Efektywny czasowo test oparty na spektroskopii fluorescencji do oceny stanu polimeryzacji aktyny w tkankach mózgu gryzoni i ludzi

Aktyna jest głównym składnikiem cytoszkieletu i krytycznie reguluje kilka aspektów morfologii i fizjologii komórek, w tym neuronów. Aktyna występuje w równowadze między swoimi dwiema formami, monomeryczną globularną G-aktyną lub polimeryczną nitkowatą F-aktyną. Status polimeryzacji aktyny jest rygorystycznie regulowany na wielu poziomach, zarówno przez białka wiążące aktynę, jak i jej własną regulację potranslacyjną.

W międzyneuronalnych kontaktach synaptycznych dynamiczne zmiany poziomu F-aktyny są kluczowym zdarzeniem regulacyjnym, kontrolującym sygnalizację i plastyczność zarówno na końcach przed, jak i po synaptyce. Nic dziwnego, że dysfunkcja aktyny jest związana z kilkoma stanami neuropatologicznymi. Ostatnie postępy doprowadziły do powstania bogatej wiedzy na temat aktyny w fizjologii i patofizjologii neuronów.

Jednak wiele jest nadal niewiadomych i należy się na nich skupić. Pod tym względem fluorescencyjne analogi falloidyny okazały się głównym narzędziem w badaniach nad aktyną. Ta fallotoksyna specyficznie wiąże się z aktyną nitkowatą, a zatem może być używana jako bezpośrednia miara ilości F-aktyny i jej zmiany w stanach patofizjologicznych.

W badaniu przedstawiono szybki i wydajny test fluorometryczny do oceny stanu polimeryzacji aktyny w próbkach biologicznych ex-vivo, takich jak hurtowe homogenaty i biochemicznie izolowane zakończenia synaptyczne z tkanek mózgowych. Warto zauważyć, że test można zastosować do innych typów komórek i tkanek oraz związanych z nimi zjawisk fizjologicznych. Receptury użytych w tym badaniu znajdują się w tekście szczegółowym.

Próbki tkanki mózgowej od szczurów lub ludzi homogenizowano w szklanej probówce Pottera-Elvehjema i tłuczku na lodzie w 10 objętościach buforu homogenizacyjnego. W celu przygotowania synaptosomu homogenat wirowano najpierw z małą prędkością, a następnie z większą prędkością, aby uzyskać surową synaptosomalną frakcję mitochondrialną. Wzbogacone synaptosomy z tej surowej frakcji otrzymano w wyniku nieciągłego gradientu sacharozy.

W przypadku preparatu synaptoneurosomalnego homogenaty przepuszczono sekwencyjnie przez dwa filtry o wielkości 100 mikronów i jeden filtr o wielkości 5 mikronów. Ocenę białka przeprowadzono za pomocą odczynnika Bradforda, a próbki rozcieńczono w buforze Krebsa w stężeniu od dwóch do trzech miligramów na ml białka w końcowej objętości 50 mikrolitrów. Stymulację izolowanych zakończeń synaptycznych, synaptosomów lub synaptoneurosomów, przeprowadzono poprzez krótki 30-sekundowy wzrost zewnątrzkomórkowego potasu w temperaturze 37 stopni.

W tym celu do próbek dodano jeden molowy chlorek potasu do końcowego stężenia 15 milimolów. Homogenaty są niestymulowane, a zdepolaryzowane fragmenty synaptyczne utrwalono za pomocą 2,5% aldehydu glutarowego, poprzez dodanie wymaganej objętości 25% roztworu podstawowego aldehydu glutarowego. Próbki inkubowano przez dwie, trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Utrwalacz usunięto przez odwirowanie w stężeniu 20 000 G przez pięć minut. Próbki następnie poddano procesowi permeabilizacji przez ponowne zawieszenie w buforze Krebsa zawierającym 0,1% Triton X-100 i 1 mg na ml borowodorku sodu przez dwie do trzech minut w temperaturze pokojowej. Bufor permeabilizacji został ponownie usunięty przez odwirowanie, a osad został powierzchownie przemyty buforem Krebsa i ponownie zawieszony w buforze Krebsa zawierającym 1X falloidynę Alexa Fluor 647, co odpowiada 500 mikrojednostkom falloidyny.

Wiązanie pozostawiono na 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Nadmiar niezwiązanej falloidyny usunięto z próbek przez odwirowanie w temperaturze 20 000 G przez pięć minut, a granulki powierzchownie przemyto buforem Krebsa i ponownie zawieszono w buforze Krebsa zawierającym 0,32 molowej sacharozy w celu utrzymania wyporu synaptosomów lub synaptoneurosomów. Fluorescencyjne próbki związane falloidyną dozowano na czarnej płytce 96-dołkowej w celu odczytu fluorometrycznego w czytniku płytek.

Długości fal wzbudzenia i emisji ustalono odpowiednio na 645 nanometrów i 670 nanometrów. Do każdego zestawu eksperymentów dołączyliśmy różne ilości falloidyny Alexa Fluor 647 w buforze Krebsa zawierającym 0,32 molowej sacharozy. Aby uwzględnić wszelkie ubytki próbek podczas etapów mycia, próbki przeniesiono z czarnej płytki do przezroczystej płytki 96-dołkowej.

Pobieranie próbek zostało następnie zbadane przy 440 nanometrach. Retencja fluorescencyjnej falloidyny jest wprost proporcjonalna do ilości włókien aktynowych lub poziomów F-aktyny w próbkach. Liniowość wiązania falloidyny obserwowano w zakresie od 50 do 200 mikrogramów białek.

Jako dowód słuszności zasady, przetestowaliśmy również skuteczność naszego testu w modelach depolimeryzacji F-aktyny przy użyciu farmakologicznego rozerwania filamentów aktyny przez latrunkulinę A, a także stymulacji tworzenia F-aktyny przez stymulację izolowanych zakończeń synaptycznych za pośrednictwem KCl. Emisja fluorescencji ze związanej falloidyny może być wyrażona jako jednostki związanej falloidyny wygenerowane ze standardowej krzywej liniowej i są względne w stosunku do próbek kontrolnych. Dla ryciny 4 poziomy F-aktyny są wyrażone jako mikrojednostki związanej falloidyny.

Z drugiej strony, dla rysunku 5 poziomy F-aktyny w zdepolaryzowanych fragmentach synaptycznych są wyrażane w stosunku do kontrolnych próbek niezdepolaryzowanych. Opisujemy solidny, efektywny czasowo i wysokoprzepustowy test do analizy filamentów aktynowych lub F-aktyny oraz jej zmian w stanach fizjologicznych i patofizjologicznych odpowiednich dla formatu płytki 96-dołkowej. Test jest znacznie szybszy niż istniejące alternatywne protokoły i może służyć jako niezbędne narzędzie w badaniach związanych z aktyną, samodzielnie lub w połączeniu z istniejącymi testami immunohistochemicznymi i Western blot.