Name: Metoda ekspansji komórek NK i CAR-NK przy użyciu linii komórkowej B zmodyfikowanej przez błonę IL-21 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Poznaj metodę ekspansji komórek NK i CAR-NK przy użyciu linii komórkowej B z błoną IL-21. Protokół umożliwia uzyskanie dużych ilości czynnych komórek o wysokiej czystości z krwi pępowinowej, krwi obwodowej i tkanek stałych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować członkom laboratorium Liu (Dr. Hsiang-chi Tseng, Dr. Xuening Wang i Dr. Chih-Hsiung Chen) za ich komentarze na temat manuskryptów. Chcielibyśmy podziękować dr Gianpietro Dotti za wektory SFG i dr Ericowi Longowi za 721.221 komórek. Praca ta była częściowo wspierana przez HL125018 (D. Liu), AI124769 (D. Liu), AI129594 (D. Liu), AI130197 (D. Liu) i Rutgers-Health Advance Funding (program NIH REACH), U01HL150852 (R. Panettieri, S. Libutti i R. Pasqualini), S10OD025182 (D. Liu) oraz fundusze Rutgers University-New Jersey Medical School Startup dla D. Liu Laboratory.

Praca związana z tkankami ludzkimi i krwią w tym protokole jest zgodna z wytycznymi Rutgers University Institutional Review Board (IRB)
1. Ekspansja komórek NK z tkanek wątroby (Dzień 0), jak pokazano w Rysunek 1.
UWAGA: Początkowa liczba komórek i żywotność są silnie skorelowane z czasem od usunięcia narządu i początkową ilością próbki tkanki. Jeśli jednak tkanki zostaną umieszczone w 30 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) i przechowywane na lodzie lub w lodówce w temperaturze 4 °C przez noc, komórki NK mogą nadal ekspansować się przy wysokiej czystości i żywotności do 24 godzin później.
<ol>
	<li>Zidentyfikuj żywe obszary tkanek w celu uzyskania limfocytów z tkanek i skrawków za pomocą sterylnego sprzętu chirurgicznego.</li>
	<li>Umieść tkanki w 30 ml HBSS (bez wapnia lub magnezu) i trzymaj na lodzie, aż będą gotowe do przygotowania do izolacji.</li>
	<li>Zmiel tkankę w kostkę o długości <0,5 cm za pomocą sterylnych żyletek lub nożyczek i kleszczy w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Przygotuj 1x roztwór kolagenazy dożylnej (1 mg / ml), rozcieńczając 10x zapas w HBSS (10x Kolagenaza IV: 10 mg / ml lub ~ 200 U / ml).</li>
	<li>Umieść zmielone kawałki tkanki w probówkach dysocjatora tkanek. Napełnij probówki nie więcej niż 4 g chusteczki i zanurz kawałki tkanki w ~ 10 ml 1x kolagenazy IV. 
	UWAGA: Stosowanie DNazy I nie jest zalecane, ponieważ może nieznacznie zmniejszyć żywotność i wydajność NK. Proszę zapoznać się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z konkretnymi używanymi rurkami do dysocjacji tkanek.</li>
	<li>Umieścić probówki dysocjatora tkanek w dysocjatorze tkankowym i zmiksować w temperaturze 37 °C, aby dokładnie zmielić tkankę. 
	UWAGA: W przypadku tkanki wątroby może to potrwać ponad 30 minut. W przypadku bardziej kruchych tkanek może wystarczyć około 15 minut. Proszę zapoznać się z Tabelą Materiałów, aby uzyskać informacje na temat określonych probówek do dysocjacji tkanek i zastosowanego dysocjatora tkankowego.</li>
	<li>Wyjmij probówki dysocjatora tkanek i przetrzyj przez nylonowe sitko komórkowe o średnicy 40 μm za pomocą końcówki strzykawki o pojemności 5 ml. Zebrać eluent i wyrzucić duże, niestrawione fragmenty.</li>
	<li>Odwirowywać eluent w temperaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić granulki komórkowe w 30% krzemionce pokrytej poliwinylopirolidonem (PVP), aby usunąć komórki tłuszczowe, które w przeciwnym razie zanieczyściłyby końcową frakcję limfocytów.
	<ol>
		<li>Aby przygotować 1x krzemionkę pokrytą PVP, użyj rozcieńczenia 9:1 krzemionki pokrytej PVP w 10x PBS. 
		UWAGA: Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z konkretną zastosowaną krzemionką pokrytą PVP.</li>
		<li>Aby przygotować 30% krzemionki pokrytej PVP, rozcieńczyć 1x krzemionkę pokrytą PVP za pomocą PBS / HBSS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wirować osad komórkowy o masie 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 9 ml pożywki R-10. 
	UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać informacje na temat składu pożywek R-10</li>
	<li>Ostrożnie ułóż zawiesinę komórkową na 4 ml Ficollu lub pożywki do separacji limfocytów, aby oddzielić limfocyty od czerwonych krwinek i komórek wielojądrzastych.</li>
	<li>Rozdzielić warstwy, wirując przy 400 x g przez 23 minuty w temperaturze pokojowej z wyłączonym przyspieszaniem i hamowaniem lub przy najniższym ustawieniu. Ostrożnie zdekantować górną warstwę pożywki i zebrać interfazę zawierającą limfocyty naciekające tkanki.</li>
	<li>Przepłukać komórki 10 ml pożywki i przystąpić do zliczania komórek, cytometrii przepływowej, porcjowania i zamrażania komórek lub pierwotnego protokołu ekspansji NK.</li>
</ol>
2. Pierwotna ekspansja komórek NK z PBMC (lub CB lub tkanek narządowych) (Dzień 0), jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 2.
<ol>
	<li>Rozmrozić zamrożony PBMC i zamrożone, napromieniowane komórki zasilające w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przemyć oddzielnie PBMC i 100 napromieniowanych promieniami gamma (napromieniowanych Gy) komórek 221-mIL-21 przez odwirowanie przy 400 x g przez 5 minut za pomocą 10 ml pożywki R-10.</li>
	<li>Zaoszczędź 1 x 106 komórek PBMC do cytometrii przepływowej. 
	UWAGA: Początkowa czystość komórek NK jest ważnym czynnikiem przy obliczaniu szybkości ekspansji komórek NK.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki R-10. Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego.</li>
	<li>Wymieszać 5 x 106 komórek PBMC z 10 x 106 komórek 100 napromieniowanych Gy-221 komórek 221-mIL-21 w specjalnej 6-dołkowej płytce (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Dodać 30 ml pożywki R-10 uzupełnionej ludzką IL-2 (200 U/ml) i ludzką IL-15 (5 ng/ml) (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Inkubować specjalną 6-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Zastąp pożywkę pożywką R-10 uzupełnioną ludzką IL-2 (200 U/ml) i ludzką IL-15 (5 ng/ml) w celu utrzymania komórek NK co 3-4 dni. 
