Name: Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Poznaj metody fluorescencyjnego obrazowania funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w hodowanych neuronach. Techniki te umożliwiają szybką ocenę transmisji synaptycznej i badanie potencjalnych terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować obecnym i byłym członkom Jefferson Weinberg ALS Center za krytyczne opinie i sugestie dotyczące optymalizacji tych technik i ich analiz. Praca ta była wspierana przez fundusze NIH (RF1-AG057882-01 i R21-NS0103118 do D.T.), NINDS (R56-NS092572 i R01-NS109150 do P.P.), Muscular Dystrophy Association (D.T.), Robert Packard Center for ALS Research (D.T.), fundacji Family Strong 4 ALS oraz Fundacji Rodziny Farber (B.K.J., K.K. i P.P.).

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Trzy kroki wspólne dla obu opisanych metod mają kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu i wymiernych wyników. Po pierwsze, niezbędne jest przygotowanie świeżego płynu mózgowo-rdzeniowego przed każdą rundą eksperymentów, zgodnie z załączoną instrukcją. Niezastosowanie się do tego może zapobiec odpowiedniej depolaryzacji neuronów. Próbka nieleczonych neuronów kontrolnych powinna być stale testowana przed stymulacją jakichkolwiek grup eksperymentalnych, aby zapewnić prawidłową depolaryzację komórkową i stanowić punkt...

