Name: Montaż i charakterystyka dwuwarstwy z powierzchnią kropelkową w kontrolowanej temperaturze (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Poznaj metodę montażu dwuwarstwy z powierzchnią kropelkową w kontrolowanej temperaturze do badań biomimetycznych błon lipidowych. Protokół umożliwia precyzyjne pomiary właściwości elektrofizjologicznych i optycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie finansowe zostało zapewnione przez National Science Foundation Grant CBET-1752197 oraz Grant Biura Badań Naukowych Sił Powietrznych FA9550-19-1-0213.

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Opisany w niniejszym dokumencie protokół zawiera instrukcje dotyczące montażu i obsługi układu eksperymentalnego służącego do kontrolowania temperatury oleju oraz kropelek wykorzystywanych do tworzenia DIB. Jest on szczególnie przydatny w przypadku formowania DIB przy użyciu lipidów o temperaturach topnienia powyżej temperatury pokojowej (RT). Ponadto, poprzez precyzyjną zmianę temperatury zbiornika z olejem, można manipulować temperaturą dwuwarstwy, aby zbadać wpływ podwyższonych temperatur na różne właściwości i charak...

Błony komórkowe to selektywnie przepuszczalne bariery składające się z tysięcy typów lipidów1, białek, węglowodanów i steroli, które otaczają i dzielą wszystkie żywe komórki. Zrozumienie, w jaki sposób ich skład wpływa na ich funkcje i ujawnienie, w jaki sposób naturalne i syntetyczne cząsteczki oddziałują z błonami komórkowymi, przylegają do nich, zakłócają je i przemieszczają, są zatem ważnymi obszarami badań o szerokich implikacjach w biologii, medycynie, chemii, fizyce i inżynierii materiałowej.
Te cele odkrywcze bezpośrednio korzystają ze sprawdzonych technik montażu, manipulacji i badania błon modelowych - w tym dwuwarstw lipidowych złożonych z syntetycznych lub naturalnie występujących lipidów - które naśladują skład, strukturę i właściwości transportowe swoich komórkowych odpowiedników. W ostatnich latach dużą uwagę poświęcono metodzie dwuwarstwowej interfejsu kropelkowego (DIB)2,3,4 do budowy płaskiej dwuwarstwy lipidowej między pokrytymi lipidami kropelkami wody w oleju zyskała dużą uwagę5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21, 22,23, i wykazał praktyczne zalety w porównaniu z innymi podejściami do tworzenia membran modelowych: metoda DIB jest prosta do wykonania, nie wymaga skomplikowanej produkcji ani przygotowania (np. "malowania") podłoża do podparcia membrany, konsekwentnie daje membrany o najwyższej trwałości, pozwala na standardowe pomiary elektrofizjologiczne i upraszcza tworzenie membran modelowych z asymetrycznością Ulotka Compositions3. Ponieważ dwuwarstwa tworzy się spontanicznie między kropelkami, a każda kropla może być dostosowana pod względem pozycji i składu, technika DIB wzbudziła również znaczne zainteresowanie w opracowywaniu systemów materiałowych inspirowanych komórkami, które opierają się na wykorzystaniu membran reagujących na bodźce18,24,25,26,27,28,29, zrównoważony podział na przedziały i transport14,30,31, and tissue-like materials17,23,32,33,34,35,36.
Większość opublikowanych eksperymentów na błonach modelowych, w tym tych z DIBami, została przeprowadzona w temperaturze pokojowej (RT, ~20-25 °C) i z użyciem kilku syntetycznych lipidów (np. DOPC, DPhPC, itp.). Praktyka ta ogranicza zakres pytań biofizycznych, które można badać w błonach modelowych, a na podstawie obserwacji może również ograniczać rodzaje lipidów, które można wykorzystać do składania DIBs. Na przykład syntetyczny lipid, taki jak DPPC, który ma temperaturę topnienia 42 °C, nie składa ciasno upakowanych monowarstw ani nie tworzy DIB w RT37. Tworzenie DIB w temperaturze pokojowej okazało się również trudne w przypadku ekstraktów naturalnych, takich jak ekstrakty ze ssaków (np. ekstrakt lipidowy z mózgu, BTLE)38 lub bakterii (np. Escherichia coli total lipid extract, ETLE)37, które zawierają wiele różnych rodzajów lipidów i pochodzą z komórek żyjących w podwyższonych temperaturach (37 °C). Umożliwienie badania różnych składów daje zatem możliwość zrozumienia procesów zachodzących za pośrednictwem błony w warunkach istotnych z biologicznego punktu widzenia.
Podniesienie temperatury oleju może służyć dwóm celom: zwiększa kinetykę montażu jednej warstwy i może spowodować, że lipidy ulegną przemianie topnienia, aby osiągnąć płynną fazę nieuporządkowaną. Obie konsekwencje pomagają w montażu monowarstwowym39, co jest warunkiem wstępnym dla DIB. Oprócz ogrzewania w celu tworzenia dwóch warstw, chłodzenie membrany po utworzeniu może być wykorzystane do identyfikacji przejść termotropowych w pojedynczych dwuwarstwach lipidowych38, w tym w naturalnych mieszaninach lipidowych (np. BTLE), które mogą być trudne do wykrycia za pomocą kalorymetrii. Oprócz oceny przemian termotropowych lipidów, precyzyjna zmiana temperatury DIB może być wykorzystana do badania wywołanych temperaturą zmian w strukturze błony38 i zbadania, w jaki sposób skład lipidowy i płynność wpływają na kinetykę gatunków aktywnych błonowo (np. peptydów tworzących pory i białek transbłonowych37), w tym błon modelowych ssaków i bakterii w fizjologicznie odpowiedniej temperaturze (37 °C).
Tutaj zostanie wyjaśniony opis, jak zmontować zmodyfikowany zbiornik oleju DIB i uruchomić regulator temperatury sprzężenia zwrotnego, aby umożliwić montaż jednowarstwowy i tworzenie dwuwarstw w temperaturach wyższych niż RT. W odróżnieniu od poprzedniego protokołu40, zawarto wyraźne szczegóły dotyczące integracji oprzyrządowania potrzebnego do pomiaru i kontroli temperatury równolegle z montażem i charakteryzacją DIB w zbiorniku oleju. Procedura ta umożliwi zatem użytkownikowi zastosowanie tej metody do tworzenia i badania DIB w różnych temperaturach w różnych kontekstach naukowych. Co więcej, reprezentatywne wyniki dostarczają konkretnych przykładów rodzajów mierzalnych zmian zarówno w strukturze błony, jak i transporcie jonów, które mogą wystąpić wraz ze zmianami temperatury. Techniki te są ważnymi dodatkami do wielu badań biofizycznych, które można zaprojektować i skutecznie przeprowadzić w DIBs, w tym badania kinetyki gatunków aktywnych błonowo w różnych składach błonowych.

