Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy
8 marca 2024
Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.
Podczas rozwoju kory mózgowej neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej i migrują w kierunku powierzchni naszego mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów, w tym te odpowiedzialne za zaburzenia neurorozwojowe i psychiatryczne. W tym procesie zajmujemy się ich funkcjami w odniesieniu do tych zachowań.
Niedawno informowaliśmy, że przodkowie astrocytów przyjmują dwa różne tryby migracji, migrację nieregularną i sterowaną naczyniami krwionośnymi. Obserwacje te zostały przeprowadzone przy użyciu kombinacji etykietowania specyficznego dla serotypu i metod obserwacji poklatkowej przedstawionych w tym filmie. Do znakowania ogniw wykorzystaliśmy system elektroporacji in utero, który opracowaliśmy w celu wizualizacji pojedynczych komórek o wysokim stosunku sygnału do szumu.
Ten system transferu genów in vivo umożliwia nam również łatwe przeprowadzanie eksperymentów ze wzmocnieniem lub utratą funkcji na danych genach poprzez koelektroporację ich ekspresji lub wektory knockdown. Korzystając z tego eksperymentalnego systemu, staramy się obserwować zachowania komórek neuronów, gleju i naczyń krwionośnych oraz wyjaśnić wzajemne oddziaływanie między nimi. Wyniki tych badań przyczynią się do zrozumienia patogenezy zaburzeń neurorozwojowych.
Na początek umieść znieczuloną mysz na talerzu o temperaturze 38 stopni Celsjusza. Po wykonaniu nacięcia skóry w linii środkowej umieść sterylny plastikowy arkusz na skórze, a następnie kawałek sterylnej bibułki i utwórz otwór pośrodku. Zwilż papier sterylnym PBS i ostrożnie wyciągnij róg macicy przez otwory.
Za pomocą mikropipety dołączonej do zespołu rurki aspiratora wstrzyknąć jeden mikrolitr mieszanki plazmidowej do lewej lub prawej bocznej komory. Przez ścianę macicy zastosuj ciśnienie wydechowe. Ściśnij głowę zarodka elektrodą typu pęseta i dostarczaj impulsy elektryczne za pomocą elektroporatora.
Po umieszczeniu rogu macicy z powrotem w jamie brzusznej, zszyj ścianę brzucha i skórę za pomocą nici jedwabnej 5-0. Na początek uzyskaj uśpioną mysz z odpowiednimi plazmidami. Aby przygotować naczynie hodowlane, dodaj 1,9 mililitra pożywki hodowlanej do szklanego naczynia i ostrożnie umieść na nim wkładkę do hodowli komórkowej.
Następnie dodaj 500 mikrolitrów pożywki hodowlanej na filtr i umieść ją na lodzie. Usuń zarodki i umieść je na szalce Petriego zawierającej lodowaty PBS. Pod mikroskopem wybierz zarodki na podstawie ekspresji białka zielonej fluorescencji lub innych markerów fluorescencyjnych.
Po wypreparowaniu mózgu umieść go w stopionym żelu agarozowym pobranym w krioformie i kilkakrotnie zwiń. Gdy agaroza zestali się w temperaturze pokojowej, umieść ją na lodzie. Za pomocą wibrującego mikrotomu pokrój mózgi na grubość 350 mikrometrów i ułóż je na filtrze.
Następnie usuń 600 mikrolitrów pożywki hodowlanej zarówno z wewnątrz, jak i na zewnątrz kubka filtra. Po pięciu minutach dodaj 100 mikrolitrów świeżej pożywki hodowlanej do wnętrza wkładki do hodowli komórkowej. W przypadku obrazowania poklatkowego należy wykonać około 10 zdjęć ze stosu Z przy użyciu obiektywu o dużej odległości roboczej 20x.
Analiza poklatkowych obrazów mózgu myszy dostarczyła trajektorii komórek migrujących z dodatnim EGFP i komórek migrujących z dodatnim RFP od 2 do 21 godzin.
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na rozwoju kory mózgowej, ze szczególnym uwzględnieniem migracji neuronów i progenitorów glejowych ze strefy komorowej w kierunku powierzchni mózgu. Dzięki zastosowaniu technik obrazowania time-lapse wraz z elektroporacją in utero do znakowania komórek, praca analizuje tryby migracji progenitorów astrocytów oraz geny wpływające na zaburzenia neurorozwojowe i psychiatryczne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Rozwój neurologiczny
- Migracja komórek
- Neurobiologia
Wstęp
- Badanie zgłębia pochodzenie neuronów i komórek glejowych podczas rozwoju kory mózgowej.
- Analizuje ono rolę specyficznych genów w zaburzeniach neurorozwojowych i psychiatrycznych.
- Progenitory astrocytów wykazują odmienne tryby migracji, które mają znaczenie dla formowania się kory.
- Techniki transferu genów in vivo ułatwiają obserwację tych wzorców migracji.
Cel badania
- W celu wizualizacji i analizy zachowań migrujących neuronów i komórek glejowych.
- W celu wyjaśnienia funkcjonalnych ról genów zaangażowanych w neurorozwój.
