Name: Zoptymalizowana metoda izolowania i namnażania niezmiennych limfocytów T NK ze śledziony myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę izolacji i namnażania niezmiennych limfocytów T NK ze śledziony myszy. Protokół wykorzystuje separację komórek magnetycznych i sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

D.E. i M.B.D. są członkami multidyscyplinarnej platformy badawczej (MRP) Uniwersytetu w Gandawie oraz konsorcjum Badaczy z Gandawy ds. Rozwiniętych Białek w Chorobach Zapalnych (GROUP-ID).

W tym badaniu wykorzystano dorosłe (6-8 tygodni) samice myszy C57Bl/6. Myszy były trzymane i hodowane zgodnie z wytycznymi wiwarium Uniwersytetu w Gandawie. Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki.
1. Przygotowanie komórek jednojądrzastych (MNC) ze śledziony myszy
<ol>
	<li>Poświęć mysz przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Umieść mysz z powrotem na desce sekcyjnej i przymocuj tylne i przednie nogi za pomocą szpilek.</li>
	<li>Wysterylizować powierzchnię skóry 70% (obj./obj.) etanolem/H2O.</li>
	<li>Przeciąć skórę wzdłuż linii środkowej brzucha do klatki piersiowej i odsłonić śledzionę za pomocą sterylnych narzędzi chirurgicznych.</li>
	<li>Po przycięciu otaczających tkanek tłuszczowych umieścić śledzionę w 24-dołkowej płytce zawierającej 1 ml 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyciąć śledzionę za pomocą sterylnego skalpela i przenieść kawałki do nylonowego filtra o wielkości 70 μm umieszczonego w probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 2 ml delikatnie rozgnieć kawałki śledziony przez sitko do komórek i przemyć 5 ml 1x PBS.</li>
	<li>Dodać 3 ml Ficoll-Paque do probówki o pojemności 15 ml i nałożyć pożywkę o gradiencie gęstości na 5 ml zawiesiny komórkowej.</li>
	<li>Wirować przy 400 x g przez 20 minut przy RT bez hamulca.</li>
	<li>Przenieść interfazę do świeżej probówki o pojemności 15 ml, dodać 10 ml zimnego 1x PBS i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 2 ml 1x PBS zawierającym 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (bufor FACS). Przenieść 10 μl zawiesiny komórek do małej probówki, wymieszać z 10 μl 0,4%</li>
</ol>
2. Wzbogacanie, wykrywanie i oczyszczanie mysich komórek iNKT
<ol>
	<li>Wzbogacenie mysich limfocytów CD5dodatnich (CD5+) śledziony.
	<ol>
		<li>(Opcjonalnie) Zabarwić 105 komórek anty-CD5 sprzężonym z FITC (4 μl rozcieńczenia 1:30 / 106 komórek) przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności, przemyć 200 μl buforu FACS i ponownie zawiesić w 500 μl buforu FACS. Przygotować 20 μM roztwór roboczy 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) w 1x PBS, dodać 1 μl do 105 komórek w buforze FACS i inkubować w temperaturze RT przez 5 minut. Zdobądź 104 wstępnie wzbogaconych komórek na cytometrze przepływowym.
		<ol>
			<li>Korzystając z FCS-H i FCS-W, elektronicznie bramkuj ogniwalo FSC-W, aby wykluczyć dublety i agregacje komórek (rysunek 1A). Następnie elektronicznie wyłącz DAPI+ (martwe) komórki w populacjilo FSC-W (Figura 1B) i użyj SSC-A i FCS-A do elektronicznego wyboru populacji limfocytów według wielkości (Figura 1C).</li>
			<li>Wykorzystując komórki w bramce limfocytów, wykreśl SSC-A w porównaniu z CD5 i elektronicznie bramkuj limfocyty CD5 +, jak pokazano na rysunku 1D. Pozostałą część wstępnie wzbogaconej próbki pobrać na cytometr przepływowy.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dostosuj liczbę komórek do 107 komórek na 90 μl w buforze FACS i dodaj 10 μl mikrogranulek anty-CD5.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 4 °C przez 15 minut, przemyć raz 4 ml buforu FACS i ponownie zawiesić w 500 μl zimnego buforu FACS. Wzbogacić na limfocyty CD5+ za pomocą kolumn do magnetycznej separacji komórek (MACS) zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