	UWAGA: Utrzymuj mniej niż 20 x 106 komórek na studzienkę w celu dalszej ekspansji przy każdej zmianie podłoża. Aby uzyskać najlepszą żywotność, upewnij się, że całkowita liczba komórek w każdym dołku nie przekracza 100 x 106 komórek.</li>
	<li>Zapisz całkowitą liczbę komórek, żywotność i wykonuj cytometrię przepływową co 3-4 dni, aby obliczyć szybkość ekspansji komórek NK.</li>
</ol>
3. Dołączenie komórek 293T (Dzień 2), jak pokazano na Rysunek 2.
<ol>
	<li>Podzielić 1,8 x 106 komórek 293T w 11 ml pożywki D-10 na płytkę 100 mm poddaną działaniu środka. 
	UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać informacje na temat składu pożywek D-10</li>
	<li>Inkubować komórki 293T w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
</ol>
4. Transfekcja retrowirusa (Dzień 3)
<ol>
	<li>W probówce o pojemności 1,7 ml wymieszaj 470 μl zredukowanej pożywki surowicy z 30 μl odczynnika do transfekcji. 
	UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby zapoznać się z konkretnymi zastosowanymi pożywkami o zredukowanej surowicy i odczynnikami do transfekcji.</li>
	<li>W oddzielnej probówce o pojemności 1,7 ml dodaj 2,5 μg plazmidu pRDF, 3,75 μg plazmidu Pegpam3 i 2,5 μg konstruktu CAR w wektorze SFG do zredukowanej pożywki surowicy, tak aby końcowa objętość wynosiła 500 μL.</li>
	<li>Roztwory z kroków 4.1 i 4.2 mieszać kroplami.</li>
	<li>Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Dodać 1 ml mieszaniny z etapu 4.4 do płytki komórkowej 293T w dniu 1 w postaci kropli.</li>
	<li>Inkubować płytkę (płytki) w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 48–72 godzin.</li>
</ol>
5. Powlekanie płytką Retronektyny (Dzień 3)
<ol>
	<li>Rozcieńczyć białko retronektyny solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do końcowego stężenia 50-100 μg/ml.</li>
	<li>Dodać 500 μl rozcieńczonej retronektyny do każdej studzienki niepoddanej działaniu 24-dołkowej płytki (5 dołków na konstrukt CAR). Uszczelnić płytkę za pomocą parafilmu i inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
</ol>
6. Transdukcja (Dzień 4)
<ol>
	<li>Odwirować płytkę retronektyny o stężeniu 2103 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zablokować każdą studzienkę 24-dołkowej płytki 1 ml pożywki R-10.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 1 godzinę.</li>
	<li>Podgrzej wirówkę do temperatury 32 °C, podczas gdy płytka retronektyny jest blokowana.</li>
	<li>Zebrać supernatant retrowirusa, filtrując transfekowane komórki 293T za pomocą filtra 0,45 μm.</li>
	<li>Porcjować 2 ml przefiltrowanego supernatantu retrowirusa do każdej studzienki.</li>
	<li>Odwirować 24-dołkową płytkę o stężeniu 2103 x g przez 2 godziny w temperaturze 32 °C.</li>
	<li>Podczas wirowania na płytce należy zebrać ekspandowane komórki PBNK z dnia 0 i policzyć komórki za pomocą błękitu trypanowego. 
	UWAGA: Kontynuuj rozszerzanie komórek PBNK, dodając pożywkę R-10 uzupełnioną IL-2 (200 U/mL) i IL-15 (5 ng/ml).</li>
	<li>Rozcieńczyć ekspandowane komórki PBNK pożywką R-10 uzupełnioną IL-2 (200 U/ml) i IL-15 (5 ng/ml) do 2,5 x 105-5 x 105 komórek/ml (0,5 x 106-1 x 106 komórek na studzienkę). 
	UWAGA: Zapisz całkowitą liczbę komórek, żywotność i zapisz 5 x 105 rozszerzonych komórek PBNK do cytometrii przepływowej, ponieważ te wartości są ważne przy określaniu szybkości ekspansji komórek NK.</li>
	<li>Po odwirowaniu częściowo odessać supernatant retrowirusa z każdej studzienki. 
	UWAGA: Nie należy całkowicie aspirować, tj. pozostawić około 100 μl supernatantu retrowirusa na studzienkę, ponieważ zmniejszy to wydajność transdukcji.</li>
	<li>Podwielokrotność 2 ml rozcieńczonych ekspandowanych komórek PBNK od etapu 6.8 do każdego dołka.</li>
	<li>Odwirować płytkę przy 600 x g przez 10 minut w temperaturze 32 °C. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 48-72 h. 
	UWAGA: Nie parafilmuj płyty.</li>
</ol>
7. Zbiór komórek CAR-NK (dzień 6 lub 7), jak pokazano w Rysunek 2.
<ol>
	<li>Delikatnie zebrać komórki z 24-dołkowej płytki i przenieść je do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml 
	UWAGA: Staraj się nie generować pęcherzyków, ponieważ spowoduje to zmniejszenie żywotności komórek.</li>
	<li>Odwirować probówkę o sile 400 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Zawiesić osad z 1 ml pożywki R-10 i policzyć komórki za pomocą Trypan Blue. 
	UWAGA: Zapisz 5 x 105 komórek do cytometrii przepływowej w celu określenia wydajności transdukcji.</li>
	<li>Przenieś zawieszone komórki na specjalną 6-dołkową płytkę zawierającą 30 ml pożywki R-10 uzupełnionej IL-2 (200 U/ml) i IL-15 (5 ng/ml).</li>
	<li>Inkubować specjalną 6-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Zastąp pożywkę R-10 uzupełnioną IL-2 (200 U/ml) i IL-15 (5 ng/ml), aby utrzymać komórki NK co 3 - 4 dni. 
	UWAGA: Utrzymuj mniej niż 20 x 106 komórek na studzienkę w celu dalszej ekspansji przy każdej zmianie. Aby uzyskać najlepszą żywotność, upewnij się, że całkowita liczba komórek w każdym dołku nie przekracza 100 x 106 komórek.</li>
	<li>Zapisuj całkowitą liczbę komórek, żywotność i wykonuj cytometrię przepływową co 3-4 dni, aby obliczyć szybkość ekspansji komórek NK.</li>
	<li>Komórki należy wykorzystać do odpowiednich testów in vitro lub in vivo. 
	UWAGA: Ekspandowane ex vivo komórki PBNK i CAR-NK można hodować w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez około 4 tygodnie.</li>
	<li>Zbadaj liczbę i czystość komórek NK w 7, 11, 14, 18 i 21 dniu za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>

