Name: Eksperymenty dwuwarstwowe lipidowe z dwuwarstwami pęcherzyków kontaktowych dla zacisków krosowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Poznaj metodę dwuwarstw pęcherzyków kontaktowych (CBB) do tworzenia lipidowych błon dwuwarstwowych w biologii i biofizyce. Technika ta umożliwia rejestrację prądów pojedynczych kanałów jonowych z wysokim stosunkiem sygnału do szumu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Mariko Yamatake i Masako Takashima za pomoc techniczną. Prace te były częściowo wspierane przez granty KAKENHI o numerach 16H00759 i 17H04017 (SO).

1. Przygotowanie liposomów
<ol>
	<li>Rozproszyć fosfolipidy (np. 10 mg w proszku) w chloroformie w pożądanym stężeniu (np. 10 mg/ml).</li>
	<li>Odparować chloroform.
	<ol>
		<li>Umieścić roztwór fosfolipidów w kolbie okrągłodennej i umieścić go na wyparce obrotowej (patrz Tabela materiałów) podłączonej do butli z gazemN2. Obracać kolbę pod przepływemN2 w temperaturze pokojowej, aż pojawi się cienki film fosfolipidowy (po ~30 minutach).</li>
		<li>Umieścić otwartą kolbę w eksykatorze podłączonym do pompy próżniowej. Za pomocą pompy próżniowej zasysać wnętrze eksykatora przez kilka godzin, aby dokładnie usunąć chloroform.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać odpowiednią objętość roztworu elektrolitu do kolby i zawiesić fosfolipid w celu uzyskania zawiesiny fosfolipidów o stężeniu 2 mg/ml.</li>
	<li>Sonikować zawiesinę przez kilkadziesiąt sekund za pomocą sonikatora do kąpieli (patrz Tabela Materiałów) w celu uzyskania wielowarstwowej zawiesiny pęcherzyków (MLV).</li>
	<li>W celu przygotowania proteoliposomów, które zawierają białka kanałów jonowych, dodaj roztwór białka (z białkami rozpuszczonymi przy użyciu odpowiednich detergentów; maksymalna objętość wynosi 2%) do zawiesiny MLV i sonikuj przez kilka sekund za pomocą sonikatora do kąpieli.</li>
</ol>
2. Przygotuj szklane pipety o dużej średnicy
<ol>
	<li>Umieść szklaną kapilę w ściągaczu do pipet i wyprodukuj mikropipety z cienką, stożkową końcówką w dwóch etapach.</li>
	<li>Umieścić mikropipetę na mikrokuźni i zetknąć końcówką mikropipety z włóknem platynowym w zwężającej się części o średnicy od 30 do 50 μm.</li>
	<li>Podgrzej krótko żarnik (5 s) i natychmiast go wyłącz. 
	UWAGA: Ta manipulacja tworzy pęknięcie w punkcie nagrzewania, w wyniku którego końcówka mikropipety zostaje odcięta, pozostawiając szeroki otwór o średnicy od 30 do 50 μm.</li>
</ol>
3. Potraktuj powierzchnię szkiełka za pomocą płytkiej studni wklęsłej (silikonizacja dla wykończenia hydrofobowego)
<ol>
	<li>Oczyść powierzchnię szkiełka szklanego płytką studnią z wodą destylowaną i etanolem.</li>
	<li>Nanieść odpowiednią objętość (np. 100 μl) odczynnika silikonowającego (hydrofobowego) na szkiełko szkiełkowe z otworem.</li>
	<li>Całkowicie wysuszyć odczynnik na powietrzu.</li>
	<li>Umieść szklane szkiełko na stoliku odwróconego mikroskopu.</li>
</ol>
4. Utwórz CBB i wykonaj pomiar elektrofizjologiczny
<ol>
	<li>Dodaj 100 μl heksadekanu do płytkiego dołka silikonowanego szkła szkiełkowego z otworem. 
	UWAGA: W przypadku metody lipid-out fosfolipidy są wcześniej dyspergowane w heksadekanie (20 mg/ml).</li>
	<li>Napełnij roztwór elektrolitu do połowy długości mikropipety za pomocą strzykawki tuberkulinowej do połowy długości.</li>
	<li>Umieść mikropipetę na uchwycie mikropipety z portem ciśnieniowym, tak aby elektroda drutowa Ag/AgCl wsiąkła w roztwór elektrolitu do pipety.</li>
	<li>Podłącz jeden z uchwytów mikropipet do stopnia głównego patch-clamp amplifier, a drugi do uziemienia elektrycznego.</li>
	<li>Podłącz mikroiniektor do portu ciśnieniowego uchwytu mikropipety.</li>
	<li>Ustaw mikropipetę w odpowiedniej pozycji nad stolikiem mikroskopu odwróconego, manipulując mikromanipulatorem.</li>
	<li>Dostosuj potencjał przesunięcia elektrody.
	<ol>
		<li>Umieść 1 μl tego samego roztworu elektrolitu, który został użyty do napełnienia mikropipety, na płaskiej powierzchni wokół płytkiego dołka szkła szkiełkowego z otworem, tworząc kopułę elektrolitu.</li>