<table><tbody><tr><td>25 mm x 40 mm x 1 mm guma izolacyjna (x2)</td><td>Dowolna</td><td></td><td>Izoluje spód aluminiowej oprawy od stolika mikroskopu</td></tr><tr><td>25 mm x 40 mm x 6 mm guma izolacyjna (x2)</td><td>Dowolna</td><td></td><td>Chroni elementy grzejne przed uszkodzeniem przez klipsy stolika mikroskopu i izoluje górną część elementów grzejnych.</td></tr><tr><td>Kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3183</td><td>Środek buforujący do roztworu lipidowego</td></tr><tr><td>Podłoże akrylowe</td><td>Wykonane we własnym zakresie</td><td>HTD_STG_2</td> <td>~ 1000 uL akrylowej studni z zewnętrznym profilem poka-yoke do ustalenia orientacji</td></tr><tr><td>Aluminiowa oprawa</td><td>Wykonana we własnym HTD_STG_1</td><td></td><td>Oprawa podstawowa z szybem naftowym, w której znajduje się oprawa acylowa i zawiera dwie płaskie podkładki przylegające do szybu naftowego dla elementów grzejnych&nbsp;</td></tr><tr><td>Brain Total Lipid Extract</td><td>Avanti</td><td>131101C-100mg</td><td>25 mg/ml ekstrakt lipidowy ze świństwa&nbsp;</td></tr><tr><td>Kompaktowa obudowa DAQ (cDAQ)</td><td>Instrumenty krajowe&nbsp;</td><td>cDAQ-9174&nbsp;</td><td>Obudowa do przechowywania wielu typów czujników, modułów pomiarowych lub wyjściowych</td></tr><tr><td>System akwizycji danych (DAQ)</td><td>Urządzenia molekularne&nbsp;</td><td>Digidata 1440A&nbsp;</td><td>Przetwornik analogowo-cyfrowy o wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>Wzmacniacz/zasilacz o stałym wzmocnieniu</td><td>Hewlitt Packard</td><td>HP 6826A</td><td>Wzmacnia napięcie wyjściowe DC z modułu wyjściowego napięcia</td></tr><tr><td>Glass Cover Slip</td><td>Corning</td><td>CLS284525</td><td>Uszczelnia spód aluminiowej podstawy i pozwala na charakterystykę optyczną dwuwarstwowej</td></tr><tr><td>Element grzejny (x2)</td><td>Omega</td><td>KHLV-101/5</td><td>25 mm Element grzejny kaptonowy z folii polimmidowej o wymiarach 25 mm x 25 mm z ograniczeniem mocy 5 watów.</td></tr><tr><td>Śruba M3 ze stali nierdzewnej</td><td>McMaster Carr</td><td>90116A150</td><td>Mocuje termoparę do aluminiowego uchwytu</td></tr><tr><td>Wzmacniacz zacisków krosowych</td><td>Urządzenia molekularne&nbsp;</td><td>AxoPatch 200B&nbsp;</td><td>Mierzy prąd i wyprowadza napięcie do stopnia głównego</td></tr><tr><td>Komputer osobisty</td><td>Dowolny</td><td></td><td>komputer z wieloma szybkimi portami USB i minimum 6 GB pamięci RAM</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td>Elektrolit roztwór zdysocjowanych jonów</td></tr><tr><td>Moduł wejściowy temperatury</td><td>National Instruments&nbsp;</td><td>NI 9211</td><td>Umożliwia pomiary termopary z otwartym i zimnym złączem dla podwozia cDAQ</td></tr><tr><td>Termopara</td><td>Omega</td><td>JMTSS-020U-6&nbsp;</td><td>Termopara typu U o średnicy 0,02 cala i długości 6 cali</td></tr><tr><td>Klej utwardzany promieniami UV</td><td>Loctite</td><td>19739</td><td>Mocuje szklane szkiełko nakrywkowe do aluminiowego uchwytu podstawy</td></tr><tr><td>Moduł wyjściowy napięcia</td><td>National Instruments&nbsp;</td><td>NI 9263</td><td>Analogowy moduł wyjściowy napięcia do użytku z obudową cDAQ</td></tr><tr><td>Generator przebiegów</td><td>Agilent</td><td>33210A&nbsp;</td><td>Służy do wyprowadzania fali sinusoidalnej 10 mV 10 Hz</td></tr></tbody></table>

montaż i charakterystyka dwuwarstwy z powierzchnią kropelkową w kontrolowanej temperaturze

Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer

Metoda dwuwarstwowej granicy kropel (DIB) do łączenia dwuwarstw lipidowych (tj. DIBs) pomiędzy pokrytymi lipidami kropelkami wodnymi w oleju oferuje kluczowe korzyści w porównaniu z innymi metodami: DIB są stabilne i często długotrwałe, obszar dwuwarstwowy może być odwracalnie dostrojony, asymetria listków jest łatwo kontrolowana za pomocą kompozycji kropel, a tkankopodobne sieci dwuwarstw można uzyskać poprzez przyleganie wielu kropel. Tworzenie DIB wymaga spontanicznego łączenia lipidów w monowarstwy lipidowe o dużej gęstości na powierzchni kropel. Chociaż zachodzi to łatwo w temperaturze pokojowej w przypadku zwykłych syntetycznych lipidów, wystarczająca monowarstwa lub stabilna dwuwarstwa nie tworzy się w podobnych warunkach dla lipidów o temperaturze topnienia powyżej temperatury pokojowej, w tym niektórych komórkowych ekstraktów lipidowych. To zachowanie prawdopodobnie ograniczyło skład – i być może biologiczne znaczenie – DIB w modelowych badaniach błonowych. Aby rozwiązać ten problem, przedstawiono protokół eksperymentalny mający na celu dokładne podgrzanie zbiornika oleju, w którym znajdują się kropelki DIB i scharakteryzowanie wpływu temperatury na błonę lipidową. W szczególności protokół ten pokazuje, jak używać przewodzącej ciepło aluminiowej oprawy i rezystancyjnych elementów grzejnych kontrolowanych przez pętlę sprzężenia zwrotnego w celu przepisania podwyższonych temperatur, co poprawia montaż monowarstw i tworzenie dwuwarstw dla szerszego zestawu typów lipidów. Charakterystyki strukturalne błony, jak również termotropowe przejścia fazowe lipidów tworzących dwuwarstwę, określa się ilościowo poprzez pomiar zmian pojemności elektrycznej DIB. Łącznie procedura ta może pomóc w ocenie zjawisk biofizycznych w błonach modelowych w różnych temperaturach, w tym w określeniu efektywnej temperatury topnienia (TM) dla wieloskładnikowych mieszanin lipidowych. Zdolność ta pozwoli zatem na bliższą replikację naturalnych przemian fazowych w błonach modelowych i zachęci do tworzenia i wykorzystywania błon modelowych z szerszego zakresu składników błony, w tym tych, które lepiej oddają niejednorodność ich komórkowych odpowiedników.

Rysunek 1 przedstawia sposób przygotowania aluminiowego uchwytu i akrylowego zbiornika na olej na stoliku mikroskopu w celu formowania DIB. Kroki montażowe 1.2-1.4 służą do izolacji termicznej uchwytu od stolika, co pozwala na bardziej efektywne ogrzewanie. Kroki 1.5-1.7 pokazują, jak prawidłowo przymocować termoparę do uchwytu i ustawić zbiornik na olej, a kroki 1.8-1.9 wskazują zalecane miejsca aplikacji oleju do tych elementów.
Rysunek 2</s...

Ten protokół szczegółowo opisuje użycie systemu ogrzewania sterowanego temperaturą sprzężenia zwrotnego do promowania składania monowarstw lipidowych i tworzenia dwuwarstwowych warstw na granicy kropelek dla lipidów o podwyższonych temperaturach topnienia, oraz pomiary pojemności w celu scharakteryzowania zmian w membranie sterowanych temperaturą.

Montaż i charakterystyka dwuwarstwy z powierzchnią kropelkową w kontrolowanej temperaturze

The droplet interface bilayer (DIB) method for assembling lipid bilayers (i.e., DIBs) between lipid-coated aqueous droplets in oil offers key benefits ...