<ol><li>Van Acker, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD56+in+the+immune+system%3A+More+than+a+marker+for+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD56 in the immune system: More than a marker for cytotoxicity.</a> Frontiers in Immunology. 8, 892(2017).</li>
<li>Caligiuri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human natural killer cells.</a> Blood. 112 (3), 461-469 (2008).</li>
<li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+and+expression+of+three+cloned+human+non-HLA-A%2CB%2CC+class+I+major+histocompatibility+complex+genes+in+mutant+lymphoblastoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Nationall+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfer and expression of three cloned human non-HLA-A,B,C class I major histocompatibility complex genes in mutant lymphoblastoid cells.</a> Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 85 (1), 227-231 (1988).</li>
<li>Wu, J., Lanier, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells and cancer.</a> Advances in Cancer Research. 90, 127-156 (2003).</li>
<li>Liu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+CAR-transduced+natural+killer+cells+in+CD19-positive+lymphoid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors.</a> The New England Journal of Medicine. 382 (6), 545-553 (2020).</li>
<li>Alonso-Camino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+toxicity+management+of+CAR-T-cell+immunotherapy%3A+a+matter+of+responsiveness+control+or+tumour-specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Efficacy and toxicity management of CAR-T-cell immunotherapy: a matter of responsiveness control or tumour-specificity.</a> Biochemical Society Transactions. 44 (2), 406-411 (2016).</li>
<li>Bonifant, C. L., Jackson, H. J., Brentjens, R. J., Curran, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+and+management+in+CAR+T-cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Toxicity and management in CAR T-cell therapy.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 3, 16011(2016).</li>
<li>Kalaitsidou, M., Kueberuwa, G., Schitt, A., Gilham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T-cell+therapy%3A+toxicity+and+the+relevance+of+preclinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">CAR T-cell therapy: toxicity and the relevance of preclinical models.</a> Immunotherapy. 7 (5), 487-497 (2015).</li>
<li>Gust, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+activation+and+blood-brain+barrier+disruption+in+neurotoxicity+after+adoptive+immunotherapy+with+CD19+CAR-T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Endothelial activation and blood-brain barrier disruption in neurotoxicity after adoptive immunotherapy with CD19 CAR-T cells.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).</li>
<li>Hay, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+biomarkers+of+severe+cytokine+release+syndrome+after+CD19+chimeric+antigen+receptor-modified+T-cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Kinetics and biomarkers of severe cytokine release syndrome after CD19 chimeric antigen receptor-modified T-cell therapy.</a> Blood. 130 (21), 2295-2306 (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+kinetics+of+human+natural+killer+cells%3A+the+effects+of+ageing+and+acute+and+chronic+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">In vivo kinetics of human natural killer cells: the effects of ageing and acute and chronic viral infection.</a> Immunology. 121 (2), 258-265 (2007).</li>
<li>Vidard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD137+%284-1BB%29+Engagement+fine-tunes+synergistic+IL-15-+and+IL-21-driven+nk+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD137 (4-1BB) Engagement fine-tunes synergistic IL-15- and IL-21-driven nk cell proliferation.</a> Journal of Immunology. 203 (3), Baltimore, Md. 676-685 (2019).</li>
<li>Venkatasubramanian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-21-dependent+expansion+of+memory-like+NK+cells+enhances+protective+immune+responses+against+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-21-dependent expansion of memory-like NK cells enhances protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis.</a> Mucosal Immunology. 10 (4), 1031-1042 (2017).</li>
<li>Ojo, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+bound+IL-21+based+NK+cell+feeder+cells+drive+robust+expansion+and+metabolic+activation+of+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Membrane bound IL-21 based NK cell feeder cells drive robust expansion and metabolic activation of NK cells.</a> Scientific Reports. 9 (1), 14916(2019).</li>
<li>Denman, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+IL-21+promotes+sustained+ex+vivo+proliferation+of+human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound IL-21 promotes sustained ex vivo proliferation of human natural killer cells.</a> PLoS One. 7 (1), 30264(2012).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superior+expansion+and+cytotoxicity+of+human+primary+NK+and+CAR-NK+cells+from+various+sources+via+enriched+metabolic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Superior expansion and cytotoxicity of human primary NK and CAR-NK cells from various sources via enriched metabolic pathways.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 18, 428-445 (2020).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cell-based+cancer+immunotherapy%3A+from+basic+biology+to+clinical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">NK cell-based cancer immunotherapy: from basic biology to clinical development.</a> Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 7(2021).</li>
<li>Gong, J. H., Maki, G., Klingemann, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+human+cell-line+%28Nk-92%29+with+phenotypical+and+functional-characteristics+of+activated+natural-killer-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Characterization of a human cell-line (Nk-92) with phenotypical and functional-characteristics of activated natural-killer-cells.</a> Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).</li>
<li>Tam, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+genetically+altered%2C+interleukin+2-independent+natural+killer+cell+lines+suitable+for+adoptive+cellular+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Characterization of genetically altered, interleukin 2-independent natural killer cell lines suitable for adoptive cellular immunotherapy.</a> Human Gene Therapy. 10 (8), 1359-1373 (1999).</li>
<li>Robertson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+cell+line%2C+NKL%2C+derived+from+an+aggressive+human+natural+killer+cell+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a cell line, NKL, derived from an aggressive human natural killer cell leukemia.</a> Experimental Hematology. 24 (3), 406-415 (1996).</li>
<li>Hu, Y., Tian, Z. G., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29-transduced+natural+killer+cells+in+tumor+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor (CAR)-transduced natural killer cells in tumor immunotherapy.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (2), 167-176 (2018).</li>
<li>Tseng, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+anti-CD147+chimeric+antigen+receptors+targeting+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Efficacy of anti-CD147 chimeric antigen receptors targeting hepatocellular carcinoma.</a> Nature Communications. 11 (1), 4810(2020).</li>
<li>Easom, N. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-15+overcomes+hepatocellular+carcinoma-induced+NK+cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-15 overcomes hepatocellular carcinoma-induced NK cell dysfunction.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1009(2018).</li>
<li>Granzin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+IL-21+and+feeder+cell-driven+ex+vivo+expansion+of+human+NK+cells+with+therapeutic+activity+in+a+xenograft+mouse+model+of+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient IL-21 and feeder cell-driven ex vivo expansion of human NK cells with therapeutic activity in a xenograft mouse model of melanoma.</a> Oncoimmunology. 5 (9), 1219007(2016).</li>
<li>Liu, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cord+blood+derived+natural+killer+cells+engineered+with+a+chimeric+antigen+receptor+targeting+CD19+and+expressing+IL-15+have+long+term+persistence+and+exert+potent+anti-leukemia+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cord blood derived natural killer cells engineered with a chimeric antigen receptor targeting CD19 and expressing IL-15 have long term persistence and exert potent anti-leukemia activity.</a> Blood. 126 (23), (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Większość obecnych produktów CAR-NK w badaniach klinicznych wykorzystuje linie komórkowe NK17, takie jak NK-92, linia komórkowa wyizolowana od pacjenta z chłoniakiem nieziarniczym18, NK-92MI, niezależna od IL-2 linia komórkowaNK-92 19 i NKL, wyizolowana od pacjenta z dużymi ziarnistymi limfocytami20, ponieważ te linie komórkowe łatwo się namnażają w przypadku produktów "z półki". Jednak te linie komórkowe, np. komórki NK-92, mają marginalną skuteczność kliniczną i ekspansję in vivo, ponieważ wymagają napromieniania przed infuzją, co ogranicza ich proliferację i cytotoksyczność in vivo21. Biorąc pod uwagę te powody, obecnie badane są różne strategie ekspansji pierwotnych komórek NK z kilku źródeł, w tym krwi obwodowej, CB, szpiku kostnego (BM), ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (HSC), indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i tkanek nowotworowych 21,22,23. Na przykład komórki NK mogą być ekspandowane ex vivo przy użyciu interleukin, w tym IL-15, IL-18 i IL-21. Linie komórek limfoblastoidalnych, takie jak komórki K562 lub linie komórek limfoblastoidalnych przekształcone w wirusa Epsteina-Barr, takie jak komórki 721.221, są również wykorzystywane do ekspansji komórek NK16. Jednak wyżej wymienione strategie często generują niewystarczającą liczbę komórek NK do adoptywnego transferu immunoterapii CAR-NK22,24. Aby pomóc w rozwiązaniu tego problemu, badanie przedstawia protokół ekspansji komórek NK ex vivo przy użyciu genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej przekształconej przez EBV, komórek zasilających 221-mIL-21.
Metodologia ekspansji przy użyciu komórek zasilających 221-mIL-21 pokazana w tym protokole jest zoptymalizowana pod kątem ekspansji komórek NK z szybkością ekspansji co najmniej 10 do 100 razy wyższą niż w przypadku innych linii komórkowych białaczki, w tym HL-60 i OCl-AML3 z ekspresją błony IL-21, K562 i K652-mIL21 z ekspresją liganda OX40 22,24,25. Ekspresja CAR jest również oceniana przez około 2 tygodnie ex vivo. Co ważniejsze, strategia ekspansji komórek zasilających 221-mIL-21 może być stosowana do namnażania komórek NK z różnych źródeł, w tym PBMC, CB i narządów stałych, takich jak wątroba, bez początkowego etapu wzbogacania NK. Chociaż system zasilający 221-mIL-21 nie jest tak zależny od dawcy jak wyżej wymienione linie komórkowe zasilające, nie jest całkowicie niezależny od dawców. Średnio system ekspansji 221-mIL-21 może osiągnąć 90% czystości komórek NK przy wysokiej liczbie komórek NK, przy około <5% zanieczyszczenia limfocytów T w 14 dniu po ekspansji. Dlatego, aby wyeliminować możliwość zanieczyszczenia limfocytów T, konieczne jest wyizolowanie komórek NK z otrzymanych próbek przed ekspansją ex vivo lub zastosowanie systemu selekcji CD3+ w celu wyeliminowania limfocytów T po ekspansji ex vivo.
Jednym z zarzutów związanych ze stosowaniem systemu ekspansji komórek NK jest to, że komórki zasilające mogły nie zostać w pełni wyeliminowane po ekspansji lub przed transfuzją, co może budzić poważne obawy regulacyjne; Dlatego tak ważne jest całkowite wyeliminowanie komórek żywicielskich przed transfuzją. Jednak ostatnie badania kliniczne CAR-NK, w których komórki zasilające K562-mIL21-4-1BBL zostały wykorzystane do ekspansji komórek CBNK ex vivo 24,25, nie wykazały żadnych niepokojących powikłań. Co więcej, nasze wstępne dane wykazały stopniowy spadek napromieniowanej populacji 221-mIL-21 wraz z postępem ekspansji (dane nie pokazane). Jednak aby ta metoda ekspansji mogła zostać wdrożona w warunkach klinicznych, potrzebne są bardziej obszerne badania. Reasumując, system ekspansji 221-mIL-21 pomaga rozwiązać problem ekspansji pierwotnych komórek CAR-NK, a tym samym znacząco przyczyni się do szerszego zastosowania immunoterapii opartej na komórkach CAR-NK w najbliższej przyszłości.

