Zoptymalizowana metoda izolowania i namnażania niezmiennych limfocytów T NK ze śledziony myszy

Ogólnym celem niniejszej procedury jest namnażanie niezmiennikowych naturalnych komórek T lub komórek iNKT wyizolowanych ze śledziony myszy. Osiąga się to poprzez wstępną izolację mononuklearnych komórek śledziony, a następnie wzbogacenie populacji limfocytów CD5+ za pomocą magnetycznej separacji komórek. Następnie frakcja komórek iNKT ze śledziony jest dodatkowo izolowana za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją.

W ostatnim kroku posortowane komórki iNKT zostają poddane ekspansji in vitro. Ostatecznie profil cytokinowy wyhodowanych komórek iNKT można ocenić za pomocą testu ELISA. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ oczyszczanie i ekspansja komórek iNKT wymagają zastosowania kombinacji różnych technik.

Procedurę tę przeprowadzi student studiów doktoranckich z mojego laboratorium. Po pobraniu śledziony przenieść tkankę na filtr nylonowy o rozmiarze oczek 70 µm, następnie za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 2 ml delikatnie rozetrzeć śledzionę przez sito do probówki stożkowej o pojemności 50 ml i przemyć filtr 5 ml PBS. Następnie dodać 3 ml roztworu gęstościowego do probówki 15 ml i nanieść na gradient gęstości 5 ml zawiesiny komórkowej.

Oddziel komórki poprzez wirowanie i przenieś granicę faz w nowej probówce o objętości 15 ml. Następnie przemyj komórki w 10 ml zimnego PBS i resuspenduj osad w dwóch ml buforu fax, aby wzbogacić próbkę o limfocyty śledzionowe CD5+. Dostosuj rozcieńczenie komórek do stężenia 1×10⁷ komórek na 90 µl, dodając więcej buforu fax, a następnie dodaj do komórek 10 µl mikrokulek anty-CD5.

Po 15 minutach w temperaturze 4°C przemyj komórki 4 ml buforu FACS i resuspenduj osad w 500 µl świeżego buforu FACS. Wyizoluj komórki CD5+ za pomocą magnetycznej separacji komórek zgodnie z zaleceniami producenta. Następnie rozcieńcz wzbogacone limfocyty CD5+ w stężeniu 1×10⁶ komórek na 20 µl buforu FACS zawierającego przeciwciała anty-CD16, CD32 oraz sprzężony z PE tetramer α-Gal-α-CD1D w temperaturze pokojowej w ciemności. Po 30 minutach inkubuj komórki z interesującymi przeciwciałami w temperaturze 4°C w ciemności przez kolejne 30 minut.

Następnie przemyj komórki w świeżym buforze FACS i barw w nich 10 µL 20 µM roztworu roboczego DPI na 1×10⁶ komórek przez pięć minut. W temperaturze pokojowej nabierz teraz około 1×10⁴ wzbogaconych zdarzeń limfocytów CD5-dodatnich na cytometrze przepływowym, stosując elektroniczne bramkowanie na podstawie niskiego rozproszenia przedniego (forward scatter low), aby wykluczyć dublety i agregaty komórkowe. Wyklucz komórki DAPI-dodatnie, CD8-dodatnie oraz CD19-dodatnie w obrębie populacji o niskim rozproszeniu przednim, korzystając z wykresów obszarowych rozproszenia bocznego i przedniego.

Aby elektronicznie wyselekcjonować limfocyty, należy wykreślić tetramery alpha gal SER CD 1D względem CD3ε i elektronicznie bramkować komórki iNKT dodatnie dla tetrameru alpha gal SER CD 1D i dodatnie dla CD3ε, zgodnie z oznaczeniem. Następnie, nabywając nie więcej niż 2×10⁵ limfocytów wzbogaconych o CD5, należy wyznaczyć procent komórek iNKT dodatnich dla tetrameru alpha gal SER CD 1D i dodatnich dla CD3ε obecnych we wzbogaconej frakcji komórkowej. Korzystając z tej bramki, należy posortować komórki iNKT dodatnie dla tetrameru alpha gal SER CD 1D i dodatnie dla CD3ε do probówki FACS zawierającej 1 mL płodowej surowicy bydlęcej pod koniec sortowania.

