Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy
8 marca 2024
Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.
Podczas rozwoju kory mózgowej neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej i migrują w kierunku powierzchni naszego mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów, w tym te odpowiedzialne za zaburzenia neurorozwojowe i psychiatryczne. W tym procesie zajmujemy się ich funkcjami w odniesieniu do tych zachowań.
Niedawno informowaliśmy, że przodkowie astrocytów przyjmują dwa różne tryby migracji, migrację nieregularną i sterowaną naczyniami krwionośnymi. Obserwacje te zostały przeprowadzone przy użyciu kombinacji etykietowania specyficznego dla serotypu i metod obserwacji poklatkowej przedstawionych w tym filmie. Do znakowania ogniw wykorzystaliśmy system elektroporacji in utero, który opracowaliśmy w celu wizualizacji pojedynczych komórek o wysokim stosunku sygnału do szumu.
Ten system transferu genów in vivo umożliwia nam również łatwe przeprowadzanie eksperymentów ze wzmocnieniem lub utratą funkcji na danych genach poprzez koelektroporację ich ekspresji lub wektory knockdown. Korzystając z tego eksperymentalnego systemu, staramy się obserwować zachowania komórek neuronów, gleju i naczyń krwionośnych oraz wyjaśnić wzajemne oddziaływanie między nimi. Wyniki tych badań przyczynią się do zrozumienia patogenezy zaburzeń neurorozwojowych.
Na początek umieść znieczuloną mysz na talerzu o temperaturze 38 stopni Celsjusza. Po wykonaniu nacięcia skóry w linii środkowej umieść sterylny plastikowy arkusz na skórze, a następnie kawałek sterylnej bibułki i utwórz otwór pośrodku. Zwilż papier sterylnym PBS i ostrożnie wyciągnij róg macicy przez otwory.
Za pomocą mikropipety dołączonej do zespołu rurki aspiratora wstrzyknąć jeden mikrolitr mieszanki plazmidowej do lewej lub prawej bocznej komory. Przez ścianę macicy zastosuj ciśnienie wydechowe. Ściśnij głowę zarodka elektrodą typu pęseta i dostarczaj impulsy elektryczne za pomocą elektroporatora.
Po umieszczeniu rogu macicy z powrotem w jamie brzusznej, zszyj ścianę brzucha i skórę za pomocą nici jedwabnej 5-0. Na początek uzyskaj uśpioną mysz z odpowiednimi plazmidami. Aby przygotować naczynie hodowlane, dodaj 1,9 mililitra pożywki hodowlanej do szklanego naczynia i ostrożnie umieść na nim wkładkę do hodowli komórkowej.
Następnie dodaj 500 mikrolitrów pożywki hodowlanej na filtr i umieść ją na lodzie. Usuń zarodki i umieść je na szalce Petriego zawierającej lodowaty PBS. Pod mikroskopem wybierz zarodki na podstawie ekspresji białka zielonej fluorescencji lub innych markerów fluorescencyjnych.
Po wypreparowaniu mózgu umieść go w stopionym żelu agarozowym pobranym w krioformie i kilkakrotnie zwiń. Gdy agaroza zestali się w temperaturze pokojowej, umieść ją na lodzie. Za pomocą wibrującego mikrotomu pokrój mózgi na grubość 350 mikrometrów i ułóż je na filtrze.
Następnie usuń 600 mikrolitrów pożywki hodowlanej zarówno z wewnątrz, jak i na zewnątrz kubka filtra. Po pięciu minutach dodaj 100 mikrolitrów świeżej pożywki hodowlanej do wnętrza wkładki do hodowli komórkowej. W przypadku obrazowania poklatkowego należy wykonać około 10 zdjęć ze stosu Z przy użyciu obiektywu o dużej odległości roboczej 20x.
Analiza poklatkowych obrazów mózgu myszy dostarczyła trajektorii komórek migrujących z dodatnim EGFP i komórek migrujących z dodatnim RFP od 2 do 21 godzin.
Przegląd
To badanie koncentruje się na rozwoju kory mózgowej, podkreślając migrację neuronów i przodków komórek glejowych z strefy komorowej na powierzchnię mózgu. Za pomocą technik obrazowania time-lapse w połączeniu z elektroporacją in utero do oznakowywania komórek, badania śledzą sposoby migracji przodków astrocytów i geny wpływające na zaburzenia neurorozwojowe i psychiatryczne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurorozwój
- Migracja komórek
- Neurobiologia
Tło
- Badanie śledzi pochodzenie neuronów i komórek glejowych podczas rozwoju kory.