		<li>Zanurz końcówki obu mikropipet w kopule elektrolitu, manipulując mikromanipulatorem.</li>
		<li>Dostosuj potencjał przesunięcia elektrody wzmacniacza patch-clamp.</li>
		<li>Potwierdź prawidłowe przesunięcie na końcu eksperymentów, rozbijając CBB poprzez zastosowanie wysokiego potencjału membranowego (przebicie elektryczne; użycie Zap na wzmacniaczu), powodując stopienie dwóch pęcherzyków w jeden (fuzja pęcherzykowa).</li>
		<li>Popraw potencjał złącza cieczy54 w przypadkach, gdy stosowane są asymetryczne roztwory elektrolitu, tak aby obliczona wartość była dodawana do zastosowanego potencjału membrany dla rzeczywistego potencjału membranowego. 
		UWAGA: Potencjał złącza cieczy jest obliczany za pomocą programu JPCalc55.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Narysuj roztwór liposomu z końcówki. 
	UWAGA: Gdy kanały rozpuszczalne w wodzie są badane metodą lipidową, odsysanie roztworu liposomu nie jest konieczne.
	<ol>
		<li>Umieścić 1 μl roztworu liposomu na płaskiej powierzchni wokół płytkiego dołka szkła szkiełkowego z otworem (kopuła zawierająca liposom).</li>
		<li>Manipuluj mikromanipulatorem i włóż końcówkę mikropipety do kopuły zawierającej liposom.</li>
		<li>Odessać roztwór zawierający liposom, obniżając ciśnienie wewnątrz uchwytu mikropipety za pomocą mikrowstrzykiwacza.</li>
		<li>Powtórz procedurę dla drugiej pipety.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Manipuluj mikromanipulatorem i zanurz końcówkę mikropipety w sześciokątu w płytkiej studzience.</li>
	<li>Powoli przedmuchuj pęcherzyk wody, zwiększając ciśnienie, aż pęcherzyk osiągnie pożądany rozmiar (np. 50 μm średnicy), a następnie utrzymuj to samo ciśnienie.</li>
	<li>Wyrzuć pęcherzyki, przepuszczając końcówkę przez interfejs olej-powietrze, jeśli trudno jest utrzymać stabilny rozmiar pęcherzyków.</li>
	<li>Powtarzaj kroki od 4.8 do 4.9, aż utworzą się stabilne pęcherzyki.</li>
	<li>Manipuluj bąbelkami, aby umożliwić kontakt między nimi (<silna klasa="xfig">Rysunek 5). 
	UWAGA: Czasami bąbelki zbliżają się do siebie spontanicznie, tworząc CBB. W innych przypadkach bąbelki są blisko, ale nie stykają się ze sobą. W takim przypadku popchnij bąbelki nawzajem mechanicznie.</li>
	<li>Dostosuj ciśnienie, aby utrzymać rozmiar pęcherzyka, ponieważ rozmiar może się stopniowo zmieniać nawet przy stałym ciśnieniu wewnątrz pęcherzyka.</li>
	<li>Ustaw potencjał membrany na odpowiednią wartość za pomocą wzmacniacza patch-clamp i poczekaj, aż pojawi się prąd kanału (Rysunek 6).</li>
</ol>
5. Zmierz pojemność dwuwarstwową
<ol>
	<li>Zmierz dwuwarstwową pojemność elektryczną (Cel), stosując potencjał narastania. 
	UWAGA: Gdy szybkość zmiany napięcia w poleceniu rampy wynosi 10 mV/10 ms (lub 1 V/s), po której następuje -10 mV/10 ms, amplituda skoku prądu przy zmianach nachylenia odpowiada odczytowi wartości pojemności membrany (np. 100 pA → 100 pF).</li>
	<li>Oceń obszar dwuwarstwowy dwóch pęcherzyków ułożonych jeden na drugim i ustaw mikroskop na poziomie dwuwarstwy, aby zobaczyć krawędź dwuwarstwy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 6). 
	UWAGA: Kształt dwuwarstwowy jest w większości okrągły, a obszar jest obliczany na podstawie promienia.</li>
	<li>Oblicz pojemność właściwą membrany (Csp), dzieląc pojemność elektryczną przez powierzchnię dwuwarstwy (Csp = Cel/A).</li>
	<li>Obliczyć grubość dwuwarstwy (grubość rdzenia hydrofobowego) za pomocą Dc = (εrε0)/Csp (gdzie εr i ε0 oznaczają odpowiednio przenikalność elektryczną obszaru hydrofobowego dwuwarstwy i przenikalność elektryczną próżni).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Metoda tworzenia dwuwarstw lipidowych CBB opiera się na zasadzie kropli wody w oleju wyłożonej monowarstwą20. Z technicznego punktu widzenia procedury formowania CBB są łatwe, szczególnie dla badaczy zajmujących się zaciskami krosowymi, którzy są biegli w manipulowaniu szklanymi mikropipetami. Konfiguracja elektrofizjologiczna zacisku krosowego jest chętnie stosowana w CBB, gdy dostępne są dwa manipulatory pipet z mikrowtryskiwaczami. Z drugiej strony, ponieważ CBB jest następcą konwencjonalnego P...