Komórki NK są ważnym podzbiorem limfocytów, które wykazują ekspresję CD56 i nie mają ekspresji markera limfocytów T, CD31,2. Konwencjonalne komórki NK są klasyfikowane jako wrodzone komórki odpornościowe odpowiedzialne za nadzór immunologiczny nad komórkami zakażonymi wirusem i komórkami rakowymi. W przeciwieństwie do limfocytów T, komórki NK rozpoznają zakażone lub złośliwe komórki za pomocą CD16 lub innych receptorów aktywujących i nie wymagają tworzenia kompleksu między peptydami antygenowymi a cząsteczkami głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I3,4. Ostatnie badania kliniczne z wykorzystaniem komórek CAR-NK z wykorzystaniem chimerycznego receptora antygenowego (CAR)-NK w leczeniu nawrotowych lub opornych na leczenie nowotworów CD19-dodatnich (chłoniak nieziarniczy lub przewlekła białaczka limfocytowa [CLL]) wykazały wyjątkowe zalety bezpieczeństwa komórek CAR-NK5. Na przykład infuzja komórek CAR-NK wiąże się z minimalną lub znikomą chorobą przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD), neurotoksycznością, kardiotoksycznością i zespołem uwalniania cytokin (CRS)6,7,8,9,10. Jednak konwencjonalne metody namnażania ludzkich komórek NK wykazały wyczerpujące fenotypy z silnym bratobójczym zabijaniem i niedoborem telomerów, co stanowi poważne wyzwanie w uzyskaniu odpowiedniej liczby funkcjonalnych komórek NK do immunoterapii adoptywnej11.
Aby przezwyciężyć te wyzwania, opracowano metodę bezpośredniego namnażania pierwotnych komórek NK z niefrakcjonowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) lub krwi pępowinowej (CB) przy użyciu napromieniowanej i genetycznie modyfikowanej linii komórkowej 721.221 (dalej 221), ludzkiej linii komórkowej B-limfoblastoidalnej o niskiej ekspresji cząsteczek MHC klasy I3. Wcześniejsze badania wykazały znaczenie IL-21 w ekspansji komórek NK; w związku z tym opracowano genetycznie zmodyfikowaną błonę IL-21 wyrażającą wersję linii komórkowej 721.221 (zaczynając od teraz, 221-mIL-21) 11,12,13,14,15. Wyniki wykazały, że pierwotne komórki NK o pojemności 221 mIL-21 z ekspandowaną komórką zasilającą były ekspandowane średnio do >40 000 razy z utrzymującą się wysoką czystością komórek NK przez około 2-3 tygodnie. Dodatkowe informacje dotyczące stosowania tego protokołu można znaleźć w Yang et al.16.
Ten protokół ma na celu zademonstrowanie krok po kroku procedury nowego rozszerzania komórek PBNK, CBNK, NK pochodzących z tkanek i CAR-NK ex vivo.