		<li>Opcjonalnie) Zabarwić 105 komórek anty-CD5 sprzężonym z FITC (4 μl rozcieńczenia 1:30 / 106 komórek) i DAPI jak w 2.1.1. Pobrać 104 wzbogacone limfocyty na cytometrze przepływowym i sprawdzić, czy bramki elektroniczne utworzone w 2.1.1. wybierz limfocyty CD5 + we wzbogaconej frakcji komórkowej. Zdobądź 105 komórek na cytometrze przepływowym i przeanalizuj procent limfocytów CD5 + obecnych we wzbogaconej frakcji, jak pokazano na rysunku 1E-H.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie i izolacja mysich komórek iNKT za pomocą FACS.
	<ol>
		<li>Zawiesić wzbogacone limfocyty CD5 + w stężeniu około 106 komórek na 20 μl w buforze FACS zawierającym anty-CD16 / CD32 (4 μl rozcieńczenia 1:50 / 106 komórek) i tetramer αGalCer / CD1d sprzężony z PE (1 μg / 106 komórek).</li>
		<li>Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Rozcieńczyć mysie przeciwciała (mAb) anty-CD3ε V500 (4 μl o rozcieńczeniu 1:20 / 106 komórek), anty-CD19 e450 (4 μl o rozcieńczeniu 1:50 / 106 komórek) i anty-CD8α e450 (4 μl rozcieńczenia 1:50 / 106 komórek) w buforze FACS, dodać do limfocytów CD5 + i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
		<li>Przemyć komórki 1 ml buforu FACS przez odwirowanie przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w 4 ml buforu FACS do końcowego stężenia10-7 komórek/ml.</li>
		<li>Przefiltruj komórki przez sitko o wielkości 30 μm i umieść komórki na lodzie.</li>
		<li>Skalibrować cytometr przepływowy do sortowania komórek zgodnie z zaleceniami producenta 14,15. 
		Uwaga: Kalibracja cytometru przepływowego do sortowania komórek wymaga przeszkolenia i może być wykonana przez doświadczonego operatora lub przeszkolonego technika.</li>
		<li>Dodać 10 μl 20 μM roztworu roboczego DAPI na 10-6 komórek i inkubować w temperaturze RT przez 5 minut. Uzyskać około 104 wzbogaconych limfocytów CD5 + na cytometrze przepływowym. Elektroniczna bramka na ogniwachlo FSC-W w celu wykluczenia dubletów i agregacji komórek (rysunek 2A). Następnie elektronicznie wyklucz komórki DAPI+ CD8+CD19+ (kanał zrzutu) w populacjilo FSC-W (Figura 2B) i użyj SSC-A i FCS-A do elektronicznej selekcji limfocytów (Figura 2C), jak opisano w 2.1.1.1.
		<ol>
			<li>Wykreślić tetramer αGalCer/CD1d za pomocą CD3ε i elektronicznie bramkować komórki αGalCer/CD1d tetramer + CD3ε+ iNKT, jak pokazano na rysunku 2D. Pozyskaj nie więcej niż 2 x 105 limfocytów wzbogaconych w CD5 +, aby określić procent komórek αGalCer / CD1d tetramer + CD3ε + iNKT obecnych we wzbogaconej frakcji komórkowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Korzystając z bramek elektronicznych utworzonych w 2.2.7., FACS sortuje komórki αGalCer/CD1d tetramer+CD3ε+ iNKT na cytometrze przepływowym przy ciśnieniu 70 psi za pomocą dyszy 70 μm przy natężeniu przepływu "1,5". Zebrać posortowane komórki iNKT w probówce FACS zawierającej 1 ml 100% FCS. Następnie przepłukać posortowane komórki iNKT od strony probówki FACS za pomocą 10 ml pożywki RMPI 1640 i odwirować komórki przy sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ponownie zawiesić posortowane komórki iNKT w 1 ml pożywki RPMI 1640 i pobrać z nich 40 μl na cytometrze przepływowym w celu oceny czystości posortowanych komórek iNKT. Wybrać limfocyty FSC-Wlo DAPI- zgodnie z opisem w 2.2.7. (Rysunek 2E-G) i elektronicznie bramkować komórki αGalCer / CD1d tetramer + CD3ε + iNKT, jak pokazano na rysunku 2H.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Hodowla i ekspansja mysich komórek iNKT
Dzień 0
<ol>