Dla kanałów jonowych, błona komórkowa nie jest po prostu materiałem nośnym, ale partnerem do generowania strumienia jonów. Funkcjonalnie membrana jest izolatorem elektrycznym, w którym osadzone są kanały jonowe, a wszystkie błony komórkowe są wyposażone w spoczynkowy potencjał błonowy. Konwencjonalnie arbitralny potencjał błonowy był narzucany z zewnętrznego obwodu, za pomocą którego mierzono prąd elektryczny przepływający przez kanały. Ta ilościowa ocena strumienia jonów przy różnych potencjałach błonowych ujawniła właściwości molekularne tych kanałów, takie jak ich selektywne przenikanie jonów i funkcje bramkowania1,2. Platformą błonową do badań funkcjonalnych kanałów jonowych jest błona komórkowa lub dwuwarstwowa błona lipidowa. Historycznie rzecz biorąc, jednokanałowe zapisy prądu elektrycznego były po raz pierwszy wykonywane w dwuwarstwach lipidowych3,4, a odpowiednie techniki zostały opracowane dla błon komórkowych, takich jak metoda patch-clamp (Rysunek 1A)5,6. Od tego czasu te dwie techniki ewoluowały oddzielnie dla różnych celów (Rysunek 1)7,8.
Lipidy błonowe i błony dwuwarstwowe są obecnie przedmiotem badań ze względu na ich rolę we wspieraniu struktury i funkcji białek kanałowych. W związku z tym istnieje duże zapotrzebowanie na metody zmiany składu lipidowego w dwuwarstwach. Metody tworzenia dwuwarstw lipidowych, takie jak płaska dwuwarstwa lipidowa (PLB)8,9,10,11, dwuwarstwa kropli wody w oleju12, oraz dwuwarstwa interfejsu kropelki (DIB)13,14,15,16,17,18,19 technik (Rysunek 1) są częstym wyborem, dającym możliwość zbadania funkcji kanału w różnych składach lipidowych20. Chociaż DIB jest technicznie znacznie łatwiejszy do wyprodukowania niż konwencjonalny PLB, duży rozmiar DIB zniechęcił zaciskarki do stosowania go do badania jednokanałowych nagrań prądowych o zwykłej przewodności (<100 pS).
Aby obejść szum tła, obszar dwuwarstwowy musi być zminimalizowany. W tym numerze przywołuje się powtórki historyczne w opracowywaniu technik elektrofizjologicznych dla dwuwarstw lipidowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Na początku na końcówce pipety tworzyła się dwuwarstwa o małych rozmiarach (o średnicy 1-30 μm) (metoda zanurzania końcówki; <silna klasa="xfig">Rysunek 1C)21,22,23, zamiast używać wolnostojącej dwuwarstwy (~100 μm średnicy) na hydrofobowej przegrodzie w komorze (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Metoda tip-dip pozwoliła na pomiary elektryczne przy znacznie niższym szumie tła24. Nasze doświadczenia z PLB25,26, tip-dip22,23,27, and patch-clamp28,29,30,31 Metody doprowadziły nas do nowatorskiego pomysłu tworzenia dwuwarstw lipidowych przy użyciu zasad dwuwarstwy woda w oleju. Nazwaliśmy to metodą dwuwarstwy bąbelkowej (CBB)20,32. W tej metodzie, zamiast zawieszać kropelki wody w fazie olejowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D), pęcherzyk wody jest wdmuchiwany ze szklanej pipety (o średnicy końcówki około 30 μm) do fazy olejowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E i 2), gdzie pęcherzyk jest utrzymywany przez zastosowanie stałego ciśnienia. Monowarstwa tworzy się spontanicznie na granicy faz woda-olej na powierzchni pęcherzyka. Następnie dwie pęcherzyki są dokowane przez manipulację dwiema szklanymi pipetami, a dwuwarstwa jest tworzona, gdy dwie monowarstwy zbliżają się do siebie, uzyskując obszar równowagi dwuwarstwowej. Wielkość pęcherzyka jest kontrolowana przez ciśnienie wewnątrz pęcherzyka (ciśnienie trzymania), a także rozmiar dwuwarstwy. Często stosuje się średnią średnicę 50 μm. Chociaż objętość pęcherzyka jest niewielka (<100 l), jest ona połączona z większą objętością roztworu pipety, która mieści się w zakresie mikrolitrów, stanowiąc masową fazę elektrolitową.
Istnieje wiele korzyści z zastosowania metody CBB (Tabela 1). Jako technika tworzenia dwuwarstw lipidowych można wytwarzać błony o różnym składzie lipidowym, a błony asymetryczne są łatwiej formowane32 niż te przy użyciu konwencjonalnej metody składania33. Dwuwarstwą można manipulować mechanicznie, w przeciwieństwie do konwencjonalnego PLB, który można zginać tylko przy różnicy ciśnień hydrostatycznych34,35. Zmieniając ciśnienie trzymania, pęcherzyki rozszerzają się lub kurczą, co prowadzi do zwiększenia lub zmniejszenia napięcia membrany32. Dwuwarstwa jest mechanicznie odłączalna na monowarstwy, podobnie jak technika zamrażania i pękania36,37 membran w badaniach morfologicznych, ale w przypadku CBB manewr pozwala na wielokrotne cykle odłączania i dołączania32. Niewielka objętość roztworu elektrolitu w pęcherzyku pozwala na efektywne wtopienie liposomów odtworzonych w kanale w dwuwarstwę, a prawdopodobieństwo uzyskania nagrań kanałowych jest znacznie wyższe niż w przypadku konwencjonalnej techniki PLB. Mała objętość pęcherzyków umożliwia również szybką perfuzję (w ciągu ~20 ms) po włożeniu kolejnej pipety iniekcyjnej do któregokolwiek z pęcherzyków. W przeciwieństwie do metody patch-clamp, po zerwaniu membrana CBB jest natychmiast i wielokrotnie ponownie formowana, a pipety mogą być używane kilka razy dziennie. Łącząc zalety metod patch-clamp i PLB, CBB zapewnia wszechstronną platformę do zmiany warunków fizykochemicznych membrany, umożliwiając bezprecedensowe badania interakcji kanał-membrana.
