Montaż i charakterystyka dwuwarstwy z powierzchnią kropelkową w kontrolowanej temperaturze
April 19th, 2021
Ten protokół szczegółowo opisuje użycie systemu ogrzewania sterowanego temperaturą sprzężenia zwrotnego do promowania składania monowarstw lipidowych i tworzenia dwuwarstwowych warstw na granicy kropelek dla lipidów o podwyższonych temperaturach topnienia, oraz pomiary pojemności w celu scharakteryzowania zmian w membranie sterowanych temperaturą.
Protokół ten umożliwia naukowcom precyzyjne podgrzanie dwuwarstwowej membrany modelowej z interfejsem kropelkowym (DIB), co pozwala na badanie różnych efektów związanych z temperaturą, które występują w środowiskach komórkowych. Podstawowa zaleta wynika z możliwości lokalnego pomiaru i kontrolowania temperatury kąpieli w zbiorniku o małej objętości bez utrudniania dostępu do charakterystyk elektrycznych lub optycznych DIB. Możliwość precyzyjnego podgrzewania kąpieli płynowej otwiera możliwość badania właściwości transportowych i sygnalizacyjnych w DIB utworzonych ze znacznie szerszej gamy składników błonowych, w tym naturalnych ekstraktów komórkowych.
Jest to wieloetapowy protokół wykorzystujący wiele urządzeń, które muszą być ściśle przestrzegane, aby osiągnąć wystarczającą dokładność eksperymentalną, dzięki czemu wszelkie niejasności w pisemnym procesie można wyjaśnić za pomocą wizualnej demonstracji. Aby rozpocząć, zbierz dwa kawałki gumy izolacyjnej o grubości jednego milimetra przycięte do długości 25 na 40 milimetrów, dwa kawałki gumy o grubości sześciu milimetrów, które również mają wymiary 25 na 40 milimetrów, przygotowany aluminiowy zespół mocowania podstawy oraz akrylowy zbiornik oleju, który mieści się w viewokienko aluminiowej podstawy. Umieść cieńsze kawałki gumy na stoliku mikroskopu tak, aby długa krawędź każdego elementu była styczna do otworu stolika.
Umieść aluminiową oprawę podstawy na podkładkach izolacyjnych tak, aby viewokienko oprawy wyśrodkowane nad soczewką obiektywu. Umieść grubszy kawałek gumy na każdym rezystancyjnym elemencie grzejnym, a następnie użyj klipsa do stolika mikroskopowego, aby przytrzymać go na miejscu, aby chronić elementy grzejne przed uszkodzeniem spowodowanym przez zaciski stage i zaizolować przed przypadkowym zwarciem elektrycznym. Ostrożnie zegnij końcówkę pomiarową termopary, aby uzyskać kąt 90 stopni w odległości około czterech milimetrów od końca.
Włóż wygiętą końcówkę termopary do lewego dolnego rogu aluminiowej oprawy i delikatnie zabezpiecz ją śrubą blokującą. Umieść akrylowy zbiornik w studzience aluminiowego uchwytu przed dodaniem oleju heksadekanowego do studzienki aluminiowego uchwytu, aby zminimalizować ryzyko uwięzienia pęcherzyków powietrza między viewokienko a dnem akrylowego zbiornika. Dozuj około 1,000 mikrolitrów oleju heksadekanowego do studzienki aluminiowej oprawy, aby zapewnić maksymalną powierzchnię do wymiany ciepła, nie dopuszczając jednocześnie do rozlania się oleju przez krawędzie oprawy na stolik mikroskopu lub soczewkę obiektywu.
Wlej około 1,000 mikrolitrów oleju heksadekanowego do akrylowego zbiornika, nie przepełniając go. Zmierz nominalną pojemność membrany, jednocześnie obniżając temperaturę kąpieli olejowej z nastawy, która umożliwia tworzenie się dwuwarstw w celu identyfikacji termotropowych przemian fazowych lipidów w membranie. Kliknij prawym przyciskiem myszy wykres temperatury w graficznym interfejsie użytkownika i wyczyść dane wyświetlania, aby upewnić się, że w buforze jest wystarczająca ilość miejsca na kolejne nagrania.
