Name: Zmodyfikowana metoda rurki rolkowej do precyzyjnie zlokalizowanego i powtarzalnego obrazowania przerywanego podczas długotrwałej hodowli wycinków mózgu w systemie zamkniętym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Naucz się zmodyfikowanej metody rurki rolkowej do długotrwałej hodowli wycinków mózgu gryzoni z powtarzalnym obrazowaniem w zamkniętym systemie. Technika umożliwia badanie dynamiki neuronów i zmian synaptycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal%2C+a+new+serum-free+medium+combination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: a review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li>
<li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+imaging+of+neuronal+circuits+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).</li>
<li>Roo, M. D., Ribic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+structural+plasticity+of+dendritic+spines+in+organotypic+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture.</a> Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).</li>
<li>Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -P., Béīque, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+synaptic+inputs+drive+dendritic+calcium+amplification+and+cooperative+plasticity+during+clustered+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development.</a> Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).</li>
<li>Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+cofilin-actin+rods+in+stressed+hippocampal+slices+and+the+role+of+cdc42+in+amyloid-beta-induced+rods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods.</a> J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).</li>
<li>Clark, R. E., Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarity+in+form+and+function+of+the+hippocampus+in+rodents%2C+monkeys%2C+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, Suppl 2 10365-10370 (2013).</li>
<li>Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+stimuli+induce+persistent+ADF%2Fcofilin-actin+rods+that+disrupt+distal+neurite+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function.</a> Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).</li>
<li>Rahman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+rods+and+aggregates+concur+with+tau+pathology+and+the+development+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer's disease.</a> J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).</li>
<li>Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+and+cofilin-actin+rods+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease.</a> Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).</li>
<li>He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).</li>
<li>Minamide, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+use+of+replication-deficient+adenovirus+for+transgene+expression+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons.</a> Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).</li>
<li>Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+synapsin+1+gene+promoter+confers+highly+neuron-specific+long-term+transgene+expression+from+an+adenoviral+vector+in+the+adult+rat+brain+depending+on+the+transduced+area%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area.</a> Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).</li>
<li>Mi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+reporter+for+real-time+imaging+of+cofilin-actin+rods+in+living+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons.</a> PLOS ONE. 8 (12), 83609(2013).</li>
<li>Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+recombinant+adeno-associated+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Production and purification of recombinant adeno-associated vectors.</a> Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).</li>
<li>Matsushita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vectors+can+be+efficiently+produced+without+helper+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus.</a> Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).</li>
<li>Ward, P., Walsh, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+integration+of+rAAV+vector+into+the+AAVS1+region%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region.</a> Virology. 433 (2), 356-366 (2012).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines%2C+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PLOS ONE. 6 (4), 18556(2011).</li>
<li>Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26611582">Lentivirus production and purification.</a> Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).</li>
<li>Huang, L., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoprocessing+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+protease+miniprecursor+fusions+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells.</a> AIDS Res Ther. 7, 27(2010).</li>
<li>Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gibson+assembly%3A+an+easy+way+to+clone+polyviral+full-length+infectious+cDNA+clones+expressing+an+ectopic+VPg%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg.</a> Virol J. 12, 89(2015).</li>
<li>Er, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuO%3A+a+fluorescent+chemical+probe+for+live+neuron+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).</li>
<li>Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+actin-ADF%2Fcofilin+rods+transiently+retards+decline+of+mitochondrial+potential+and+ATP+in+stressed+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).</li>
<li>Cichon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+aggregation+blocks+intracellular+trafficking+and+induces+synaptic+loss+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons.</a> J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).</li>
<li>Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+conditions+for+amyloid-beta+peptide+oligomerization+and+fibrillogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis.</a> J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).</li>
<li>Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-secretase-cleaved+amyloid+precursor+protein+accumulates+at+actin+inclusions+induced+in+neurons+by+stress+or+amyloid+beta%3A+a+feedforward+mechanisms+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).</li>
<li>Davis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta+dimers%2Ftrimers+potently+induce+cofilin-actin+rods+that+are+inhibited+by+maintaining+cofilin+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation.</a> Mol Neurodegener. 6, 10(2011).</li>
<li>Walsh, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-%CE%B2+and+proinflammatory+cytokines+utilize+a+prion+protein-dependent+pathway+to+activate+NADPH+oxidase+and+induce+cofilin-actin+rods+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons.</a> PLOS ONE. 9 (4), 95995(2014).</li>
<li>Woo, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RanBP9+at+the+intersection+between+cofilin+and+A%CE%B2+pathologies%3A+rescue+of+neurodegenerative+changes+by+RanBP9+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Disease%22%5BJournal%5D)">RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction.</a> Cell Death Disease. , 6(2015).</li>
<li>Shaw, A. E., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+regulation+of+cofilin+activity+in+the+CNS%3A+a+novel+therapeutic+approach+for+treatment+of+multiple+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders.</a> Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).</li>
</ol>