Modelowanie stwardnienia bocznego zanikowego (ALS) w warunkach laboratoryjnych jest wyjątkowo trudne ze względu na przytłaczająco sporadyczny charakter ponad 80% przypadków1, w połączeniu z ogromną liczbą znanych mutacji genetycznych wywołujących tę chorobę2. Mimo to, wszystkie przypadki ALS łączy wspólna cecha: przed całkowitym zdegenerowaniem neuronów dochodzi do zaburzeń komunikacji między presynaptycznymi neuronami ruchowymi a postsynaptycznymi komórkami mięśniowymi3,4. Klinicznie, w miarę utraty połączeń między pozostałymi górnymi i dolnymi neuronami ruchowymi, u pacjentów w przebiegu choroby występują objawy nadmiernej i obniżonej pobudliwości neuronalnej5,6,7,8,9, co odzwierciedla złożone, leżące u podstaw zmiany molekularne w tych synapsach, które staramy się zrozumieć jako badacze ALS.
Wiele modeli transgenicznych wykazało, że degradacja i dezorganizacja złącza nerwowo-mięśniowego występują przy ekspresji mutacji genetycznych wywołujących ALS, w tym SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 oraz TDP4317,18,19, co potwierdzono w ocenach morfologicznych, obejmujących analizę guzków synaptycznych, gęstości kolców dendrytycznych oraz organizacji presynaptycznej i postsynaptycznej. Pod względem mechanistycznym, od czasu przełomowych prac Cole'a, Hodgkina i Huxleya z lat 30. XX wieku, możliwe stało się również ocenianie odpowiedzi synaptycznych za pomocą technik elektrofizjologicznych, zarówno w hodowlach komórkowych in vitro, jak i w preparatach skrawków tkankowych20. Dzięki tym strategiom w wielu modelach ALS wykazano deficyty przekaźnictwa synaptycznego. Na przykład mutant wariantu TDP43 powoduje zwiększenie częstotliwości wyładowań i obniżenie progu potencjału czynnościowego w komórkach podobnych do neuronów ruchowych NSC-34 (linia hybrydowa rdzenia kręgowego x neuroblastomy 34)21. Ten sam wariant powoduje również dysfunkcyjne przekaźnictwo synaptyczne w złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) przed wystąpieniem behawioralnych deficytów ruchowych w modelu mysim22. Wcześniej wykazano, że ekspresja mutantu FUS skutkuje zmniejszeniem przekaźnictwa synaptycznego w NMJ w modelu drosofili FUS-ALS przed wystąpieniem zaburzeń lokomocyjnych11. Niedawny raport z wykorzystaniem indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących od nosicieli ekspansji C9orf72 ujawnił redukcję łatwo uwalnianej puli pęcherzyków synaptycznych23. Podsumowując, badania te i inne podkreślają znaczenie budowania pełniejszego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw sygnalizacji synaptycznej w modelach ALS istotnych dla przebiegu choroby. Będzie to kluczowe dla zrozumienia patobiologii ALS i opracowania potencjalnych celów terapeutycznych dla pacjentów.
Metody zaciskania prądowego i napięciowego komórek były nieocenione w określaniu właściwości błonowych, takich jak przewodnictwo, spoczynkowy potencjał błonowy oraz zawartość kwantowa poszczególnych synaps20,24. Jednak jednym z istotnych ograniczeń elektrofizjologii jest fakt, że jest ona wymagająca technicznie i dostarcza informacji tylko z jednego neuronu w danym czasie. Konfokalna mikroskopia żywych komórek, w połączeniu ze specyficznymi sondami fluorescencyjnymi, daje możliwość badania transmisji synaptycznej neuronów w sposób spatiotemporalny25,26,27. Choć nie jest to bezpośredni pomiar pobudliwości neuronalnej, podejście fluorescencyjne może dostarczyć względnego pomiaru dwóch molekularnych korelacji funkcji synaptycznej: uwalniania pęcherzyków synaptycznych oraz przejściowych zmian stężenia wapnia w zakończeniach synaptycznych.
Gdy potencjał czynnościowy dociera do regionu terminala presynaptycznego neuronów, wyzwalane są przejściowe wzrosty stężenia wapnia, co ułatwia przejście od sygnału elektrycznego do procesu uwalniania neurotransmiterów28. Napięciowo zależne kanały wapniowe zlokalizowane w tych obszarach ściśle regulują sygnalizację wapniową, aby modulować kinetykę uwalniania neurotransmiterów29. Pierwsze opisane rejestracje przejściowych zmian stężenia wapnia oparte na fluorescencji przeprowadzono przy użyciu dwudługościowego wskaźnika Fura-2 AM lub jednodługościowego barwnika Fluo-3 AM30,31,32. Choć barwniki te dostarczyły w tamtym czasie przełomowych informacji, obarczone są kilkoma ograniczeniami, takimi jak niespecyficzna kompartymentalizacja wewnątrz komórek, aktywna lub pasywna utrata barwnika z komórek znakowanych, fotoblaknięcie oraz toksyczność przy obrazowaniu przez dłuższy czas33. W ciągu ostatniej dekady genetycznie kodowane wskaźniki wapnia stały się podstawowymi