	<li>Pokryj płaskodenną 96-dołkową płytkę oczyszczonym anty-CD3ε (3 μg/ml) na studzienkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć dwukrotnie 200 μl 1x PBS i raz 200 μl pełnej pożywki RPMI 1640 (10% obj./obj. FCS, 100 U/ml penicyliny-streptomycyny, 5,5 μM β-merkaptoetanolu).</li>
	<li>Policz liczbę żywotnych posortowanych komórek iNKT (krok 2.2.8) za pomocą 0,4% hemocytometru, jak w 1.11, odwiruj przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawieś przy 5 x 105 komórek/ml w kompletnym pożywce RPMI 1640 zawierającej rekombinowaną mysią IL-2 (10 ng/ml), rekombinowaną mysią IL-12 (1 ng/ml) i rozpuszczalną anty-mysią CD28 (5 μg/ml). Komórki iNKT posortowane płytkowo w 10-5 komórkach/basenie na płytkach pokrytych anty-CD3ε i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 przez 2 dni.</li>
</ol>
Dzień 2 
<ol start="3">
	<li>Przenieść komórki na świeżą, niepowlekaną, płaskodenną 96-dołkową płytkę i hodować komórki w warunkach spoczynku w kompletnym podłożu RPMI 1640 w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 przez 2 dni.</li>
</ol>
Dzień 4 
<ol start="4">
	Usunąć <li>komórki z płytki za pomocą delikatnego pipetowania i przenieść komórki do świeżej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, ponownie zawiesić w temperaturze 5 x 105 komórek/ml w kompletnej pożywce RPMI 1640 zawierającej rekombinowaną mysią IL-7 (5 ng/ml) i płytkę 105 komórek/basenik w płaskodennej 96-dołkowej płytce przez 4 dni w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .</li>
</ol>
Dzień 8
<ol start="5">
	<li>Zebrać komórki do świeżej probówki, odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić przy 5 x 105 komórek/ml w kompletnej pożywce RPMI 1640 zawierającej rozpuszczalny anty-CD28 (5 μg/ml).</li>
	<li>Pokryć płaskodenną płytkę 96-dołkową oczyszczonym anty-CD3ε (3 μg/ml) na studzienkę i umyć jak w 3.1. Płytkę 105 komórek/basenik na płytkach pokrytych anty-CD3ε i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 do dnia 11.</li>
</ol>
Dzień 11 – 18
<ol start="7">
	<li>Powtórz kroki od 3.4 do 3.6.</li>
</ol>
Dzień 19-20
<ol start="8">
	<li>Przenieść komórki do świeżej probówki o pojemności 15 ml, odwirować przy 300 x g i ponownie zawiesić przy 5 x 105 komórek/ml w pełnej pożywce RPMI 1640.</li>
	<li>Umieścić komórki w 10-5 komórkach/baseniku na płaskodennej płytce 96-dołkowej i pozostawić komórki na 2 dni w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 przed użyciem w doświadczeniu.</li>
</ol>
4. Produkcja cytokin przez mysie komórki iNKT przy użyciu testu CD1d na płytce
<ol>
	<li>Pokryć płaskodenną 96-dołkową płytkę 100 μl rekombinowanego mysiego CD1d (10 μg/ml w 1x PBS) na basenik i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przemyć czterokrotnie 200 μl 1x PBS, dodać 200 μl 2% FCS do 1x PBS (roztwór blokujący) na studzienkę i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Usunąć roztwór blokujący, dodać 200 μl αGalCer (5 ng/μl) do dołka i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 16 godzin. [W celu przygotowania roztworu αGalCer dodać 1,085 μ 1x PBS do 55 μg αGalCer rozpuszczonego w nośniku zawierającym 96 mg/ml sacharozy, 10 mg/ml deoksycholanu sodu i 5 mg/ml tween 20].</li>
	<li>Po inkubacji odrzucić roztwór αGalCer i dwukrotnie przemyć studzienkę 200 μl 1x PBS, a następnie 200 μl pełnej pożywki RPMI 1640.</li>
	<li>Zebrać ekspandowane komórki iNKT in vitro w 21 dniu, odwirować komórki przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w pełnej pożywce RPMI 1640 o stężeniu 0,5 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Dodać 200 μl zawiesiny komórek iNKT do dołka i inkubować przez 72 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .</li>
	<li>Zebrać supernatant i zmierzyć interesujące go cytokiny za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA) zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>

