Metoda ekspansji komórek NK i CAR-NK przy użyciu linii komórkowej B zmodyfikowanej przez błonę IL-21

Tutaj prezentujemy metodę rozszerzania naturalnego killera krwi obwodowej (PBNK), komórek NK z tkanek wątroby oraz chimerycznych receptorów antygenowych (CAR)-komórek NK pochodzących z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) lub krwi pępowinowej (CB). Protokół ten demonstruje ekspansję komórek NK i CAR-NK przy użyciu ogniw zasilających 221-mIL-21 oprócz zoptymalizowanej czystości ekspandowanych komórek NK.

Protokół ten może znacznie poprawić ekspansję funkcjonalnych, niewyczerpujących, przypominających pamięć komórek NK ex vivo w porównaniu z innymi komórkami zasilającymi opartymi na systemie ekspansji. Jest to prostsza metoda w porównaniu z innymi protokołami wykorzystującymi komórki zasilające, w których pomijamy etap izolacji komórek NK przed ekspansją komórek NK. Protokół ten może zapewnić wystarczającą liczbę komórek NK i CAR-NK do immunoterapii.

Ta technika jest wysoce powtarzalna. Jednak użycie świeżych, nowych materiałów wyjściowych i dbanie o to, aby nie zakłócić pracy komórek NK w ciągu pierwszych kilku dni ekspansji, ma kluczowe znaczenie. Zacznij od zidentyfikowania i podzielenia żywotnych obszarów tkanek za pomocą sterylnego sprzętu chirurgicznego w celu uzyskania limfocytów.

Następnie umieść pocięte tkanki w 30 mililitrach HBSS bez wapnia i magnezu i trzymaj tkankę na lodzie, aż będzie gotowa do izolacji. Pracując w komorze bezpieczeństwa biologicznego, zmiel tkankę na mniej niż 0,5 centymetra kostki za pomocą sterylnych żyletek i kleszczy. Umieścić kawałki tkanki mielonej, nie więcej niż 4 gramy, w probówkach dysocjatora tkanek i dodać 10 mililitrów kolagenazy IV do kawałków tkanki.

Aby dokładnie zmielić tkankę, potraktuj probówki dysocjatora tkanek do dysocjatora tkanek w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po wyjęciu probówek z dysocjatora tkanek należy przepuścić zmieloną tkankę przez 40-mikronowe nylonowe sitko do komórek, używając końcówki strzykawki o pojemności 5 mililitrów. Wyrzuć duże, niestrawione fragmenty.

Odwiruj zebrany eluent w 400G przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odessaj supernatant przed ponownym zawieszeniem granulek komórkowych w 30% krzemionce pokrytej poliwinylopirolidonem w celu usunięcia komórek tłuszczowych. Zakręć ogniwa zgodnie z opisem przed ponownym zawieszeniem osadu komórkowego w 9 mililitrach pożywki R-10. Aby oddzielić limfocyty od czerwonych krwinek i komórek wielojądrzastych, ostrożnie ułóż zawiesinę komórkową na 4 mililitrach Ficollu lub pożywki do separacji limfocytów.

Oddziel warstwy, wirując w temperaturze 400 G przez 23 minuty w temperaturze pokojowej z wyłączonym przyspieszaniem i hamowaniem. Następnie ostrożnie zdekantować górną warstwę pożywki i zebrać interfazę zawierającą limfocyty naciekające tkanki. Przepłucz komórki 10 mililitrami pożywki i przystąp do analizy lub protokołu ekspansji komórek pierwotnej metody naturalnej zabójcy lub NK.

Przemyć komórki jednojądrzaste krwi obwodowej lub PBMC i 100 napromieniowanych promieniami gamma komórek 221-mIL-21 oddzielnie przez odwirowanie w temperaturze 400 G przez 5 minut z 10 mililitrami pożywki R-10. Po odwirowaniu zachowaj 1 x 10 do 6. PBMC do cytometrii przepływowej i wymieszaj 5 x 10 do 6. PBMC z 10 x 10 do 6. 100 napromieniowanych promieniami gamma komórek 221-mIL-21 w specjalnej 6-dołkowej płytce. Dodaj 30 mililitrów pożywki R-10 uzupełnionej ludzką interleukiną-2 i ludzką interleukiną-15 do tej samej 6-dołkowej płytki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, wymieniając pożywkę co 3 do 4 dni.

Podczas inkubacji zapisuj całkowitą żywotność komórek naturalnego zabójcy krwi obwodowej (PBNK) i wykonuj cytometrię przepływową co 3 do 4 dni, aby obliczyć szybkość ekspansji komórek NK. Dodaj 1,8 x 10 do szóstych komórek 293T w 11 mililitrach pożywki D-10 na traktowaną 100 milimetrową płytkę i inkubuj komórki 293T w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. W probówce o pojemności 1,70 mililitra wymieszaj 470 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy z 30 mikrolitrami odczynnika do transfekcji.

