Name: Strategie optymalizacji pozyskiwania danych z kriogenicznej tomografii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Poznaj strategie optymalizacji pozyskiwania danych z kriogenicznej tomografii elektronowej przy użyciu automatyzacji SerialEM i PyEM. Ta metoda znacząco zwiększa efektywność czasową mikroskopii i usprawnia wybór celów akwizycji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za wsparcie ze strony Zakładu Biologii Strukturalnej i Obliczeniowej oraz Głównego Ośrodka Mikroskopii Elektronowej w Europejskim Laboratorium Biologii Molekularnej w Heidelbergu, Niemcy oraz od iNEXT-Discovery (numer projektu 871037). Jesteśmy niezmiernie wdzięczni za doskonałe wsparcie ze strony autora pakietu oprogramowania SerialEM, profesora Davida Mastronarde. Dziękujemy również Hermanowi Fungowi za krytyczną lekturę manuskryptu.

Protokół opisany tutaj jest częścią bardziej obszernego dokumentu opracowanego przez platformę EMBL CryoEM Service, który zawiera dokładne instrukcje krok po kroku i zrzuty ekranu ilustrujące całą procedurę typowej sesji krioET, w tym ładowanie próbek, mapowanie siatki, strojenie mikroskopu, ustawianie punktów akwizycji i automatyczne zbieranie danych. Pełny protokół można pobrać pod następującym linkiem: https://oc.embl.de/index.php/s/9OuTl8AazDkCNq0/download
1. Wymagania wstępne
<ol>
	<li>Zainstaluj SerialEM w wersji 3.8 i skonfiguruj do sterowania mikroskopem i detektorem (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/betaHlp/html/setting_up_serialem.htm).</li>
	<li>Zainstaluj fikcyjne wystąpienie SerialEMversion 3.8 (https://sphinx-emdocs.readthedocs.io/en/latest/serialEM-note-setup-dummy.html).</li>
	<li>Zainstaluj PyEM (https://git.embl.de/schorb/pyem).</li>
</ol>
2. Mapowanie siatki
<ol>
	<li>Załaduj kasetę z siatkami do automatycznego podajnika mikroskopu.</li>
	<li>Skonfiguruj warunki obrazowania odpowiednie do mapowania całej siatki. Zrób to przy możliwie najmniejszym powiększeniu, biorąc pod uwagę pole widzenia na zastosowanym detektorze (EFTEM SA 2250x). Zapisz warunki obrazowania jako stan obrazowania SerialEM, aby ułatwić późniejsze użycie.</li>
	<li>Skonfiguruj pełny montaż
	<ol>
		<li>Otwórz menu SerialEM Navigator.</li>
		<li>Wybierz opcję Montaż i siatki.</li>
		<li>Wybierz opcję Skonfiguruj pełny montaż.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom skrypt Grid_Mapping. Pozwól skryptowi czekać, aż autoloader ostygnie; Wykonaj inwentaryzację, a następnie zmapuj każdą siatkę, którą znalazła procedura inwentaryzacji. Wprowadź wiadomość e-mail za pomocą menu serii Tilt, aby umożliwić skryptowi wygodne wysłanie wiadomości e-mail po zakończeniu.</li>
	<li>Zapisz nawigatora.</li>
	<li>Sprawdź wszystkie mapy siatki w SerialEM Navigator i wybierz siatkę, która ma być mapowana dalej przy większym powiększeniu. 
	UWAGA: Wiele TEMów wyposażonych w system automatycznego ładowania pokaże obrót siatki po ponownym załadowaniu. Najlepiej jest ponownie zmapować dowolną siatkę po jej ponownym załadowaniu. Alternatywne systemy zwykle doświadczają tylko pewnych przesunięć, które można skorygować w SerialEM za pomocą procedury Shift To Marker.</li>
</ol>
3. Ustaw niską dawkę SerialEM
<ol>
	<li>Ustaw powiększenie trybów SerialEM low dose View i Preview (jest to wymagane w kroku 6).</li>
	<li>Uzyskaj obraz widoku i zapisz go jako mapę w Nawigatorze.</li>
	<li>Pobierz obraz podglądu i zapisz go jako mapę w Nawigatorze.
	<ol>
		<li>Ustaw oba tryby na to samo kategoryzowanie (sugerowane jest kategoryzowanie 4). Pozwala to na zapisanie dwóch map w jednym stosie obrazów.</li>
		<li>W oknie SerialEM Navigator zmień etykietę mapy widoku na Widok, a etykietę mapy podglądu na Podgląd.</li>
		<li>Zapisz i zamknij plik nawigatora. 
		UWAGA: Dla początkowych obrazów Podgląd i Podgląd nie jest wymagany żaden cel, PyEM użyje jedynie ich ustawień obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Mapowanie kwadratów siatki
<ol>
	<li>Skonfiguruj warunki obrazowania, aby zmapować kwadraty siatki. Bardzo ważne jest, aby móc zobaczyć interesującą nas próbkę i rozkład koralików odniesienia. Aby zapewnić optymalny kontrast dla map kwadratowych z siatką, wykonaj następujące czynności.
	<ol>
		<li>Wstaw przysłonę obiektywu.</li>
		<li>W razie potrzeby włóż szczelinę filtra energii.</li>
		<li>Użyj rozmycia -100 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekran dla dobrych kwadratów siatki nadających się do dalszego mapowania. Po oględzinach kwadratowych z mapy siatkowej wykonaj zdjęcia próbne kwadratu z warunkami obrazowania, które mają być użyte na mapach kwadratów siatki.</li>
	<li>Po zidentyfikowaniu prawidłowego kwadratu należy oznaczyć jego środek na obrazie mapy siatki za pomocą funkcji Dodaj punkty w nawigatorze SerialEM.</li>
	<li>Po dodaniu wszystkich punktów w Nawigatorze SerialEM naciśnij Shift + A w pierwszym punkcie, a następnie naciśnij Shift + A w ostatnim punkcie. 