<ol><li>Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+CD1-specific+NK1+T+cells%3A+development%2C+specificity%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function.</a> Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).</li>
<li>Kronenberg, M., Gapin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unconventional+lifestyle+of+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immuno%22%5BJournal%5D)">The unconventional lifestyle of NKT cells.</a> Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).</li>
<li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+CD1d-restricted+repertoire+is+dominated+by+a+few+autoreactive+T+cell+receptor+families%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families.</a> J Exp Med. 193, 893-904 (2001).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+glycosphingolipid+recognition+by+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells.</a> Science. 306, 1786-1789 (2004).</li>
<li>Cardell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1-restricted+CD4%2B+T+cells+in+major+histocompatibility+complex+class+II-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice.</a> J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).</li>
<li>Kawano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1d-restricted+and+TCR-mediated+activation+of+valpha14+NKT+cells+by+glycosylceramides%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides.</a> Science. 278, 1626-1629 (1997).</li>
<li>Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells+in+rheumatic+disease%3A+a+joint+dilemma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma.</a> Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).</li>
<li>Terabe, M., Berzofsky, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKT+cells+in+immunoregulation+of+tumor+immunity%3A+a+new+immunoregulatory+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis.</a> Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).</li>
<li>Molling, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+sustained+expansion+of+mouse+spleen+invariant+NKT+cell+lines+with+preserved+cytokine+releasing+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity.</a> J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).</li>
<li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reliable+generation+of+invariant+natural+killer+T-cell+lines+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro.</a> Immunology. 128, 324-333 (2009).</li>
<li>Gumperz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+CD1d-restricted+T+cell+recognition+of+cellular+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids.</a> Immunity. 12, 211-221 (2000).</li>
<li>Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+TCRs+recognize+murine+CD1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Diverse TCRs recognize murine CD1.</a> J Immunol. 162, 161-167 (1999).</li>
<li>Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+detection%2C+isolation+and+culture+of+mouse+and+human+invariant+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells.</a> Nature protocols. 3, 70-78 (2008).</li>
<li>Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).</li>
<li>Osborne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+quantifying+cell+sorting+yield+in+%27real+time%27%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A+%3A+the+journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">A method of quantifying cell sorting yield in 'real time'.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).</li>
<li>Drennan, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thymic+microenvironment+differentially+regulates+development+and+trafficking+of+invariant+NKT+cell+sublineages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages.</a> J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.

