Zmodyfikowana metoda rurki rolkowej do precyzyjnie zlokalizowanego i powtarzalnego obrazowania przerywanego podczas długotrwałej hodowli wycinków mózgu w systemie zamkniętym

Ogólnym celem tej zmodyfikowanej metody roller tube do hodowli plastrów mózgu jest zapewnienie zamkniętego systemu hodowli w celu długoterminowego przetrwania plastrów. z możliwością powtarzalnego obrazowania kwiatowego w wysokiej rozdzielczości. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące rozwoju neuronów i zaburzeń neurodegeneracyjnych, które wymagają obserwacji tych samych neuronów w czasie, takich jak lokalizacja kluczowych białek zaangażowanych w tworzenie lub utratę synaps.

Głównymi zaletami tej techniki są w pełni zamknięty system hodowli, który umożliwia bezpieczne wykorzystanie wirusów do ekspresji białek oraz użycie fototrawionych szkiełek nakrywkowych do lokalizacji tych samych komórek do obrazowania. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy hodowaliśmy plastry na szkiełkach nakrywkowych wewnątrz rur rolkowych, ale potrzebowaliśmy lepszego sposobu na wizualizację zmian zachodzących w żywych plasterkach w czasie. Powszechne stosowanie wektorów wirusowych do ekspresji transgenów i określonych populacji komórek do obrazowania mikroskopowego skłoniło nas do opracowania zamkniętego systemu w celu ochrony użytkowników i wyeliminowania zanieczyszczenia obiektywów mikroskopowych.

Zdolność do śledzenia identycznej populacji komórek w wycinkach mózgu w czasie pozwala na badania nad rozwojem zmian patologicznych i zmian synaps w modelach gryzoni z ludzkimi zaburzeniami neurologicznymi. Aby rozpocząć, przygotuj stojak na rury rolkowe i wykonaj przyrząd, który pomoże w wywierceniu otworu w rurach rolkowych, zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Za pomocą przyrządu przytrzymaj na miejscu płaską, jednocentymetrową, plastikową rurkę hodowlaną, tak aby płaska strona była skierowana do góry.

Następnie wywierć otwór o średnicy sześciu milimetrów, którego środek znajduje się jeden centymetr od dołu i jest wyśrodkowany między bokami rury. Za pomocą obrotowego narzędzia do usuwania zadziorów wygładź krawędzie otworu i wykonaj cztery rowki na wewnętrznej krawędzi otworu, aby ułatwić opróżnianie otworu podczas obracania. Następnie przepłucz probówki 70% etanolem, a następnie wysusz je na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Sterylizuj probówki w około 12-milimetrowych dziurkowanych samoprzylepnych krążkach z gumy silikonowej przez 40 minut pod lampą UV. Po 20 minutach zmień położenie probówek i krążków, aby wszystkie odsłonięte powierzchnie zostały wysterylizowane. Następnie odklej biały podkład od krążka samoprzylepnego, wyrównaj otwory i przymocuj gumę silikonową na zewnątrz tuby.

Po uzyskaniu plastrów umieść dwa mikrolitry osocza kurczaka na środku blaszki nakrowej na środku blaszki nakrywkowej. Lekko rozprowadź plazmę, aby uzyskać plamkę o średnicy od trzech do czterech mililitrów. Następnie użyj sterylnej szpatułki z wąską końcówką, aby podnieść przygotowany plasterek mózgu.

Użyj zamkniętych kleszczy, aby utrzymać plasterek na końcówce szpatułki podczas podnoszenia plasterka. Przyłóż szpatułkę do plamki plazmy na szkiełku nakrywkowym i przy zamkniętych kleszkach wepchnij plasterek na szkiełko nakrywkowe. Dodaj cienką warstwę osocza piskląt na szkiełko nakrywkowe przed umieszczeniem plastra i minimalną ilość osocza poddanego działaniu trombiny, aby przykryć plasterek.

Jeśli plasterek unosi się na wodzie, nie pozostanie przyklejony po usunięciu chmury. Następnie wymieszaj 2,5 mikrolitra osocza i 2,5 mikrolitra trombiny w osobnej probówce. Szybko umieść 2,5 mikrolitra tej mieszaniny nad plasterkiem i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby go wymieszać.

Usuń przezroczystą, plastikową osłonę z odsłoniętej strony kleju z kauczuku silikonowego uprzednio przymocowanego do rury rolki. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe z plasterkiem mózgu na kleju, wyrównując plasterek w otworze. Aby zapewnić przyczepność, należy delikatnie i równomiernie docisnąć szkiełko nakrywkowe kciukiem, równomiernie dociskając szkiełko nakrywkowe i przytrzymując je przez około minutę podczas przenoszenia do szafy bezpieczeństwa biologicznego.

Nacisk na szkiełko nakrywkowe, aby przykleić się do rurki bez przeciekania, musi być odpowiednie i utrzymywane wystarczająco długo, aby wyeliminować kanały powietrzne w pomieszczeniu. Zbyt duży nacisk spowoduje pęknięcie szkiełka nakrywkowego. W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodaj 0,8 mililitra kompletnej pożywki hodowlanej Neurobases do każdej probówki.