Protokół ten umożliwia naukowcom precyzyjne podgrzanie dwuwarstwowej membrany modelowej z interfejsem kropelkowym (DIB), co pozwala na badanie różnych efektów związanych z temperaturą, które występują w środowiskach komórkowych. Podstawowa zaleta wynika z możliwości lokalnego pomiaru i kontrolowania temperatury kąpieli w zbiorniku o małej objętości bez utrudniania dostępu do charakterystyk elektrycznych lub optycznych DIB. Możliwość precyzyjnego podgrzewania kąpieli płynowej otwiera możliwość badania właściwości transportowych i sygnalizacyjnych w DIB utworzonych ze znacznie szerszej gamy składników błonowych, w tym naturalnych ekstraktów komórkowych.Jest to wieloetapowy protokół wykorzystujący wiele urządzeń, które muszą być ściśle przestrzegane, aby osiągnąć wystarczającą dokładność eksperymentalną, dzięki czemu wszelkie niejasności w pisemnym procesie można wyjaśnić za pomocą wizualnej demonstracji. Aby rozpocząć, zbierz dwa kawałki gumy izolacyjnej o grubości jednego milimetra przycięte do długości 25 na 40 milimetrów, dwa kawałki gumy o grubości sześciu milimetrów, które również mają wymiary 25 na 40 milimetrów, przygotowany aluminiowy zespół mocowania podstawy oraz akrylowy zbiornik oleju, który mieści się w viewokienko aluminiowej podstawy. Umieść cieńsze kawałki gumy na stoliku mikroskopu tak, aby długa krawędź każdego elementu była styczna do otworu stolika.Umieść aluminiową oprawę podstawy na podkładkach izolacyjnych tak, aby viewokienko oprawy wyśrodkowane nad soczewką obiektywu. Umieść grubszy kawałek gumy na każdym rezystancyjnym elemencie grzejnym, a następnie użyj klipsa do stolika mikroskopowego, aby przytrzymać go na miejscu, aby chronić elementy grzejne przed uszkodzeniem spowodowanym przez zaciski stage i zaizolować przed przypadkowym zwarciem elektrycznym. Ostrożnie zegnij końcówkę pomiarową termopary, aby uzyskać kąt 90 stopni w odległości około czterech milimetrów od końca.Włóż wygiętą końcówkę termopary do lewego dolnego rogu aluminiowej oprawy i delikatnie zabezpiecz ją śrubą blokującą. Umieść akrylowy zbiornik w studzience aluminiowego uchwytu przed dodaniem oleju heksadekanowego do studzienki aluminiowego uchwytu, aby zminimalizować ryzyko uwięzienia pęcherzyków powietrza między viewokienko a dnem akrylowego zbiornika. Dozuj około 1,000 mikrolitrów oleju heksadekanowego do studzienki aluminiowej oprawy, aby zapewnić maksymalną powierzchnię do wymiany ciepła, nie dopuszczając jednocześnie do rozlania się oleju przez krawędzie oprawy na stolik mikroskopu lub soczewkę obiektywu.Wlej około 1,000 mikrolitrów oleju heksadekanowego do akrylowego zbiornika, nie przepełniając go. Zmierz nominalną pojemność membrany, jednocześnie obniżając temperaturę kąpieli olejowej z nastawy, która umożliwia tworzenie się dwuwarstw w celu identyfikacji termotropowych przemian fazowych lipidów w membranie. Kliknij prawym przyciskiem myszy wykres temperatury w graficznym interfejsie użytkownika i wyczyść dane wyświetlania, aby upewnić się, że w buforze jest wystarczająca ilość miejsca na kolejne nagrania.Korzystając z generatora przebiegów podłączonego do