	UWAGA: Wszystkie dodane punkty są teraz oznaczone literą A, co oznacza, że wszystkie są punktami zdobycia.</li>
	<li>Naciśnij Shift + N (utwórz nowy plik w elemencie) w pierwszym punkcie, a następnie ponownie w ostatnim punkcie. W wyświetlonym oknie dialogowym wybierz opcję Montaged Images (Obrazy montażowe).</li>
	<li>Gdy pojawi się okno dialogowe montażu, ustaw rozmiar montażu, który obejmuje jeden kwadrat siatki. Zależy to od powiększenia i rozmiaru siatki użytych siatek i zazwyczaj wymaga montaży od 2 x 2 do 4 x 4. Nadaj mu nazwę z numerem (np. squaremap_01.mrc), aby umożliwić SerialEM wygodne automatyczne numerowanie wszystkich plików na kwadracie siatki.</li>
	<li>Rozpocznij mapowanie siatki, otwierając menu SerialEM Navigator i kliknij Zdobądź w elementach.</li>
	<li>Z wyskakującego menu wybierz następujące opcje.
	<ol>
		<li>Wybierz opcję Przybliżona eucentryczność.</li>
		<li>Wybierz opcję Pobierz obraz mapy.</li>
		<li>Wybierz opcję Zamknij zawory kolumny na końcu.</li>
		<li>Wybierz pozycję Wyślij wiadomość e-mail na końcu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Wybór celów
<ol>
	<li>Otwórz fikcyjną instancję SerialEM. Można to skonfigurować na komputerze SerialEM, który steruje mikroskopem, lub na innym komputerze (pomocniczym), jeśli oba komputery mają wspólne połączenie sieciowe.</li>
	<li>Po zmapowaniu pierwszego kwadratu siatki użyj opcji Scal w menu SerialEM Navigator, aby zobaczyć montaż w fikcyjnej instancji SerialEM.</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie okno Nawigatora, aby otworzyć kwadratową mapę siatki.</li>
	<li>Przeszukaj mapę i użyj fikcyjnej opcji SerialEM Navigator Dodaj punkty, aby dodać punkty akwizycji obrazu w interesującym Cię celu.</li>
	<li>Po zakończeniu i po zmapowaniu nowych kwadratów zapisz plik Nawigatora i ponownie scal Nawigatora; kontynuuj, aż wszystkie kwadraty siatki zostaną zmapowane.</li>
</ol>
6. Generuj mapy wirtualne
<ol>
	<li>Ponownie scal plik nawigatora z fikcyjną instancją SerialEM.</li>
	<li>Uruchom skrypt PyEM Virtual maps z fikcyjnego menu SerialEM, Narzędzia i wybierz Virtual Anchor Maps. Może to zająć trochę czasu w zależności od rozmiaru i ilości kwadratowych map siatki oraz kategoryzacji map widoku i podglądu. 
	UWAGA: PyEM uruchamia okno poleceń, które automatycznie zamyka się po zakończeniu, a następnie można otworzyć nowy plik nawigatora. Na zmontowaną mapę, która zawiera wybrane punkty, PyEM zapisuje pojedynczą scaloną mapę i wszystkie jej mapy widoku i podglądu. Na koniec zapisuje nowy plik Navigatora o nazwie <navigatorfilename>_automaps.nav.</li>
</ol>
7. Strojenie mikroskopu
<ol>
	<li>Sprawdź strojenie mikroskopu. Aby zapewnić prawidłowe działanie mikroskopu, należy użyć tej samej konfiguracji powiększenia i rozmiaru wiązki do pozyskiwania danych, w następującej kolejności.
	<ol>
		<li>Uruchom wyrównanie SeriaLEM bez komy za pomocą CTF (Zemlin tableau).</li>
		<li>Wstaw i wyśrodkuj otwór obiektywu.</li>
		<li>Uruchom SerialEM Correct Astigmatism przez CTF (autostygmatyzacja).</li>
		<li>Uruchom GIF Quick Tune (tj. tylko ostrość szczelinowa). 
		UWAGA: Ponieważ kroki 7.1.1, 7.1.3 i 7.1.4 mogą wymagać większej dawki dawki, należy zmienić tylko rozmiar plamki; Nie należy zmieniać rozmiaru wiązki, ponieważ powoduje to przechylenie wiązki, co powoduje nieprawidłowe strojenie. Kroki 7.1.1, 7.1.2 i 7.1.3 są częściowo zautomatyzowane w tym publicznie dostępnym skrypcie (https://serialemscripts.nexperion.net/script/47).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Konfiguracja Nawigatora
<ol>
	<li>W programie SerialEM otwórz nowy plik nawigatora o nazwie <navigatorfilename>_automaps.nav. 
	UWAGA: V_yyyy to Wyświetl mapy, a P_yyyy są mapy w wersji zapoznawczej. Mapy podglądu są ustawione jako punkty nabycia.</li>
	<li>W oknie SerialEM Navigator usuń zaznaczenie wszystkich punktów A, zaznacz pierwszy V_yyyy mapy, wybierz opcję Zwiń, kliknij dwukrotnie A i usuń zaznaczenie opcji Zwiń.</li>
	<li>Wybierz pierwszą pozycję V_yyyy, naciśnij Shift + T, a następnie wybierz ostatnią pozycję V_yyyy i ponownie naciśnij Shift + T.</li>
	<li>Wybierz opcję Obrazy z pojedynczą ramką we właściwościach pliku, aby otworzyć okno dialogowe.</li>
	<li>W następnym oknie dialogowym File Properties (Właściwości pliku) wybierz żądane parametry zgodnie z potrzebami obrazowania i ustawieniami urządzenia.</li>
	<li>Po wyświetleniu monitu podaj nazwę wraz z numerem (np. TS_001.mrc) i kliknij Zapisz. 
