Zoptymalizowana metoda izolowania i namnażania niezmiennych limfocytów T NK ze śledziony myszy

Ogólnym celem tej procedury jest ekspansja wariantu komórek T lub INKT NK pobranych ze śledziony myszy. Osiąga się to najpierw poprzez wyizolowanie jednojądrzastych komórek śledziony, a następnie wzbogacenie populacji limfocytów CD 5 dodatnich przez magnetyczną separację komórek. Frakcja komórek INKT śledziony jest następnie dalej izolowana przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją.

W ostatnim etapie posortowane komórki INKT są sadzane w celu ekspansji in vitro. Ostatecznie profil cytokin rozszerzonych komórek INKT może być oceniany przez Elizę. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ oczyszczanie i ekspansja komórek INKT wymaga połączenia różnych technik.

Ta procedura będzie owiana studentem z mojego laboratorium. Po pobraniu śledziony przenieś tkankę do nylonowego filtra o grubości 70 mikronów, a następnie użyj dwumililitrowego tłoka strzykawki, aby delikatnie rozgnieść śledzionę przez sitko do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów i umyj filtr pięcioma mililitrami PBS. Następnie dodaj trzy mililitry opakowania węgla do 15-mililitrowej probówki i nałóż gradient gęstości na pięć mililitrów zawiesiny komórkowej.

Oddziel komórki przez odwirowanie i przenieś interfejs do nowej 15-mililitrowej probówki. Następnie umyj komórki w 10 mililitrach zimnego PBS i ponownie zawieś osad w dwóch mililitrach buforu faksu, aby wzbogacić dla CD pięć dodatnich limfocytów śledziony. Dostosuj rozcieńczenie komórek do jednego razy 10 do siódmych komórek na 90 mikrolitrów z większą ilością bufora faksu i dodaj 10 mikrolitrów anty CD pięć mikrogranulek do komórek.

Po 15 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza umyj komórki czterema mililitrami buforu faksowego i ponownie zawieś osad w 500 mikrolitrach świeżego buforu faksu. Wyizolować CD pięć dodatnich komórek przez magnetyczną separację komórek zgodnie z zaleceniem producenta. Następnie rozcieńczyć wzbogacone CD pięć dodatnich limfocytów jednorazowo 10 do sześciu komórek na 20 mikrolitrów buforu inax zawierającego anty CD 16, CD 32 i PE sprzężone z powietrzem alfa galony tetramer CD 1D w temperaturze pokojowej w ciemności po 30 minutach, inkubować komórki z interesującymi przeciwciałami w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności przez kolejne 30 minut.

Następnie umyj komórki w świeżym buforze faksu i zabarwij je 10 mikrolitrami 20 mikromolowego roztworu roboczego DPI na jeden raz 10 do sześciu komórek przez pięć minut. W temperaturze pokojowej teraz uzyskuje się około 10 razy do czwartego wzbogaconego CD pięć dodatnich zdarzeń limfocytów na cytometrze przepływowym, elektronicznie bramkując na rozproszenie do przodu z niskimi komórkami, aby wykluczyć elektronicznie dublety i agregacje komórek. Wyłącz dodatnie komórki DAPI CD z ośmioma dodatnimi komórkami CD 19 dodatnimi w przednim rozproszeniu o niskiej populacji i użyj wykresów bocznego rozproszenia i obszaru rozproszenia do przodu.

Aby elektronicznie wybrać limfocyty, wykreśl tetramery alfa gal SER CD 1D za pomocą CD trzy epsilon i elektronicznie ga alfa gal ser CD 1D tetramer dodatni CD trzy epsilon dodatnie komórki INKT zgodnie ze wskazaniami. Następnie uzyskując nie więcej niż dwa razy 10 do piątego CD, pięć dodatnich wzbogaconych limfocytów, określa procent alfa gal, SER CD 1D, tetramerowo-dodatnich CD, trzech epsilonowo-dodatnich komórek INKT obecnych we wzbogaconej frakcji komórkowej. Korzystając z tego niskiego sortowania bramki, alfa alser CD 1D tetramer dodatni CD trzy epsilonowo-dodatnie komórki INKT do rurki faksowej zawierającej jeden mililitr płodowej surowicy cielęcej na końcu sortowania.