Korzystając z generatora przebiegów podłączonego do wzmacniacza patch clamp, nałóż trójkątny przebieg napięcia na dwuwarstwowe elektrody interfejsu kropelkowego lub DIB i zarejestruj indukowaną odpowiedź prądową przez dwuwarstwę. Schłodzić dwuwarstwę, zmniejszając temperaturę zadaną w krokach co pięć stopni, czekając co najmniej pięć minut w nowej temperaturze w stanie ustalonym między zmianami temperatury, aż do osiągnięcia żądanej temperatury. Po kąpieli olejowej i schłodzeniu dwuwarstwy do żądanej temperatury minimalnej, ponownie kliknij prawym przyciskiem myszy wykres temperatury w graficznym interfejsie użytkownika i wyeksportuj dane dotyczące temperatury w funkcji czasu do oprogramowania arkusza kalkulacyjnego.
Zatrzymaj bieżące nagrywanie. Na podstawie zmierzonego prądu oblicz pojemność nominalną odpowiedzi na prąd fali prostokątnej w funkcji czasu w okresie chłodzenia. Wykreśl pojemność nominalną w funkcji temperatury, aby zaobserwować, jak zmieniła się pojemność membrany, a następnie zlokalizuj niemonotoniczne zmiany pojemności w funkcji temperatury, aby określić temperaturę topnienia.
Podobnie należy ocenić quasi-statyczną pojemność właściwą dwuwarstwy w ustalonych temperaturach, kolejno zwiększając temperaturę kąpieli olejowej i obszaru dwuwarstwy. Zmień nastawę temperatury w krokach co 10 stopni Celsjusza za pomocą graficznego interfejsu użytkownika i pozwól systemowi zrównoważyć się do nowej temperatury. Wykonaj wcześniej opisane kroki, aby zainicjować pomiar prądu pojemnościowego i rejestrację.
Zmień obszar dwuwarstwy, ostrożnie dostosowując położenie elektrod za pomocą mikromanipulatorów. Pozwól, aby prąd fali prostokątnej osiągnął amplitudę w stanie ustalonym i zbierz obrazy DIB, aby umożliwić obliczenie powierzchni membrany w funkcji czasu. Użyj kamery zamontowanej na mikroskopie, aby zobrazować dwuwarstwę widzianą z apertury.
Jednocześnie dodaj znacznik cyfrowy do bieżącego oprogramowania do nagrywania, aby oznaczyć odpowiedni punkt czasowy do zbierania obrazów. Uzyskaj w sumie pięć obrazów DIB i obszarów stanu ustalonego prądu dwuwarstwowego, a następnie zresetuj temperaturę i powtórz obrazowanie. Przeanalizuj bieżące nagrania i obrazy DIB w oznaczonych punktach czasowych odpowiadających obszarom dwuwarstwowym w stanie ustalonym, wyodrębnij pojemność i obszar dwuwarstwowy dla każdej temperatury.
Wykreśl pojemność w funkcji powierzchni dla każdej temperatury i oblicz nachylenie regresji pierwszego rzędu, które reprezentuje pojemność właściwą dwuwarstwy w każdej temperaturze. Następnie wykreśl wartości określonej pojemności w funkcji odpowiednich temperatur. Zbadaj dane dotyczące określonej pojemności w funkcji temperatury dla zmian niemonotonicznych, aby określić temperatury topnienia.
Oceń dynamikę powstawania kanałów jonowych zależnych od napięcia, generując krok wejściowy napięcia DC na dwuwarstwie. Ustaw napięcie początkowe na żądaną wartość kroku w miliwoltach, a końcowe napięcie i rozmiar kroku na wartość wyższą niż żądany krok. Ustaw żądany czas trwania wejścia kroku w sekundach, a następnie wybierz żądaną polaryzację wejścia krokowego.