	UWAGA: SerialEM automatycznie ponumeruje nazwy plików dla wszystkich serii pochylenia.</li>
	<li>Ustaw regulator serii przechyłu na pierwszą pozycję TS. Po zakończeniu kliknij OK, aby ustawić te parametry dla wszystkich serii pochylenia po tym elemencie przejęcia. Wszystkie mapy podglądu są teraz wybierane jako TS (Tilt Series) z numerowaną nazwą pliku TS_xxx.mrc. 
	UWAGA: Parametry można później zmienić ręcznie za pomocą funkcji Navigator TSparams; Zmiany zostaną zastosowane do wszystkich pozycji znajdujących się niżej na liście. Użytkownik ma możliwość uruchomienia niestandardowego skryptu zamiast serii pochylenia.</li>
</ol>
9. Ustaw pozycje ostrości/ścieżki
<ol>
	<li>W razie potrzeby ustaw odległość ostrości/śledzenia dla każdego celu (upewnij się, że niska dawka SerialEM jest włączona).</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie Mapę widoków, aby ją załadować.</li>
	<li>Wybierz opcję Podgląd mapy z listy Nawigator</li>.
	<li>Wybierz opcję Edytuj fokus w oknie Nawigatora.</li>
	<li>W panelu Low Dose Control (Sterowanie niską dawką) usuń zaznaczenie opcji Obróć oś międzyobszarową, aby umieścić opcje Trial (Próba) i Focus (Ostrość) wzdłuż osi pochylenia stołu montażowego.</li>
	<li>Kliknij żądany region na załadowanej mapie widoków, aby ustawić ostrość/pozycję próbną dla tej serii pochylenia.</li>
	<li>Upewnij się, że element Nawigatora ma teraz ustawiony TSP; powtórz procedurę dla wszystkich elementów. 
	UWAGA: Pozycje ostrości/ścieżki są automatycznie kopiowane w dół w Nawigatorze. W związku z tym, jeśli pozycja ostrości/ścieżki dla poprzedniego elementu znajduje się po właściwej stronie i w odpowiedniej odległości, nie ma potrzeby jej zmiany dla bieżącego elementu.</li>
</ol>
10. Ustawianie dodatkowych skryptów
<ol>
	<li>Dwa skrypty obsługują zakres Focus: pretomo i duringtomo. Skrypt pretomo jest uruchamiany przed każdą serią tiltów, a skrypt duringtomo podczas każdej serii tiltu.</li>
	<li>Edytuj zakres ostrości w pretomo skryptu.</li>
	<li>W menu SerialEM Tilt Series zaznacz opcję Uruchom skrypt w TS i wybierz numer skryptu duringtomo.</li>
</ol>
11. Uruchom
<ol>
	<li>Sprawdź poziom azotu w zbiorniku.</li>
	<li>Sprawdź, czy wybrano opcję Wyłącz turbo automatyczną ładowarkę.</li>
	<li>Sprawdź wolne miejsce w pamięci masowej.</li>
	<li>W menu Plik SerialEM usuń zaznaczenie opcji ciągłego zapisywania dla pliku dziennika i zamknij wszystkie aktualnie otwarte pliki dziennika. Każda seria pochyleń otrzyma swój własny plik dziennika.</li>
	<li>W menu Nawigator kliknij opcję Zdobądź w elementach.</li>
	<li>Uruchom skrypt PreTomo.</li>
	<li>Wybierz zadanie podstawowe Zdobądź serię pochylenia.</li>
	<li>Wybierz opcję Uruchom skrypt po PostTomo.</li>
	<li>Wybierz opcję Zamknij zawory kolumny na końcu.</li>
	<li>Wybierz pozycję Wyślij wiadomość e-mail na końcu.</li>
	<li>Kliknij GO. 