narzędziami do obrazowania różnych form aktywności neuronalnej. Wskaźniki te łączą zmodyfikowane białko fluorescencyjne z białkiem chelatującym wapń, które szybko zmienia intensywność fluorescencji po związaniu jonów Ca2+34. Zastosowanie tych nowych wskaźników jest bardzo szerokie, co pozwala na znacznie łatwiejszą wizualizację wewnątrzkomórkowych przejściowych zmian stężenia wapnia zarówno w warunkach in vitro, jak i in vivo. Obecnie powszechnie wykorzystywana jest rodzina tych genetycznie kodowanych reporterów znana jako GCaMP. Wskaźniki te zawierają domenę kalmoduliny na końcu C-terminalnym, po której następuje zielone białko fluorescencyjne (GFP), a całość wieńczy region wiążący kalmodulinę na końcu N-terminalnym35,36. Wiązanie wapnia do domeny kalmoduliny wywołuje oddziaływanie z regionem wiążącym kalmodulinę, co prowadzi do zmiany konformacyjnej w ogólnej strukturze białka i znacznego wzrostu fluorescencji części GFP35,36. Na przestrzeni lat rodzina ta przechodziła kilka ewolucyjnych modyfikacji, aby umożliwić odczytywanie konkretnych przejściowych zmian stężenia wapnia o określonej kinetyce (wolnej, średniej i szybkiej), z których każda posiada nieco inne właściwości37,38. W niniejszej pracy wyróżniono zastosowanie reportera GcaMP6, o którym wcześniej wykazano, że wykrywa pojedyncze potencjały czynnościowe oraz dendrytyczne przejściowe zmiany stężenia wapnia w neuronach zarówno in vivo, jak i in vitro37.
Przejściowe wzrosty stężenia wapnia w regionie presynaptycznym wyzwalają zdarzenia fuzji pęcherzyków synaptycznych, co powoduje uwalnianie neuroprzekaźników do szczeliny synaptycznej i inicjację zdarzeń sygnalizacyjnych w komórce postsynaptycznej28,39. Pęcherzyki synaptyczne są szybko uwalniane i recyklingowane, ponieważ komórka homeostatycznie utrzymuje stałą powierzchnię błony komórkowej oraz pulę pęcherzyków związanych z błoną, zdolnych do fuzji i gotowych do uwalniania40. Zastosowany tutaj barwnik styrylowy wykazuje powinowactwo do błon lipidowych i specyficznie zmienia swoje właściwości emisyjne w zależności od uporządkowania otaczającego środowiska lipidowego41,42. Dzięki temu jest on idealnym narzędziem do znakowania recyklingowanych pęcherzyków synaptycznych i późniejszego śledzenia tych pęcherzyków podczas ich uwalniania po stymulacji neuronalnej41,42. Opracowany i zoptymalizowany protokół jest adaptacją koncepcji opisanych pierwotnie przez Gaffielda i współpracowników, co pozwala na ciągłą wizualizację oznakowanych barwnikiem styrylowym punktów pęcherzyków synaptycznych w czasie41.
W niniejszej pracy opisano dwie powiązane metodologie oparte na fluorescencji, które wiarygodnie raportują specyficzne zdarzenia komórkowe biorące udział w transmisji synaptycznej. Zdefiniowano protokoły służące do badania dynamiki indukowanego depolaryzacją napływu jonów wapnia do zakończeń presynaptycznych oraz egzocytozy pęcherzyków synaptycznych w hodowlach neuronów. Metody i reprezentatywne wyniki koncentrują się tutaj na wykorzystaniu pierwotnych neuronów korowych lub ruchowych gryzoni jako modelu in vitro, ponieważ istnieją opublikowane badania z wykorzystaniem tych typów komórek43,44. Metody te są jednak możliwe do zastosowania również w przypadku zróżnicowanych ludzkich neuronów korowych pochodzących z i345, ponieważ odnieśliśmy sukces w zastosowaniu obu protokołów w aktualnie prowadzonych eksperymentach w naszym laboratorium. Ogólny protokół przedstawiono w formie liniowej sekwencji kroków, ukazanej na Rysunku 1. W skrócie, aby badać dynamikę wapnia w neurytach, dojrzałe neurony są transfekowane plazmidowym DNA w celu ekspresji fluorescencyjnego reportera GCaMP6m pod promotorem cytomegalowirusowym (CMV)37,46. Transfekowane komórki wykazują niski poziom podstawowej fluorescencji zielonej, która wzrasta w obecności wapnia. Wyznacza się obszary zainteresowania (ROI), aby monitorować zmiany fluorescencji podczas przeprowadzanych manipulacji. Pozwala to na pomiar fluktuacji wapnia o wysokiej lokalizacji przestrzennej i czasowej37,46. W celu oceny fuzji i uwalniania pęcherzyków synaptycznych, dojrzałe neurony są obciążane barwnikiem styrylowym, który wbudowuje się w błony pęcherzyków synaptycznych podczas ich recyklingu, reformowania i ponownego napełniania neuroprzekaźnikami w komórkach presynaptycznych41,42,43,47,48. Obecnie stosowane do tego celu barwniki znakują pęcherzyki synaptyczne wzdłuż neurytów i są wykorzystywane jako wskaźnik tych obszarów w eksperymentach z obrazowaniem na żywo, co wykazały badania Kraszewskiego i współpracowników poprzez wspólne barwienie