Opisana tutaj metoda roller tube pozwala na długoterminową hodowlę i obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości pokrojonej tkanki mózgowej. Jednym z głównych problemów związanych z zastosowaną tutaj techniką plastrów jest montaż i konserwacja plastrów. Powłoki szkiełek nakrywkowych, które wspomagają przyleganie plastrów, sprzyjają przerzedzaniu plastrów poprzez zwiększenie wzrostu neurytów i migracji komórek z plasterka; W ten sposób uniknęliśmy stosowania tych podłoży. Wprowadzenie grup aminowych do szkła poprzez pot...

Pierwotna hodowla zdysocjowanych neuronów z regionów mózgu gryzoni jest ważnym narzędziem używanym przez badaczy do obserwacji reakcji na patologicznie uwikłane bodźce. Jednak takie badania mają tę wadę, że patrzą na neurony tylko w 2D i bez ich glejowego systemu wsparcia. Ponadto, o ile nie jest uprawiany w warunkach bardzo dużej gęstości (640 neuronów/mm2 lub około 16% powierzchni), w których niemożliwe staje się śledzenie losowego wzrostu dendrytu lub aksonu na więcej niż krótką odległość od jego ciała komórkowego, żywotność neuronów hipokampa w ciągu 4 tygodni znacznie spada1, ograniczając użycie zdysocjowanych kultur do rozszerzonych badań patologii związanych z wiekiem. Hodowla plastrów przygotowanych z mózgu gryzoni jest atrakcyjną opcją, która pokonuje te ograniczenia, utrzymując zorganizowaną architekturę komórek i żywotność przez tygodnie lub miesiące. Opisano warunki utrzymania wielu różnych regionów mózgu gryzoni w hodowli plastrów2.
Dwie główne metody są szeroko stosowane do długotrwałej hodowli wycinków mózgu: hodowla na błonach na granicy powietrze-ciecz3 lub hodowla na szkiełkach nakrywkowych w szczelnie zamkniętych probówkach, które mogą obracać się w inkubatorze rolkowym w celu zapewnienia napowietrzania4. Plastry hodowane na błonach można bezpośrednio obrazować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości przy użyciu mikroskopu pionowego i obiektywów zanurzeniowych w wodzie5. Alternatywnie, plastry hodowane na błonach przeniesiono do naczyń ze szklanym dnem, aby uzyskać dobrą rozdzielczość kolców dendrytycznych za pomocą mikroskopu odwróconego6. Jednak obie metody obrazowania plastrów hodowanych na błonach są systemami otwartymi, które wymagają zmian podłoża i często wykorzystują leki przeciwgrzybicze i/lub antybiotyki w celu zapobiegania lub zmniejszania zanieczyszczenia5,6. Plastry na błonie na granicy powietrze-medium zachowują doskonałą morfologię i przeżycie, ale powrót do precyzyjnych lokalizacji podczas powtarzalnego obrazowania przy dużym powiększeniu jest niezwykle trudny, chyba że eksperyment śledzi tylko małe grupy komórek wyrażających marker fluorescencyjny. Chociaż plastry wyhodowane na błonach były używane z ekspresją transgenów