Wyizolowane ogniwa NKT z boku rurki faksu przepłukać 10 mililitrami pożywki RPMI 1640. Następnie odwiruj ogniwa, ponownie zawieś osad w jednym mililitrze RPMI 1640 i użyj 40 mikrolitrowej porcji komórek do oceny czystości posortowanych komórek. Korzystanie z tej samej strategii bramkowania.

Jeśli chodzi o ustawienie parametrów sortowania w celu rozszerzenia komórek INCT, odkręć komórki i ponownie zawieś izolowane komórki w ilości pięć razy 10 do piątej komórki na mililitr w kompletnym pożywce RPMI 1640 uzupełnionej IL dwoma IL 12 i anty CD 28. Następnie wysiewaj komórki raz po 10 do 5 komórek INKT na studzienkę na 96-dołkowej płaskiej płytce pokrytej anty CD trzema epsilonami i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po dwóch dniach przenieść komórki na świeżą, niepowlekaną płytkę 96-dołkową z płaskim dnem w celu hodowli w warunkach spoczynku w pełnym RPMI 1640.

Pożywka do kolejnej dwudniowej inkubacji. Czwartego dnia po sortowaniu delikatnie odpipetować supernatant w każdym dołku, aby usunąć komórki i zebrać je w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Po odwirowaniu ponownie zawiesić podniebienie pięć razy od 10 do piątej komórki na mililitr.

W kompletnym pożywce RPMI 16 uzupełnionej IL siedem i wysiew jeden razy 10 do piątej komórki na studzienkę. Na nowej płaskodennej 96-dołkowej płytce po czterech dniach włóż komórki do inkubatora, wciągnij je do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów w celu odwirowania. Ponownie zawiesić osad w kompletnym podłożu RPMI 1640 zawierającym rozpuszczalny anty CD 28 i zasiać komórki na 96-dołkowej płaskiej płytce dolnej pokrytej anty CD three epsilon jednorazowo 10 piątych komórek na studzienkę i zwrócić komórki do inkubatora na kolejne trzy dni, cztery dni, od 11 do 18.

Powtórzyć leczenie IL seven anty CD 28 i anty CD 3 epsilon, jak właśnie wykazano w dniu 19. Przenieś komórki do nowej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Zakręć je w dół i ponownie zawieś granulkę w ilości pięć razy od 10 do piątej komórki na mililitr w pełnym RPMI 1640.Medium.

Następnie wysiewaj komórki po 10 do 5 komórek na studzience na płaskiej płytce 96-dołkowej z płaskim dnem i pozwól komórkom odpoczywać przez dwa dni w inkubatorze do hodowli komórkowych. Stymulacja posortowanych komórek INKT za pomocą związanego płytką anty CD three epsilonu w obecności IL dwóch IL 12 i rozpuszczalnego anty CD 28 powoduje około trzykrotne zwiększenie liczby INKT po dwóch dniach hodowli. Późniejsza ekspansja komórek INKT w obecności IL seven powoduje trzy- lub czterokrotny wzrost liczby komórek INKT obecnych w czwartym dniu hodowli.

Warto zauważyć, że powtarzanie tych warunków hodowli może dać średnio siedem razy 10 do siódmych komórek INKT po dwóch rundach ekspansji bez widocznej utraty komórek między zmianami w pożywkach hodowlanych w różnych dniach, co skutkuje co najmniej 70-krotną ekspansją w ciągu 18 dni. Dalej rozszerzone komórki INKT aktywowane rekombinowaną mysią rośliną związaną z płytką. CD 1D załadowany alfa alserem wytwarza IL dwa, IL, cztery IFN gamma, TNF alfa i IL sześć po 48 godzinach od stymulacji, co pokazuje, że komórki INKT zachowują zdolność do wytwarzania cytokin TH jeden i TH dwóch po ekspansji.

Próbując tej procedury, należy pamiętać, że prawidłowe barwienie komórek INKT cdre obciążonym alfa ceramidami jest niezbędne do identyfikacji komórek INKT podczas cytometrii przepływowej. Pewny.