wzmacniacza patch clamp, nałóż trójkątny przebieg napięcia na dwuwarstwowe elektrody interfejsu kropelkowego lub DIB i zarejestruj indukowaną odpowiedź prądową przez dwuwarstwę. Schłodzić dwuwarstwę, zmniejszając temperaturę zadaną w krokach co pięć stopni, czekając co najmniej pięć minut w nowej temperaturze w stanie ustalonym między zmianami temperatury, aż do osiągnięcia żądanej temperatury. Po kąpieli olejowej i schłodzeniu dwuwarstwy do żądanej temperatury minimalnej, ponownie kliknij prawym przyciskiem myszy wykres temperatury w graficznym interfejsie użytkownika i wyeksportuj dane dotyczące temperatury w funkcji czasu do oprogramowania arkusza kalkulacyjnego.Zatrzymaj bieżące nagrywanie. Na podstawie zmierzonego prądu oblicz pojemność nominalną odpowiedzi na prąd fali prostokątnej w funkcji czasu w okresie chłodzenia. Wykreśl pojemność nominalną w funkcji temperatury, aby zaobserwować, jak zmieniła się pojemność membrany, a następnie zlokalizuj niemonotoniczne zmiany pojemności w funkcji temperatury, aby określić temperaturę topnienia.Podobnie należy ocenić quasi-statyczną pojemność właściwą dwuwarstwy w ustalonych temperaturach, kolejno zwiększając temperaturę kąpieli olejowej i obszaru dwuwarstwy. Zmień nastawę temperatury w krokach co 10 stopni Celsjusza za pomocą graficznego interfejsu użytkownika i pozwól systemowi zrównoważyć się do nowej temperatury. Wykonaj wcześniej opisane kroki, aby zainicjować pomiar prądu pojemnościowego i rejestrację.Zmień obszar dwuwarstwy, ostrożnie dostosowując położenie elektrod za pomocą mikromanipulatorów. Pozwól, aby prąd fali prostokątnej osiągnął amplitudę w stanie ustalonym i zbierz obrazy DIB, aby umożliwić obliczenie powierzchni membrany w funkcji czasu. Użyj kamery zamontowanej na mikroskopie, aby zobrazować dwuwarstwę widzianą z apertury.Jednocześnie dodaj znacznik cyfrowy do bieżącego oprogramowania do nagrywania, aby oznaczyć odpowiedni punkt czasowy do zbierania obrazów. Uzyskaj w sumie pięć obrazów DIB i obszarów stanu ustalonego prądu dwuwarstwowego, a następnie zresetuj temperaturę i powtórz obrazowanie. Przeanalizuj bieżące nagrania i obrazy DIB w oznaczonych punktach czasowych odpowiadających obszarom dwuwarstwowym w stanie ustalonym, wyodrębnij pojemność i obszar dwuwarstwowy dla każdej temperatury.Wykreśl pojemność w funkcji powierzchni dla każdej temperatury i oblicz nachylenie regresji pierwszego rzędu, które reprezentuje pojemność właściwą dwuwarstwy w każdej temperaturze. Następnie wykreśl wartości określonej pojemności w funkcji odpowiednich temperatur. Zbadaj dane dotyczące określonej pojemności w funkcji temperatury dla zmian niemonotonicznych, aby określić temperatury topnienia.Oceń dynamikę powstawania kanałów jonowych zależnych od napięcia, generując krok wejściowy napięcia DC na dwuwarstwie. Ustaw napięcie początkowe na żądaną wartość kroku w miliwoltach, a końcowe napięcie i rozmiar kroku na wartość wyższą niż żądany krok. Ustaw żądany czas trwania wejścia kroku w sekundach, a następnie wybierz żądaną polaryzację wejścia krokowego.Przełącz wzmacniacz z zaciskiem krosowym, aby wysłać napięcie