Zanim przedstawimy szczegółowy protokół procesu tworzenia CBB, najpierw przedstawiono fizykochemiczne tło powstawania dwuwarstwy, które będzie pomocne dla zaciskaczy plastrów w rozwiązywaniu napotkanych trudności eksperymentalnych związanych z tworzeniem membrany.
Eksperymenty CBB udzielają lekcji chemii powierzchni38. CBB jest podobny do bańki mydlanej wydmuchiwanej ze słomki w powietrze, gdzie podobnie pęcherzyk wody jest wdmuchiwany do rozpuszczalnika organicznego. Można zauważyć, że pęcherzyk wody jest prawie nie napompowany, gdy lipidy błonowe nie są zawarte ani w pęcherzyku wody, ani w rozpuszczalniku organicznym. W przypadku braku lipidów amfipatycznych napięcie powierzchniowe na granicy faz woda-olej jest wysokie, a ciśnienie wewnątrz pęcherzyka do wydmuchiwania pęcherzyka będzie wysokie. Jest to realizacja równania Laplace'a (ΔP = 2 γ/R, gdzie ΔP to ciśnienie wewnątrz pęcherzyka, γ to napięcie powierzchniowe, a R to promień pęcherzyka). Gdy stężenie lipidów w fazie organicznej lub roztworze elektrolitu jest wysokie, gęstość lipidów w monowarstwie wzrasta, zgodnie z izotermą adsorpcji Gibbsa (-dγ = Γi dμi, gdzie Γi jest nadmiarem powierzchniowym związku i, a μi jest potencjałem chemicznym składnika i)39, co prowadzi do obniżenia napięcia powierzchniowego i łatwości tworzenia pęcherzyków. W CBB dwuwarstwę można obserwować pod kątem stycznym (<silna klasa="xfig">Rysunek 2), a kąt zwilżania między monowarstwą a dwuwarstwą jest mierzalny. Kąt ten reprezentuje równowagę między napięciami powierzchniowymi jednowarstwy i dwuwarstwy (równanie Younga: γbi = γmo cos(θ), gdzie γbi to napięcie dwuwarstwowe, γmo to napięcie jednowarstwowe, a θ to kąt zwilżania). Zmiany kąta zwilżania wskazują na zmiany napięcia dwuwarstwowego, biorąc pod uwagę, że napięcie monowarstwy jest oceniane na podstawie zmian kąta zwilżania w funkcji potencjału błonowego (równanie Younga-Lippmanna: γmo = Cm V2/4 (cos(θ0) - cos(θv)), gdzie Cm jest pojemnością membrany, V jest potencjałem błony, a θ0 i θv to kąty działania odpowiednio 0 i V mV)40,41,42. Kiedy dwie bąbelki są wystarczająco blisko, zbliżają się do siebie spontanicznie. Dzieje się tak za sprawą siły van der Waalsa, a ten dynamiczny proces możemy obserwować wizualnie w procesie powstawania CBB.
System CBB składa się z odrębnych faz: mianowicie fazy olejowej, pęcherzyków wody pokrytych monowarstwą i dwuwarstwy kontaktowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Przypominają one wiele faz obserwowanych w PLB, takich jak torus zawierający rozpuszczalnik wokół fazy dwuwarstwowej i cienka faza organiczna umieszczona na dwóch monowarstwach43,44. W CBB faza jednowarstwowa jest ciągła z dwuwarstwową ulotką, a cząsteczki lipidów łatwo dyfundują między monowarstwą a ulotką. Faza jednowarstwowa pokrywa większość powierzchni pęcherzyka, stanowiąc główną fazę, która służy jako rezerwuar lipidów. Ponieważ hydrofobowy ogon lipidów w monowarstwie rozciąga się na zewnątrz do fazy oleju luzem, wnętrze dwuwarstwowe lub rdzeń hydrofobowy otwiera się na fazę oleju luzem. W ten sposób substancja hydrofobowa wstrzyknięta do fazy olejowej w pobliżu dwuwarstwy jest w stanie łatwo uzyskać dostęp do wnętrza dwuwarstwy. Jest to technika perfuzji membranowej, którą niedawno opracowaliśmy45, dzięki której skład lipidowy w dwuwarstwie jest zmieniany gwałtownie (w ciągu sekundy) podczas jednokanałowych zapisów prądu. Odkryliśmy, że zawartość cholesterolu w dwuwarstwie może być odwracalnie kontrolowana poprzez włączanie i wyłączanie perfuzji cholesterolu45. W przypadku, gdy stężenie odpowiedniej substancji w warstwie jednowarstwowej i dwuwarstwowej jest różne, gradient stężenia odpowiedniej substancji jest natychmiast rozpuszczany w drodze dyfuzji, która jest znana jako efekt Marangoniego46,47. Z drugiej strony, przerzutniki na monowarstwach są powolne48,49,50.
Korzystając z metody CBB, dwuwarstwa jest tworzona w różnych warunkach fizykochemicznych, takich jak pH elektrolitu tak niskie jak 1 51, stężenie soli (K+, Na+, itd.) do 3 M, potencjał membranowy do ±400 mV, oraz temperatura systemu do 60 °C.
Istnieje kilka opcji tworzenia CBB i włączania do niego cząsteczek kanałowych. W celu wytworzenia monowarstwy na granicy faz woda-olej, lipidy są dodawane albo w rozpuszczalniku organicznym (metoda lipid-out; <silna klasa="xfig">Rysunek 4A, 4C) lub w bańce jako liposomy (metoda lipidowa; <silna klasa="xfig">Rysunek 4B, 4D). Warto zauważyć, że metoda lipid-in pozwala na tworzenie asymetrycznych błon15,32. Cząsteczki kanałowe rozpuszczalne w roztworze wodnym (np. peptydy tworzące kanały) są bezpośrednio dodawane do pęcherzyka (Rysunek 4A, B)52,53, podczas gdy białka kanałowe są odtwarzane w liposomach, które są następnie dodawane do pęcherzyka (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C, D). W tym przypadku tworzenie CBB metodą lipid-in dla peptydu kanałowego (politeonamid B (pTB); <silna klasa="xfig">Rysunek 4A) lub białko (kanał potasowy KcsA, <silna klasa="xfig">Rysunek 4C) jest pokazany.