W oddzielnej probówce o pojemności 1,70 mililitra dodaj 2,5 mikrograma plazmidu pRDF, 3,75 mikrograma plazmidu Pegpam3 i 2,5 mikrograma konstruktu CAR w wektorze SFG do zredukowanej pożywki surowicy, aby uzyskać końcową objętość 500 mikrolitrów. Wymieszaj zawartość probówki z przygotowaną wcześniej tubką o pojemności 1,70 mililitra w sposób kroplowy. Po 15 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej dodać 1 mililitr mieszaniny z probówki do płytki komórkowej 293T kroplami i umieścić płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na 48 do 72 godzin.

Rozcieńczyć białko retronektyny PBS do końcowego stężenia od 50 do 100 mikrogramów na mililitr. Dodać 500 mikrolitrów rozcieńczonej retronektyny do każdej studzienki niepoddanej działaniu 24-dołkowej płytki. Następnie uszczelnij płytkę za pomocą parafilmu i inkubuj płytkę w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia odwirować płytkę retronektyny o temperaturze 2,103G przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza i wyrzucić supernatant. Po zablokowaniu każdej studzienki 24-dołkowej płytki 1 mililitrem pożywki R-10, inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 1 godzinę. Przefiltruj wcześniej transfekowane komórki 293T za pomocą filtra 0,45 mikrona, aby zebrać supernatant retrowirusa.

Porcję 2 mililitrów przefiltrowanego supernatantu retrowirusa do każdej studzienki 24-dołkowej płytki retronektyny. Odwirować 24-dołkową płytkę retronektyny o temperaturze 2,103 G przez 2 godziny do wstępnie ogrzanej wirówki w temperaturze 32 stopni Celsjusza. Podczas wirowania płytek należy zebrać ekspandowane komórki PBNK z dnia 0 i policzyć komórki za pomocą błękitu trypanowego.

Rozcieńczyć ekspandowane komórki PBNK pożywką R-10 uzupełnioną interleukiną-2 i interleukiną-15 do stężenia 2,5 x 10 do 5 do 5 x 10 do 5 komórek na mililitr. Po odwirowaniu 24-dołkowej płytki retronektyny, częściowo odessać supernatant retrowirusa z każdej studzienki. Następnie dodaj 2 mililitry rozcieńczonych ekspandowanych komórek PBNK do każdej studzienki.

Odwirować płytkę w temperaturze 600 G przez 10 minut w temperaturze 32 stopni Celsjusza, a następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 48 do 72 godzin. Przenieś komórki z 24-dołkowej płytki do 50-mililitrowej probówki wirówkowej, aby odwirować probówkę o masie 400 G przez 5 minut. Po ponownym wymieszaniu osadu z 1 mililitrem pożywki R-10 przenieś zawieszone komórki na specjalną 6-dołkową płytkę zawierającą 30 mililitrów pożywki R-10 uzupełnionej interleukiną-2 i interleukiną-15.

Inkubować specjalną 6-dołkową płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla z pożywką odświeżającą i obliczać szybkość ekspansji komórek NK co 3 do 4 dni. Wykazano, że komórki PBNK rozszerzone przez 221-mIL-21 rozszerzają się prawie 5 x 10 do 4 fałdów. Czystość komórek NK została utrzymana na poziomie około 85% przez cały 21-dniowy okres ekspansji.

Przed ekspansją zbadano wytrzymałość systemu ekspansji 221-mIL-21 poprzez barwienie PBMC pod kątem anty-CD56 i anty-CD3, które wykazały czystość komórek 7,09% dla komórek NK i wysoki odsetek limfocytów T. W 4 dniu kokultury PBMC i 221-mIL-21 czystość NK została sprawdzona przed transdukcją CAR-NK. Komórki CAR-NK wybarwione pod kątem anty-CD56, anty-CD3 i anty-ludzkie-IgG wykazały wysoką populację komórek NK w dniu 7 i zaobserwowano wysoką skuteczność transdukcji CAR wynoszącą około 70%.

W 18. dobie ekspresję CAR w różnych podzbiorach sprawdzono za pomocą cytometrii przepływowej. Po ekspansji komórek NK komórki mogą być wykorzystywane do testów funkcjonalnych in vitro lub do eksperymentów in vivo. Badacz może wykorzystać ten protokół do rozszerzenia NK i CAR-NK u pacjentów z funkcjonalnym niedoborem NK, a także u innych gatunków, takich jak pies.