- Dotyczy roli określonych genów w zaburzeniach neurorozwojowych i psychiatrycznych.
- Przodkowie astrocytów wykazują odrębne sposoby migracji istotne dla formowania się kory.
- Techniki in vivo transferu genów ułatwiają obserwację tych wzorców migracji.
Cel badania
- Wizualizowanie i analiza zachowań migrujących neuronów i komórek glejowych.
- Wyjaśnienie funkcyjnych ról genów zaangażowanych w neurorozwój.
- Badanie zachowań komórek i interakcji między neuronami, gleją i naczyniami krwionośnymi.
Zastosowane metody
- Wykorzystano elektroporację in utero do transferu genów i oznakowywania komórek.
- Skoncentrowano się na modelach mysich do badania migracji przodków neuronów i glejowych.
- Zastosowano time-lapse imaging komórek pozytywnych na EGFP i RFP.
- Protokół określał szczegółowe techniki chirurgiczne i obrazowania dla dokładnych obserwacji.
- Zawierał tworzenie przekrojów mózgu do analizy za pomocą mikrotomu wibracyjnego.
Główne wyniki
- Zidentyfikowano dwa odrębne sposoby migracji przodków astrocytów: chaotyczne i prowadzone przez naczynia krwionośne.
- Przedstawione dane pokazały zdefiniowane trajektorie migrujących komórek w czasie.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia mechanizmów zaburzeń neurorozwojowych.
- Wykazano skuteczność elektroporacji w wizualizowanie pojedynczych komórek.
Wnioski
- To badanie dostarcza wglądu w mechanizmy migracji neuronów podczas rozwoju kory.
- Wyniki mogą zwiększyć nasze zrozumienie zaburzeń neurorozwojowych i psychiatrycznych.
- Wyniki podkreślają złożoną współpracę między komórkami glejowymi i składnikami naczyniowymi w rozwoju mózgu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Time-lapse imaging of migrating neurons and glial progenitors in embryonic mouse brain slices enables direct visualization of cellular dynamics underlying neurodevelopmental processes. This capability is critical for de-risking target validation and understanding gene function in disease-relevant systems, particularly for neurodevelopmental and psychiatric disorder portfolios. The approach supports predictive confidence in early discovery by linking genetic perturbations to quantifiable cellular behaviors.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of candidate genes implicated in neurodevelopmental disorders.
- Supports mechanistic de-risking by revealing how genetic modifications alter neuronal and glial migration.
- Facilitates high-confidence target validation through direct observation of cellular phenotypes.
- Provides a platform for gain-of-function and loss-of-function studies in a physiologically relevant context.
Screening & Assay Development
- Establishes validated brain slice systems for quantitative analysis of cell migration dynamics.
- Delivers reproducible, high signal-to-noise imaging outputs suitable for downstream screening workflows.
- Enables standardization of migration assays for comparative evaluation of genetic or pharmacological interventions.
- Supports scalability for multiplexed analysis of multiple gene perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by recapitulating in vivo neurodevelopmental processes.
- Provides translational continuity from genetic discovery to preclinical validation of mechanistic hypotheses.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative migration phenotypes linked to disease genes.
- Supports biomarker identification through dynamic cellular readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early gene function studies through preclinical model validation, bridging target identification and mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on gene function in neuronal and glial migration.
- Screening: Provides quantitative, reproducible migration metrics for assay development.
- Analytics: Enables measurement of migration speed, trajectory, and mode for comparative analysis.
- Translational Research: Connects genetic perturbations to disease-relevant cellular behaviors in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis platform for diverse neurodevelopmental gene targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic understanding.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable imaging workflows for cross-project use.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking gene perturbations to functional cellular outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental disorder targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic brain dissection, in utero electroporation, and advanced imaging.
- Demands access to high-resolution fluorescence microscopy and time-lapse imaging infrastructure.
- Necessitates standardized protocols for reproducibility across teams and projects.
- Adaptation may be needed for different genetic constructs or model systems.
- Potential limitations include technical complexity and throughput constraints inherent to live tissue imaging.
