Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego
16 lipca 2021
Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.
Metody te umożliwiają szybką ocenę, czy eksperymentalna manipulacja, białko wywołujące chorobę lub RNA mogą wpływać na procesy synaptyczne i czy związki terapeutyczne mogą przywrócić funkcję. Techniki te zapewniają wiarygodny odczyt funkcji synaptycznych z grupy neuronów w stosunkowo krótkim czasie w porównaniu z elektrofizjologią. Protokół ten może być stosowany do każdej choroby związanej z rozwojem lub zwyrodnieniem neuronów.
Działa to dobrze w przypadku pierwotnych kultur neuronalnych gryzoni oraz neuronów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Aby rozpocząć, zoptymalizuj ustawienia akwizycji obrazu za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazowania konfokalnego. Utrzymuj stałą moc wzbudzenia, czas ekspozycji, wzmocnienie detektora i liczbę klatek na sekundę we wszystkich próbkach.
W przypadku obrazowania poklatkowego wybierz współczynnik proporcji 512 na 512 i liczbę klatek na sekundę wynoszącą dwa obrazy na sekundę, aby zminimalizować wybielanie barwnikiem. Następnie wybierz kombinacje filtrów wzbudzenia fluorescencji, dichroicznych i emisyjnych dla GCaMP sześć M/GCaMP trzy z Fitzy i barwnik stearoilowy z Trixi. Aby uniknąć dryftu Z podczas obrazowania poklatkowego, należy użyć funkcji idealnej ostrości w oprogramowaniu do akwizycji obrazowania konfokalnego.
Następnie wybierz zakładkę czasu w panelu akwizycji obrazu. Dla pierwszej fazy ustaw interwał 500 milisekund i czas trwania od trzech do pięciu minut. A dla fazy drugiej ustaw interwał 500 milisekund i czas trwania pięć minut.
Następnie, aby zmontować aparat do perfuzji grawitacyjnej dla sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego lub ACSF, załaduj bufor ACSF o wysokiej zawartości chlorku potasu do 50-mililitrowej strzykawki w górnej części aparatu i ustaw natężenie przepływu na jeden mililitr na minutę. Następnie załaduj szklane naczynie o pojemności 35 mililitrów zawierające neurony na stolik obrazowania konfokalnego z końcem rurki perfuzyjnej umieszczonym na krawędzi naczynia i wybierz pole do obrazowania. 48 godzin po transfekcji inkubować pierwotne neurony korowe lub ruchowe w buforze ACSF o niskiej zawartości chlorku potasu przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnie usuń bufor przez aspirację i za pomocą pipety załaduj neurony w ciemności na szklaną płytkę Petriego wypełnioną ACSF zawierającą 50 milimolowy chlorek potasu i 10 mikromolowy barwnik styrylowy. Po pięciu minutach usuń roztwór ładujący i zanurz neurony w buforze ACSF o niskiej zawartości chlorku potasu w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby wyeliminować niespecyficzne obciążenie barwnikiem. Następnie umieść naczynie na stoliku do obrazowania odwróconego mikroskopu konfokalnego i obserwuj komórki pod 20-krotnym obiektywem powietrznym lub 40-krotnym obiektywem zanurzeniowym w oleju.
Wzbudz barwnik stalowy za pomocą lasera o długości 546 nanometrów i zbierz emisję za pomocą filtra pasmowo-przepustowego o długości od 570 do 620 nanometrów. Po wybraniu pola obrazowania i ustawieniu idealnej ostrości wykonaj pojedynczy nieruchomy obraz z jasnym polem, Trixi i kanałami markerów fluorescencyjnych, aby zaznaczyć granice neuronów. Następnie uruchom teraz w oprogramowaniu do akwizycji i przeprowadzaj podstawowy zapis przez trzy do pięciu minut, aby wykluczyć różnice w intensywności barwnika.
Zaraz po przełączeniu na fazę drugą uruchom przycisk włączania systemu perfuzyjnego i stale perfunduj 50-milimolowy chlorek potasu do neuronów, aby ułatwić rozładunek barwnika. Kontynuuj nagrania przez pięć minut, a następnie wyłącz wyłącznik systemu perfuzyjnego. Zapisz eksperyment do późniejszej analizy danych za pomocą oprogramowania konfokalnego.
48 godzin po transfekcji za pomocą GCaMP six M inkubuj pierwotne neurony korowe gryzoni z ACSF o niskiej zawartości chlorku potasu przez 15 minut. Następnie zamontuj czaszę na platformie obrazowania i zwizualizuj fluorescencję GCaMP sześć M za pomocą filtra Fitzy i obiektywu 20 lub 40 razy. Po wybraniu pola obrazowania i ustawieniu idealnej ostrości zrób pojedynczy nieruchomy obraz z kanałami jasnego pola, Fitzy i markerów fluorescencyjnych, aby zaznaczyć granice neuronów.