<table><tbody><tr><td>Azolectin (L-&alpha;-fosfatydylocholina, typ IV-S)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P3644</td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik A/D</td><td>Cząsteczki molekularne</td><td>Digidata1550A</td><td></td></tr><tr><td>Elektroda Ag/AgCl</td><td>Warner</td><td>Instruments 64-1317</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator do kąpieli</td><td>Branson</td><td>M1800H-J</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-10C</td><td></td></tr><tr><td>Szklany aparat kapilarny</td><td>Harvard</td><td>30-0062</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Dojindo</td><td>342-01375</td><td></td></tr><tr><td>Szklany szkiełko z otworem</td><td>Matsunami Szklany</td><td></td> mikroskop odwrócony S339929 <td></td></tr> Stół izolacyjny <tr><td></td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Herz</td><td></td><td>TDI-86LA(Y)2</td><td></td></tr><tr><td>Mikro injenctor</td><td>Narishige</td><td>IM-11-2</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>EMM</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr>Uchwyt <td></td><td></td><td></td><td>na mikropipety</td></tr><tr><td>z sześciokątem</td><td>Nacalai</td><td>07819-32</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz z zaciskiem krosowym</td><td>HEKA</td><td>EPC800</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>POPC (1-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfocholina)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457</td><td></td></tr><tr><td>POPE (1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina )</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850757</td><td></td></tr><tr><td>POPG (1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol)) Avanti</td> <td>Polar Lipids</td><td>840457</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Nacalai</td><td>28514-75</td><td></td></tr><tr><td>Parownik obrotowy</td><td>Iwaki</td><td>REN-1000</td><td></td></tr><tr><td>Kwas bursztynowy</td><td>Nacalai</td><td>32402-05</td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>Buchi</td><td>V-100</td><td></td></tr></tbody></table>