<table><tbody><tr><td>100 mm poddane obróbce powierzchniowej sterylne naczynia do hodowli tkanek</td><td>VWR</td><td>10062-880</td><td>Do transfekcji</td></tr><tr><td>komórek 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>Do transfekcji</td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka G-REX</td><td>Wilson Wolf</td><td>80240M</td><td>Do ekspansji komórek NK</td></tr><tr><td>AF647-sprzężony fragment AffiniPure F(ab')2 anty-ludzki IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-606-088</td><td>Dla przepływu cytometria</td></tr><tr><td>Konstrukt CAR w wektorze SFG</td><td>Wygenerowany w laboratorium dr Dongfang Liu</td><td>Do transfekcji</td>Kolagenaza IV Sigma C4-22-1G Do izolacji TIL Pożywka kriokonserwacyjna Składnik: Surowica bydlęca płodu (FBS)Corning 35-010-CV 90% pożywki kriokonserwowej Składnik: Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma D2050 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>10%</td></tr><tr><td>D-10 pożywka Składnik: DMEM</td><td>VWR</td><td>45000-304</td><td></td></tr><tr><td>D-10 media Składnik: Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td>10%</td></tr><tr><td>D-10 media Składnik: Penicylina Streptomycyna</td><td>VWR</td><td>45000-652</td><td>1%</td></tr><tr><td>FastFlow & Nisko wiążąca membrana Millipore Express PES</td><td>Millex</td><td>SLHPR33RB</td><td>Do transdukcji</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Genejuice</td><td>VWR</td><td>80611-356</td><td>Do transfekcji</td></tr><tr><td>GentleMACS C-tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>Do izolacji TIL</td></tr><tr><td>gentleMACS Octo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cytat</td><td>Do izolacji TIL</td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS - bez wapń lub magnez)</td><td>ThermoFisher</td><td>14170120</td><td>Do izolacji TIL</td></tr><tr><td>Ludzka IL-15</td><td>Peprotech</td><td>200-15</td><td>Do ekspansji komórek NK</td></tr><tr><td>Ludzka IL-2</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td>Do ekspansji komórek NK</td></tr><tr><td>Napromieniowane komórki zasilające 221-mIL21</td><td>Wygenerowane w laboratorium dr Dongfang Liu</td><td>Zamrożone w pożywkach kriokonserwacyjnych</td>Pożywki do separacji limfocytów <td></td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>25-072-CV</td><td>Do izolacji TIL</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>ThermoFisher</td><td>31895</td><td>Do transfekcji</td></tr><tr><td>PE anty-ludzki klon CD3 HIT3a</td><td>Biolegend</td><td>300308</td><td>Do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>PE/Cy7 anty-ludzki klon CD56 (NCAM) 5.1H11</td><td>BioLegend</td><td>362509</td><td>Do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Plazmid Pegpam3</td><td>Wygenerowany w laboratorium dr Dongfang Liu</td> Dla <td></td><td> transfekcja</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17089101</td><td>Do izolacji TIL</td></tr><tr><td>Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMCs)</td><td>New York Blood Center</td><td></td><td>Wyizolowane z osocza zdrowych dawców, zamrożone w pożywce kriokonserwującej</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>Do transdukcji</td></tr><tr><td>plazmidu pRDF</td><td>Wygenerowany w laboratorium</td><td></td> dr Dongfang Liu<td>Do transfekcji</td></tr><tr><td>R-10 media Składniki: RPMI 1640</td><td>VWR</td><td>45000-404</td><td></td></tr><tr><td>R-10 media Składnik: L-glutamina</td><td>VWR</td><td>45000-304</td><td>1%</td></tr><tr><td>R-10 media Składnik: Penicylina Streptomycyna</td><td>VWR</td><td>45000-652</td><td>1%</td></tr><tr><td>R-10 media Składnik: Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td>10%</td></tr><tr><td>Retronektyna</td><td>Wygenerowane w laboratorium dr Dongfang Liu</td><td>domowej roboty</td><td>Do transdukcji</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Corning</td><td>25-900-Cl</td><td>Do liczenia komórek</td></tr><tr><td>Nieobrobiona płytka 24-dołkowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-690-071</td><td>Do transdukcji</td></tr></tbody></table>

metoda ekspansji komórek nk i car-nk przy użyciu linii komórkowej b zmodyfikowanej przez błonę il-21

Natural Killer (NK) and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Terapia komórkami odpornościowymi zmodyfikowanymi przez chimeryczny receptor antygenowy (CAR) stała się nowym sposobem leczenia nowotworów i chorób zakaźnych. Immunoterapia oparta na NK, a w szczególności na komórkach CAR-NK, jest jednym z najbardziej obiecujących rozwiązań "z półki" bez poważnej toksyczności zagrażającej życiu. Jednak wąskim gardłem w opracowaniu skutecznej terapii CAR-NK jest uzyskanie wystarczającej liczby niewyczerpujących, długowiecznych, "gotowych" komórek CAR-NK od strony trzeciej. W tym miejscu opracowaliśmy nową metodę ekspansji CAR-NK przy użyciu linii komórek B transformowanej wirusem Epsteina-Barr (EBV) wyrażającej genetycznie zmodyfikowaną błonową formę interleukiny-21 (IL-21). W tym protokole przedstawiono procedury krok po kroku mające na celu ekspansję komórek NK i CAR-NK z krwi pępowinowej i krwi obwodowej, a także tkanek narządów litych. Prace te znacznie usprawnią rozwój kliniczny immunoterapii CAR-NK.