Przepłucz wyizolowane komórki NKT z boku probówki do cytometrycznego 10 mililitrami pożywki RPMI 1640. Następnie odwiruj komórki, resuspenduj osad w jednym mililitrze RPMI 1640 i pobierz 40 mikrolitrów zawiesiny komórkowej w celu oceny czystości posortowanych komórek, stosując tę samą strategię bramkowania.

W celu ustawienia parametrów sortowania dla namnożenia komórek iNKT, odwiruj komórki, a następnie resuspender wyizolowane komórki w stężeniu 5 × 10⁵ komórek/ml w pełnym medium RPMI 1640 uzupełnionym o IL-2, IL-12 oraz przeciwciało anty-CD28. Następnie wysiej komórki w liczbie 1 × 10⁵ komórek iNKT na studzienkę w 96-dołkowej płytce z płaskim dnem pokrytej przeciwciałem anty-CD3ε i inkubuj je w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po dwóch dniach przenieś komórki na nową, niepowlekaną płytkę 96-dołkową z płaskim dnem do hodowli w warunkach spoczynku w pełnym medium RPMI 1640.

Pożywka do kolejnej dwudniowej inkubacji. W czwartym dniu po sortowaniu delikatnie pipetuj nadsącz w każdej studni, aby oderwać komórki, a następnie przenieś je do 15 mililitrowej probówki stożkowej. Po wirowaniu ponownie zawieś osad w stężeniu 5 × 10⁵ komórek na mililitr.

W pełnym medium RPMI 1640 uzupełnionym o IL-7 wysiać 1 × 10⁵ komórek na studzienkę. W nowej płytce 96-dołkowej o płaskim dnie zwrócić komórki do inkubatora; po czterech dniach przenieść je do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml w celu odwirowania. Osad zawiesić ponownie w pełnym medium RPMI 1640 zawierającym rozpuszczalne przeciwciała anty-CD28 i wysiać komórki na płytkę 96-dołkową o płaskim dnie, powleczoną anty-CD3ε, w zagęszczeniu 1 × 10⁵ komórek na studzieniec, a następnie zwrócić komórki do inkubatora na kolejne trzy dni, dni 11–18.

Powtórz traktowanie przeciwciałami anty-CD28 i anty-CD3ε, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, w dniu 19. Przenieś komórki do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Odwiruj je i resuspenduj osad do stężenia 5×10⁵ komórek/ml w pełnej pożywce RPMI 1640.

Następnie wysiej komórki w zagęszczeniu 1 × 10⁵ komórek na studzienkę w 96-dołkowej płytce z płaskim dnem i pozostaw komórki na dwa dni w inkubatorze do hodowli komórkowych. Stymulacja wyselekcjonowanych komórek iNKT za pomocą unieruchomionego na płytce przeciwciała anty-CD3ε w obecności IL-2, IL-12 i rozpuszczalnego przeciwciała anty-CD28 prowadzi do około trzykrotnego zwiększenia liczby komórek iNKT po dwóch dniach hodowli. Następująca ekspansja komórek iNKT w obecności IL-7 skutkuje trzymu- lub czterokrotnym wzrostem liczby obecnych komórek iNKT w czwartym dniu hodowli.

Warto zaznaczyć, że powtarzanie tych warunków hodowli może pozwolić na uzyskanie średnio 7 × 10⁷ komórek iNKT po dwóch rundach ekspansji, bez widocznej utraty komórek pomiędzy zmianami pożywek w różne dni, co skutkuje co najmniej 70-krotną ekspansją w ciągu 18 dni. Dalszej ekspansji poddane komórki iNKT aktywowane związanym z płytką rekombinowanym CD1d mysiego, obciążonym α-galaktocylo ceramidem, produkują IL-2, IL-4, IFN-γ, TNF-α oraz IL-6 w 48 godzinach po stymulacji, co wykazuje, że komórki iNKT zachowują zdolność do produkcji cytokin Th1 i Th2 po ekspansji.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że prawidłowe barwienie komórek iNKT za pomocą cdre obciążonego alfa-ceramidem jest niezbędne do ich zidentyfikowania podczas cytometrii przepływowej.