eksperymenty dwuwarstwowe lipidowe z dwuwarstwami pęcherzyków kontaktowych dla zacisków krosowych

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

Dwuwarstwy lipidowe stanowią unikalną platformę eksperymentalną do badań funkcjonalnych kanałów jonowych, umożliwiając badanie interakcji kanał-błona pod różnymi składami lipidowymi błony. Wśród nich popularność zyskała dwuwarstwa interfejsu kropelkowego; Jednak duży rozmiar membrany utrudnia rejestrację niskiego poziomu elektrycznego szumu tła. Opracowaliśmy metodę dwuwarstwowej pęcherzyków kontaktowych (CBB), która łączy w sobie zalety płaskich metod dwuwarstwowych lipidów i patch-clamp, takie jak odpowiednio możliwość zmiany składu lipidowego i manipulowania mechaniką dwuwarstwową. Korzystając z konfiguracji do konwencjonalnych eksperymentów z zaciskiem krosowym, eksperymenty oparte na CBB można łatwo przeprowadzić. Krótko mówiąc, roztwór elektrolitu w szklanej pipecie jest wdmuchiwany do fazy rozpuszczalnika organicznego (heksadekanu), a ciśnienie pipety jest utrzymywane w celu uzyskania stabilnego rozmiaru pęcherzyka. Bańka jest spontanicznie wyłożona monowarstwą lipidową (czyste lipidy lub mieszane lipidy), która jest dostarczana z liposomów w pęcherzykach. Następnie dwa pęcherzyki wyłożone monowarstwą (o średnicy ~50 μm) na końcówce szklanych pipet są dokowane w celu utworzenia dwuwarstwy. Wprowadzenie liposomów odtworzonych przez kanał do pęcherzyka prowadzi do włączenia kanałów do dwuwarstwy, co pozwala na jednokanałowy zapis prądu ze stosunkiem sygnału do szumu porównywalnym z nagraniami patch-clamp. Łatwo tworzą się CBB o asymetrycznym składzie lipidowym. CBB jest wielokrotnie odnawiany poprzez wydmuchiwanie poprzednich pęcherzyków i tworzenie nowych. Na CBB mogą być nakładane różne zakłócenia chemiczne i fizyczne (np. perfuzja membrany i napięcie dwuwarstwowe). W niniejszym artykule przedstawiamy podstawową procedurę tworzenia CBB.

Typowa CBB miała średnicę 50 µm (Rysunek 5, 6), a swoista pojemność błony w heksadekanie wynosiła 0,65 µF/cm2. Rozmiar pęcherzyka był regulowany w sposób dowolny poprzez ciśnienie wewnątrz pęcherzyka. W przypadku, gdy do rejestracji niskoszumowej wymagane są małe pęcherzyki, średnica końcówki powinna być odpowiednio mała. Na przykład dla pęcherzyka o średnicy 50 µm średnica końcówki powinna wynosić 30 µm.
<p class="jove_content...

Tutaj prezentujemy protokół tworzenia dwuwarstw lipidowych za pomocą metody dwuwarstwowej pęcherzyków kontaktowych. Pęcherzyk wody jest wdmuchiwany do rozpuszczalnika organicznego, w wyniku czego na granicy faz woda-olej tworzy się monowarstwa. Dwie pipety są manipulowane w celu zadokowania pęcherzyków w celu utworzenia dwuwarstwy.

Eksperymenty dwuwarstwowe lipidowe z dwuwarstwami pęcherzyków kontaktowych dla zacisków krosowych

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...