Schematyczny przebieg procesu izolacji naciekających tkanki komórek NK oraz ekspansji komórek PBNK z wykorzystaniem metodologii z komórkami karmicielkami 221-mIL-21 przedstawiono na Rysunku 1 oraz Rysunku 2. Ekspandowane komórki PBNK zbierano co 3 lub 4 dni do analizy cytometrycznej w celu określenia czystości komórek NK poprzez barwienie komórek przeciwciałami anty-ludzkimi CD56 i anty-ludzkimi CD3. Eksperyment powtórzono z wykorzystaniem dwóch różnych dawców, aby wykazać powtarzalność systemu ekspansji (Rysunek 3). Wykazano, że komórki PBNK ekspandowane przez 221-mIL-21 ulegają namnożeniu prawie 5 × 104 razy (Rysunek 3A). Co więcej, czystość komórek NK została utrzymana na wysokim poziomie, około 85% przez cały 21-dniowy okres ekspansji (Rysunek 3B). Przy zastosowaniu systemu ekspansji z komórkami karmicielkami 221-mIL-21 czystość komórek NK konsekwentnie mieściła się w zakresie 85%-95%, niezależnie od dawców (dane nie pokazano). Aby zademonstrować odporność systemu ekspansji 221-mIL-21, komórki PBMC przed ekspansją poddano barwieniu przeciwciałami anty-CD56 i anty-CD3, co wykazało czystość komórek NK na poziomie 7,09% oraz wysoki odsetek limfocytów T (Rysunek 4A). Komórki PBMC współhodowano z 221-mIL-21 w celu ekspansji komórek NK; czystość NK sprawdzono przed transdukcją CAR-NK w dniu 4 (Rysunek 4A). Komórki CAR-NK zebrano i poddano barwieniu przeciwciałami anty-CD56, anty-CD3 oraz anty-hIgG(H+L) F(ab')2, co wykazało wysoką populację komórek NK (86,9% w dniu 7) i wysoką wydajność transdukcji CAR wynoszącą około 70% (Rysunek 4). Wyższe wydajności transdukcji (do 95%) zaobserwowano również przy użyciu systemu pakowania retrowirusów. Podsumowując, dane te pokazują, że komórki karmicielki 221-mIL-21 mogą skutecznie ekspandować komórki NK i zachowywać ich czystość ex vivo.
<img alt="Schemat procesu trawienia tkanek i separacji komórek dla hodowli komórek NK; obejmuje dodawanie cytokin." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62336/62336fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat ekspansji komórek NK z próbek ludzkich organów litych. W skrócie, otrzymane próbki ludzkiej wątroby są siekane na małe kostki w celu trawienia mechanicznego. Następnie rozdzielone komórki są izolowane przy użyciu krzemionki powlekanej PVP oraz pożywki do separacji limfocytów (Lymphocyte Separation Media). Dalej, komórki NK są namnażane zgodnie z protokołem ekspansji opisanym na Rysunku 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62336/62336fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Produkcja komórek CAR-NK; transfekcja, pakowanie retrowirusa; ekspansja cytokinowa, schemat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62336/62336fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schematyczny przebieg procesu generowania komórek CAR-NK z PBMC. W skrócie, komórki dokarmiające 221-mIL21 zostały napromienione dawką 100 Gy przed współhodowlą z PBMC uzupełnionymi o IL-2 i IL-15 w dniu 0. Równolegle komórki 293T zostały poddane transfekcji systemem pakowania retrowirusów w celu wytworzenia retrowirusa CAR, który następnie został przetransdukowany do wyekspandowanych komórek PBNK w obecności IL-2 i IL-15. Pierwotne komórki CAR-NK zebrano w dniu 7 i kontynuowano ich ekspansję przez 21 dni. Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie pracy Yang i wsp.16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62336/62336fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy proliferacji i czystości komórek NK; A: zmiana krotności; B: czystość komórek w ciągu 25 dni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62336/62336fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
Rysunek 3: Dynamiczna ekspansja komórek PBNK w czasie. (A) Krotność ekspansji PBNK w ciągu 22 dni. Komórki barwiono przeciwciałami anty-CD56 i anty-CD3 we wskazanych dniach do analizy cytometrycznej. Całkowita liczba komórek NK została wyznaczona poprzez pomnożenie czystości komórek NK przez całkowitą liczbę komórek. Tempo ekspansji obliczono w następujący sposób: (Liczba komórek NK)Tn/(Liczba komórek NK)T0, gdzie Liczba komórek NK = (procent czystości komórek NK) × (całkowita liczba komórek), T0 to liczba komórek NK w dniu 0, a Tn to liczba komórek NK w dniu n. (B) Czystość komórek NK w ciągu 22 dni. Ekspansję komórek NK powtórzono dwukrotnie z udziałem dwóch różnych dawców. Słupki błędu reprezentują ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62336/62336fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy cytometrii przepływowej komórek CD3/CD56; wyniki przed/po ekspansji, transdukcji i analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62336/62336fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywna analiza cytometryczna komórek CAR-NK. (A) Reprezentatywne wykresy kropkowe przedstawiające dynamiczne zmiany czystości komórek NK w populacji komórek CAR-NK w ciągu 18 dni. Analizę cytometrią przepływową przeprowadzono poprzez barwienie komórek przeciwciałami anty-CD56 i anty-CD3 w określonych punktach czasowych. Dzień 0 oznacza etap przed ekspansją PBNK. Dzień 4 oznacza etap po ekspansji PBNK i przed transdukcją komórek CAR-NK. Dzień 7 oznacza etap po transdukcji komórek CAR-NK. (B) Reprezentatywne wykresy kropkowe przedstawiające wydajność transdukcji komórek CAR-NK z wykorzystaniem systemu pakowania retrowirusów. Komórki zabarwiono przeciwciałami anty-CD56, anty-CD3 oraz anty-hIgG(H+L) F(ab')2 do analizy cytometrycznej. (C) Reprezentatywne wykresy kropkowe przedstawiające ekspresję CAR w różnych subpopulacjach, w tym CD56+CD3-, CD56-CD3+, CD56+CD3+ oraz CD56-CD3- w 18. dniu. Komórki zabarwiono przeciwciałami anty-CD56, anty-CD3 oraz anty-hIgG(H+L) F(ab')2 (wskazującym na ekspresję CAR) do analizy cytometrycznej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62336/62336fig04large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>

Tutaj prezentujemy metodę rozszerzania naturalnego killera krwi obwodowej (PBNK), komórek NK z tkanek wątroby oraz chimerycznych receptorów antygenowych (CAR)-komórek NK pochodzących z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) lub krwi pępowinowej (CB). Protokół ten demonstruje ekspansję komórek NK i CAR-NK przy użyciu ogniw zasilających 221-mIL-21 oprócz zoptymalizowanej czystości ekspandowanych komórek NK.

Metoda ekspansji komórek NK i CAR-NK przy użyciu linii komórkowej B zmodyfikowanej przez błonę IL-21

Chimeric antigen receptor (CAR)-modified immune cell therapy has become an emerging treatment for cancers and infectious diseases. NK-based immunotherapy, ...