za pośrednictwem wirusa5,6, protokoły bezpieczeństwa biologicznego mogą wymagać zastosowania zamkniętego systemu hodowli dla niektórych wektorów wirusowych, które są używane do ekspresji fluorescencyjnie znakowanych białek i reporterów fizjologii komórki. Ponadto cele zanurzenia wymagają dekontaminacji między próbkami, które będą śledzone w culture5. Jednym z głównych zastosowań kultur interfejsu błonowego jest połączenie obrazowania w wysokiej rozdzielczości z elektrofizjologią w pojedynczych punktach czasowych7.
Metoda rolkowa z szkiełkami nakrywkowymi wewnątrz plastikowej rurki nie pozwala na żadną elektrofizjologię ani obrazowanie w wysokiej rozdzielczości bez usunięcia szkiełka nakrywkowego. Z tego powodu metoda ta była najczęściej stosowana w badaniach długoterminowych, w których dokonano obserwacji po fiksacji8. Opisana tutaj jest metoda, która wykorzystuje technikę hodowli w rurce rolkowej, ale na wywierconych rurkach z plastrami na szkiełkach nakrywkowych, które można obrazować powtarzalnie tak długo, jak długo kultury są utrzymywane. Zamknięty system nie wymaga wymiany podłoża do obrazowania i wykorzystuje blaszki nakrywkowe, aby zapewnić znaki referencyjne, które umożliwiają obrazowanie w dużym powiększeniu, po dniach lub tygodniach, dokładnie tych pól, które zostały wcześniej zobrazowane.
Stosujemy tę metodę do badania zmian w hipokampie gryzoni, głównym regionie mózgu odpowiedzialnym za pamięć i uczenie się. Hipokamp gryzoni jest często badany jako model zmian patologicznych lub związanych z wiekiem obserwowanych podczas rozwoju zaburzeń poznawczych9, takich jak te, które występują w AD. Nasza metoda szczególnie dobrze nadaje się do badania zmian patologicznych, które rozwijają się w obrębie pojedynczego wycinka w czasie w odpowiedzi na zmiany środowiskowe, takie jak wzrost peptydów Aβ, co jest charakterystyczne dla AD8. Jedną z patologii związanych z mózgiem człowieka i gryzonia jest obecność agregatów i pręcików kofilina-aktyna, przy czym te ostatnie zawierają wiązki włókien, w których kofilina i aktyna są w stosunku molowym 1:110,11,12. Pręciki zaobserwowano w utrwalonych wycinkach hipokampa szczura po leczeniu Aβ, a także w żywym wycinku mózgu gryzonia wyrażającego kofilinę-GFP poddanego hipoksji8 i mogą one przyczyniać się do dysfunkcji synaps obserwowanej w AD i udarze. Tutaj używamy tej nowej metody hodowli do obserwacji przebiegu i rozkładu w czasie w wycinkach ekspresji egzogennych chimerycznych białek fluorescencyjnych wprowadzonych przez różne wirusy. Następnie wykorzystujemy specyficzną dla neuronów ekspresję konstruktu reporterowego kofiliny, aby śledzić rozwój patologii pręcików i agregatów kofiliny w wycinkach hipokampa w odpowiedzi na leczenie rozpuszczalnymi oligomerami Aβ (Aβo).