Kluczowe etapy obecnego protokołu obejmują izolację, a następnie wzbogacenie limfocytów CD5+ (sekcja 1 i 2), sortowanie FACS (sekcja 3) i wstępne posiewanie komórek iNKT (sekcja 4). Spośród kroków wykonanych w sekcji 1 należy pamiętać o ostrożnym nałożeniu zawiesiny komórkowej śledziony na podłoże o gradiencie gęstości, tak aby po odwirowaniu powstała wyraźna interfaza komórkowa. Późniejsze wzbogacenie limfocytów CD5 + przez magnetyczną separację komórek (sekcja 2) minimalizuje odczynniki i czas pot...

Mysie niezmienne komórki T naturalnego killera (iNKT) są odrębną populacją wrodzonych limfocytów T wybranych w grasicy przez tymocyty korowe z ekspresją CD1d 1,2. Komórki iNKT wyrażają receptor limfocytów T (TCR) składający się z niezmiennego łańcucha TCR Vα14-Jα18 sparowanego z TCR Vβ8, Vβ7 lub Vβ2 3, który jest zdolny do rozpoznawania endogennych i obcych antygenów lipidowych w kontekście CD1d. Na przykład mysie komórki iNKT rozpoznają i są aktywowane przez endogenny antygen lipidowy zwany izoglobotriheksozyloceramidem (iGb3) 4, a także α-galaktozyloceramid (αGalCer) 5,6, glikolipid wyizolowany z gąbek morskich. Zależna od TCR aktywacja komórek iNKT sprzyja pobudzaniu adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych, w wyniku czego wykazano, że komórki iNKT są funkcjonalnie zaangażowane w poprawę lub rozwój szeregu patologii, w tym choroby reumatycznej 7 i raka 8. Obecnie syntetyczne ligandy komórek iNKT stanowią obiecujące nowe adiuwanty szczepionkowe, które mogą być zdolne do regulowania wielu schorzeń immunopatologicznych.
Wcześniej wykazano, że komórki iNKT mogą być generowane in vitro po izolacji z tkanki myszy; wiele z tych badań wykorzystuje pierwotne komórki prezentujące antygen (APC) i/lub linie komórkowe 9, myszy transgeniczne Vα14 TCR (Tg) 10, lub grasiczaki do generowania hybrydomów pochodzących z komórek iNKT 11,12. Co więcej, duża liczba myszy, duże ilości odczynników, takich jak dimery CD1d załadowane αGalCer, oraz długi czas hodowli sprawiają, że niektóre opublikowane protokoły są mniej atrakcyjne etycznie i ekonomicznie 9,13.
W tym raporcie opisujemy dostosowaną metodę izolacji i ekspansji in vitro komórek iNKT z śledziony myszy. Dokładniej rzecz ujmując, protokół opisuje metodę wzbogacania komórek iNKT ze śledziony myszy, która zmniejsza liczbę myszy, odczynników i czasu potrzebnego do sortowania komórek FACS, a także proponuje zoptymalizowane podejście do namnażania posortowanych komórek iNKT śledziony in vitro.