	UWAGA: SerialEM wyśle wiadomość e-mail na serię przechyłu, pomyślnie lub błędnie; Błąd może jednak również oznaczać, że nie osiągnięto pełnego zakresu pochylenia.</li>
</ol>

<ol><li>Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of viruses.</a> Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).</li>
<li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM-How+did+it+get+here+and+where+will+it+go%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go.</a> Science. 361 (6405), 876-880 (2018).</li>
<li>Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+studies+by+electron+tomography%3A+From+Cells+to+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural studies by electron tomography: From Cells to Molecules.</a> Annual Review of Biochemistry. 74 (1), 833-865 (2005).</li>
<li>Pfeffer, S., Mahamid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+molecular+complexity+in+structural+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Unravelling molecular complexity in structural cell biology.</a> Current Opinion in Structural Biology. 52, 111-118 (2018).</li>
<li>Schur, F. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+high-resolution+in+situ+structural+biology+with+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Current Opinion in Structural Biology. 58, 1-9 (2019).</li>
<li>Bohning, J., Bharat, T. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+high-throughput+in+situ+structural+biology+using+electron+cryotomography%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards high-throughput in situ structural biology using electron cryotomography.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. , (2020).</li>
<li>Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+in+situ--the+potential+of+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).</li>
<li>Wan, W., Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWan%2C+W+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 579, Elsevier. NY. 329-367 (2016).</li>
<li>Tan, Y. Z., Cheng, A., Potter, C. S., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+data+collection+in+single+particle+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy%22%5BJournal%5D)">Automated data collection in single particle electron microscopy.</a> Microscopy. 65 (1), 43-56 (2016).</li>
<li>Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Tomoauto%3A+A+protocol+for+high-throughput+automated+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Using Tomoauto: A protocol for high-throughput automated cryo-electron tomography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (107), e53608(2016).</li>
<li>Resch, G. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aResch%2C+GP+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. 152, Elseiver. NY. 135-178 (2019).</li>
<li>Bharat, T. A., Kukulski, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBharat%2C+TA+%22Correlative+Imaging%3A+Focusing+on+the+Future%22">Correlative Imaging: Focusing on the Future</a>. , John Wiley & Sons. NY. 137-153 (2019).</li>
<li>Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+a+cryo-electron+tomography+tilt-scheme+optimized+for+high+resolution+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging.</a> Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).</li>
<li>O'Toole, E., vander Heide, P., McIntosh, R. J., Mastronarde, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aO%27Toole%2C+E+%22Cellular+Imaging%3A+Electron+Tomography+and+Related+Techniques%22">Cellular Imaging: Electron Tomography and Related Techniques</a>. , Springer, Cham. 95-116 (2018).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16, 471-477 (2019).</li>
<li>Turonova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+tomographic+acquisition+schemes+for+high-resolution+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Benchmarking tomographic acquisition schemes for high-resolution structural biology.</a> Nature Communications. 11 (1), 876(2020).</li>
<li>Chreifi, G., Chen, S., Metskas, L. A., Kaplan, M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+tilt-series+acquisition+for+electron+cryotomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid tilt-series acquisition for electron cryotomography.</a> Journal of Structural Biology. 205 (2), 163-169 (2019).</li>
<li>Eisenstein, F., Danev, R., Pilhofer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+applicability+and+robustness+of+fast+cryo-electron+tomography+data+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Improved applicability and robustness of fast cryo-electron tomography data acquisition.</a> Journal of Structural Biology. 208 (2), 107-114 (2019).</li>
<li>Turonova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+structural+analysis+of+SARS-CoV-2+spike+reveals+flexibility+mediated+by+three+hinges%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In situ structural analysis of SARS-CoV-2 spike reveals flexibility mediated by three hinges.</a> Science. 370 (6513), 203-208 (2020).</li>
<li>O'Reilly, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-cell+architecture+of+an+actively+transcribing-translating+expressome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In-cell architecture of an actively transcribing-translating expressome.</a> Science. 369 (6503), 554-557 (2020).</li>
<li>Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-particle+cryo-EM+refinement+with+M+visualizes+ribosome-antibiotic+complex+at+3.7+%C3%85+inside+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.7 Å inside cells.</a> Nature Methods. 18, 186-193 (2020).</li>
<li>Karuppasamy, M., Karimi Nejadasl, F., Vulovic, M., Koster, A. J., Ravelli, R. B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+damage+in+single-particle+cryo-electron+microscopy%3A+effects+of+dose+and+dose+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">Radiation damage in single-particle cryo-electron microscopy: effects of dose and dose rate.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 18 (3), 398-412 (2011).</li>
<li>Liberta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+fibril+structures+from+systemic+AA+amyloidosis+reveal+the+species+complementarity+of+pathological+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM fibril structures from systemic AA amyloidosis reveal the species complementarity of pathological amyloids.</a> Nature Communications. 10 (1), 1104(2019).</li>
<li>Radamaker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+a+light+chain-derived+amyloid+fibril+from+a+patient+with+systemic+AL+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of a light chain-derived amyloid fibril from a patient with systemic AL amyloidosis.</a> Nature Communications. 10 (1), 1103(2019).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Z techniki niszowej, cryoET stał się obecnie szeroko rozpowszechnioną metodą wykonywania badań strukturalnych na poziomie komórkowym i molekularnym z niespotykaną dotąd osiągalną rozdzielczością21,22. Stale rosnące zapotrzebowanie na obrazowanie krioelektromagnetyczne stanowi obciążenie dla ograniczonych zasobów dostępnych w celu uzyskania dostępu do tej technologii. Pomimo otwarcia wielu krajowych ośrodków krioEM i wysiłków instytutów naukowych w celu zwiększenia ich zdolności TEM do zaspokajania potrzeb społeczności na całym świecie, dostęp do instrumentów krioEM jest nadal ograniczony, a zatem czas dostępny na gromadzenie danych musi być efektywnie wykorzystany przez użytkowników, aby zmaksymalizować wydajność każdej sesji mikroskopowej. Konieczność pozyskania setek serii pochyleń w połączeniu z ograniczonym czasem dostępnym na gromadzenie danych wymagała nowatorskich procedur akwizycji obrazów w celu osiągnięcia lepszej przepustowości bez uszczerbku dla jakości danych. Ostatnie osiągnięcia w zakresie sprzętu i procesów obrazowania znacznie zwiększyły szybkość akwizycji serii pochylenia18,19, co spowodowało radykalną zmianę stosunku czasu poświęconego na ustawienie punktu akwizycji do czasu potrzebnego na faktyczną akwizycję serii pochylenia. Ogólnie rzecz biorąc, procedura ustawiania punktów akwizycji staje się jednym z głównych wąskich gardeł dla osiągalnej przepustowości sesji krioET.