<table><tbody><tr><td>Dnka od 15 cm naczyń hodowlanych</td><td>VWR Scientific</td><td>25384-326</td><td></td></tr><tr><td>maszynowe z krzyżakowym (#10-32)</td><td>Ace Hardware</td><td></td><td>Podkładki płaskie o długości 2,5 cala i średnicy 3/16"</td></tr><tr><td>#10</td><td>Nakrętki maszynowych ACE Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(#10-32)</td>Gumowe przelotki <td>ACE Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>ACE Hardware</td><td></td><td>5/16", gruby; 5/8", średnica otworu; 1.125", OD</td></tr><tr><td>Rurki polietylenowe (5/16"; OD, 3/16"; ID)</td><td>ACE Hardware</td><td></td><td>Cut to 1,8</td></tr>" <tr><td>długości Podkładka blokująca #10</td><td>ACE Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wiertarka, 5 prędkości&nbsp;</td><td>Ace Hardware</td><td>ProTech Model 1201</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta Rury płaskie</td><td>VWR</td><td>62407-076</td><td></td></tr><tr><td>Wiertła, 3 mm, 6 mm i 15 mm&nbsp;</td><td>Ace Hardware</td><td>Marka Diablo Freud</td><td>Wiertła do cięcia tworzyw sztucznych.</td></tr><tr><td>Wiertła do drewna, 1,5 cm i 1 mm</td><td>Ace Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pilnik do drewna, 1/4" okrągły</td><td>Ace Harware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klipsy sprężynowe, uchwyt zatrzaskowy 16 mm</td><td>Ace Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Narzędzie do gratowania z obrotową głowicą, 5"</td> <td>Ace Hardware</td><td>26307</td><td></td></tr><tr><td>Samoprzylepny arkusz silikonowy (Secure Seal)</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>666581</td><td>Grubość 0,5 mm</td></tr><tr><td>Dziurkacz 6 mm</td><td>Office Max</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz 12 mm</td><td>thepunchbunch.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>etanolu Fototechnologiczne szkiełka nakrywkowe, średnica 12 mm</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>1916-91012</td><td></td></tr><tr>Palnik <td></td><td></td><td></td><td>Bunsena</td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoczysta woda</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropylotrietoksylan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>#5 Kleszcze Dumonta</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Rozdrabniacz tkanek McIlwain</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>10180</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki z podwójną krawędzią</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman VWR</td><td></td><td>28450-182</td><td>Pocięte na kółka o średnicy 5,8 cm</td></tr><tr><td>Poli-chloro-trifluoro-etylen (Aclar)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>10501-10</td><td>Pocięte w kółka o średnicy 5,8 cm</td></tr><tr><td>#21 Ostrze chirurgiczne</td><td>VWR Scientific</td><td>25860-144</td><td></td></tr><tr><td>#5 Kleszcze Dumont</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Szpatułka, nierdzewna ze stożkowym końcem</td><td>VWR</td><td>82027-518</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Gey's</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9779&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Glukoza</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15023-021</td><td>25% (w/v) Roztwór, filtr 0,2 mm sterylizowany</td></tr><tr><td>Osocze kurczaka</td><td>Cocalico Biologicals</td><td>30-0300-5L</td><td>Uwodnić w sterylnej wodzie, odwirować przy 2500 x g 30 min przy 4 &stopniach; C, szybkie zamrażanie podwielokrotności w ciekłym azocie i przechowywanie w&nbsp; -80 stopni Celsjusza</td></tr><tr><td>Trombina, miejscowa (bydlęca)</td> <td>Pfizer</td><td>Trombin-JMI</td><td>Szybkie zamrażanie podwielokrotności w ciekłym azocie w stężeniu 1,000 jednostek międzynarodowych/ml w dostarczonym rozcieńczalniku i przechowywanie w temperaturze -80 stopni Celsjusza. Stosować w dawce 250 jednostek/ml.</td></tr><tr><td>Inkubator</td> rolkowy <td>Bellco Biotech</td><td>SciERA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Forma</td><td>Model 3956</td><td></td></tr><tr><td>N21-MAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AR008</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>200 mM Glutamina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15023-021</td><td>25% (w/v) Roztwór, filtr 0,2 mm sterylizowany</td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10888-022&nbsp;</td><td>Kompletna pożywka: 48 ml Neurobasal A, 1 ml N21-MAX, 0,625 ml 200 mM glutaminy, 0,180 ml 25% glukozy, 0,250 ml 100x wstrzykiwacz/paciorkowiec.</td></tr><tr><td>Opakowanie lentiwirusa trzeciej generacji</td><td>Life Technologies</td><td>K4975-00</td><td></td></tr><tr><td>159 K odcinające filtry odśrodkowe (Centricon)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lentiviral system klonowania (InFusion)</td><td>Clonetech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmids 30323, 50856, 51279</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barwnik żywotności komórek neuronalnych (NeuO)</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>1801</td><td>Rozmrozić raz i szybko zamrozić w 4 i mikro; L podwielokrotności. Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>Obiektywy mikroskopowe</td><td>Olympus</td><td>powietrze: 4X, 20; olej: 40X, 60X,</td><td></td></tr> <tr><td>system konfokalny z wirującym dyskiem</td><td>Yokagawa</td><td>CSU22</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop EMCCD Kamera</td><td>fotometryczna</td><td>Kaskada II</td><td></td></tr><tr><td>Kodowanie liniowe (x,y), piezoelektryczny z płaskim górnym stopniem</td><td>ASI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lasery mikroskopowe i integracja</td><td>Innowacje w zakresie inteligentnego obrazowania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T komórek</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka plazmina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1867</td><td>0,002 U/ml w 0,1% albuminie surowicy bydlęcej (filtr 0,2 mm sterylizowany), szybkie zamrażanie w ciekłym azocie i przechowywanie w temperaturze -80 stopni Celsjusza.</td></tr></tbody></table>