barwnikiem styrylowym i synaptotagminą49. Dołączono tutaj reprezentatywne obrazy podobnych barwień, które również zostały wykonane (Rysunek 2A). Poprzedni badacze szeroko wykorzystywali takie barwniki do raportowania dynamiki pęcherzyków synaptycznych w złączach nerwowo-mięśniowych i neuronach hipokampa48,49,50,51,52,53,54,55,56. Poprzez wybór punktowych obszarów pęcherzyków obciążonych barwnikiem oraz monitorowanie spadku intensywności fluorescencji po uwolnieniu pęcherzyków, można badać funkcjonalną wydajność transmisji synaptycznej oraz dynamikę czasową uwalniania po stymulacji43. W obu metodach stosuje się medium zawierające wysokie stężenie chlorku potasu, aby zdepolaryzować komórki w celu naśladowania aktywności neuronalnej. Parametry obrazowania są określone tak, aby rejestrować odstępy poniżej sekundy, obejmujące normalizację linii bazowej, a następnie okres rejestracji stymulacji. Pomiary fluorescencji w każdym punkcie czasowym są wyznaczane, normalizowane względem tła i kwantyfikowane w całym okresie eksperymentu. Dzięki tej strategii można wykryć wzrost fluorescencji GCaMP6m indukowany napływem wapnia lub spadek fluorescencji barwnika styrylowego wynikający z efektywnej egzocytozy pęcherzyków synaptycznych. Szczegółowy opis konfiguracji metodologicznej i parametrów dla tych dwóch protokołów oraz omówienie ich zalet i ograniczeń przedstawiono poniżej.
<img alt="Schemat pracy z kulturą neuronalną: sekcja, transfekcja DNA, mikroskopia, stymulacja, analiza danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62813/62813fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Wizualizacja ogólnego przebiegu protokołu. (1) Izolacja i hodowla pierwotnych neuronów gryzoni in vitro do wybranego punktu czasowego dojrzewania. (2) Wprowadzenie DNA GCaMP lub barwnika styrylowego jako reporterów aktywności synaptycznej. (3) Konfiguracja paradygmatu obrazowania z wykorzystaniem mikroskopu konfokalnego wyposażonego do obrazowania na żywo oraz powiązanego oprogramowania. Rozpoczęcie okresu pomiaru bazowego. (4) Podczas trwania akwizycji obrazów na żywo, stymulacja neuronów poprzez perfuzję kąpieli z wysokim stężeniem KCl. (5) Ocena pomiarów intensywności fluorescencji w czasie w celu zmierzenia przejściowych zmian stężenia wapnia lub fuzji pęcherzyków synaptycznych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62813/62813fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>20x obiektyw powietrzny</td><td>Nikon</td><td></td><td>Do obrazowania</td></tr><tr><td>40-krotny obiektyw zanurzeniowy</td><td>w oleju Nikon</td><td></td><td>Do obrazowania</td></tr><tr><td>suplement B27</td><td>Thermo Scientific</td><td>17504044</td><td>Suplement na wzrost neuronów</td></tr><tr><td>Strzykawki BD bez igły, 50 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-689-8</td><td>Część zespołu perfuzji grawitacyjnej</td></tr><tr><td>Kaptur</td> <td>do hodowli komórkowej bezpieczeństwa biologicznegoBaker</td><td>SterilGARD III SG403A</td><td>Asceptic cell hodowla, transfekcja i ładowanie barwnika</td></tr><tr><td>b-Merkaptoetanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>M3148</td><td>Do hodowli i utrzymania kultur neuronalnych</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9418</td><td>Do przygotowania kultur neuronalnych</td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Millipore Sigma</td><td>223506</td><td>Składnik roztworów aCSF</td></tr><tr><td>Inkubator CO2 do hodowli komórkowych</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-998-123</td><td>Do hodowli i utrzymania neuronów</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Do przygotowania hodowli neuronów</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti + A1R rdzeń</td><td>Do obrazowania fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>CoolSNAP ES2&nbsp; Kamera CCD</td><td>Fotometria</td><td></td><td>Do akwizycji obrazu</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Millipore Sigma</td><td>G8270</td><td>Składnik roztworów aCSF</td></tr><tr><td>DNase</td><td>Millipore Sigma</td><td>D5025</td><td>Do przygotowania hodowli neuronów</td></tr><tr><td>Samica, ciąża w czasie Sprague Dawley</td><td>szczury Charles river</td><td>400SASSD</td><td>Do przygotowania embrionalnych kultur neuronów ruchowych korowych i rdzeniowych</td></tr><tr><td>FITC Kostka filtracyjna</td><td>Nikon</td><td>77032509</td><td>Do obrazowania stanów przejściowych wapnia Gcamp</td></tr><tr><td>FM4-64 barwnik styrylowy</td><td>Invitrogen</td><td>T13320</td><td>Do obrazowania uwalniania pęcherzyków