sterujące pochodzące z widoku laboratoryjnego lub modułu wyjściowego napięcia do stopnia głównego, włącz napięcie i zarejestruj indukowaną odpowiedź prądową, która powinna zahamować odpowiedź w kształcie litery S na napięcie krytyczne. Oddzielnie uzyskaj dynamiczne zależności napięcia prądu dla membrany w żądanych temperaturach, aby ujawnić zależności zależne od napięcia, takie jak zachowanie kanału jonowego. Przełącz wzmacniacz z zaciskiem krosowym, aby wysłać napięcie sterujące pochodzące z generatora przebiegów do stopnia głównego i zainicjować nagrania prądu.Na generatorze przebiegów wyprowadź ciągły przebieg sinusoidalny o żądanej amplitudzie, przesunięciu i częstotliwości. Zapisz odpowiedź na prąd indukowany w jednym lub wielu cyklach i powtórz w razie potrzeby dla różnych amplitud fali sinusoidalnej, częstotliwości i temperatur. System kontroli temperatury został wykorzystany do pokazania zależności od temperatury DIB utworzonego z lipidów całkowitego ekstraktu lipidowego mózgu lub BTLE.Pomiary prądu pojemnościowego i temperatury w funkcji czasu są wyświetlane podczas cyklu ogrzewania od temperatury pokojowej do około 60 stopni Celsjusza. Udokumentowano zmiany pojemności nominalnej w funkcji temperatury w jednym pełnym cyklu chłodzenia/ogrzewania, po początkowym utworzeniu się dwuwarstwy w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Quasi-statyczne pomiary pojemności właściwej w różnych temperaturach mogą być wykorzystane do określenia temperatury topnienia lipidów.Wykreślenie pojemności dwuwarstwy w stosunku do obszaru dwuwarstwowego pozwala na regresję liniową, gdzie nachylenie reprezentuje wartość określonej pojemności. Obraz DIB pokazuje, że gdy temperatura jest niższa od temperatury topnienia, membrana przyjmuje stan silnej przyczepności, nawet pod wpływem naprężeń spowodowanych rozciągniętymi kropelkami spowodowanymi przez dobrze oddzielone elektrody. Pokazane ścieżki prądu w funkcji napięcia uzyskano poprzez zastosowanie sinusoidalnych napięć membranowych, mierząc indukowany prąd w dwóch różnych temperaturach.Strzałki i kolejne cyfry pomagają w wizualizacji kolejnych ćwiartek napięcia sinusoidalnego w odniesieniu do czasu. Zmierzona gęstość prądu dla membrany BTLE domieszkowanej monazomycyną przy tym samym poziomie napięcia i dwóch różnych temperaturach jest pokazana tutaj. Bardzo ważne jest, aby prawidłowo dozować olej heksadekanowy do studzienki aluminiowej oprawy.Jeśli zostanie to zrobione poza kolejnością lub nieostrożnie, pod studnią akrylową utworzą się pęcherzyki powietrza, które będą utrudniać widok DIB od dołu do góry. Użytkownik musi również pamiętać o wyczyszczeniu bufora danych w oprogramowaniu do kontroli temperatury przed każdym pomiarem, aby zapewnić pełną rejestrację. Procedura ta pozwala na scharakteryzowanie błon biomimetycznych w zakresie temperatur, co jest potrzebne do badania zależności struktury membrany i transportu od temperatury.Ponadto zdolność ta może zostać wykorzystana do ujawnienia nanoskalowych efektów innych gatunków aktywnych błonowo, takich jak biologiczne kanały jonowe i zmodyfikowane nanomateriały.