Przełącz wzmacniacz z zaciskiem krosowym, aby wysłać napięcie sterujące pochodzące z widoku laboratoryjnego lub modułu wyjściowego napięcia do stopnia głównego, włącz napięcie i zarejestruj indukowaną odpowiedź prądową, która powinna zahamować odpowiedź w kształcie litery S na napięcie krytyczne. Oddzielnie uzyskaj dynamiczne zależności napięcia prądu dla membrany w żądanych temperaturach, aby ujawnić zależności zależne od napięcia, takie jak zachowanie kanału jonowego. Przełącz wzmacniacz z zaciskiem krosowym, aby wysłać napięcie sterujące pochodzące z generatora przebiegów do stopnia głównego i zainicjować nagrania prądu.
Na generatorze przebiegów wyprowadź ciągły przebieg sinusoidalny o żądanej amplitudzie, przesunięciu i częstotliwości. Zapisz odpowiedź na prąd indukowany w jednym lub wielu cyklach i powtórz w razie potrzeby dla różnych amplitud fali sinusoidalnej, częstotliwości i temperatur. System kontroli temperatury został wykorzystany do pokazania zależności od temperatury DIB utworzonego z lipidów całkowitego ekstraktu lipidowego mózgu lub BTLE.
Pomiary prądu pojemnościowego i temperatury w funkcji czasu są wyświetlane podczas cyklu ogrzewania od temperatury pokojowej do około 60 stopni Celsjusza. Udokumentowano zmiany pojemności nominalnej w funkcji temperatury w jednym pełnym cyklu chłodzenia/ogrzewania, po początkowym utworzeniu się dwuwarstwy w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Quasi-statyczne pomiary pojemności właściwej w różnych temperaturach mogą być wykorzystane do określenia temperatury topnienia lipidów.
Wykreślenie pojemności dwuwarstwy w stosunku do obszaru dwuwarstwowego pozwala na regresję liniową, gdzie nachylenie reprezentuje wartość określonej pojemności. Obraz DIB pokazuje, że gdy temperatura jest niższa od temperatury topnienia, membrana przyjmuje stan silnej przyczepności, nawet pod wpływem naprężeń spowodowanych rozciągniętymi kropelkami spowodowanymi przez dobrze oddzielone elektrody. Pokazane ścieżki prądu w funkcji napięcia uzyskano poprzez zastosowanie sinusoidalnych napięć membranowych, mierząc indukowany prąd w dwóch różnych temperaturach.
Strzałki i kolejne cyfry pomagają w wizualizacji kolejnych ćwiartek napięcia sinusoidalnego w odniesieniu do czasu. Zmierzona gęstość prądu dla membrany BTLE domieszkowanej monazomycyną przy tym samym poziomie napięcia i dwóch różnych temperaturach jest pokazana tutaj. Bardzo ważne jest, aby prawidłowo dozować olej heksadekanowy do studzienki aluminiowej oprawy.
Jeśli zostanie to zrobione poza kolejnością lub nieostrożnie, pod studnią akrylową utworzą się pęcherzyki powietrza, które będą utrudniać widok DIB od dołu do góry. Użytkownik musi również pamiętać o wyczyszczeniu bufora danych w oprogramowaniu do kontroli temperatury przed każdym pomiarem, aby zapewnić pełną rejestrację. Procedura ta pozwala na scharakteryzowanie błon biomimetycznych w zakresie temperatur, co jest potrzebne do badania zależności struktury membrany i transportu od temperatury.