zmodyfikowana metoda rurki rolkowej do precyzyjnie zlokalizowanego i powtarzalnego obrazowania przerywanego podczas długotrwałej hodowli wycinków mózgu w systemie zamkniętym

Modified Roller Tube Method for Precisely Localized and Repetitive Intermittent Imaging During Long-term Culture of Brain Slices in an Enclosed System

Hodowane wycinki mózgu gryzoni są przydatne do badania komórkowego i molekularnego zachowania neuronów i gleju w środowisku, które utrzymuje wiele z ich normalnych interakcji in vivo. Wycinki uzyskane z różnych transgenicznych linii myszy lub wykorzystanie wektorów wirusowych do ekspresji fluorescencyjnie znakowanych białek lub reporterów w wycinkach mózgu typu dzikiego pozwalają na obrazowanie w wysokiej rozdzielczości za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Chociaż opracowano kilka metod obrazowania wycinków mózgu, połączenie hodowli wycinków z możliwością wykonywania powtarzalnego obrazowania w wysokiej rozdzielczości określonych komórek w żywych wycinkach przez długi czas stwarzało problemy. Jest to szczególnie ważne, gdy wektory wirusowe są używane do ekspresji białek egzogennych, ponieważ najlepiej zrobić to w systemie zamkniętym, aby chronić użytkowników i zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. Doniesiono o prostych modyfikacjach dokonanych w metodzie hodowli wycinków mózgu w rurce rolkowej, które pozwalają na powtarzalne obrazowanie wycinków w wysokiej rozdzielczości przez wiele tygodni w zamkniętym systemie. Hodowla plastrów na blaszkach nakrywkowych pozwala na użycie znaczników odniesienia w celu szybkiej i precyzyjnej zmiany położenia sceny w celu zobrazowania tego samego pola w czasie przed i po różnych zabiegach. Przedstawiono przykłady zastosowania tej metody w połączeniu ze specyficznym barwieniem i ekspresją neuronów w celu zaobserwowania zmian w architekturze wycinków hipokampa, ekspresji neuronalnej białek fluorescencyjnych za pośrednictwem wirusa oraz rozwoju patologii kofiliny, którą wcześniej obserwowano w hipokampie choroby Alzheimera (AD) w odpowiedzi na leczenie plasterkami oligomerów peptydu β amyloidu (Aβ).

Aby określić, z jaką dokładnością można wykorzystać znaczniki fiducjalne do ponownego obrazowania tych samych komórek w tych samych polach widzenia w czasie, zbadaliśmy skrawki hodowane na trawionych fotochemicznie szkiełkach nakrywkowych (Rysunek 6A). Neurony zwizualizowano poprzez barwienie barwnikiem witalnym (100 nM przez 2 h; nie barwi komórek nieneuronalnych), który z czasem znika z neuronów, nie uszkadzając komórek25<...