Następnie zainicjuj Uruchom teraz w oprogramowaniu do akwizycji i przeprowadź podstawowe nagrywanie przez trzy do pięciu minut. Następnie należy przeprowadzić fuzję ACSF zawierającą 50 milimolowy chlorek potasu do neuronów, jak wykazano wcześniej, i nagrywać przez pięć minut. Gdy akwizycja obrazu zostanie zatrzymana, zapisz eksperyment i przejdź do analizy danych za pomocą oprogramowania konfokalnego.
Aby przeprowadzić analizę obrazu, otwórz obrazy poklatkowe w oprogramowaniu konfokalnym i wyrównaj obrazy, klikając Obraz, następnie przetwarzanie, a następnie wyrównaj bieżący dokument, a następnie wybierz Wyrównaj do pierwszej klatki. Wybierz obszary zainteresowania wzdłuż neurytów za pomocą narzędzia do wyboru ROI, a także zaznacz ROI reprezentujące intensywność fluorescencji tła. Następnie zainicjuj funkcję pomiaru z panelu pomiaru czasu, aby zmierzyć surową fluorescencję w czasie dla wybranych ROI.
Po pomiarze wyeksportuj surowe intensywności fluorescencji do arkusza kalkulacyjnego. Pokazano tutaj hodowane pierwotne neurony korowe szczura obciążone barwnikiem styrylowym. Specyficzność obciążenia barwnikiem określono przez koznakowanie markerem pęcherzyków synaptycznych synaptofizyną, a większość sterylnych punkcta z dodatnim barwnikiem jest kododatnia dla tego markera.
Analiza wartości intensywności surowca w całym okresie obrazowania pokazuje, że synaptofizyna i intensywność pozostają stałe, podczas gdy intensywność barwnika styrylowego zmniejsza się po stymulacji. W przypadku neuronów kontrolnych transfekowanych białkiem zielonej fluorescencji skuteczne uwalnianie pęcherzyków synaptycznych spowodowało uderzającą utratę fluorescencji barwnika po wysokiej depolaryzacji chlorku potasu. Ten reprezentatywny film pokazuje neuron selektywnie rozładowujący barwnik styrylowy w nowym prawym regionie po stymulacji.
W przeciwieństwie do tego, w neuronach transfekowanych C nine ORF 72 połączonych z konstruktem powtórzeń peptydu barwnikowego do GA 50, upośledzona transmisja synaptyczna jest reprezentowana przez zatrzymaną fluorescencję barwnika nawet po wysokiej depolaryzacji chlorku potasu. Przedstawiono reprezentatywne obrazy fluorescencyjne neuronów korowych transfekowanych GCaMP sześć M przed i po depolaryzacji chlorku potasu. Zwiększone wartości fluorescencji i neurony korowe transfekowane GCaMP six M wskazują na wnikanie wapnia do neurytów po depolaryzacji indukowanej chlorkiem potasu.
Pod koniec wyjściowego okresu rejestracji neurony wyrażały GCaMP sześć M przy niskiej fluorescencji. Następnie obserwuje się dramatyczny wzrost fluorescencji na początku stymulacji. Upewnij się, że zapisy podstawowe fluorescencji dla barwnika styrylowego i GCaMP są stabilne.
Zawsze używaj idealnej ostrości, aby uniknąć dryfu obrazu, co utrudniłoby przetwarzanie danych po obrazie. Dalsza hodowla neuronów nie jest zalecana, ponieważ naczynia są wystawione na działanie powietrza podczas obfitości. Jednak barwienie immunologiczne lub ekstrakcja białka lub RNA może ocenić potencjalne przyczyny zmian synaptycznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza praca omawia dwie metody wizualizacji zdarzeń podkomórkowych istotnych dla przekazywania sygnałów synaptycznych, koncentrując się na monitoringu w czasie rzeczywistym napływu wapnia presynaptycznego i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych w uprawianych neuronach. Przedstawione protokoły mogą być stosowane do oceny manipulacji eksperymentalnych związanych z procesami synaptycznymi i badania potencjalnych interwencji terapeutycznych.
Kluczowe Elementy Badań
Obszar Nauki
- Neurobiologia
- Przekazywanie Sygnałów Synaptycznych
- Mikroskopia Komórek Żywych
Tło
- Zrozumienie procesów synaptycznych jest kluczowe dla wyjaśnienia mechanizmów rozwoju i degeneracji neuronów.
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym umożliwia monitorowanie dynamiki wapnia i uwalniania pęcherzyków synaptycznych.
- Techniki można dostosować do różnych modeli neuronalnych, w tym do upraw pierwszorzędnych zmysłowych gryzoni i neuronów pochodzących z iPSC.
Cel Badań
- Opracowanie niezawodnych metod monitorowania funkcji synaptycznej i oceny wpływu związków eksperymentalnych lub terapeutycznych.
- Badanie wpływu białek lub RNA związanych z chorobami na przekazywanie sygnałów synaptycznych.
- Zaoferowanie szybkiej alternatywy dla tradycyjnych ocen elektrofizjologicznych.
