Eksperymenty dwuwarstwowe lipidowe z dwuwarstwami pęcherzyków kontaktowych dla zacisków krosowych
January 16th, 2019
Tutaj prezentujemy protokół tworzenia dwuwarstw lipidowych za pomocą metody dwuwarstwowej pęcherzyków kontaktowych. Pęcherzyk wody jest wdmuchiwany do rozpuszczalnika organicznego, w wyniku czego na granicy faz woda-olej tworzy się monowarstwa. Dwie pipety są manipulowane w celu zadokowania pęcherzyków w celu utworzenia dwuwarstwy.
Metoda dwuwarstwowa pęcherzyków kontaktowych jest techniką alternatywną dla konwencjonalnych dwuwarstw lipidowych. Ta metoda pozwala na bardziej wszechstronne wibracje przez membranę. Metoda CBB łączy w sobie zalety planarnej dwuwarstwy lipidowej i metody zacisku krosowego.
Jako technikę dwuwarstwową lipidów można utworzyć CBB o dowolnym składzie lipidowym. Opracowaliśmy CBB do jednokanałowych nagrań prądowych o wysokim stosunku sygnału do szumu. Ta metoda pozwala na różnorodność drgań membrany i oferuje rozległą platformę typu do interfejsu membrany kanałowej.
Każdy doświadczył bańki mydlanej. Podobne manewry są wykonywane w przypadku tworzenia CBB poprzez ręczne dostrajanie przyłożonego ciśnienia, a nie ustami. Ćwicz i ciesz się CBB.
Aby wykonać tę procedurę, należy rozproszyć fosfolipidy w chloroformie w pożądanym stężeniu w kolbie okrągłodennej. Umieścić roztwór fosfolipidów na parowniku obrotowym podłączonym do butli z azotem gazowym. Obracać kolbę pod wpływem przepływu azotu w temperaturze pokojowej, aż pojawi się cienki film fosfolipidowy.
Następnie umieść otwartą kolbę w eksykatorze podłączonym do pompy próżniowej. Za pomocą pompy próżniowej zasysać wnętrze eksykatora przez kilka godzin, aby dokładnie usunąć chloroform. Następnie dodać odpowiednią objętość roztworu elektrolitu do kolby i zawiesić fosfolipid, aby uzyskać zawiesinę fosfolipidów w proporcjach dwóch miligramów na mililitr
.Utrwalaj zawiesinę przez 20 do 30 sekund za pomocą sonikatora do kąpieli, aby uzyskać wielowarstwową zawiesinę pęcherzykową. W celu przygotowania proteoliposomów zawierających białka kanałów jonowych należy dodać roztwór białka do wielowarstwowej zawiesiny pęcherzyków. I sonikować przez kilka sekund za pomocą soniku do kąpieli.
Aby przygotować szklane pipety o dużej średnicy, umieść szklaną kapilę w ściągaczu do pipet i wykonaj mikropipetę z cienką, stożkową końcówką w dwóch etapach. Następnie umieść mikropipetę na mikrokuźni i przyłóż końcówkę mikropipety do filamentu platynowego w zwężającej się części o średnicy od 30 do 50 mikrometrów. Podgrzej krótko filament i natychmiast go wyłącz
.Za pomocą wody destylowanej i etanolu oczyść powierzchnię szkiełka płytką studnią. Następnie nałóż odczynnik silikonowy na szkiełko podstawowe i pozwól odczynnikowi całkowicie wyschnąć na powietrzu. Następnie umieść szklane szkiełko na stoliku mikroskopu odwróconego.
Dodaj 100 mikrolitrów heksadekanu do płytkiej studzienki szkiełka silikonowanego. Za pomocą strzykawki tuberkulinowej napełnić roztwór elektrolitu do połowy długości mikropipety. Następnie umieść mikropipetę na uchwycie mikropipety z portem ciśnieniowym, pozwalając elektrodzie drucianej z srebrem/chlorkiem srebra zanurzyć się w roztworze elektrolitu pipety.