temperature-controlled-assembly-characterization-droplet-interface

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Bakteryjne kanały mechanowrażliwe mogą być używane jako przetworniki mechanoelektryczne w urządzeniach biomolekularnych.  Dwuwarstwy interfejsu kropelkowego (DIB), inspirowane komórkami elementami budulcowymi takich urządzeń, stanowią nowe platformy do włączania i stymulowania kanałów mechanowrażliwych.  W tym miejscu demonstrujemy nową metodę tworzenia DIB opartą na mikropipetach, umożliwiającą badanie kanałów mechanoczułych pod wpływem stymulacji mechanicznej.

Wielofunkcyjna, oparta na mikropipetach metoda wprowadzania i stymulacji mechanowrażliwych kanałów jonowych bakterii w dwuwarstwach interfejsu kropelkowego

Demonstrujemy system tworzenia dwuwarstwowych lipidów, który można przechowywać, przenośny. Dwuwarstwowa błona lipidowa może powstać w ciągu 1 godziny z ponad 80% skutecznością, gdy zamrożony prekursor błony zostanie doprowadzony do temperatury otoczenia. System ten ograniczy pracochłonne procesy i wiedzę specjalistyczną związaną z kanałami jonowymi.

Zautomatyzowane tworzenie dwuwarstwowej błony lipidowej za pomocą cienkiej warstwy polidimetylosiloksanu

Montaż i ustawienie wrzeciona mitotycznego zależy od połączonych sił generowanych przez dynamikę mikrotubul, białka motoryczne i sieciery. Tutaj przedstawiamy nasze ostatnio opracowane metody, w których geometryczne uwięzienie sferycznych kropelek emulsji jest wykorzystywane do odtworzenia od dołu do góry podstawowych wrzecion mitotycznych.

