Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Metody te umożliwiają szybką ocenę, czy eksperymentalna manipulacja, białko wywołujące chorobę lub RNA mogą wpływać na procesy synaptyczne i czy związki terapeutyczne mogą przywrócić funkcję. Techniki te zapewniają wiarygodny odczyt funkcji synaptycznych z grupy neuronów w stosunkowo krótkim czasie w porównaniu z elektrofizjologią. Protokół ten może być stosowany do każdej choroby związanej z rozwojem lub zwyrodnieniem neuronów.

Działa to dobrze w przypadku pierwotnych kultur neuronalnych gryzoni oraz neuronów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Aby rozpocząć, zoptymalizuj ustawienia akwizycji obrazu za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazowania konfokalnego. Utrzymuj stałą moc wzbudzenia, czas ekspozycji, wzmocnienie detektora i liczbę klatek na sekundę we wszystkich próbkach.

W przypadku obrazowania poklatkowego wybierz współczynnik proporcji 512 na 512 i liczbę klatek na sekundę wynoszącą dwa obrazy na sekundę, aby zminimalizować wybielanie barwnikiem. Następnie wybierz kombinacje filtrów wzbudzenia fluorescencji, dichroicznych i emisyjnych dla GCaMP sześć M/GCaMP trzy z Fitzy i barwnik stearoilowy z Trixi. Aby uniknąć dryftu Z podczas obrazowania poklatkowego, należy użyć funkcji idealnej ostrości w oprogramowaniu do akwizycji obrazowania konfokalnego.

Następnie wybierz zakładkę czasu w panelu akwizycji obrazu. Dla pierwszej fazy ustaw interwał 500 milisekund i czas trwania od trzech do pięciu minut. A dla fazy drugiej ustaw interwał 500 milisekund i czas trwania pięć minut.

Następnie, aby zmontować aparat do perfuzji grawitacyjnej dla sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego lub ACSF, załaduj bufor ACSF o wysokiej zawartości chlorku potasu do 50-mililitrowej strzykawki w górnej części aparatu i ustaw natężenie przepływu na jeden mililitr na minutę. Następnie załaduj szklane naczynie o pojemności 35 mililitrów zawierające neurony na stolik obrazowania konfokalnego z końcem rurki perfuzyjnej umieszczonym na krawędzi naczynia i wybierz pole do obrazowania. 48 godzin po transfekcji inkubować pierwotne neurony korowe lub ruchowe w buforze ACSF o niskiej zawartości chlorku potasu przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie usuń bufor przez aspirację i za pomocą pipety załaduj neurony w ciemności na szklaną płytkę Petriego wypełnioną ACSF zawierającą 50 milimolowy chlorek potasu i 10 mikromolowy barwnik styrylowy. Po pięciu minutach usuń roztwór ładujący i zanurz neurony w buforze ACSF o niskiej zawartości chlorku potasu w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby wyeliminować niespecyficzne obciążenie barwnikiem. Następnie umieść naczynie na stoliku do obrazowania odwróconego mikroskopu konfokalnego i obserwuj komórki pod 20-krotnym obiektywem powietrznym lub 40-krotnym obiektywem zanurzeniowym w oleju.

Wzbudz barwnik stalowy za pomocą lasera o długości 546 nanometrów i zbierz emisję za pomocą filtra pasmowo-przepustowego o długości od 570 do 620 nanometrów. Po wybraniu pola obrazowania i ustawieniu idealnej ostrości wykonaj pojedynczy nieruchomy obraz z jasnym polem, Trixi i kanałami markerów fluorescencyjnych, aby zaznaczyć granice neuronów. Następnie uruchom teraz w oprogramowaniu do akwizycji i przeprowadzaj podstawowy zapis przez trzy do pięciu minut, aby wykluczyć różnice w intensywności barwnika.

Zaraz po przełączeniu na fazę drugą uruchom przycisk włączania systemu perfuzyjnego i stale perfunduj 50-milimolowy chlorek potasu do neuronów, aby ułatwić rozładunek barwnika. Kontynuuj nagrania przez pięć minut, a następnie wyłącz wyłącznik systemu perfuzyjnego. Zapisz eksperyment do późniejszej analizy danych za pomocą oprogramowania konfokalnego.