Ponadto zdolność ta może zostać wykorzystana do ujawnienia nanoskalowych efektów innych gatunków aktywnych błonowo, takich jak biologiczne kanały jonowe i zmodyfikowane nanomateriały.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół umożliwia precyzyjne podgrzewanie dwuwarstwy interfejsu kropelek (DIB) modelu błony, ułatwiając badanie efektów związanych z temperaturą w środowiskach komórkowych. Pozwala na lokalny pomiar i regulację temperatury otoczenia bez blokowania dostępu do charakterystyki elektrycznej lub optycznej.
Kluczowe elementy badania
Dział / Obszar Nauki
- Neurobiologia
- Biofizyka
- Biologia błon
Tło
- Badanie koncentruje się na montażu pojedynczej warstwy lipidów i tworzeniu DIB.
- Kontrola temperatury jest kluczowa dla badania właściwości błon.
- Pomiary pojemności służą do oceny zmian wynikających z temperatury.
- Naturalne ekstrakty komórkowe mogą być wykorzystywane jako składniki błon.
Cel badania
- Promowanie montażu pojedynczej warstwy lipidów i tworzenia DIB.
- Badanie efektów związanych z temperaturą na zachowanie błon.
- Poprawa dokładności eksperymentalnej dzięki precyzyjnej kontroli temperatury.
Wykorzystane metody
- Układ podgrzewania z regulacją temperatury oparty na sprzężeniu zwrotnym.
- Pomiary pojemności do charakteryzacji błon.
- Wielostopniowy protokół ze specyficznymi wymaganiami sprzętowymi.
- Demonstracje wizualne w celu wyjaśnienia niejednoznaczności proceduralnych.
Główne wyniki
- Pomyślny montaż pojedynczych warstw lipidów i DIB.
- Możliwość badania szerszej gamy składników błon.
- Wzbogacone zrozumienie właściwości transportu i sygnalizacji.
- Wykażona dokładność w kontrolowaniu temperatury podczas eksperymentów.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodną metodę badania DIB.
- Kontrola temperatury jest niezbędna dla dokładnych wyników eksperymentalnych.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę metodę do różnorodnych badań nad błonami.
Najczęściej zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Temperature-controlled assembly and characterization of droplet interface bilayers (DIBs) enables biopharma R&D teams to interrogate membrane structure and function using lipid compositions that closely mimic cellular diversity. This approach expands predictive confidence in early discovery by supporting mechanistic de-risking and target validation in physiologically relevant model membranes. The method enhances portfolio decision-making by enabling robust, quantitative assessment of membrane-active compounds across a broader range of lipid environments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic interrogation of membrane-active targets in biologically relevant lipid contexts.
- Supports functional target validation by quantifying temperature-dependent membrane properties.
- Facilitates predictive de-risking of candidate molecules acting on diverse membrane systems.
- Improves confidence in early-stage triage by revealing phase transitions and structural dynamics.
Screening & Assay Development
- Prepares validated model membranes for downstream compound screening workflows.
- Standardizes assay conditions by controlling temperature and lipid composition.
- Delivers reproducible, quantitative capacitance and current measurements for reliable evaluation.
- Enables scalable adaptation to different lipid mixtures, including natural extracts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns model membrane studies with disease-relevant lipid heterogeneity.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling phase transition analysis.
- Provides risk-adjusted data for advancing membrane-targeted therapeutics.
- Facilitates investigation of nanoscale effects of ion channels and engineered nanomaterials.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, mechanistic de-risking, and quantitative analytics in membrane biology.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and pathway clarification in membrane-active target studies.
- Screening: Provides assay-ready, temperature-controlled model membranes for compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative capacitance and current readouts for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical work by modeling natural lipid phase transitions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse membrane composition studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in membrane-targeted programs.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of membrane assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of membrane-active assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, membrane biophysics, and temperature-controlled instrumentation.
- Needs access to patch clamp amplifiers, waveform generators, and optical imaging systems.
- Demands rigorous cross-team standardization of temperature and measurement protocols.
- Adaptable to a range of lipid mixtures, including synthetic and natural extracts.
- Careful oil dispensing and data management are critical to avoid measurement artifacts.