<table><tbody><tr><td>Materiał</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>rekombinowana mysia IL-2</td><td>eBiosciences</td><td>14-8021</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowana mysia IL-12</td><td>eBiosciences</td><td>39-8122-65</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowana mysia IL-7</td><td>eBiosciences</td><td>14-8071</td><td></td></tr><tr><td>oczyszczona anty-mysia CD3e (145-2C11)</td><td>eBiosciences</td><td>16-0032-86</td><td></td></tr><tr><td>oczyszczona anty-mysie CD28 (37.51)</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td></td></tr><tr><td>e450-sprzężony anty-mysz CD19 (eBio1D3)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>e450-sprzężony anty-mysz CD8&alfa; (53-6,7)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysie CD5 (53-7.3) Sprzężone</td> z <td>FITC</td><td>11-0051-81</td><td></td></tr><tr><td>V500 Anty-mysie CD3 i epsilon ze sprzężeniem FITC; (500A2)</td><td>BD biosciences</td><td>560771</td><td></td></tr><tr><td>mikrokulki anty-mysie CD5 (Ly-1)</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-049-301</td><td></td></tr><tr><td>oczyszczony anty-mysz CD16/32 (2.4G2)</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>MACS MS Kolumny Macs</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy, 0,4% (wt/vol)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Gibco</td><td>12633-020</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-056</td><td>[Ca2+/Mg2+ - wolne]</td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-123</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td> <td>surowicy bydlęcejSigma-Aldrich</td><td>A7906-100MG</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque plus</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00 AF</td><td></td></tr><tr><td>Equipment Płytka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa F-bottom</td><td>Greiner-bio one</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Greiner-bio one</td><td>665-180</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Greiner-bio one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>15 ml falcon tubka</td><td>Greiner-bio one</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubka sokoła</td><td>Greiner-bio one</td><td>227-261</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m filtr</td><td>Greiner-bio one</td><td>542-070</td><td></td></tr><tr><td>30 &micro; m filtr</td><td>Separator Millipore</td><td>SVGP01050</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2 z płaszczem wodnym</td><td>Hemocytometr VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do rozwarstwiania</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zoptymalizowana metoda izolowania i namnażania niezmiennych limfocytów t nk ze śledziony myszy

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

Zdolność do szybkiego wydzielania cytokin po stymulacji jest funkcjonalną cechą niezmiennej linii komórkowej T (iNKT). Komórki iNKT są zatem charakteryzowane jako wrodzona populacja limfocytów T zdolna do aktywacji i kierowania adaptacyjnymi odpowiedziami immunologicznymi. Opracowanie ulepszonych technik hodowli i namnażania mysich komórek iNKT ułatwia badanie biologii komórek iNKT w systemach modelowych in vitro i in vivo. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę izolacji i ekspansji mysich komórek iNKT śledziony.
Śledziony myszy C57Bl/6 są usuwane, preparowane i naprężane, a powstała zawiesina komórkowa jest nakładana na podłoże o gradiencie gęstości. Po odwirowaniu pobiera się jednojądrzaste komórki śledziony (MNC), a limfocyty CD5-dodatnie (CD5+) są wzbogacane do użycia kulek magnetycznych. Komórki iNKT we frakcji CD5+ są następnie barwione tetramerem CD1d załadowanym αGalCer i oczyszczane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). Komórki iNKT posortowane w FACS są następnie początkowo hodowane in vitro przy użyciu kombinacji rekombinowanych cytokin mysich i bodźców receptora komórek T związanych z płytką (TCR), a następnie są namnażane w obecności rekombinowanej myszy IL-7. Stosując tę technikę, w ciągu 18-20 dni hodowli można wygenerować około10-8 komórek iNKT, po czym można je wykorzystać do testów funkcjonalnych in vitro lub do eksperymentów transferowych in vivo u myszy.

Izolacja mononuklearnych komórek śledziony przy użyciu gradientu gęstości trwa około 1 h i eliminuje konieczność stosowania odczynników wymaganych do lizy erytrocytów (RBCs). Metoda ta pozwala na uzyskanie wysokiej wydajności żywych komórek oraz usuwa zanieczyszczenia powstające podczas przeciskania narządu przez sitko. Typowo częstotliwość występowania komórek iNKT w puli limfocytów śledzionowych mieści się w granicach od 1 do 5% całkowitej liczby limfocytów T, jednak wartość ta może się różnić w zależności od wieku, pł...

Tutaj prezentujemy dostosowany protokół, który może być użyty do wygenerowania dużej liczby mysich niezmiennych limfocytów T NK z mysiej śledziony. W protokole przedstawiono podejście, dzięki któremu komórki iNKT śledziony mogą być wzbogacane, izolowane i namnażane in vitro przy użyciu ograniczonej liczby zwierząt i odczynników.