Przedstawiony tutaj zoptymalizowany protokół umożliwił nam ustawienie, w trybie off-line, 171 pozycji do automatycznej akwizycji tomograficznej w ciągu pierwszego dnia sesji krioET, podczas gdy mikroskop był aktywnie zaangażowany w inne operacje (np. mapowanie kwadratowe, strojenie i automatyczną akwizycję serii pochylenia), bez wpływu na czas dostępny do zbierania danych pod mikroskopem. Oprócz maksymalizacji przepustowości sesji cryoET, potok ten drastycznie zmniejsza ilość czasu zainwestowanego przez użytkownika w fazę przygotowawczą sesji automatycznego zbierania danych. W opisanym protokole użytkownik jest proszony o przeglądanie zmapowanych kwadratów siatki w celu zidentyfikowania odpowiednich obszarów zainteresowania i dodania ich do Serial EM Navigator jako punktów akwizycji. Wszystkie cele zostaną następnie automatycznie przetworzone wsadowo w SerialEM przez narzędzie PyEM w celu wytworzenia map wirtualnych16. Przedstawione podejście obliczeniowe jest zatem znacznie szybsze niż pozyskiwanie rzeczywistych map zakotwiczenia, eliminując okresy oczekiwania związane z ruchem sceny, akwizycją obrazu, zmianą warunków obrazowania między widokiem a podglądem oraz poprzez ewentualne powtórzenie tych kroków przy wyśrodkowaniu w dużym powiększeniu. Dodatkowo, ponieważ każdy uzyskany obraz prowadzi do akumulacji dawki elektronów na obiekcie zainteresowania23, wykorzystanie wirtualnych map do precyzyjnego przegrupowania celów zmniejsza uszkodzenia radiacyjne wprowadzone w fazie przygotowawczej sesji krioET przed właściwą akwizycją serii pochylenia. Opisany tutaj protokół wykorzystuje zarówno średnie, jak i duże powiększenia wirtualne mapy (odpowiednio Podgląd i Widok) do ponownego wyrównania celu przed akwizycją serii pochylenia. Procedurę tę można łatwo zmodyfikować tak, aby używała tylko pośredniego powiększenia Wyświetl obraz, gdy dokładność wyrównania ma mniejsze znaczenie, na przykład w przypadku dużych konstrukcji, w których ostateczna dokładność celu jest mniej istotna10 lub w przypadku próbek do analizy pojedynczych cząstek, które są słabo rozłożone na kriosiatce, co wymaga ręcznego wyboru przez użytkownika każdego punktu akwizycji24, Lokal mieszkalny 25. Wreszcie, podejście oparte na wykorzystaniu w trybie off-line fikcyjnej instancji SerialEM ułatwia również ustawianie punktów akwizycji za pośrednictwem zdalnego połączenia, minimalizując potrzebę fizycznej obecności użytkownika przy mikroskopie, umożliwiając w ten sposób większą elastyczność w zakresie organizacji operacyjnej obiektu.
Ostatnie postępy w technologii i metodach krioET drastycznie poprawiły szybkość i niezawodność automatycznych sesji zbierania danych. Konieczne są jednak dalsze prace w celu rozwiązania pozostałych etapów ograniczania szybkości w ramach tej metody. Przede wszystkim początkowy etap mapowania siatki i kwadratu staje się obecnie jednym z głównych wąskich gardeł w konfiguracji sesji, generując w ten sposób potrzebę ulepszeń sprzętowych mających na celu zwiększenie prędkości ruchów stolika mikroskopu i akwizycji obrazu przez bezpośrednie detektory elektronów. Ponadto opracowanie podejść do uczenia maszynowego w celu pełnej automatyzacji procesu identyfikacji celów będzie miało kluczowe znaczenie dla wyeliminowania potrzeby oględzin użytkowników w celu wyboru obszarów zainteresowania, co jest czasochłonną procedurą, która opiera się na wiedzy specjalistycznej użytkowników.

Metody kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryoEM) opierają się na obrazowaniu próbek biologicznych za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) po ich szybkiej witryfikacji, procesie przygotowania próbki, który zachowuje struktury molekularne i komórkowe próbek w stanie zbliżonym do natywnego i uwodnionego1,2. W kriogenicznej tomografii elektronowej (cryoET) model 3D zeszklonej próbki uzyskuje się poprzez uzyskanie szeregu obrazów tego samego obszaru zainteresowania z różnych orientacji, tzw. szereg pochylenia, a następnie obliczeniową rekonstrukcję objętości tomograficznej3. Ta zaawansowana technika obrazowania dojrzała do tego, aby stać się potężną metodą badania strukturalnego procesów biologicznych w kontekście ich rodzimych środowisk komórkowych4,5,6.
Oprócz analizy ultrastrukturalnej zeszklonej próbki, rekonstrukcje kompleksów makromolekularnych, które są obecne w wielu kopiach w objętości tomografii, można uzyskać poprzez zastosowanie subtomogramu uśredniającego5. To podejście do rekonstrukcji opiera się na iteracyjnym dopasowywaniu i uśrednianiu podwoluminów zawierających strukturę będącą przedmiotem zainteresowania i ma na celu zwiększenie stosunku sygnału do szumu oraz rozdzielczości końcowej rekonstrukcji7,8. Uśrednianie subtomogramu opiera się na gromadzeniu i przetwarzaniu dużej ilości danych, co często wymaga pozyskania setek serii przechyłu za pomocą wysokiej klasy TEMów o wysokich kosztach eksploatacji.
Obecnie konfiguracja takich automatycznych sesji cryoET jest czasochłonnym procesem, który zazwyczaj opiera się na ręcznym wprowadzaniu danych przez użytkownika9,10,11. Zazwyczaj cele są identyfikowane poprzez oględziny zmapowanej siatki, a następnie ustawiane do automatycznego gromadzenia danych. Na skuteczność użytkownika w identyfikowaniu punktów akwizycji często wpływa charakter próbki, co staje się szczególnie trudne podczas analizy oczyszczonych makrocząsteczek o nieoptymalnym stężeniu lub w przypadku rzadkich zdarzeń w zatłoczonych środowiskach komórkowych, co implikuje stosowanie podejść korelacyjnych12. Co więcej, obecne przepływy pracy wymagają pozyskiwania obrazów podczas ustawiania przy różnych powiększeniach, które zostaną później wykorzystane do precyzyjnej lokalizacji i wyśrodkowania celu podczas automatycznej akwizycji11,13,14. Te bardzo precyzyjne etapy ponownego wyrównywania mają kluczowe znaczenie dla zastosowań o wysokiej rozdzielczości, które wymagają wykonywania obrazowania w dużym powiększeniu i wymagają dokładnych kroków centrowania w celu zachowania obszaru zainteresowania w wynikowym małym polu widzenia. W sumie na tę czasochłonną procedurę, podczas której TEM nie jest zaangażowany w akwizycję serii pochylenia, poświęca się w sumie kilka godzin z każdej sesji zbierania danych. W związku z tym, w zależności od wymaganej liczby serii nachylenia, identyfikacja i ustawienie punktów akwizycji może mieć znaczący wpływ na czas dostępny pod mikroskopem na zbieranie danych podczas sesji krioET.