- W celu zbadania zachowania komórek oraz interakcji między neuronami, glejem a naczyniami krwionośnymi.
Zastosowane metody
- Wykorzystano elektroporację in utero w celu transferu genów i znakowania komórek.
- Skupiono się na modelach mysich w celu zbadania migracji prekursorów neuronalnych i glejowych.
- Zastosowano obrazowanie time-lapse komórek wykazujących pozytywną ekspresję EGFP i RFP.
- Protokół określił szczegółowe techniki chirurgiczne i obrazowania w celu uzyskania dokładnych obserwacji.
- Uwzględniono przygotowanie skrawków mózgu do analizy przy użyciu wibrotomu.
Główne wyniki
- Zidentyfikowano dwa odrębne tryby migracji progenitorów astrocytów: chaotyczny oraz prowadzony przez naczynia krwionośne.
- Przedstawione dane wykazały określone trajektorie migrujących komórek w czasie.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia mechanizmów zaburzeń neurorozwojowych.
- Wykazano skuteczność elektroporacji w wizualizacji pojedynczych komórek.
Wnioski
- Niniejsze badanie dostarcza informacji na temat mechanizmów migracji neuronalnej podczas rozwoju kory mózgowej.
- Wyniki mogą poszerzyć naszą wiedzę na temat zaburzeń neurorozwojowych i psychiatrycznych.
- Otrzymane rezultaty podkreślają złożone oddziaływanie między komponentami glejowymi a naczyniowymi w rozwoju mózgu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie time-lapse migrujących neuronów i progenitorów glejowych w skrawkach embrionalnego mózgu myszy umożliwia bezpośrednią wizualizację dynamiki komórkowej leżącej u podstaw procesów neurorozwojowych. Możliwość ta jest kluczowa dla minimalizacji ryzyka podczas walidacji celów oraz zrozumienia funkcji genów w układach istotnych dla chorób, szczególnie w przypadku portfolio zaburzeń neurorozwojowych i psychiatrycznych. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną we wczesnej fazie odkrywania poprzez powiązanie perturbacji genetycznych z mierzalnymi zachowaniami komórkowymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną analizę genów kandydackich zaangażowanych w zaburzenia neurorozwojowe.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez ujawnienie, w jaki sposób modyfikacje genetyczne wpływają na migrację neuronów i gleju.
- Ułatwia wysokowiarygodną walidację celów poprzez bezpośrednią obserwację fenotypów komórkowych.
- Zapewnia platformę do badań nad funkcją uzyskaną (gain-of-function) oraz utratą funkcji (loss-of-function) w fizjologicznie istotnym kontekście.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowane systemy skrawków mózgu do ilościowej analizy dynamiki migracji komórek.
- Zapewnia powtarzalne wyniki obrazowania o wysokim stosunku sygnału do szumu, odpowiednie dla późniejszych procesów przesiewowych.
- Umożliwia standaryzację testów migracyjnych do porównawczej oceny interwencji genetycznych lub farmakologicznych.
- Wspiera skalowalność w celu multipleksowej analizy wielu perturbacji genowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla chorób poprzez odwzorowanie procesów neurorozwojowych in vivo.
- Zapewnia ciągłość translacyjną od odkryć genetycznych po przedkliniczną walidację hipotez mechanistycznych.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszych etapach rozwoju z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ilościowe fenotypy migracji powiązane z genami chorobowymi.
- Wspiera identyfikację biomarkerów poprzez dynamiczne odczyty komórkowe.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkryć, od wczesnych badań nad funkcją genów po walidację w modelach przedklinicznych, stanowiąc pomost między identyfikacją celu a ograniczaniem ryzyka mechanistycznego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących funkcji genów w migracji neuronów i gleju.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, powtarzalnych wskaźników migracji do rozwoju testów analitycznych.
- Analityka: Umożliwia pomiar prędkości, trajektorii i sposobu migracji w celu przeprowadzenia analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy perturbacje genetyczne z zachowaniami komórkowymi istotnymi dla przebiegu chorób w modelach przedklinicznych.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku platformę obrazowania i analizy dla różnych genów docelowych związanych z rozwojem układu nerwowego.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów oraz w rozumieniu mechanizmów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowane, skalowalne przepływy pracy obrazowania do wykorzystania w wielu projektach.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań poprzez powiązanie perturbacji genowych z funkcjonalnymi efektami komórkowymi.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów w zaburzeniach neurorozwojowych z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w sekcji zarodkowego mózgu, elektroporacji in utero oraz zaawansowanym obrazowaniu.
- Konieczny jest dostęp do wysokorozdzielczej mikroskopii fluorescencyjnej i infrastruktury do obrazowania time-lapse.
- Wymagane są zestandaryzowane protokoły w celu zapewnienia powtarzalności wyników pomiędzy zespołami i projektami.
- Może być konieczna adaptacja metody dla różnych konstruktów genetycznych lub systemów modelowych.
- Potencjalne ograniczenia obejmują złożoność techniczną oraz limity przepustowości właściwe dla obrazowania żywej tkanki.