Wykorzystane Metody
- Obrazowanie komórek żywych w in vitro uprawianych neuronach z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.
- Neuronami pierwszorzędowymi kory mózgowej i neuronami pochodzącymi z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych były modele biologiczne.
- Harmonogram obejmował obrazowanie oparte na fazach w odstępach czasu 3-5 minut w celu zebrania danych.
- Szczegółowo opisano specyficzne protokoły barwienia i ustawienia obrazowania, co poprawia jakość obrazowania i wiarygodność danych.
Główne Wyniki
- Pomyślna wizualizacja uwalniania pęcherzyków synaptycznych wykazała, że dynamika wapnia wiąże się z funkcją synaptyczną.
- Zaburzenia przekazywania sygnałów synaptycznych zostały wskazane przez zatrzymaną fluorescencję barwnika w określonych warunkach eksperymentalnych.
- Pomiary natężenia fluorescencji dostarczyły wglądu w aktywność synaptyczną przed i po depolaryzacji.
- Wyniki potwierdzają potencjalne zastosowanie terapeutyczne metod w celu zrozumienia i leczenia dysfunkcji synaptycznych.
Wnioski
- Badanie umożliwia wizualizację krytycznych zdarzeń w przekazywaniu sygnałów synaptycznych, wspomagając ocenę stanu zdrowia neuronów.
- Opracowane metody mogą ułatwić badanie związków terapeutycznych celujących w procesy synaptyczne.
- Ogólnie rzecz biorąc, podejścia te wnoszą fundamentalny wkład w nasze zrozumienie mechanizmów synaptycznych i potencjalnych interwencji w przebieg chorób.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Real-time fluorescent measurement of synaptic functions provides a rapid, quantitative readout of presynaptic activity in neuronal models, enabling early assessment of compound effects on neurotransmission. This approach supports target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease programs by linking molecular perturbations to functional synaptic outputs. The multiplexable design allows integration with overexpression of disease-associated proteins, facilitating phenotypic screening and translational biomarker alignment in ALS and related models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and calcium influx as functional readouts of neuronal health.
- Operational Value: Enables rapid screening of compounds that may restore synaptic function in disease models, reducing reliance on slower electrophysiology.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying synaptic rescue in FUS-ALS and C9ORF72-ALS models using primary rodent cortical and motor neurons.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates normalized fluorescence readouts of styryl dye loss and GCaMP6m gain, providing unambiguous, quantifiable metrics of vesicle release and calcium dynamics.
- Reproducibility: Requires consistent excitation power, exposure time, detector gain, and frame rate across samples to ensure reliable longitudinal comparisons.
- Scalability: Compatible with high-content imaging platforms and perfusion systems, enabling time-lapse acquisition over 3–5 minute basal and 5 minute stimulation phases.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly models synaptic dysfunction in FUS-ALS and C9ORF72-ALS, capturing early pathophysiological changes preceding neurodegeneration.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by providing functional readouts that correlate with neuronal communication deficits in motor and cognitive domains.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables evaluation of whether disease-associated proteins or RNAs impair synaptic transmission, informing target confidence and lead identification.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for neurodegenerative disease programs where synaptic dysfunction is an early biomarker.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking genetic or pharmacological manipulations to changes in synaptic vesicle recycling and presynaptic calcium flux.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (fluorescence intensity over time) that enable comparison of compound effects across conditions.
- Analytics: Provides normalized fluorescence measurements that allow teams to assess synaptic function rescue or impairment relative to baselines.
- Translational Research: Aligns with biomarker strategies by modeling synaptic deficits in human-relevant ALS genotypes using primary and iPSC-derived neurons.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for longitudinal assessment of synaptic health across multiple projects and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity between genetic insults and functional synaptic outcomes.
- Operational Value: Standardizes synaptic function assessment via reproducible live-imaging protocols with built-in baseline and stimulation phases.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by offering early, functional evidence of target engagement in neuronal models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds that demonstrate synaptic rescue in ALS-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, live-cell imaging, and fluorescent dye handling (styryl dye and GCaMP6m).
- Dependent on stable perfusion systems and image acquisition software with perfect focus to minimize drift during time-lapse acquisition.
- Necessitates standardization of staining, incubation, and perfusion protocols across laboratories to ensure cross-site reproducibility.
- Adaptation to iPSC-derived neurons requires optimization of transfection efficiency and maturation timing while maintaining consistent KCl stimulation parameters.
- Practical limitation: Extended culturing post-perfusion is discouraged due to air exposure, limiting downstream assays to fixed endpoints like immunostaining or molecular extraction.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:52
Microscope and Perfusion System Setup
2:33
Styryl Dye Imaging of Synaptic Vesicle Release
4:30
Fluorescence Imaging of Gcamp6m Calcium Transients
5:36
Image Analysis
6:23
Results: Real-Time Monitoring of the Dynamics of Presynaptic Calcium Influx and Synaptic Vesicle Membrane Fusion in In Vitro Cultured Neurons
8:15
Conclusion