Rekonstytucja podstawowych wrzecion mitotycznych w sferycznych kropelkach emulsji

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji szkła za pomocą nanometrycznych plastrów białkowych otoczonych płynną dwuwarstwą lipidową. Substraty te są kompatybilne z zaawansowaną mikroskopią optyczną i oczekuje się, że posłużą jako platforma do badań adhezji i migracji komórek.

Macierze nanoklastrów ligandów w podpartej dwuwarstwie lipidowej

Tutaj prezentujemy protokół tworzenia dwuwarstw lipidowych za pomocą metody dwuwarstwowej pęcherzyków kontaktowych. Pęcherzyk wody jest wdmuchiwany do rozpuszczalnika organicznego, w wyniku czego na granicy faz woda-olej tworzy się monowarstwa. Dwie pipety są manipulowane w celu zadokowania pęcherzyków w celu utworzenia dwuwarstwy.

Eksperymenty dwuwarstwowe lipidowe z dwuwarstwami pęcherzyków kontaktowych dla zacisków krosowych

Ogólnym celem protokołu jest przygotowanie ponad miliona uporządkowanych, jednolitych, stabilnych i biokompatybilnych kropel femtolitru na płaskim podłożu o powierzchni 1cm2, który może być użyty do syntezy białek bez komórek.

Femtolitrowa matryca kropelkowa do masowo równoległej syntezy białek z pojedynczych cząsteczek DNA

Przedstawiamy protokół wytwarzania hybrydowej błony lipidowej na granicy woda/powietrze poprzez domieszkowanie dwuwarstwy lipidowej cząsteczkami miedzi (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-ftalocyjaniny (CuPc). Powstała hybrydowa błona lipidowa ma strukturę warstwową lipid/CuPc/lipid. Protokół ten może być również stosowany do tworzenia innych funkcjonalnych nanomateriałów.

Samoorganizacja hybrydowych błon lipidowych domieszkowanych hydrofobowymi cząsteczkami organicznymi na granicy faz woda/powietrze

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Tutaj przedstawiono protokół do wykonywania i analizy wiązania, mobilności i składania pojedynczych cząsteczek na sztucznych zatłoczonych błonach lipidowych za pomocą mikroskopii smTIRF (smTIRF) z wykorzystaniem pojedynczej cząsteczki całkowitego wewnętrznego odbicia.

Dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach

Prezentacja dwuwarstwowego urządzenia opartego na polidimetylosiloksanie (PDMS) do produkcji bibliotek kombinatorycznych w emulsjach (korkach) typu woda w oleju jest przedstawiona. Niezbędny sprzęt i oprogramowanie wymagane do automatyzacji produkcji zatyczek jest szczegółowo opisane w protokole, a także pokazano produkcję ilościowej biblioteki zatyczek fluorescencyjnych.

Dwuwarstwowe urządzenie mikroprzepływowe do kombinatorycznej produkcji korków

Przedstawiono protokół eksperymentalny do składania, stymulacji elektrycznej i analizy kropli dwuwarstwy lipidowych zmodyfikowanych gramicydyną A. Relacje struktura-funkcja lipidów i białek są ilościowo określane poprzez pomiar zmian w obszarze błony, przepływie jonowym i przewodnictwie pojedynczego kanału oraz odniesienie tych reakcji do zmian przypominających plasticzne zmiany w przewodnictwie jonowym w modelu błony inspirowanym synapsami elektrycznymi.

Charakterystyka struktury i funkcji błony lipidowo-białkowej z wykorzystaniem warstw dwubiegunowych interfejsu kropelkowego

Poznaj metodę montażu dwuwarstwy z powierzchnią kropelkową w kontrolowanej temperaturze do badań biomimetycznych błon lipidowych. Protokół umożliwia precyzyjne pomiary właściwości elektrofizjologicznych i optycznych.

Montaż i charakterystyka dwuwarstwy z powierzchnią kropelkową w kontrolowanej temperaturze

Przeglądaj więcej filmów