Następnie przepuść mieszaninę 5% dwutlenku węgla i 95% powietrza przez sterylną bawełnianą pipetę Pasteura z korkiem, bezpiecznie przytrzymywaną przez zacisk. Użyj tego, aby przepłukać rurkę rolkową mieszaniną gazów i szybko zakryć rurkę, gdy jest wyjmowana z okolic pipety. Następnie oznacz tuby numerem plasterka i numerem stojaka.

Włóż rurki do stojaka na rolki; zapewnienie, że są one wyważone geometrycznie. Jeśli liczba probówek jest nieparzysta, dodaj puste probówki, aby zrównoważyć. Umieść stojaki w inkubatorze rolkowym o temperaturze 35 stopni Celsjusza, w którym rolki obracają stojak rolkowy z prędkością od 10 do 13 obrotów na godzinę.

Przechyl inkubator do tyłu o około 5 stopni, podnosząc jego przód na deskę. Przenieś probówkę z kulturą plastrów do specjalnie wykonanego uchwytu na probówkę, takiego jak ten pokazany tutaj. Następnie umieść uchwyt rurki w adapterze stolika, aby szkiełko nakrywkowe było prostopadłe do obiektywu podczas obrazowania.

Następnie dociśnij suwak na stage adapter mocno do rury, aby utrzymać rurkę na miejscu. Używając czterokrotnego obiektywu w świetle trans-oświetlenia jasnego pola, skup się na fototrawionej siatce pod plasterkiem. W przypadku początkowej sesji obrazowania szybko przeskanuj wycinek, aby zlokalizować i zapisać liczbę dla różnych obszarów, w których pożądane jest obrazowanie w większym powiększeniu.

Po zidentyfikowaniu obszarów zainteresowania przenieś stół montażowy do pierwszego kwadratu siatki zawierającego obszar zainteresowania. Następnie przełącz się na cel 20 błąd siły i znajdź znak odniesienia. Następnie przełącz się na cel o wyższej mocy, zlokalizuj ten sam znak odniesienia i zapisz pozycję x i y stolika.

Przesuń scenę, aby znaleźć inne pola zainteresowania w pobliżu i zapisz ich przesunięcia x i y od znaku odniesienia. Przesunięte pozycje pozwalają na spójne wskazanie tego samego położenia szkiełka nakrywkowego, gdy wycinek jest obrazowany, nawet jeśli oryginalne ustawienie x, y znaku odniesienia zmienia się, gdy rurka lub adapter stolika są usuwane i wymieniane. Uchwyć obraz Z-stick w każdym wybranym polu za pomocą elementu sterującego obiektywem mikroskopu lub elementu sterującego stolikiem piezoelektrycznym, jeśli jest dostępny.

Za pomocą neuronalnego barwnika witalnego, konfokalny stos obrazów pokazany tutaj, podkreśla architekturę 3D zarówno neurytów, jak i ciała komórki, ale plama jest wykluczona z jądra. Aby zbadać zależne od czasu zmiany w morfologii i żywotności wycinka wzrostu w obrębie plastrów podczas długotrwałej hodowli, ten sam wycinek znakowano fluorescencyjnym barwnikiem neuronalnym raz w tygodniu, 24 godziny przed obrazowaniem. Aby zademonstrować powtarzalność obrazowania identycznych komórek w czasie, to samo pole wycinka oznaczonego barwnikiem neuronalnym w dniu 13, zobrazowano w dniach 14, 15, 16 i 17.

Położenie trzech komórek w każdym dniu jest pokazane symbolem nad jądrem. Oprócz barwnika niezbędnego do oznaczania komórek, do znakowania komórek można wykorzystać białka fluorescencyjne za pośrednictwem wirusa. W tym przypadku zarówno wrażliwy na wapń reporter, jak i pałeczki zawierające kofilinę są w stanie wyraźnie zidentyfikować 10 dni po zakażeniu.

Pomyślne wdrożenie tej procedury wymaga wcześniejszego przygotowania wszystkich probówek, szkiełek nakrywkowych i roztworów. Możliwość uzyskania plastrów w krótkim odstępie czasu po uboju ma również kluczowe znaczenie dla sukcesu i wymaga dużej praktyki. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około 90 minut, aby uzyskać 12-18 plasterków hipokampa od szczeniaka myszy, wliczając czas na rozbiór i posiew.

Po tej procedurze wycinki mózgu mogą być w różnym czasie zakażone wirusami w celu uzyskania specyficznej dla typu komórki ekspresji fluorescencyjnie znakowanych białek lub wyciszenia ekspresji genów z małym interferującym RNA lub krótkim RNA spinki do włosów w celu zbadania funkcji genu. Nie zapominaj, że praca z rekombinowanymi wirusami może być niebezpieczna, a podczas pracy z tymi odczynnikami należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie ochrony oczu.