Zoptymalizowana metoda izolowania i namnażania niezmiennych limfocytów T NK ze śledziony myszy

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest namnażanie niezmiennikowych naturalnych komórek T lub komórek iNKT wyizolowanych ze śledziony myszy. Osiąga się to poprzez wstępną izolację mononuklearnych komórek śledziony, a następnie wzbogacenie populacji limfocytów CD5+ za pomocą magnetycznej separacji komórek. Następnie frakcja komórek iNKT ze śledziony jest dodatkowo izolowana za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją.W ostatnim kroku posortowane komórki iNKT zostają poddane ekspansji in vitro. Ostatecznie profil cytokinowy wyhodowanych komórek iNKT można ocenić za pomocą testu ELISA. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ oczyszczanie i ekspansja komórek iNKT wymagają zastosowania kombinacji różnych technik.Procedurę tę przeprowadzi student studiów doktoranckich z mojego laboratorium. Po pobraniu śledziony przenieść tkankę na filtr nylonowy o rozmiarze oczek 70 µm, następnie za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 2 ml delikatnie rozetrzeć śledzionę przez sito do probówki stożkowej o pojemności 50 ml i przemyć filtr 5 ml PBS. Następnie dodać 3 ml roztworu gęstościowego do probówki 15 ml i nanieść na gradient gęstości 5 ml zawiesiny komórkowej.Oddziel komórki poprzez wirowanie i przenieś granicę faz w nowej probówce o objętości 15 ml. Następnie przemyj komórki w 10 ml zimnego PBS i resuspenduj osad w dwóch ml buforu fax, aby wzbogacić próbkę o limfocyty śledzionowe CD5+. Dostosuj rozcieńczenie komórek do stężenia 1×10⁷ komórek na 90 µl, dodając więcej buforu fax, a następnie dodaj do komórek 10 µl mikrokulek anty-CD5.Po 15 minutach w temperaturze 4°C przemyj komórki 4 ml buforu FACS i resuspenduj osad w 500 µl świeżego buforu FACS. Wyizoluj komórki CD5+ za pomocą magnetycznej separacji komórek zgodnie z zaleceniami producenta. Następnie rozcieńcz wzbogacone limfocyty CD5+ w stężeniu 1×10⁶ komórek na 20 µl buforu FACS zawierającego przeciwciała anty-CD16, CD32 oraz sprzężony z PE tetramer α-Gal-α-CD1D w temperaturze pokojowej w ciemności. Po 30 minutach inkubuj komórki z interesującymi przeciwciałami w temperaturze 4°C w ciemności przez kolejne 30 minut.Następnie przemyj komórki w świeżym buforze FACS i barw w nich 10 µL 20 µM roztworu roboczego DPI na 1×10⁶ komórek przez pięć minut. W temperaturze pokojowej nabierz teraz około 1×10⁴ wzbogaconych zdarzeń limfocytów CD5-dodatnich na cytometrze przepływowym, stosując elektroniczne bramkowanie na podstawie niskiego rozproszenia przedniego (forward scatter low), aby wykluczyć dublety i agregaty komórkowe. Wyklucz komórki DAPI-dodatnie, CD8-dodatnie oraz CD19-dodatnie w obrębie populacji o niskim rozproszeniu przednim, korzystając z wykresów obszarowych rozproszenia bocznego i przedniego.Aby elektronicznie wyselekcjonować limfocyty, należy wykreślić tetramery alpha gal SER CD 1D względem CD3ε i elektronicznie bramkować komórki iNKT dodatnie dla tetrameru alpha gal SER CD 1D i dodatnie dla CD3ε, zgodnie z oznaczeniem. Następnie, nabywając nie więcej niż 2×10⁵ limfocytów wzbogaconych o CD5, należy wyznaczyć procent komórek iNKT dodatnich dla tetrameru alpha gal SER CD 1D i dodatnich dla CD3ε obecnych we wzbogaconej frakcji komórkowej. Korzystając z tej bramki, należy posortować komórki iNKT dodatnie dla tetrameru alpha gal SER CD 1D i dodatnie dla CD3ε do probówki FACS zawierającej 1 mL płodowej surowicy bydlęcej pod koniec sortowania.Przepłucz wyizolowane komórki NKT z boku probówki do cytometrycznego 10 mililitrami pożywki RPMI 1640. Następnie odwiruj komórki, resuspenduj osad w jednym mililitrze RPMI 1640 i pobierz 40 mikrolitrów zawiesiny komórkowej w celu oceny czystości posortowanych komórek, stosując tę samą strategię bramkowania.W celu ustawienia parametrów sortowania dla namnożenia komórek iNKT, odwiruj komórki, a następnie resuspender wyizolowane komórki w stężeniu 5 × 10⁵ komórek/ml w pełnym medium RPMI 1640 uzupełnionym o IL-2, IL-12 oraz przeciwciało anty-CD28. Następnie wysiej komórki w liczbie 1 × 10⁵ komórek iNKT na studzienkę w 96-dołkowej płytce z płaskim dnem pokrytej przeciwciałem anty-CD3ε i inkubuj je w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po dwóch dniach przenieś komórki na nową, niepowlekaną płytkę 96-dołkową z płaskim dnem do hodowli w warunkach spoczynku w pełnym medium RPMI 1640.Pożywka do kolejnej dwudniowej inkubacji. W czwartym dniu po sortowaniu delikatnie pipetuj nadsącz w każdej studni, aby oderwać komórki, a następnie przenieś je do 15 mililitrowej probówki stożkowej. Po wirowaniu ponownie zawieś osad w stężeniu 5 × 10⁵ komórek na mililitr.W pełnym medium RPMI 1640 uzupełnionym o IL-7 wysiać 1 × 10⁵ komórek na studzienkę. W nowej płytce 96-dołkowej o płaskim dnie zwrócić komórki do inkubatora; po czterech dniach przenieść je do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml w celu odwirowania. Osad zawiesić ponownie w pełnym medium RPMI 1640 zawierającym rozpuszczalne przeciwciała anty-CD28 i wysiać komórki na płytkę 96-dołkową o płaskim dnie, powleczoną anty-CD3ε, w zagęszczeniu 1 × 10⁵ komórek na studzieniec, a następnie zwrócić komórki do inkubatora na kolejne trzy dni, dni 11–18.Powtórz traktowanie przeciwciałami anty-CD28 i anty-CD3ε, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, w dniu 19. Przenieś komórki do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Odwiruj je i resuspenduj osad do stężenia 5×10⁵ komórek/ml w pełnej pożywce RPMI 1640.Następnie wysiej komórki w zagęszczeniu 1 × 10⁵ komórek na studzienkę w 96-dołkowej płytce z płaskim dnem i pozostaw komórki na dwa dni w inkubatorze do hodowli komórkowych. Stymulacja wyselekcjonowanych komórek iNKT za pomocą unieruchomionego na płytce przeciwciała anty-CD3ε w obecności IL-2, IL-12 i rozpuszczalnego przeciwciała anty-CD28 prowadzi do około trzykrotnego zwiększenia liczby komórek iNKT po dwóch dniach hodowli. Następująca ekspansja komórek iNKT w obecności IL-7 skutkuje trzymu- lub czterokrotnym wzrostem liczby obecnych komórek iNKT w czwartym dniu hodowli.Warto zaznaczyć, że powtarzanie tych warunków hodowli może pozwolić na uzyskanie średnio 7 × 10⁷ komórek iNKT po dwóch rundach ekspansji, bez widocznej utraty komórek pomiędzy zmianami pożywek w różne dni, co skutkuje co najmniej 70-krotną ekspansją w ciągu 18 dni. Dalszej ekspansji poddane komórki iNKT aktywowane związanym z płytką rekombinowanym CD1d mysiego, obciążonym α-galaktocylo ceramidem, produkują IL-2, IL-4, IFN-γ, TNF-α oraz IL-6 w 48 godzinach po stymulacji, co wykazuje, że komórki iNKT zachowują zdolność do produkcji cytokin Th1 i Th2 po ekspansji.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że prawidłowe barwienie komórek iNKT za pomocą cdre obciążonego alfa-ceramidem jest niezbędne do ich zidentyfikowania podczas cytometrii przepływowej.