Prezentowana tutaj jest zmodyfikowana metoda rolkowa do hodowli i przerywanego obrazowania w wysokiej rozdzielczości wycinków mózgu gryzoni przez wiele tygodni z precyzyjną zmianą położenia na fototrawionych szkiełkach nakrywkowych. Żywotność neuronów i morfologia warstw są dobrze zachowane. Zapewnione są zastosowania tego w pełni zamkniętego systemu wykorzystującego wirusy do ekspresji specyficznej dla typu komórki.

Zmodyfikowana metoda rurki rolkowej do precyzyjnie zlokalizowanego i powtarzalnego obrazowania przerywanego podczas długotrwałej hodowli wycinków mózgu w systemie zamkniętym

Cultured rodent brain slices are useful for studying the cellular and molecular behavior of neurons and glia in an environment that maintains many of ...

Ogólnym celem tej zmodyfikowanej metody roller tube do hodowli plastrów mózgu jest zapewnienie zamkniętego systemu hodowli w celu długoterminowego przetrwania plastrów. z możliwością powtarzalnego obrazowania kwiatowego w wysokiej rozdzielczości. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące rozwoju neuronów i zaburzeń neurodegeneracyjnych, które wymagają obserwacji tych samych neuronów w czasie, takich jak lokalizacja kluczowych białek zaangażowanych w tworzenie lub utratę synaps.Głównymi zaletami tej techniki są w pełni zamknięty system hodowli, który umożliwia bezpieczne wykorzystanie wirusów do ekspresji białek oraz użycie fototrawionych szkiełek nakrywkowych do lokalizacji tych samych komórek do obrazowania. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy hodowaliśmy plastry na szkiełkach nakrywkowych wewnątrz rur rolkowych, ale potrzebowaliśmy lepszego sposobu na wizualizację zmian zachodzących w żywych plasterkach w czasie. Powszechne stosowanie wektorów wirusowych do ekspresji transgenów i określonych populacji komórek do obrazowania mikroskopowego skłoniło nas do opracowania zamkniętego systemu w celu ochrony użytkowników i wyeliminowania zanieczyszcz

modified-roller-tube-method-for-precisely-localized-repetitive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół opisuje test z wykorzystaniem organotypowych przekrojów zoptymalizowany dla mózgu postnatalnego oraz wysokorozdzielcze obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w rostralnym prądzie migracyjnym.

Organotypowy test skrawkowy do wysokorozdzielczego obrazowania poklatkowego migracji neuronalnej w mózgu postnatalnym

W niniejszej pracy opisujemy szybką i prostą metodę obrazowania fluorescencyjnie znakowanych komórek w półgrubych skrawkach mózgu. Poprzez utrwalenie, pocięcie i optyczne klarowanie tkanki mózgowej opisujemy, w jaki sposób standardowe obrazowanie epifluorescencyjne lub konfokalne może być wykorzystane do wizualizacji poszczególnych komórek i sieci neuronalnych w obrębie nienaruszonej tkanki nerwowej.

Szybka metoda obrazowania fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości w półgrubych przekrojach mózgu

W niniejszym protokole aktualizujemy opis ostatnich postępów w obrazowaniu sygnałów Ca2+ w neuronach znakowanych GFP w skrawkach tkanki mózgowej z wykorzystaniem czerwonego fluorescencyjnego wskaźnika Ca2+.

Obrazowanie odpowiedzi wapniowych w neuronach z etykietą GFP w skrawkach mózgu myszy z obszaru podwzgórza

Ten film demonstruje zmodyfikowaną metodę rurki rolkowej do długoterminowego hodowania wycinków mózgu z modelu gryzonia. Najpierw plastry mózgu są przymocowane do szkiełek nakrywkowych. Następnie pobiera się płaskie rurki rolkowe z otworem po płaskiej stronie, a szkiełka nakrywkowe umieszcza się na otworze za pomocą krążków samoprzylepnych. Na koniec do probówki dodaje się pożywkę oraz mieszaninę dwutlenku węgla i powietrza, a probówki inkubuje się ruchem tocznym.