Metoda dwuwarstwowa pęcherzyków kontaktowych jest techniką alternatywną dla konwencjonalnych dwuwarstw lipidowych. Ta metoda pozwala na bardziej wszechstronne wibracje przez membranę. Metoda CBB łączy w sobie zalety planarnej dwuwarstwy lipidowej i metody zacisku krosowego.Jako technikę dwuwarstwową lipidów można utworzyć CBB o dowolnym składzie lipidowym. Opracowaliśmy CBB do jednokanałowych nagrań prądowych o wysokim stosunku sygnału do szumu. Ta metoda pozwala na różnorodność drgań membrany i oferuje rozległą platformę typu do interfejsu membrany kanałowej.Każdy doświadczył bańki mydlanej. Podobne manewry są wykonywane w przypadku tworzenia CBB poprzez ręczne dostrajanie przyłożonego ciśnienia, a nie ustami. Ćwicz i ciesz się CBB.Aby wykonać tę procedurę, należy rozproszyć fosfolipidy w chloroformie w pożądanym stężeniu w kolbie okrągłodennej. Umieścić roztwór fosfolipidów na parowniku obrotowym podłączonym do butli z azotem gazowym. Obracać kolbę pod wpływem przepływu azotu w temperaturze pokojowej, aż pojawi się cienki film fosfolipidowy.Następnie umieść otwartą kolbę w eksykatorze podłączonym do pompy próżniowej. Za pomocą pompy próżniowej zasysać wnętrze eksykatora przez kilka godzin, aby dokładnie usunąć chloroform. Następnie dodać odpowiednią objętość roztworu elektrolitu do kolby i zawiesić fosfolipid, aby uzyskać zawiesinę fosfolipidów w proporcjach dwóch miligramów na mililitr.Utrwalaj zawiesinę przez 20 do 30 sekund za pomocą sonikatora do kąpieli, aby uzyskać wielowarstwową zawiesinę pęcherzykową. W celu przygotowania proteoliposomów zawierających białka kanałów jonowych należy dodać roztwór białka do wielowarstwowej zawiesiny pęcherzyków. I sonikować przez kilka sekund za pomocą soniku do kąpieli.Aby przygotować szklane pipety o dużej średnicy, umieść szklaną kapilę w ściągaczu do pipet i wykonaj mikropipetę z cienką, stożkową końcówką w dwóch etapach. Następnie umieść mikropipetę na mikrokuźni i przyłóż końcówkę mikropipety do filamentu platynowego w zwężającej się części o średnicy od 30 do 50 mikrometrów. Podgrzej krótko filament i natychmiast go wyłącz.Za pomocą wody destylowanej i etanolu oczyść powierzchnię szkiełka płytką studnią. Następnie nałóż odczynnik silikonowy na szkiełko podstawowe i pozwól odczynnikowi całkowicie wyschnąć na powietrzu. Następnie umieść szklane szkiełko na stoliku mikroskopu odwróconego.Dodaj 100 mikrolitrów heksadekanu do płytkiej studzienki szkiełka silikonowanego. Za pomocą strzykawki tuberkulinowej napełnić roztwór elektrolitu do połowy długości mikropipety. Następnie umieść mikropipetę na uchwycie mikropipety z portem ciśnieniowym, pozwalając elektrodzie drucianej z srebrem/chlorkiem srebra zanurzyć się w roztworze elektrolitu pipety.Podłącz jeden z uchwytów mikropipet do stopnia głowicy patch clamp amplifier, a drugi do uziemienia elektrycznego. Następnie podłącz mikrowtryskiwacz do portu ciśnieniowego uchwytu mikropipety. Ustawić mikropipetę w odpowiedniej pozycji nad stolikiem mikroskopu odwróconego za pomocą mikromanipulatora.Aby wyregulować potencjał przesunięcia elektrody, umieść jeden mikrolitr tego samego roztworu elektrolitu, który jest używany do napełniania mikropipety, na płaskiej powierzchni wokół płytkiego dołka szklanego szkiełka, aby utworzyć kopułę elektrolitu. Zanurz końcówki obu mikropipet w kopule elektrolitu. Następnie wyreguluj potencjał przesunięcia elektrody wzmacniacza patch clamp.Aby pobrać roztwór liposomu z końcówki, dodaj jeden mikrolitr roztworu liposomu na płaską powierzchnię wokół płytkiego dołka szkła szkiełkowego. Następnie umieść końcówkę mikropipety w kopule zawierającej liposom. Odessać roztwór zawierający liposom za pomocą mikroiniektora.Powtórzyć procedurę dla drugiej mirkopipety dla liposomów odtworzonych w kanale aspiracyjnym. Teraz umieść mikropipetę w sześciokątu w płytkiej studzience. Powoli wydmuchuj bańkę wody, zwiększając ciśnienie, aż bańka osiągnie pożądany rozmiar, a następnie utrzymuj to samo ciśnienie.Wyrzuć bańkę, przepuszczając końcówkę przez interfejs olej-powietrze, jeśli trudno jest utrzymać stabilny rozmiar pęcherzyka. Powtarzaj procedury, aż utworzą się dwie stabilne pęcherzyki. Nawiąż kontakt między dwoma bąbelkami.Dostosuj ciśnienie, aby utrzymać rozmiar pęcherzyka, ponieważ rozmiar może się stopniowo zmieniać nawet przy stałym ciśnieniu wewnątrz pęcherzyka. Ustaw potencjał membrany na odpowiednią wartość za pomocą wzmacniacza typu patch claim amplifier i poczekaj, aż pojawi się prąd kanału. W celu stabilnego tworzenia dwuwarstw lipidowych konieczne jest oczyszczenie bibułek.Preparat szklanej kapilary lub pipety należy dokładnie umyć i unikać zanieczyszczenia cząsteczkami detergentu. Po uformowaniu CBB cząsteczki kanału, albo w roztworze wodnym, albo w liposomie, zostały spontanicznie wprowadzone do dwuwarstwy w ciągu kilku do kilkudziesięciu minut. Indukcje kanałów potwierdzono stopniowym wzrostem amplitudy prądu pod wpływem przyłożonego potencjału membranowego.Dwuwarstwa utworzona metodą CBB może zostać rozłożona na dwie monowarstwy. Prąd kanału pTB pojawił się natychmiast po podłączeniu dwóch monowarstw. Prąd stawał się większy wraz ze wzrostem styku, amplituda prądu była zsynchronizowana z manipulacją odłączania CBB.Jeśli liczba wydmuchiwanych pęcherzyków wzrasta, stężenie lipidów w roztworze wodnym zmniejsza się i monowarstwa nie tworzy się. Następnie spróbuj zmniejszyć nacisk na sekcję liposomową. Po ustaleniu tworzenia CBB i rekonstytucji kanału można spróbować zmienić skład roztworu wodnego i membrany poprzez obfitowanie lub wstrzykiwanie substancji hydrofilowych lub hydrofobowych.Metoda CBB otworzyła wszechstronne możliwości badania wzajemnych zależności między kanałem a membraną.

lipid-bilayer-experiments-with-contact-bubble-bilayers-for-patch

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wsparte płaskie dwuwarstwy są potężnymi narzędziami, które mogą być wykorzystywane do modelowania oddziaływań molekularnych w synapsie immunologicznej. W niniejszej pracy przedstawiamy metody zakotwiczenia białek adhezyjnych komórek, o których wiadomo, że modulują one tworzenie synaps, w górnej warstwie dwuwarstwy lipidowej oraz wizualizacji procesu tworzenia synapsy za pomocą mikroskopii TIRF.<br...