Opisany tutaj jest zoptymalizowany protokół oparty na pakiecie oprogramowania SerialEM15 i najnowszej wersji oprogramowania PyEM16 do mapowania siatek, mapowania kwadratów siatki, wybierania celów i ustawiania automatycznego gromadzenia danych dla zbierania serii tilt na dużą skalę. Kluczową koncepcją tego podejścia jest dostarczenie SerialEM obrazów generowanych obliczeniowo przez PyEM dla każdego elementu akwizycji, nazywanego wirtualnymi mapami, w celu dokładnej lokalizacji i wyśrodkowania celu. Aby uzyskać rzeczywisty czas akwizycji, wybór celów, jak również tworzenie wirtualnych map odbywa się w trybie off-line przy użyciu drugiej fikcyjnej instancji SerialEM, co oddziela proces wyboru celów akwizycji od operacji TEM. Chociaż nie zajmuje się tym, jak zwiększyć jakość danych13,17 lub szybkością akwizycji serii tilt18,19, protokół ten koncentruje się przede wszystkim na strategiach optymalizacji efektywności czasowej konfiguracji dużych zautomatyzowanych sesji cryoET. W związku z tym implementacja przedstawionego protokołu jest przeznaczona dla tych naukowców, którzy tworzą procesy zbierania danych cryoET, którzy chcą zmaksymalizować wydajność zautomatyzowanej akwizycji danych poprzez wydłużenie czasu mikroskopu dostępnego dla akwizycji serii pochylenia.

<table><tbody><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td></td><td></td><td>Nasz protokół opiera się wyłącznie na obliczeniowych przepływach pracy. Użytkownik będzie potrzebował tylko dostępu do dowolnego rodzaju TEM</td></tr></tbody></table>

strategie optymalizacji pozyskiwania danych z kriogenicznej tomografii elektronowej

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Kriogeniczna tomografia elektronowa (cryoET) to potężna metoda badania struktury 3D próbek biologicznych w stanie zbliżonym do rodzimego. Najnowocześniejsze metody krioET w połączeniu z analizą uśredniania subtomogramu umożliwiają określenie strukturalne w wysokiej rozdzielczości kompleksów makromolekularnych, które są obecne w wielu kopiach w ramach rekonstrukcji tomograficznych. Eksperymenty tomograficzne zwykle wymagają uzyskania ogromnej ilości serii wychylenia za pomocą wysokiej klasy transmisyjnych mikroskopów elektronowych, co wiąże się z istotnymi kosztami eksploatacji. Chociaż przepustowość i niezawodność procedur automatycznego gromadzenia danych stale się poprawiały w ostatnich latach, proces wyboru obszarów zainteresowania, w których zostanie pozyskana seria pochylenia, nie może być łatwo zautomatyzowany i nadal opiera się na ręcznym wprowadzaniu danych przez użytkownika. W związku z tym przygotowanie sesji zbierania danych na dużą skalę jest czasochłonną procedurą, która może znacznie skrócić pozostały czas mikroskopu dostępny na akwizycję serii nachylenia. W tym miejscu protokół opisuje ostatnio opracowane implementacje oparte na pakiecie SerialEM i oprogramowaniu PyEM, które znacznie poprawiają efektywność czasową przesiewania siatki i gromadzenia danych z serii przechyłu na dużą skalę. Prezentowany protokół ilustruje, w jaki sposób można wykorzystać funkcjonalności skryptów SerialEM, aby w pełni zautomatyzować mapowanie siatki, mapowanie kwadratów siatki oraz akwizycję serii pochylenia. Ponadto protokół opisuje, w jaki sposób używać PyEM do wybierania dodatkowych celów akwizycji w trybie off-line po zainicjowaniu automatycznego zbierania danych. Aby zilustrować ten protokół, opisano jego zastosowanie w kontekście wysokiej klasy gromadzenia danych z serii przechyłów Sars-Cov-2. Prezentowany potok jest szczególnie przydatny do maksymalizacji efektywności czasowej eksperymentów tomograficznych, które wymagają starannego doboru celów akwizycji i jednocześnie zebrania dużej ilości serii przechyłu.

Niniejszą procedurę zastosowano w celu uzyskania serii obrazów pochylonych Sars-Cov-2 opisanych w pracy Turonova i wsp. 202020; cały zestaw danych został wytworzony przy użyciu trzech różnych siatek podczas trzech sesji mikroskopowych w EMBL Heidelberg. Niniejsze badanie skupi się na opisie pierwszej sesji trwającej 3 dni (~72 h), przeprowadzonej z wykorzystaniem pierwszej siatki.
Po zmapowaniu całej siatki przy niskim powiększeniu (~10 min, patrz krok 2), na mapie siatki wybrano 71 odpowiednich kwadratów, a następnie wykonano mapy przy średnim powiększeniu (mapy kwadratowe) wykonano przy zastosowaniu ustawień (powiększenie, czas ekspozycji, defocus), które umożliwiają bezpośrednią wizualizację i identyfikację badanego obiektu, w tym przypadku koronawirusów (patrz krok 4) (Rysunek 1A). Czas akwizycji wynosił ok. 3 min na pole, łącznie 3 h 45 min.