synaptycznych</td></tr><tr><td>Szklane dno szalki Petriego (grubość #1,5)</td><td>CellVis</td><td>D35-10-1,5-N</td><td>Do wzrostu neuronów na misce hodowlanej zgodnej z obrazowaniem</td></tr><tr><td>Szklana pipeta Pasteura</td><td>Grainger</td><td>52NK56</td><td>Do przygotowania kultur neuronalnych</td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS)</td><td>Millipore Sigma</td><td>H6648</td><td>Do przygotowania kultur neuronalnych</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td>Składnik roztworów aCSF</td></tr><tr><td>Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy o wysokim KCl (aCSF)</td><td></td><td></td><td>Do obrazowania. Zobacz przepisy*</td></tr><tr><td>surowica dla koni</td><td>Millipore Sigma</td><td>H1138</td><td>Do hodowli i utrzymania neuronów</td></tr><tr><td>Kaptur preparacyjny z przepływem laminarnym</td><td>NUAIRE</td><td>NU-301-630</td><td>Do przygotowania kultur neuronalnych</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Scientific</td><td>23017015</td><td>Do przygotowania kultur neuronalnych</td></tr><tr><td>L-15 Medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>11415064</td> firmy Leibovitz <td> przygotowanie kultur neuronalnych</td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium, bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermo Scientific 21083027</td><td></td><td>Do przygotowania kultur neuronalnych</td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>25030149</td><td>Suplement do hodowli neuronów</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000 Odczynnik do transfekcji</td><td>Thermo Scientific</td><td>11668019</td><td>Do transfekcji neuronalnych</td></tr><tr><td>Sztuczny mózgowo-rdzeniowy o niskim KCl płyn (aCSF)</td><td></td><td></td><td>Do obrazowania. Zobacz przepisy*</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Millipore Sigma</td><td>208337</td><td>Składnik rozwiązań CSF</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy/normalizacji danych</td></tr><tr><td>Nalgene&nbsp; Jednostki filtrujące, 0,2 i mikro; m PES</td><td>Thermo Scientific</td><td>565-0020</td><td>Jednostka filtrująca do roztworu CSF</td></tr><tr><td>Pożywka neuropodstawowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>21103049</td><td>Do hodowli i utrzymania kultur neuronalnych</td></tr><tr><td>NIS-Elements Advanced Research</td><td>Oprogramowanie firmy Nikon</td><td></td><td>do przechwytywania i analizy obrazów</td></tr><tr><td>Nunc 15 mL Rurki stożkowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td>Do przygotowania hodowli neuronów i bufora roztwory</td></tr><tr><td>Nunc 50 mL probówki stożkowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>339652</td><td>Do przygotowania kultur neuronalnych i roztworów buforowych</td></tr><tr><td>Optiprep</td><td>Millipore Sigma</td><td>D1556</td><td>Do przygotowania kultur neuronalnych</td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Millipore Sigma</td><td>P4762</td><td>Do przygotowania kultur neuronalnych</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140122</td><td>Aby zapobiec zanieczyszczeniu bakteryjnemu kultur neuronalnych</td></tr><tr><td>System perfuzyjny</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-77B</td><td>Do wymiany rurki</td></tr><tr><td>perfuzyjnej</td> aCSF <td>Cole-Parmer</td><td>UX-30526-14</td><td>Część zespołu perfuzji grawitacyjnej</td></tr><tr><td>plazmid pGP-CMV-Gcamp6m</td><td>Addgene</td><td>40754</td><td>Do obrazowania stanów przejściowych</td></tr><tr><td>poli-D-lizyny bromowodorek</td><td>Millipore Sigma</td><td>P7886</td><td>Środek powlekający do szalek Petriego ze szklanym dnem</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Millipore Sigma</td><td>P3911</td><td>Składnik roztworów aCSF</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Millipore Sigma</td><td>S5761</td><td>Składnik roztworów aCSF</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888</td><td>Składnik roztworów aCSF</td></tr><tr><td>Inkubator Stage Top</td><td>Tokai Hit</td><td></td><td>Do inkubacji żywych neuronów w okresie obrazowania</td></tr><tr><td>Kostka filtra TRITC</td><td>Nikon</td><td>77032809</td><td>Do obrazowania FM4-64</td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny</td><td>Millipore Sigma</td><td>T6414</td><td>Do przygotowania kultur neuronalnych</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200056</td><td>Do przygotowania kultur neuronalnych</td></tr><tr><td>Tabela izolacji drgań</td><td>Nowy port</td><td>VIP320X2430-135520</td><td>Stół/statyw do mikroskopu</td></tr></tbody></table>

fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Przed degeneracją neuronów, przyczyną deficytów motorycznych i poznawczych u pacjentów ze stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS) i/lub otępieniem płata czołowo-skroniowego (FTLD) jest dysfunkcja komunikacji między neuronami a neuronami ruchowymi i mięśniami. Podstawowy proces transmisji synaptycznej obejmuje fuzję pęcherzyków synaptycznych zależną od depolaryzacji błony i uwalnianie neuroprzekaźników do synapsy. Proces ten zachodzi poprzez miejscowy napływ wapnia do zakończeń presynaptycznych, w których znajdują się pęcherzyki synaptyczne. W tym przypadku protokół opisuje metodologie obrazowania na żywo oparte na fluorescencji, które niezawodnie informują o egzocytozie pęcherzyków synaptycznych za pośrednictwem depolaryzacji i presynaptycznej końcowej dynamice napływu wapnia w hodowanych neuronach.
Za pomocą barwnika styrylowego, który jest wbudowany w błony pęcherzyków synaptycznych, wyjaśnia się uwalnianie pęcherzyków synaptycznych. Z drugiej strony, do badania wnikania wapnia wykorzystuje się Gcamp6m, genetycznie kodowany reporter fluorescencyjny. Stosujemy depolaryzację za pośrednictwem chlorku potasu o wysokiej zawartości chlorku potasu, aby naśladować aktywność neuronalną. Aby jednoznacznie określić ilościowo egzocytozę pęcherzyków synaptycznych, mierzymy utratę znormalizowanej fluorescencji barwnika styrylowego w funkcji czasu. W podobnych warunkach stymulacji, w przypadku napływu wapnia, fluorescencja Gcamp6m wzrasta. Normalizacja i kwantyfikacja tej zmiany fluorescencji odbywa się w podobny sposób jak protokół barwnika styrylowego. Metody te mogą być multipleksowane z nadekspresją fluorescencyjnie znakowanych zmutowanych białek opartą na transfekcji. Protokoły te były szeroko stosowane do badania dysfunkcji synaps w modelach FUS-ALS i C9ORF72-ALS, wykorzystując pierwotne neurony korowe i ruchowe gryzoni. Protokoły te z łatwością pozwalają na szybkie badania przesiewowe związków, które mogą poprawić komunikację neuronalną. W związku z tym metody te są cenne nie tylko dla badań nad ALS, ale dla wszystkich obszarów badań neurodegeneracyjnych i rozwojowych.