Wspierane dwuwarstwy płaskie do tworzenia i badania synaps immunologicznych oraz kinaps

Funkcja białek błonowych jest regulowana przez skład lipidowy błony komórkowej. Niniejszy artykuł wideo szczegółowo opisuje sposób tworzenia łatki za pomocą elektrod do łatki dwuwarstwowej, a także wykorzystanie kanałów gramicydyny jako reporterów zmienionych właściwości błony.

Metody pojedynczych cząsteczek do monitorowania zmian właściwości elastycznych dwuwarstwy

Planarne dwuwarstwy lipidowe, nazywane również sztucznymi dwuwarstwami lipidowymi, pozwalają na badanie kanałów przewodzących jony w ściśle określonym środowisku. W niniejszym materiale prezentujemy poszczególne kroki niezbędne do przygotowania komory do dwuwarstw, elektrod oraz sposób sprawdzenia, czy dwuwarstwa nadaje się do pomiarów pojedynczych kanałów.

Przygotowanie sztucznych dwuwarstw do eksperymentów elektrofizjologicznych

W tym filmie demonstrujemy procedurę badania organizacji septyny na dwuwarstwie lipidowej na podłożu szklanym in vitro przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem.

Planarny dwuwarstwowy test lipidowy: oparta na mikroskopii technika in vitro do badania składania septyny na mimikach błon biologicznych

Przekształcanie funkcjonalnych białek błonowych w gigantyczne liposomy o określonym składzie jest potężnym podejściem w połączeniu z elektrofizjologią patch-clamp. Jednak konwencjonalna produkcja gigantycznych liposomów może być niezgodna ze stabilnością białka.  Opisujemy protokoły wytwarzania gigantycznych liposomów z czystych lipidów lub małych liposomów zawierających kanały jonowe.

Preparat liposomów olbrzymich do obrazowania i elektrofizjologii patch-clamp

Bakteryjne kanały mechanowrażliwe mogą być używane jako przetworniki mechanoelektryczne w urządzeniach biomolekularnych.  Dwuwarstwy interfejsu kropelkowego (DIB), inspirowane komórkami elementami budulcowymi takich urządzeń, stanowią nowe platformy do włączania i stymulowania kanałów mechanowrażliwych.  W tym miejscu demonstrujemy nową metodę tworzenia DIB opartą na mikropipetach, umożliwiającą badanie kanałów mechanoczułych pod wpływem stymulacji mechanicznej.

Wielofunkcyjna, oparta na mikropipetach metoda wprowadzania i stymulacji mechanowrażliwych kanałów jonowych bakterii w dwuwarstwach interfejsu kropelkowego

Ten protokół szczegółowo opisuje użycie systemu ogrzewania sterowanego temperaturą sprzężenia zwrotnego do promowania składania monowarstw lipidowych i tworzenia dwuwarstwowych warstw na granicy kropelek dla lipidów o podwyższonych temperaturach topnienia, oraz pomiary pojemności w celu scharakteryzowania zmian w membranie sterowanych temperaturą.

Montaż i charakterystyka dwuwarstwy z powierzchnią kropelkową w kontrolowanej temperaturze

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Tutaj przedstawiono protokół do wykonywania i analizy wiązania, mobilności i składania pojedynczych cząsteczek na sztucznych zatłoczonych błonach lipidowych za pomocą mikroskopii smTIRF (smTIRF) z wykorzystaniem pojedynczej cząsteczki całkowitego wewnętrznego odbicia.

Dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach

Tutaj opracowano dwuwarstwowy system lipidowy oparty na nanobarach, aby zapewnić syntetyczną membranę o określonej krzywiźnie, która umożliwia charakteryzację białek z możliwością wykrywania krzywizny in vitro.

Dwuwarstwowy system lipidowy oparty na nanobarach do badania białek wykrywających krzywiznę błony in vitro

Przedstawiono protokół eksperymentalny do składania, stymulacji elektrycznej i analizy kropli dwuwarstwy lipidowych zmodyfikowanych gramicydyną A. Relacje struktura-funkcja lipidów i białek są ilościowo określane poprzez pomiar zmian w obszarze błony, przepływie jonowym i przewodnictwie pojedynczego kanału oraz odniesienie tych reakcji do zmian przypominających plasticzne zmiany w przewodnictwie jonowym w modelu błony inspirowanym synapsami elektrycznymi.

Charakterystyka struktury i funkcji błony lipidowo-białkowej z wykorzystaniem warstw dwubiegunowych interfejsu kropelkowego

Poznaj metodę dwuwarstw pęcherzyków kontaktowych (CBB) do tworzenia lipidowych błon dwuwarstwowych w biologii i biofizyce. Technika ta umożliwia rejestrację prądów pojedynczych kanałów jonowych z wysokim stosunkiem sygnału do szumu.

Eksperymenty dwuwarstwowe lipidowe z dwuwarstwami pęcherzyków kontaktowych dla zacisków krosowych

Przeglądaj więcej filmów