Gdy tylko utworzono pierwszą mapę kwadratową, na osobnym komputerze otwarto pomocniczą instancję SerialEM (bez kontroli nad kamerą lub mikroskopem), aby zwizualizować mapę kwadratową i zaznaczyć punkty na celach odpowiednich do pozyskiwania serii przechyłów (patrz krok 5) (Rysunek 1B). Nowo pozyskane mapy kwadratowe pobierano poprzez scalenie bieżącego nawigatora pomocniczej instancji SerialEM z nawigatorem z instancji SerialEM odpowiedzialnej za akwizycję. Po około 2 h akwizycji i wyboru kwadratów siatki zidentyfikowano 50 początkowych celów.
Po zakończeniu pozyskiwania map kwadratowych skonfigurowano tryb low-dose w programie SerialEM, a następnie wykonano i zapisano jako mapy obrazy referencyjne View oraz Preview (patrz krok 3). Te ostatnie mapy można było bezzwłocznie wykorzystać w pomocniczej instancji SerialEM do wygenerowania z odpowiadających im obrazów map kwadratowych map Virtual View (Rysunek 1C) oraz Virtual Preview (Rysunek 1D) dla 50 wybranych celów przy użyciu pakietu oprogramowania PyEM, co zajęło około 30 min (patrz krok 6). Ten czas przetwarzania w pomocniczej sesji SerialEM wykorzystano do przeprowadzenia końcowych przygotowań mikroskopu do akwizycji: strojenia filtra energetycznego, pozyskiwania nowego referencyjnego obrazu wzmocnienia kamery oraz wyrównania soczewki obiektywu w celu eliminacji astygmatyzmu i komy.
Po zakończeniu strojenia mikroskopu i wygenerowaniu wirtualnych map z 50 początkowych celów, skonfigurowano właściwy nawigator SerialEM do akwizycji (patrz krok 8), ustawiono pozycje ostrości i śledzenia (krok 9), a następnie rozpoczęto akwizycję serii pochyleń (patrz kroki 10 i 11). Mapy Virtual View (Rycina 1C) posłużyły do wstępnego centrowania celu (Rycina 1E), po czym przeprowadzono końcowe centrowanie przy powiększeniu stosowanym podczas właściwej akwizycji serii pochyleń (Rycina 1F), korzystając z mapy Virtual Preview (Rycina 1D).
Rozpoczęwszy od mapowania siatki o godzinie 9:30 rano, akwizycja serii nachyleń dla 50 początkowych celów rozpoczęła się około godziny 15:00. Przy ustawieniach zastosowanych do akwizycji tomograficznej (szczegóły w odniesieniu), pozyskanie jednej serii nachyleń zajmowało ~20 min, co zapewniło wystarczającą liczbę celów do pracy przez całą noc. Podczas trwania akwizycji można było analizować pozostałe mapy kwadratowe i dodawać kolejne cele, nadal w trybie off-line za pomocą pomocniczej instancji SerialEM. Spośród pozostałych map kwadratowych wybrano 121 dodatkowych celów i dodano je do nawigatora SerialEM odpowiedzialnego za akwizycję po utworzeniu map wirtualnych dla tych nowych celów, co wystarczyło do zakończenia 72 h sesji.
Procedura ta (podsumowana na Rysunku 2) pozwoliła w ciągu jednego dnia roboczego na przygotowanie 171 celów do zautomatyzowanej akwizycji tomograficznej dla 72-godzinnej (3-dniowej) sesji mikroskopowej.
<img alt="Analiza rozkładu nanocząsteczek; obrazy mikroskopowe przedstawiające powiększenia, mapy widoków, różne rozdzielczości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62383/62383fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przykład mapy kwadratowej z reprezentatywnymi mapami wirtualnymi i odpowiadającymi im akwizycjami po centrowaniu. (A) Reprezentatywna mapa kwadratowa siatki cryoEM Sars-Cov-2 użytej w pracy Turonova et al.20. Cztery obszary zainteresowania są zaznaczone czerwonym krzyżykiem. Powiększenie mikroskopu wynosi 2 250x. (B) Wycinek mapy kwadratowej wyróżniający obszary, które zostały wykorzystane do wygenerowania map Virtual View (pomarańczowe) i Virtual Preview (żółte) dla wybranego celu (czerwony krzyżyk) (C) Mapa Virtual View. (D) Mapa Virtual Preview. (E) Rzeczywista akwizycja widoku (Actual View) po centrowaniu z wykorzystaniem mapy Virtual View jako referencji. Powiększenie mikroskopu wynosi 11 500x. (F) Akwizycja przy nachyleniu 0° z serii nachyleń po centrowaniu z wykorzystaniem mapy Virtual Preview jako referencji. Powiększenie mikroskopu wynosi 64 000x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62383/62383fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat przepływu pracy w SerialEM dla mapowania siatek mikroskopowych, konfiguracji niskiej dawki i akwizycji celów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62383/62383fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przepływ pracy sesji CryoET z wykorzystaniem SerialEM oraz narzędzi PyEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62383/62383fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Rosnące zapotrzebowanie na gromadzenie danych na dużą skalę w kriogenicznej tomografii elektronowej wymaga wysokoprzepustowych procedur akwizycji obrazów. Opisano tutaj protokół, który wdraża najnowsze osiągnięcia zaawansowanych strategii akwizycji mających na celu maksymalizację efektywności czasowej i przepustowości gromadzenia danych tomograficznych.