Podłącz jeden z uchwytów mikropipet do stopnia głowicy patch clamp amplifier, a drugi do uziemienia elektrycznego. Następnie podłącz mikrowtryskiwacz do portu ciśnieniowego uchwytu mikropipety. Ustawić mikropipetę w odpowiedniej pozycji nad stolikiem mikroskopu odwróconego za pomocą mikromanipulatora.
Aby wyregulować potencjał przesunięcia elektrody, umieść jeden mikrolitr tego samego roztworu elektrolitu, który jest używany do napełniania mikropipety, na płaskiej powierzchni wokół płytkiego dołka szklanego szkiełka, aby utworzyć kopułę elektrolitu. Zanurz końcówki obu mikropipet w kopule elektrolitu. Następnie wyreguluj potencjał przesunięcia elektrody wzmacniacza patch clamp.
Aby pobrać roztwór liposomu z końcówki, dodaj jeden mikrolitr roztworu liposomu na płaską powierzchnię wokół płytkiego dołka szkła szkiełkowego. Następnie umieść końcówkę mikropipety w kopule zawierającej liposom. Odessać roztwór zawierający liposom za pomocą mikroiniektora.
Powtórzyć procedurę dla drugiej mirkopipety dla liposomów odtworzonych w kanale aspiracyjnym. Teraz umieść mikropipetę w sześciokątu w płytkiej studzience. Powoli wydmuchuj bańkę wody, zwiększając ciśnienie, aż bańka osiągnie pożądany rozmiar, a następnie utrzymuj to samo ciśnienie.
Wyrzuć bańkę, przepuszczając końcówkę przez interfejs olej-powietrze, jeśli trudno jest utrzymać stabilny rozmiar pęcherzyka. Powtarzaj procedury, aż utworzą się dwie stabilne pęcherzyki. Nawiąż kontakt między dwoma bąbelkami.
Dostosuj ciśnienie, aby utrzymać rozmiar pęcherzyka, ponieważ rozmiar może się stopniowo zmieniać nawet przy stałym ciśnieniu wewnątrz pęcherzyka. Ustaw potencjał membrany na odpowiednią wartość za pomocą wzmacniacza typu patch claim amplifier i poczekaj, aż pojawi się prąd kanału. W celu stabilnego tworzenia dwuwarstw lipidowych konieczne jest oczyszczenie bibułek.
Preparat szklanej kapilary lub pipety należy dokładnie umyć i unikać zanieczyszczenia cząsteczkami detergentu. Po uformowaniu CBB cząsteczki kanału, albo w roztworze wodnym, albo w liposomie, zostały spontanicznie wprowadzone do dwuwarstwy w ciągu kilku do kilkudziesięciu minut. Indukcje kanałów potwierdzono stopniowym wzrostem amplitudy prądu pod wpływem przyłożonego potencjału membranowego.
Dwuwarstwa utworzona metodą CBB może zostać rozłożona na dwie monowarstwy. Prąd kanału pTB pojawił się natychmiast po podłączeniu dwóch monowarstw. Prąd stawał się większy wraz ze wzrostem styku, amplituda prądu była zsynchronizowana z manipulacją odłączania CBB.
Jeśli liczba wydmuchiwanych pęcherzyków wzrasta, stężenie lipidów w roztworze wodnym zmniejsza się i monowarstwa nie tworzy się. Następnie spróbuj zmniejszyć nacisk na sekcję liposomową. Po ustaleniu tworzenia CBB i rekonstytucji kanału można spróbować zmienić skład roztworu wodnego i membrany poprzez obfitowanie lub wstrzykiwanie substancji hydrofilowych lub hydrofobowych.
Metoda CBB otworzyła wszechstronne możliwości badania wzajemnych zależności między kanałem a membraną.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia metodę Kontaktowej Bąbelkowej Dwuwarstwy (CBB) do tworzenia dwuwarstew lipidowych, oferując innowacyjną alternatywę dla konwencjonalnych technik. Metoda umożliwia wszechstronne wibracje błony i wysokiej jakości rejestracje prądów pojedynczych kanałów, poprawiając badania interakcji kanał-błona.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biofizyka
- Elektrofizjologia
- Technologia błon lipidowych
Tło
- Dwuwarstwy lipidowe są niezbędne do badania białek błonowych.
- Konwencjonalne metody mają ograniczenia w zakresie elastyczności i stabilności.