Po pomyślnej implementacji powyższego protokołu przedstawiono reprezentatywne wyniki typowego eksperymentu uwalniania pęcherzyków synaptycznych z zastosowaniem barwnika styrylowego. Hodowane pierwotne neurony korowe szczura obciążono barwnikiem zgodnie z metodą opisaną w sekcji 6. Specyficzność obciążenia barwnikiem określono poprzez współoznaczenie markerem pęcherzyków synaptycznych synaptofizyną. Większość punktów dodatnich dla barwnika styrylowego jest jednocześnie dodatnia dla tego markera (Ryc. ...

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Metody te umożliwiają szybką ocenę, czy eksperymentalna manipulacja, białko wywołujące chorobę lub RNA mogą wpływać na procesy synaptyczne i czy związki terapeutyczne mogą przywrócić funkcję. Techniki te zapewniają wiarygodny odczyt funkcji synaptycznych z grupy neuronów w stosunkowo krótkim czasie w porównaniu z elektrofizjologią. Protokół ten może być stosowany do każdej choroby związanej z rozwojem lub zwyrodnieniem neuronów.Działa to dobrze w przypadku pierwotnych kultur neuronalnych gryzoni oraz neuronów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Aby rozpocząć, zoptymalizuj ustawienia akwizycji obrazu za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazowania konfokalnego. Utrzymuj stałą moc wzbudzenia, czas ekspozycji, wzmocnienie detektora i liczbę klatek na sekundę we wszystkich próbkach.W przypadku obrazowania poklatkowego wybierz współczynnik proporcji 512 na 512 i liczbę klatek na sekundę wynoszącą dwa obrazy na sekundę, aby zminimalizować wybielanie barwnikiem. Następnie wybierz kombinacje filtrów wzbudzenia fluorescencji, dichroicznych i emisyjnych dla GCaMP sześć M/GCaMP trzy z Fitzy i barwnik stearoilowy z Trixi. Aby uniknąć dryftu Z podczas obrazowania poklatkowego, należy użyć funkcji idealnej ostrości w oprogramowaniu do akwizycji obrazowania konfokalnego.Następnie wybierz zakładkę czasu w panelu akwizycji obrazu. Dla pierwszej fazy ustaw interwał 500 milisekund i czas trwania od trzech do pięciu minut. A dla fazy drugiej ustaw interwał 500 milisekund i czas trwania pięć minut.Następnie, aby zmontować aparat do perfuzji grawitacyjnej dla sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego lub ACSF, załaduj bufor ACSF o wysokiej zawartości chlorku potasu do 50-mililitrowej strzykawki w górnej części aparatu i ustaw natężenie przepływu na jeden mililitr na minutę. Następnie załaduj szklane naczynie o pojemności 35 mililitrów zawierające neurony na stolik obrazowania konfokalnego z końcem rurki perfuzyjnej umieszczonym na krawędzi naczynia i wybierz pole do obrazowania. 48 godzin po transfekcji inkubować pierwotne neurony korowe lub ruchowe w buforze ACSF o niskiej zawartości chlorku potasu przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie usuń bufor przez aspirację i za pomocą pipety załaduj neurony w ciemności na szklaną płytkę Petriego wypełnioną ACSF zawierającą 50 milimolowy chlorek potasu i 10 mikromolowy barwnik styrylowy. Po pięciu minutach usuń roztwór ładujący i zanurz neurony w buforze ACSF o niskiej zawartości chlorku potasu w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby wyeliminować niespecyficzne obciążenie barwnikiem. Następnie umieść naczynie na stoliku do obrazowania odwróconego mikroskopu konfokalnego i obserwuj komórki pod 20-krotnym obiektywem powietrznym lub 40-krotnym obiektywem zanurzeniowym w oleju.Wzbudz barwnik stalowy za pomocą lasera o długości 546 nanometrów i zbierz emisję za pomocą filtra pasmowo-przepustowego o długości od 570 do 620 nanometrów. Po wybraniu pola obrazowania i ustawieniu idealnej ostrości wykonaj pojedynczy nieruchomy obraz z jasnym polem, Trixi i kanałami markerów fluorescencyjnych, aby zaznaczyć granice neuronów. Następnie uruchom teraz w oprogramowaniu do akwizycji i przeprowadzaj podstawowy zapis przez trzy do pięciu minut, aby wykluczyć różnice w intensywności barwnika.Zaraz po przełączeniu na fazę drugą uruchom przycisk włączania systemu perfuzyjnego i stale perfunduj 50-milimolowy chlorek potasu do neuronów, aby ułatwić rozładunek barwnika. Kontynuuj nagrania przez pięć minut, a następnie wyłącz wyłącznik systemu perfuzyjnego. Zapisz eksperyment do późniejszej analizy danych za pomocą oprogramowania konfokalnego.48 godzin po transfekcji za pomocą GCaMP six M inkubuj pierwotne neurony korowe gryzoni z ACSF o niskiej zawartości chlorku potasu przez 15 minut. Następnie zamontuj czaszę na platformie obrazowania i zwizualizuj fluorescencję GCaMP sześć M za pomocą filtra Fitzy i obiektywu 20 lub 40 razy. Po wybraniu pola obrazowania i ustawieniu idealnej ostrości zrób pojedynczy nieruchomy obraz z kanałami jasnego pola, Fitzy i markerów fluorescencyjnych, aby zaznaczyć granice neuronów.Następnie zainicjuj Uruchom teraz w oprogramowaniu do akwizycji i przeprowadź podstawowe nagrywanie przez trzy do pięciu minut. Następnie należy przeprowadzić fuzję ACSF zawierającą 50 milimolowy chlorek potasu do neuronów, jak wykazano wcześniej, i nagrywać przez pięć minut. Gdy akwizycja obrazu zostanie zatrzymana, zapisz eksperyment i przejdź do analizy danych za pomocą oprogramowania konfokalnego.Aby przeprowadzić analizę obrazu, otwórz obrazy poklatkowe w oprogramowaniu konfokalnym i wyrównaj obrazy, klikając Obraz, następnie przetwarzanie, a następnie wyrównaj bieżący dokument, a następnie wybierz Wyrównaj do pierwszej klatki. Wybierz obszary zainteresowania wzdłuż neurytów za pomocą narzędzia do wyboru ROI, a także zaznacz ROI reprezentujące intensywność fluorescencji tła. Następnie zainicjuj funkcję pomiaru z panelu pomiaru czasu, aby zmierzyć surową fluorescencję w czasie dla wybranych ROI.Po pomiarze wyeksportuj surowe intensywności fluorescencji do arkusza kalkulacyjnego. Pokazano tutaj hodowane pierwotne neurony korowe szczura obciążone barwnikiem styrylowym. Specyficzność obciążenia barwnikiem określono przez koznakowanie markerem pęcherzyków synaptycznych synaptofizyną, a większość sterylnych punkcta z dodatnim barwnikiem jest kododatnia dla tego markera.Analiza wartości intensywności surowca w całym okresie obrazowania pokazuje, że synaptofizyna i intensywność pozostają stałe, podczas gdy intensywność barwnika styrylowego zmniejsza się po stymulacji. W przypadku neuronów kontrolnych transfekowanych białkiem zielonej fluorescencji skuteczne uwalnianie pęcherzyków synaptycznych spowodowało uderzającą utratę fluorescencji barwnika po wysokiej depolaryzacji chlorku potasu. Ten reprezentatywny film pokazuje neuron selektywnie rozładowujący barwnik styrylowy w nowym prawym regionie po stymulacji.W przeciwieństwie do tego, w neuronach transfekowanych C nine ORF 72 połączonych z konstruktem powtórzeń peptydu barwnikowego do GA 50, upośledzona transmisja synaptyczna jest reprezentowana przez zatrzymaną fluorescencję barwnika nawet po wysokiej depolaryzacji chlorku potasu. Przedstawiono reprezentatywne obrazy fluorescencyjne neuronów korowych transfekowanych GCaMP sześć M przed i po depolaryzacji chlorku potasu. Zwiększone wartości fluorescencji i neurony korowe transfekowane GCaMP six M wskazują na wnikanie wapnia do neurytów po depolaryzacji indukowanej chlorkiem potasu.Pod koniec wyjściowego okresu rejestracji neurony wyrażały GCaMP sześć M przy niskiej fluorescencji. Następnie obserwuje się dramatyczny wzrost fluorescencji na początku stymulacji. Upewnij się, że zapisy podstawowe fluorescencji dla barwnika styrylowego i GCaMP są stabilne.Zawsze używaj idealnej ostrości, aby uniknąć dryfu obrazu, co utrudniłoby przetwarzanie danych po obrazie. Dalsza hodowla neuronów nie jest zalecana, ponieważ naczynia są wystawione na działanie powietrza podczas obfitości. Jednak barwienie immunologiczne lub ekstrakcja białka lub RNA może ocenić potencjalne przyczyny zmian synaptycznych.