Zmodyfikowana metoda rolkowa do długotrwałej hodowli wycinków mózgu gryzoni

Źródło: Wiegreffe, C., et. al.,  Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu {{}}W macicy elektroporacji. J. Vis. exp.{{TAG_ 44}} (2017) Ten film przedstawia poklatkową mikroskopię konfokalną w celu obserwacji radialnej migracji neuronów korowych ze strefy podkomorowej do płytki korowej za pomocą promieniowych rusztowań glejowych w transdukowanych wycinkach mózgu myszy embrionalnych.

Obrazowanie poklatkowe migracji radialnej neuronów korowych w transdukowanych wycinkach mózgu embrionalnego myszy

Opisano technikę badania komórek NG2 i oligodendrocytów za pomocą systemu hodowli plasterkowej w przodomózgowiu i móżdżku.  Metoda ta pozwala na badanie dynamiki proliferacji i różnicowania komórek w obrębie linii oligodendrocytów, w której można łatwo manipulować środowiskiem zewnątrzkomórkowym przy zachowaniu cytoarchitektury tkanek.

Organotypowe kultury warstwowe do badania dynamiki oligodendrocytów i mielinizacji

Używając wielu kątów do cięcia mózgu szczeniaka myszy, ulepszamy poprzednio opisany ostry wycinek mózgu, który rejestruje połączenia między większością głównych struktur słuchowych śródmózgowia i przodomózgowia.

Modyfikacja kolikulo-wzgórzowo-korowego wycinka mózgu myszy, obejmująca drukowanie 3D elementów komory i wieloskalowe obrazowanie optyczne

Ten protokół dostarcza instrukcji do bezpośredniej obserwacji promieniście migrujących neuronów korowych. Elektroporacja in utero, organotypowa hodowla plastrów i poklatkowe obrazowanie konfokalne są łączone w celu bezpośredniego i dynamicznego badania skutków nadekspresji lub regulacji w dół genów będących przedmiotem zainteresowania w migrujących neuronach oraz analizy ich różnicowania podczas rozwoju.

Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero

Opisujemy protokół specyficznej dla typu komórki ekspresji genetycznie kodowanego czujnika opartego na FRET ATeam1.03YEMK w organotypowych kulturach warstwowych przodomózgowia myszy. Ponadto pokazujemy, jak wykorzystać ten czujnik do dynamicznego obrazowania komórkowych poziomów ATP w neuronach i astrocytach.

Obrazowanie wewnątrzkomórkowego ATP w organotypowych wycinkach tkanki mózgu myszy przy użyciu czujnika ATeam1.03YEMK opartego na FRET

Przedstawiamy protokół do oznaczania i analizowania neuronów piramidowych, który jest kluczowy dla oceny potencjalnych zmian morfologicznych w neuronach i kolcach dendrytycznych, które mogą leżeć u podstaw nieprawidłowości neurochemicznych i behawioralnych.

Znakowanie balistyczne neuronów piramidowych w wycinkach mózgu i w pierwotnej hodowli komórkowej

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Naucz się zmodyfikowanej metody rurki rolkowej do długotrwałej hodowli wycinków mózgu gryzoni z powtarzalnym obrazowaniem w zamkniętym systemie. Technika umożliwia badanie dynamiki neuronów i zmian synaptycznych.

Zmodyfikowana metoda rurki rolkowej do precyzyjnie zlokalizowanego i powtarzalnego obrazowania przerywanego podczas długotrwałej hodowli wycinków mózgu w systemie zamkniętym (Wideo) | JoVE Journal

Zmodyfikowana metoda rurki rolkowej do precyzyjnie zlokalizowanego i powtarzalnego obrazowania przerywanego podczas długotrwałej hodowli wycinków mózgu w systemie zamkniętym

Przeglądaj więcej filmów