- Metoda CBB łączy zalety płaskich dwuwarstew lipidowych i technik patch clamp.
- Ta technika umożliwia wysokiej jakości rejestrację aktywności kanałów jonowych.
Cel badania
- Opracowanie solidnej metody tworzenia dwuwarstew lipidowych z wykorzystaniem podejścia bąbelkowego.
- Możliwość rejestracji pojedynczych kanałów z poprawioną jakością.
- Badanie dynamiki błony i interakcji kanał-błona.
Zastosowane metody
- Metoda CBB wykorzystuje kontrolowane manipulowanie bąbelkami wodnymi w środowisku organicznym do tworzenia dwuwarstew.
- Fosfolipidy są przygotowywane i sonikowane, aby utworzyć wielowarstwowe wezykuły, po czym następuje włączenie białek kanałów jonowych.
- Mikropipety są wytwarzane dla precyzyjnego stosowania i stabilizacji bąbelków podczas tworzenia dwuwarstwy.
- Ustawienia eksperymentalne obejmują wzmacniacze patch clamp do monitorowania prądów kanałów jonowych po uformowaniu dwuwarstwy.
Główne wyniki
- Metoda CBB skutecznie wspiera włączanie białek kanałów do dwuwarstew, co potwierdzają zmiany w amplitudzie prądu.
- Utworzono stabilne dwuwarstwy, demonstrując zdolność do rejestracji prądów pojedynczych kanałów.
- Metoda pokazała, że dostosowanie wielkości bąbelków może wpływać na stabilność błony i ciągłość prądu.
Wnioski
- Metoda CBB przedstawia znaczny postęp w tworzeniu dwuwarstew lipidowych, umożliwiając wszechstronne zastosowania w badaniach elektrofizjologicznych.
- To innowacyjne podejście poprawia nasze rozumienie dynamiki kanał-błona.
- Wyniki podkreślają potencjał dostosowania technologii dwuwarstew lipidowych dla różnych warunków eksperymentalnych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The Contact Bubble Bilayer (CBB) method addresses a key challenge in ion channel research by enabling high signal-to-noise ratio recordings while allowing precise control over lipid composition and membrane mechanics. This capability supports mechanistic de-risking of therapeutic targets by clarifying channel-membrane interactions under physiologically relevant conditions. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing a reproducible platform for functional validation of ion channel targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by studying ion channel function in defined lipid environments.
- Operational Value: Supports functional target validation through reproducible single-channel current measurements with low electrical noise.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking by elucidating how lipid composition modulates channel activity and stability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated lipid bilayer systems for downstream compound screening by incorporating channel-reconstituted liposomes.
- Operational Value: Enables assay standardization via controlled bubble formation and consistent bilayer renewal.
- Scalability: Supports platform reuse through repeated CBB formation and disruption cycles.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains relevance from discovery through preclinical work by modeling disease-relevant lipid compositions.
- Mechanistic De-risking: Allows assessment of how membrane perturbations affect channel function, informing safety and efficacy predictions.
- Biomarker Alignment: Supports identification of lipid-dependent channel phenotypes that may correlate with clinical responses.
Pipeline & Workflow Integration
The CBB method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, providing a lipid-controllable platform for ion channel characterization prior to compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled variation of membrane lipid composition.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible bilayer formation and stable ion channel incorporation.
- Analytics: Provides quantitative single-channel current readouts that allow comparison of channel behavior under different conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by enabling study of channel-membrane interactions in disease-relevant lipid environments.
- Enterprise Reuse: Functions as a renewable capability rather than a single-use technique, supporting sustained use across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in channel-membrane interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through controlled bubble size maintenance and bilayer renewal.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable functional data on ion channel targets early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of ion channel programs based on validated membrane-dependent activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid handling, electrophysiology, and microfluidic manipulation.
- Depends on patch-clamp amplifiers, glass capillary pullers, and microinjectors for bubble formation and pressure control.
- Necessitates cross-team standardization of lipid preparation, bubble size control, and cleaning protocols.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different ion channel types or lipid mixtures.
- Includes practical limitations such as the need for meticulous bubble size maintenance and contamination avoidance during pipette preparation.