real-time-fluorescent-measurement-synaptic-functions-models

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje ocenę uwalniania i usuwania glutaminianu w pojedynczych synapsach korowo-prążkowych w wycinku mózgu myszy. Stymulacja elektryczna ułatwia uwalnianie glutaminianu w synapsie. Uwolniony glutaminian zmienia fluorescencję białka czujnika, która zanika z czasem, wskazując na skuteczność uwalniania i klirensu.

Analiza uwalniania i klirensu glutaminianu w pojedynczej synapsie neuronu w wycinku mózgu myszy

Źródło: Krishnamurthy, K.  i wsp. Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego. J. Vis. Exp. (2021)Ten film demonstruje obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym w celu monitorowania aktywności synaptycznej w neuronach z mutacją ALS wyrażających genetycznie kodowany bioczujnik wapnia. Przedstawiono w nim etapy przygotowania neuronów do obrazowania, stymulowania dynamiki wapnia i rejestrowania fluorescencji w celu pomiaru zmian w...

Obrazowanie fluorescencyjne synaptycznej dynamiki wapnia w modelu in vitro stwardnienia zanikowego bocznego

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest zmienione w różnych stanach, które czasami mogą prowadzić do niewydolności synaptycznej. W niniejszym raporcie opisano metody oparte na mikroskopie fluorescencyjnym do ilościowego określania takich zmian strukturalnych.

Połączenie nerwowo-mięśniowe: pomiar wielkości synaps, fragmentacji i zmian gęstości białek synaptycznych za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej

Tutaj opisujemy konfigurację, nawigację po oprogramowaniu i analizę danych dla przestrzennie i czasowo precyzyjnej metody pomiaru tonicznych i fazowych zmian zewnątrzkomórkowego glutaminianu in vivo za pomocą układów mikroelektrod połączonych enzymami (MEA).

Wykorzystanie bioczujników opartych na enzymach do pomiaru toniku i glutaminianu fazowego w mysich modelach choroby Alzheimera

Ten protokół opisuje metodę precyzyjnego pomiaru szybkości transportu nukleocytoplazmatycznego w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych poprzez ilościowe określenie zmian w czasie rzeczywistym w imporcie jądrowym białka NLS-NES-GFP.

Test do pomiaru transportu nukleocytoplazmatycznego w czasie rzeczywistym w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych

Przedstawiamy protokół do oceny równowagi między uwalnianiem glutaminianu a klirensem w pojedynczych synapsach glutaminergicznym korowo-prążkowych w ostrych wycinkach od dorosłych myszy. Protokół ten wykorzystuje czujnik fluorescencyjny iGluu do wykrywania glutaminianu, kamerę sCMOS do akwizycji sygnału oraz urządzenie do ogniskowego oświetlenia laserowego.

Wskaźniki uwalniania i wychwytu glutaminianu w pojedynczych synapsach w ostrych wycinkach mózgu od myszy normalnych i myszy z chorobą Huntingtona

Przedstawiamy prosty, efektywny czasowo i wysokoprzepustowy test oparty na spektroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania włókien aktynowych w próbkach biologicznych ex vivo z tkanek mózgowych gryzoni i ludzi.

Efektywny czasowo test oparty na spektroskopii fluorescencji do oceny stanu polimeryzacji aktyny w tkankach mózgu gryzoni i ludzi

Wprowadzamy tutaj procedurę pomiaru oligomerów białkowych i agregacji w lizacie komórkowym i żywych komórkach za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji.

Wykrywanie agregacji białek za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji

Wychwyt glukozy jest zwiększony w neuronach ruchowych Drosophila dotkniętych proteinopatią białka wiążącego DNA TAR (TDP-43), na co wskazuje genetycznie kodowany czujnik glukozy oparty na FRET.

Pomiar wychwytu glukozy w modelach proteinopatii TDP-43 u drosophila

Korzystając z transgenicznych myszy fluorescencyjnych, opisano szczegółowe protokoły do oceny in vivo transportu aksonalnego endosomów sygnałowych i mitochondriów w obrębie aksonów motorycznych i czuciowych nienaruszonego nerwu kulszowego u żywych zwierząt.

Rozszerzenie zestawu narzędzi do obrazowania in vivo transportu aksonalnego

Prezentujemy tutaj protokół, jak przygotować pierwotne hodowle komórek glejowych, astrocytów i mikrogleju z kory mózgowej szczurów do obrazowania poklatkowego wewnątrzkomórkowego Ca2+ do badań nad patofizjologią stwardnienia zanikowego bocznego w modelu szczurzym hSOD1G93A.

Pierwotne kultury astrocytów szczurów i mikrogleju oraz ich zastosowanie w badaniu stwardnienia zanikowego bocznego

Poznaj metody fluorescencyjnego obrazowania funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w hodowanych neuronach. Techniki te umożliwiają szybką ocenę transmisji synaptycznej i badanie potencjalnych terapii.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Przeglądaj więcej filmów