Protokół ten może znacznie poprawić ekspansję funkcjonalnych, niewyczerpujących, przypominających pamięć komórek NK ex vivo w porównaniu z innymi komórkami zasilającymi opartymi na systemie ekspansji. Jest to prostsza metoda w porównaniu z innymi protokołami wykorzystującymi komórki zasilające, w których pomijamy etap izolacji komórek NK przed ekspansją komórek NK. Protokół ten może zapewnić wystarczającą liczbę komórek NK i CAR-NK do immunoterapii.Ta technika jest wysoce powtarzalna. Jednak użycie świeżych, nowych materiałów wyjściowych i dbanie o to, aby nie zakłócić pracy komórek NK w ciągu pierwszych kilku dni ekspansji, ma kluczowe znaczenie. Zacznij od zidentyfikowania i podzielenia żywotnych obszarów tkanek za pomocą sterylnego sprzętu chirurgicznego w celu uzyskania limfocytów.Następnie umieść pocięte tkanki w 30 mililitrach HBSS bez wapnia i magnezu i trzymaj tkankę na lodzie, aż będzie gotowa do izolacji. Pracując w komorze bezpieczeństwa biologicznego, zmiel tkankę na mniej niż 0,5 centymetra kostki za pomocą sterylnych żyletek i kleszczy. Umieścić kawałki tkanki mielonej, nie więcej niż 4 gramy, w probówkach dysocjatora tkanek i dodać 10 mililitrów kolagenazy IV do kawałków tkanki.Aby dokładnie zmielić tkankę, potraktuj probówki dysocjatora tkanek do dysocjatora tkanek w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po wyjęciu probówek z dysocjatora tkanek należy przepuścić zmieloną tkankę przez 40-mikronowe nylonowe sitko do komórek, używając końcówki strzykawki o pojemności 5 mililitrów. Wyrzuć duże, niestrawione fragmenty.Odwiruj zebrany eluent w 400G przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odessaj supernatant przed ponownym zawieszeniem granulek komórkowych w 30% krzemionce pokrytej poliwinylopirolidonem w celu usunięcia komórek tłuszczowych. Zakręć ogniwa zgodnie z opisem przed ponownym zawieszeniem osadu komórkowego w 9 mililitrach pożywki R-10. Aby oddzielić limfocyty od czerwonych krwinek i komórek wielojądrzastych, ostrożnie ułóż zawiesinę komórkową na 4 mililitrach Ficollu lub pożywki do separacji limfocytów.Oddziel warstwy, wirując w temperaturze 400 G przez 23 minuty w temperaturze pokojowej z wyłączonym przyspieszaniem i hamowaniem. Następnie ostrożnie zdekantować górną warstwę pożywki i zebrać interfazę zawierającą limfocyty naciekające tkanki. Przepłucz komórki 10 mililitrami pożywki i przystąp do analizy lub protokołu ekspansji komórek pierwotnej metody naturalnej zabójcy lub NK.Przemyć komórki jednojądrzaste krwi obwodowej lub PBMC i 100 napromieniowanych promieniami gamma komórek 221-mIL-21 oddzielnie przez odwirowanie w temperaturze 400 G przez 5 minut z 10 mililitrami pożywki R-10. Po odwirowaniu zachowaj 1 x 10 do 6. PBMC do cytometrii przepływowej i wymieszaj 5 x 10 do 6. PBMC z 10 x 10 do 6. 100 napromieniowanych promieniami gamma komórek 221-mIL-21 w specjalnej 6-dołkowej płytce. Dodaj 30 mililitrów pożywki R-10 uzupełnionej ludzką interleukiną-2 i ludzką interleukiną-15 do tej samej 6-dołkowej płytki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, wymieniając pożywkę co 3 do 4 dni.Podczas inkubacji zapisuj całkowitą żywotność komórek naturalnego zabójcy krwi obwodowej (PBNK) i wykonuj cytometrię przepływową co 3 do 4 dni, aby obliczyć szybkość ekspansji komórek NK. Dodaj 1,8 x 10 do szóstych komórek 293T w 11 mililitrach pożywki D-10 na traktowaną 100 milimetrową płytkę i inkubuj komórki 293T w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. W probówce o pojemności 1,70 mililitra wymieszaj 470 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy z 30 mikrolitrami odczynnika do transfekcji.W oddzielnej probówce o pojemności 1,70 mililitra dodaj 2,5 mikrograma plazmidu pRDF, 3,75 mikrograma plazmidu Pegpam3 i 2,5 mikrograma konstruktu CAR w wektorze SFG do zredukowanej pożywki surowicy, aby uzyskać końcową objętość 500 mikrolitrów. Wymieszaj zawartość probówki z przygotowaną wcześniej tubką o pojemności 1,70 mililitra w sposób kroplowy. Po 15 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej dodać 1 mililitr mieszaniny z probówki do płytki komórkowej 293T kroplami i umieścić płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na 48 do 72 godzin.Rozcieńczyć białko retronektyny PBS do końcowego stężenia od 50 do 100 mikrogramów na mililitr. Dodać 500 mikrolitrów rozcieńczonej retronektyny do każdej studzienki niepoddanej działaniu 24-dołkowej płytki. Następnie uszczelnij płytkę za pomocą parafilmu i inkubuj płytkę w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc.Następnego dnia odwirować płytkę retronektyny o temperaturze 2,103G przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza i wyrzucić supernatant. Po zablokowaniu każdej studzienki 24-dołkowej płytki 1 mililitrem pożywki R-10, inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 1 godzinę. Przefiltruj wcześniej transfekowane komórki 293T za pomocą filtra 0,45 mikrona, aby zebrać supernatant retrowirusa.Porcję 2 mililitrów przefiltrowanego supernatantu retrowirusa do każdej studzienki 24-dołkowej płytki retronektyny. Odwirować 24-dołkową płytkę retronektyny o temperaturze 2,103 G przez 2 godziny do wstępnie ogrzanej wirówki w temperaturze 32 stopni Celsjusza. Podczas wirowania płytek należy zebrać ekspandowane komórki PBNK z dnia 0 i policzyć komórki za pomocą błękitu trypanowego.Rozcieńczyć ekspandowane komórki PBNK pożywką R-10 uzupełnioną interleukiną-2 i interleukiną-15 do stężenia 2,5 x 10 do 5 do 5 x 10 do 5 komórek na mililitr. Po odwirowaniu 24-dołkowej płytki retronektyny, częściowo odessać supernatant retrowirusa z każdej studzienki. Następnie dodaj 2 mililitry rozcieńczonych ekspandowanych komórek PBNK do każdej studzienki.Odwirować płytkę w temperaturze 600 G przez 10 minut w temperaturze 32 stopni Celsjusza, a następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 48 do 72 godzin. Przenieś komórki z 24-dołkowej płytki do 50-mililitrowej probówki wirówkowej, aby odwirować probówkę o masie 400 G przez 5 minut. Po ponownym wymieszaniu osadu z 1 mililitrem pożywki R-10 przenieś zawieszone komórki na specjalną 6-dołkową płytkę zawierającą 30 mililitrów pożywki R-10 uzupełnionej interleukiną-2 i interleukiną-15.Inkubować specjalną 6-dołkową płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla z pożywką odświeżającą i obliczać szybkość ekspansji komórek NK co 3 do 4 dni. Wykazano, że komórki PBNK rozszerzone przez 221-mIL-21 rozszerzają się prawie 5 x 10 do 4 fałdów. Czystość komórek NK została utrzymana na poziomie około 85% przez cały 21-dniowy okres ekspansji.Przed ekspansją zbadano wytrzymałość systemu ekspansji 221-mIL-21 poprzez barwienie PBMC pod kątem anty-CD56 i anty-CD3, które wykazały czystość komórek 7,09% dla komórek NK i wysoki odsetek limfocytów T. W 4 dniu kokultury PBMC i 221-mIL-21 czystość NK została sprawdzona przed transdukcją CAR-NK. Komórki CAR-NK wybarwione pod kątem anty-CD56, anty-CD3 i anty-ludzkie-IgG wykazały wysoką populację komórek NK w dniu 7 i zaobserwowano wysoką skuteczność transdukcji CAR wynoszącą około 70%.W 18. dobie ekspresję CAR w różnych podzbiorach sprawdzono za pomocą cytometrii przepływowej. Po ekspansji komórek NK komórki mogą być wykorzystywane do testów funkcjonalnych in vitro lub do eksperymentów in vivo. Badacz może wykorzystać ten protokół do rozszerzenia NK i CAR-NK u pacjentów z funkcjonalnym niedoborem NK, a także u innych gatunków, takich jak pies.