an-optimized-method-for-isolating-expanding-invariant-natural-killer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film opisuje wzbogacanie limfocytów T ze śledziony myszy poprzez selekcję negatywną za pomocą separatora magnetycznego. Technika ta polega na ukierunkowaniu na inne komórki w próbce w celu zubożenia za pomocą przeciwciał lub ligandów skierowanych przeciwko określonym antygenom powierzchniowym komórki.

Wzbogacanie limfocytów T: technika izolowania limfocytów T z mieszanej populacji komórek za pomocą separacji magnetycznej

Ten film pokazuje izolację limfocytów, w tym komórek NK lub komórek NK, z ludzkiej tkanki wątroby w celu selektywnej ekspansji. Trawienie enzymatyczne i mechaniczne, po którym następuje separacja w gradieniu gęstości, sprzyja izolacji limfocytów, w tym komórek NK. Pobrane limfocyty mogą być dalej wykorzystywane do selektywnej ekspansji komórek NK.

Izolacja komórek NK z tkanki wątroby w celu selektywnej ekspansji

Ten film opisuje protokół izolacji limfocytów T CD8+ specyficznych dla rzadkiego antygenu za pomocą magnetycznych komórek prezentujących sztuczny antygen oparty na nanocząstkach (aAPC) funkcjonalizowanych antygenowymi peptydami MHC-Igs i przeciwciałami anty-CD28. Interakcja aAPC z limfocytami T CD8 + specyficznie eksprymującymi receptory limfocytów T ukierunkowanych na peptydy antygenowe, a następnie ich ekspansję in vitro, powoduje wzbogacenie i ekspansję tej populacji limfocytów T CD8 +.

Wzbogacanie i ekspansja limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu

Ten film demonstruje indukcję choroby jelitowej przeszczep przeciwko gospodarzowi, GvHD, u śmiertelnie napromieniowanej myszy biorcy przy użyciu allogenicznych hematopoetycznych komórek macierzystych i indukujących GvHD alloreaktywnych limfocytów T indukujących śledzionę. Protokół ten pomaga w ustaleniu modelu ciężkiej ostrej choroby jelitowej GvHD, aby zrozumieć mechanizm choroby i opracować innowacyjne opcje terapeutyczne.

Indukcja choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi w modelach mysich za pomocą allogenicznego przeszczepu szpiku kostnego i komórek śledziony

Ten film ilustruje metodę izolowania niezmiennych limfocytów T NK, znanych również jako komórki iNKT. Zabieg rozpoczyna się od wstrzyknięcia syntetycznego glikolipidu myszowi w celu stymulacji aktywacji i proliferacji komórek iNKT w śledzionie. Następnie przygotowuje się zawiesiny jednokomórkowe ze śledziony i inkubuje z kompleksami rozpoznającymi komórki iNKT znakowanymi fluoroforami, a następnie rozdziela się za pomocą kulek magnetycznych w celu wyizolowania komórek iNKT.

Izolowanie niezmiennych limfocytów T NK z modelu mysiego

Naiwne limfocyty T CD4+ polaryzują się na różne podzbiory w zależności od środowiska w momencie aktywacji.  Różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4 + do różnych podzbiorów efektorowych można osiągnąć in vitro poprzez dodanie bodźców receptora limfocytów T i specyficznych sygnałów cytokin.

Naiwna izolacja mysich limfocytów T CD4 + i różnicowanie in vitro w podzbiory limfocytów T

Odrębne podzbiory komórek dendrytycznych istnieją jako rzadkie populacje w narządach limfoidalnych, dlatego są trudne do wyizolowania w wystarczającej liczbie i czystości do eksperymentów immunologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę o wysokiej skuteczności i wysokiej wydajności do izolacji wszystkich obecnie znanych głównych podzbiorów komórek dendrytycznych śledziony myszy.

Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

Tutaj prezentujemy protokół, który opisuje allogeniczny przeszczep krwiotwórczych komórek macierzystych i umożliwia powtarzalne mini-endoskopowe oceny dystalnej części jelita grubego in situ pod kątem obecności, cech i ciężkości zapalenia jelita grubego u żywych myszy cierpiących na chorobę przeszczep przeciwko gospodarzowi jelit.

Indukcja choroby przeszczep jelitowy przeciwko gospodarzowi i jej miniendoskopowa ocena u żywych myszy

Opisujemy szybki i solidny protokół wzbogacania niezmiennych komórek T natural killer (iNKT) ze śledziony myszy i rozszerzania ich in vitro do odpowiedniej liczby dla badań in vitro i in vivo.

Oczyszczanie i namnażanie mysich niezmiennych limfocytów T NK do badań in vitro i in vivo

Tutaj prezentujemy metodę rozszerzania naturalnego killera krwi obwodowej (PBNK), komórek NK z tkanek wątroby oraz chimerycznych receptorów antygenowych (CAR)-komórek NK pochodzących z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) lub krwi pępowinowej (CB). Protokół ten demonstruje ekspansję komórek NK i CAR-NK przy użyciu ogniw zasilających 221-mIL-21 oprócz zoptymalizowanej czystości ekspandowanych komórek NK.

Metoda ekspansji komórek NK i CAR-NK przy użyciu linii komórkowej B zmodyfikowanej przez błonę IL-21

Poznaj zoptymalizowaną metodę izolacji i namnażania niezmiennych limfocytów T NK ze śledziony myszy. Protokół wykorzystuje separację komórek magnetycznych i sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją.

Zoptymalizowana metoda izolowania i namnażania niezmiennych limfocytów T NK ze śledziony myszy

Przeglądaj więcej filmów