Strategie optymalizacji pozyskiwania danych z kriogenicznej tomografii elektronowej
19 marca 2021
Rosnące zapotrzebowanie na gromadzenie danych na dużą skalę w kriogenicznej tomografii elektronowej wymaga wysokoprzepustowych procedur akwizycji obrazów. Opisano tutaj protokół, który wdraża najnowsze osiągnięcia zaawansowanych strategii akwizycji mających na celu maksymalizację efektywności czasowej i przepustowości gromadzenia danych tomograficznych.
Konfiguracja sesji zbierania danych na dużą skalę jest czasochłonną procedurą, która może znacznie skrócić pozostały czas mikroskopu dostępny na akwizycję serii pochylenia. Metoda ta umożliwia szybką konfigurację automatycznej akwizycji danych tomografii na dużą skalę w celu maksymalizacji efektywności czasowej eksperymentów tomograficznych, które wymagają starannego wyboru celów akwizycji. Zacznij od otwarcia fikcyjnej instancji SerialEM.
Po zmapowaniu pierwszego kwadratu siatki użyj opcji scalania w menu nawigatora SerialEM, aby zobaczyć montaż w fikcyjnej instancji SerialEM. Kliknij dwukrotnie okno nawigatora, aby otworzyć kwadratową mapę siatki. Przeszukaj mapę i użyj fikcyjnej opcji nawigatora SerialEM, dodaj punkty, aby dodać punkty akwizycji obrazu w interesującym Cię celu.
Po zmapowaniu nowych kwadratów zapisz plik nawigatora i ponownie scal nawigatora. Kontynuuj, aż wszystkie kwadraty siatki zostaną zmapowane. Ponownie scal plik nawigatora z fikcyjną instancją SerialEM.
Uruchom skrypt map wirtualnych Pi EM z fikcyjnego menu SerialEM. Wybierz narzędzia i wybierz wirtualne mapy kotwic. Może to zająć trochę czasu w zależności od rozmiaru i ilości kwadratowych map siatki, a także kategoryzacji map widoku i podglądu.
Aby zapewnić prawidłowe działanie mikroskopu, należy użyć tej samej konfiguracji powiększenia i rozmiaru wiązki do pozyskiwania danych w następującej kolejności. Uruchom wyrównanie bez komy SerialEM za pomocą CTF. Wstaw i wyśrodkuj otwór obiektywu.
Uruchom SerialEM poprawny astygmatyzm za pomocą CTF i szybkiego dostrajania GIF. W programie SerialEM otwórz nowy plik nawigatora. Odznacz wszystkie punkty A.
Wybierz pierwsze mapy widoków. Wybierz opcję zwiń. Kliknij dwukrotnie A i odznacz zwiń.
Wybierz pierwszą pozycję na mapie widoku. Naciśnij Shift T, a następnie wybierz ostatnią pozycję na mapie widoku i ponownie naciśnij Shift T. Wybierz obrazy z pojedynczą ramką we właściwościach pliku, aby otworzyć okno dialogowe.
W następnym oknie dialogowym właściwości pliku wybierz żądane parametry zgodnie z potrzebami obrazowania i ustawieniami urządzenia. Po wyświetleniu monitu podaj nazwę z numerem i kliknij Zapisz. Ustaw regulator serii przechyłu na pierwszą pozycję TS.
Po zakończeniu kliknij przycisk OK, aby ustawić te parametry dla wszystkich serii pochylenia po tym elemencie akwizycji. Wszystkie mapy podglądu są teraz wybierane jako TS z numerowaną nazwą pliku. W razie potrzeby ustaw odległość ostrości/śledzenia dla każdego celu.
Kliknij dwukrotnie mapę widoku, aby ją załadować. Wybierz podgląd mapy z listy nawigatora. Następnie wybierz opcję edytuj fokus w oknie nawigatora.
Na panelu sterowania o niskiej dawce usuń zaznaczenie opcji Obróć oś międzyobszarową, aby ustawić próbę i ustawić ostrość wzdłuż osi pochylenia stolika. Kliknij żądany region na załadowanej mapie widoków, aby ustawić pozycję próbną ostrości dla tej serii pochylenia i upewnij się, że element nawigatora ma ustawiony TSP. Powtórz procedurę dla wszystkich elementów.
Edytuj zakres ostrości w skrypcie PreTomo, który jest uruchamiany przed każdą serią pochylenia. W menu serii pochylania SerialEM zaznacz opcję uruchom skrypt w TS i wybierz numer skryptu DuringTomo podczas każdego pochylenia. Sprawdź poziom azotu w zbiorniku i czy wybrano opcję wyłączenia turbosprężarki automatycznej ładowarki.
Sprawdź wolne miejsce w pamięci masowej. W menu Plik SerialEM usuń zaznaczenie opcji ciągłego zapisywania dla pliku dziennika. Każda seria pochyleń otrzyma swój własny plik dziennika.
Po kliknięciu na pozycje w menu nawigacyjnym uruchom skrypt PreTomo. Wybierz zadanie podstawowe, aby uzyskać serię pochylenia, a następnie wybierz pozycję uruchom skrypt po PostTomo. Wybierz zamknij zawory kolumny na końcu i wyślij wiadomość e-mail na końcu, a następnie kliknij przejdź.