48 godzin po transfekcji za pomocą GCaMP six M inkubuj pierwotne neurony korowe gryzoni z ACSF o niskiej zawartości chlorku potasu przez 15 minut. Następnie zamontuj czaszę na platformie obrazowania i zwizualizuj fluorescencję GCaMP sześć M za pomocą filtra Fitzy i obiektywu 20 lub 40 razy. Po wybraniu pola obrazowania i ustawieniu idealnej ostrości zrób pojedynczy nieruchomy obraz z kanałami jasnego pola, Fitzy i markerów fluorescencyjnych, aby zaznaczyć granice neuronów.

Następnie zainicjuj Uruchom teraz w oprogramowaniu do akwizycji i przeprowadź podstawowe nagrywanie przez trzy do pięciu minut. Następnie należy przeprowadzić fuzję ACSF zawierającą 50 milimolowy chlorek potasu do neuronów, jak wykazano wcześniej, i nagrywać przez pięć minut. Gdy akwizycja obrazu zostanie zatrzymana, zapisz eksperyment i przejdź do analizy danych za pomocą oprogramowania konfokalnego.

Aby przeprowadzić analizę obrazu, otwórz obrazy poklatkowe w oprogramowaniu konfokalnym i wyrównaj obrazy, klikając Obraz, następnie przetwarzanie, a następnie wyrównaj bieżący dokument, a następnie wybierz Wyrównaj do pierwszej klatki. Wybierz obszary zainteresowania wzdłuż neurytów za pomocą narzędzia do wyboru ROI, a także zaznacz ROI reprezentujące intensywność fluorescencji tła. Następnie zainicjuj funkcję pomiaru z panelu pomiaru czasu, aby zmierzyć surową fluorescencję w czasie dla wybranych ROI.

Po pomiarze wyeksportuj surowe intensywności fluorescencji do arkusza kalkulacyjnego. Pokazano tutaj hodowane pierwotne neurony korowe szczura obciążone barwnikiem styrylowym. Specyficzność obciążenia barwnikiem określono przez koznakowanie markerem pęcherzyków synaptycznych synaptofizyną, a większość sterylnych punkcta z dodatnim barwnikiem jest kododatnia dla tego markera.

Analiza wartości intensywności surowca w całym okresie obrazowania pokazuje, że synaptofizyna i intensywność pozostają stałe, podczas gdy intensywność barwnika styrylowego zmniejsza się po stymulacji. W przypadku neuronów kontrolnych transfekowanych białkiem zielonej fluorescencji skuteczne uwalnianie pęcherzyków synaptycznych spowodowało uderzającą utratę fluorescencji barwnika po wysokiej depolaryzacji chlorku potasu. Ten reprezentatywny film pokazuje neuron selektywnie rozładowujący barwnik styrylowy w nowym prawym regionie po stymulacji.

W przeciwieństwie do tego, w neuronach transfekowanych C nine ORF 72 połączonych z konstruktem powtórzeń peptydu barwnikowego do GA 50, upośledzona transmisja synaptyczna jest reprezentowana przez zatrzymaną fluorescencję barwnika nawet po wysokiej depolaryzacji chlorku potasu. Przedstawiono reprezentatywne obrazy fluorescencyjne neuronów korowych transfekowanych GCaMP sześć M przed i po depolaryzacji chlorku potasu. Zwiększone wartości fluorescencji i neurony korowe transfekowane GCaMP six M wskazują na wnikanie wapnia do neurytów po depolaryzacji indukowanej chlorkiem potasu.

Pod koniec wyjściowego okresu rejestracji neurony wyrażały GCaMP sześć M przy niskiej fluorescencji. Następnie obserwuje się dramatyczny wzrost fluorescencji na początku stymulacji. Upewnij się, że zapisy podstawowe fluorescencji dla barwnika styrylowego i GCaMP są stabilne.

Zawsze używaj idealnej ostrości, aby uniknąć dryfu obrazu, co utrudniłoby przetwarzanie danych po obrazie. Dalsza hodowla neuronów nie jest zalecana, ponieważ naczynia są wystawione na działanie powietrza podczas obfitości. Jednak barwienie immunologiczne lub ekstrakcja białka lub RNA może ocenić potencjalne przyczyny zmian synaptycznych.