natural-killer-nk-car-nk-cell-expansion-method-using-membrane-bound

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W niniejszej pracy opisujemy metodę wydajnej ekspansji i oczyszczania dużych ilości ludzkich komórek NK oraz oceny ich funkcji.

Ekspansja, oczyszczanie i ocena funkcjonalna ludzkich komórek NK z krwi obwodowej

W niniejszej pracy opisujemy metodę aktywacji i ekspansji ludzkich komórek NKT z populacji zmieszanych limfocytów T przy użyciu sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC). Wykorzystanie aAPC opartych na CD1d zapewnia zestandaryzowaną metodę generowania wysokiej liczby funkcjonalnych komórek NKT.

Aktywacja i ekspansja komórek Natural Killer T (NKT) za pośrednictwem sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC)

Ten film pokazuje izolację limfocytów, w tym komórek NK lub komórek NK, z ludzkiej tkanki wątroby w celu selektywnej ekspansji. Trawienie enzymatyczne i mechaniczne, po którym następuje separacja w gradieniu gęstości, sprzyja izolacji limfocytów, w tym komórek NK. Pobrane limfocyty mogą być dalej wykorzystywane do selektywnej ekspansji komórek NK.

Izolacja komórek NK z tkanki wątroby w celu selektywnej ekspansji

Ten film demonstruje technikę ekspansji komórek NK (natural killer) bezpośrednio z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) za pomocą linii komórkowej zasilającej. PBMC są hodowane wspólnie z genetycznie zmodyfikowanymi komórkami odżywiającymi limfoblastoidy eksprymujące interleukinę-21 związaną z błoną (mIL-21), a hodowla jest uzupełniana cytokinami interleukiną-2 (IL-2) i interleukiną-15 (IL-15). Razem ten koktajl ligandów prowadzi do przedłużonej ekspansji komórek NK o wysokiej...

Ekspansja ex vivo komórek NK z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej

Tutaj prezentujemy dostosowany protokół, który może być użyty do wygenerowania dużej liczby mysich niezmiennych limfocytów T NK z mysiej śledziony. W protokole przedstawiono podejście, dzięki któremu komórki iNKT śledziony mogą być wzbogacane, izolowane i namnażane in vitro przy użyciu ograniczonej liczby zwierząt i odczynników.

Zoptymalizowana metoda izolowania i namnażania niezmiennych limfocytów T NK ze śledziony myszy

Prosta i niezawodna metoda jest tutaj opisana do analizy zestawu funkcji komórek NK, takich jak degranulacja, produkcja cytokin i chemokiny w różnych podzbiorach komórek NK.

Test oparty na cytometrii przepływowej do monitorowania funkcji komórek NK

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia izolacji i ekspansji komórek zabójczych CD3+CD56+ pochodzących z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pochodzących z cytokin indukowanych cytokinami i ilustrujemy ich efekt cytotoksyczności wobec hematologicznych i litych komórek nowotworowych za pomocą systemu cytometrii przepływowej in vitro.

Izolacja i ekspansja cytotoksycznych limfocytów T zabójców indukowanych cytokinami w leczeniu raka

Opisujemy szybki i solidny protokół wzbogacania niezmiennych komórek T natural killer (iNKT) ze śledziony myszy i rozszerzania ich in vitro do odpowiedniej liczby dla badań in vitro i in vivo.

Oczyszczanie i namnażanie mysich niezmiennych limfocytów T NK do badań in vitro i in vivo

Obecny protokół pokazuje, jak odróżnić komórki CD3−/CD45+CD56+ o łagodnej cytotoksyczności od ludzkich komórek macierzystych o rozszerzonym potencjale (hEPSC) zarówno w warunkach hodowli 3D, jak i 2D. Pozwala to na rutynową walidację fenotypową bez niszczenia złożonego mikrośrodowiska.

Generowanie komórek NK z ludzkich komórek macierzystych o rozszerzonym potencjale

Tutaj prezentujemy metodę różnicowania i rozszerzania ludzkich komórek NK wyrażających chimeryczny receptor antygenowy (CAR) pochodzących z ludzkiego iPSC z ulepszonym zabijaniem przeciwko różnym nowotworom złośliwym. Protokół ten demonstruje różnicowanie i ekspansję komórek CAR-NK pochodzących z iPSC zoptymalizowanych pod kątem metody NK oraz pomiar aktywności przeciwnowotworowej przeciwko różnym liniom komórek nowotworowych.

Postępy w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach NK wykazujących ekspresję receptora chimerycznego antygenu macierzystego

Ten protokół zapewnia zstandaryzowany in vitro przepływ pracy dla spójnego pomiaru naturalnej, chimerycznej receptora antygenowego–pośredniczonej i zależnej od przeciwciał cytotoksyczności ludzkich naturalnych komórek zwanych zbójcami przy użyciu żywego obrazu komórkowego i cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórek NK potencjowanej przez chimeryczne receptory antygenowe i przeciwciała terapeutyczne z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek i cytometrii przepływowej

Poznaj metodę ekspansji komórek NK i CAR-NK przy użyciu linii komórkowej B z błoną IL-21. Protokół umożliwia uzyskanie dużych ilości czynnych komórek o wysokiej czystości z krwi pępowinowej, krwi obwodowej i tkanek stałych.

Metoda ekspansji komórek NK i CAR-NK przy użyciu linii komórkowej B zmodyfikowanej przez błonę IL-21

Przeglądaj więcej filmów