Na siatce mapy wybrano 71 odpowiednich kwadratów w mniejszym powiększeniu. Uzyskano mapy o średnim powiększeniu z ustawieniami pozwalającymi na bezpośrednią wizualizację i identyfikację interesującej nas próbki, w tym przypadku koronawirusów. Czas akwizycji wynosił trzy minuty na kwadrat, w sumie trzy godziny i 45 minut.
Gdy tworzona była pierwsza mapa kwadratowa, na oddzielnym komputerze otwarto fikcyjną instancję SerialEM w celu wizualizacji mapy kwadratowej i dodania punktów na celach odpowiednich do akwizycji serii pochylenia. Skonfigurowano niską dawkę SerialEM, a widok referencyjny i obrazy podglądu zostały wykonane i zapisane jako mapy. Te ostatnie mapy mogą być następnie natychmiast użyte w fikcyjnej instancji SerialEM do wygenerowania wirtualnego widoku i wirtualnego podglądu z odpowiednich kwadratowych obrazów mapy.
Wirtualne mapy widoków zostały wykorzystane do wstępnego wyśrodkowania celu, a następnie do końcowego wyśrodkowania wykonanego przy rzeczywistym powiększeniu serii nachylenia przy użyciu wirtualnej mapy podglądu. Użytkownicy powinni dać sobie dużo czasu na zapoznanie się z przykładowym krajobrazem. Po przeszukaniu kilku map można lepiej wyczuć obszary dobrej jakości, z których można zbierać dane.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół zaprojektowany w celu poprawy wydajności kriogenicznej tomografii elektronownej, rozwiązując problem potrzeby dużej skali zbierania danych. Metoda koncentruje się na optymalizacji ustawienia obrazu, aby zapewnić wysoką wydajność podczas zbierania serii nachyleń, znacznie poprawiając wykorzystanie mikroskopu.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Kriogenczna tomografia elektronowa
- Wysokowydajne zbieranie obrazów
- Techniki mikroskopowe
Tło
- Rosnące zapotrzebowanie na dużą skalę zbierania danych
- Czasochłonne konfiguracje mogą ograniczać efektywny czas pracy mikroskopu
- Ważność efektywnych metod zbierania danych tomograficznych
Stosowane metody
- Protokół automatycznego zbierania danych tomograficznych
- Wykorzystanie SerialEM do nawigacji mapowania kwadratów siatki
- Implementacja wirtualnych map dla centralizacji celu
Główne wyniki
- Zidentyfikowano 71 kwadratów siatki do zbierania danych
- Efektywne zbieranie danych z łącznym czasem zbierania 3 godziny i 45 minut
- Zdemonstrowano zdolność do efektywnego wizualizacji próbek koronawirusa
Wnioski
- To badanie ilustruje uproszczone podejście do wysokowydajnego obrażania w tomografii
- Wyniki podkreślają znaczenie maksymalizacji efektywności zbierania w badaniach biologicznych
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Efficient cryogenic electron tomography (cryoET) data acquisition is critical for high-resolution structural biology, enabling rapid and reproducible 3D analysis of macromolecular complexes. Automated workflows using SerialEM and PyEM streamline grid mapping and target selection, maximizing microscope utilization and reducing operational bottlenecks. These advances directly impact early discovery and structural validation pipelines in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Accelerates structural interrogation of biological assemblies in near-native states.
- Supports functional target validation by enabling high-throughput acquisition of tilt series.
- Improves predictive confidence in macromolecular complex analysis for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Enables preparation of validated 3D structural datasets for downstream screening workflows.
- Standardizes acquisition routines, enhancing reproducibility and quantitative output quality.
- Facilitates scalable, automated data collection for reliable compound evaluation platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural data acquisition with disease-relevant systems, such as viral particles.
- Ensures continuity from discovery-stage imaging to preclinical structural validation.
- Reduces risk in translational research by supporting robust, high-throughput data generation.
Pipeline & Workflow Integration
This automated cryoET workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting structural hypothesis testing and target de-risking.
- Discovery Biology: Enables rapid hypothesis testing and pathway clarification via high-resolution 3D imaging.
- Screening: Provides reproducible, quantitative tilt series datasets for assay readiness.
- Analytics: Delivers standardized measurements and readouts for comparative structural analysis.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical continuity when imaging disease-relevant complexes.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for automated tomography data acquisition across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput of data acquisition sessions.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by maximizing instrument time.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryoEM instrumentation and data analysis software.
- Depends on access to high-end transmission electron microscopes and computational infrastructure.
- Demands cross-team standardization of acquisition parameters and data management practices.
- May require adaptation for different sample types or grid formats.
- Operational limitations include manual input for initial target selection and quality assessment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:38
Selecting the Targets
1:31
Generate Virtual Maps
2:07
Microscope Tuning
2:43
Set up Navigator
4:05
Set the Focus/Track Positions
5:00
Set up Additional Scripts
5:27
Run
6:19
Results: Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition
7:46
Conclusion
