla typu komórki.

Zmodyfikowana metoda rurki rolkowej do precyzyjnie zlokalizowanego i powtarzalnego obrazowania przerywanego podczas długotrwałej hodowli wycinków mózgu w systemie zamkniętym

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Przedstawiono procedurę wizualizacji aktywności kinazy białkowej A u myszy zachowujących się jak myszy. Ulepszony reporter aktywności kinazy A, tAKARα, ulega ekspresji w neuronach korowych i jest dostępny do obrazowania przez okno czaszkowe. Mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej służy do wizualizacji aktywności PKA in vivo podczas wymuszonej lokomocji.

Wizualizacja aktywności kinazy białkowej A u myszy zachowujących się z głową przy użyciu mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej in vivo

Tutaj prezentujemy protokół, który wykorzystuje barwniki bliskiej podczerwieni w połączeniu z immunohistochemią i skanowaniem w wysokiej rozdzielczości do oznaczania białek w obszarach mózgu.

Wykorzystanie fluorescencji w bliskiej podczerwieni i skanowania w wysokiej rozdzielczości do pomiaru ekspresji białek w mózgu gryzoni

Opisujemy metody fotoaktywacji fluorescencji do analizy transportu aksonalnego neurofilamentów w pojedynczych mielinizowanych aksonach nerwów obwodowych od transgenicznych myszy, które wyrażają fotoaktywowane białko neurofilamentu.

Obrazowanie i analiza transportu neurofilamentów w wyciętym nerwie piszczelowym myszy

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Prezentujemy protokoły prostych testów mikroprzepływowych filamentów aktynowych, w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną, które pozwalają na dokładne monitorowanie poszczególnych filamentów aktynowych w czasie rzeczywistym, podczas sekwencyjnego wystawiania ich na działanie różnych roztworów białkowych.

Wykorzystanie mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki składania pojedynczych filamentów i wiązek aktyny

Ten protokół jest przewodnikiem do wizualizacji dynamicznych aktyny i mikrotubul za pomocą testu in vitro total internal fluorescence (TIRF)  mikroskopowego.

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Poznaj szybką metodę fluorescencyjną do oceny polimeryzacji aktyny w tkankach mózgu gryzoni i ludzi. Test wykorzystuje falloidynę do ilościowego oznaczania F-aktyny w homogenatach i synaptosomach.

Efektywny czasowo test oparty na spektroskopii fluorescencji do oceny stanu polimeryzacji aktyny w tkankach mózgu gryzoni i ludzi (Wideo) | JoVE Journal

Efektywny czasowo test oparty na spektroskopii fluorescencji do oceny stanu polimeryzacji aktyny w tkankach mózgu gryzoni i ludzi

Przeglądaj więcej filmów