Strategie optymalizacji pozyskiwania danych z kriogenicznej tomografii elektronowej

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Konfiguracja sesji zbierania danych na dużą skalę jest czasochłonną procedurą, która może znacznie skrócić pozostały czas mikroskopu dostępny na akwizycję serii pochylenia. Metoda ta umożliwia szybką konfigurację automatycznej akwizycji danych tomografii na dużą skalę w celu maksymalizacji efektywności czasowej eksperymentów tomograficznych, które wymagają starannego wyboru celów akwizycji. Zacznij od otwarcia fikcyjnej instancji SerialEM.Po zmapowaniu pierwszego kwadratu siatki użyj opcji scalania w menu nawigatora SerialEM, aby zobaczyć montaż w fikcyjnej instancji SerialEM. Kliknij dwukrotnie okno nawigatora, aby otworzyć kwadratową mapę siatki. Przeszukaj mapę i użyj fikcyjnej opcji nawigatora SerialEM, dodaj punkty, aby dodać punkty akwizycji obrazu w interesującym Cię celu.Po zmapowaniu nowych kwadratów zapisz plik nawigatora i ponownie scal nawigatora. Kontynuuj, aż wszystkie kwadraty siatki zostaną zmapowane. Ponownie scal plik nawigatora z fikcyjną instancją SerialEM.Uruchom skrypt map wirtualnych Pi EM z fikcyjnego menu SerialEM. Wybierz narzędzia i wybierz wirtualne mapy kotwic. Może to zająć trochę czasu w zależności od rozmiaru i ilości kwadratowych map siatki, a także kategoryzacji map widoku i podglądu.Aby zapewnić prawidłowe działanie mikroskopu, należy użyć tej samej konfiguracji powiększenia i rozmiaru wiązki do pozyskiwania danych w następującej kolejności. Uruchom wyrównanie bez komy SerialEM za pomocą CTF. Wstaw i wyśrodkuj otwór obiektywu.Uruchom SerialEM poprawny astygmatyzm za pomocą CTF i szybkiego dostrajania GIF. W programie SerialEM otwórz nowy plik nawigatora. Odznacz wszystkie punkty A.Wybierz pierwsze mapy widoków. Wybierz opcję zwiń. Kliknij dwukrotnie A i odznacz zwiń.Wybierz pierwszą pozycję na mapie widoku. Naciśnij Shift T, a następnie wybierz ostatnią pozycję na mapie widoku i ponownie naciśnij Shift T. Wybierz obrazy z pojedynczą ramką we właściwościach pliku, aby otworzyć okno dialogowe.W następnym oknie dialogowym właściwości pliku wybierz żądane parametry zgodnie z potrzebami obrazowania i ustawieniami urządzenia. Po wyświetleniu monitu podaj nazwę z numerem i kliknij Zapisz. Ustaw regulator serii przechyłu na pierwszą pozycję TS.Po zakończeniu kliknij przycisk OK, aby ustawić te parametry dla wszystkich serii pochylenia po tym elemencie akwizycji. Wszystkie mapy podglądu są teraz wybierane jako TS z numerowaną nazwą pliku. W razie potrzeby ustaw odległość ostrości/śledzenia dla każdego celu.Kliknij dwukrotnie mapę widoku, aby ją załadować. Wybierz podgląd mapy z listy nawigatora. Następnie wybierz opcję edytuj fokus w oknie nawigatora.Na panelu sterowania o niskiej dawce usuń zaznaczenie opcji Obróć oś międzyobszarową, aby ustawić próbę i ustawić ostrość wzdłuż osi pochylenia stolika. Kliknij żądany region na załadowanej mapie widoków, aby ustawić pozycję próbną ostrości dla tej serii pochylenia i upewnij się, że element nawigatora ma ustawiony TSP. Powtórz procedurę dla wszystkich elementów.Edytuj zakres ostrości w skrypcie PreTomo, który jest uruchamiany przed każdą serią pochylenia. W menu serii pochylania SerialEM zaznacz opcję uruchom skrypt w TS i wybierz numer skryptu DuringTomo podczas każdego pochylenia. Sprawdź poziom azotu w zbiorniku i czy wybrano opcję wyłączenia turbosprężarki automatycznej ładowarki.Sprawdź wolne miejsce w pamięci masowej. W menu Plik SerialEM usuń zaznaczenie opcji ciągłego zapisywania dla pliku dziennika. Każda seria pochyleń otrzyma swój własny plik dziennika.Po kliknięciu na pozycje w menu nawigacyjnym uruchom skrypt PreTomo. Wybierz zadanie podstawowe, aby uzyskać serię pochylenia, a następnie wybierz pozycję uruchom skrypt po PostTomo. Wybierz zamknij zawory kolumny na końcu i wyślij wiadomość e-mail na końcu, a następnie kliknij przejdź.Na siatce mapy wybrano 71 odpowiednich kwadratów w mniejszym powiększeniu. Uzyskano mapy o średnim powiększeniu z ustawieniami pozwalającymi na bezpośrednią wizualizację i identyfikację interesującej nas próbki, w tym przypadku koronawirusów. Czas akwizycji wynosił trzy minuty na kwadrat, w sumie trzy godziny i 45 minut.Gdy tworzona była pierwsza mapa kwadratowa, na oddzielnym komputerze otwarto fikcyjną instancję SerialEM w celu wizualizacji mapy kwadratowej i dodania punktów na celach odpowiednich do akwizycji serii pochylenia. Skonfigurowano niską dawkę SerialEM, a widok referencyjny i obrazy podglądu zostały wykonane i zapisane jako mapy. Te ostatnie mapy mogą być następnie natychmiast użyte w fikcyjnej instancji SerialEM do wygenerowania wirtualnego widoku i wirtualnego podglądu z odpowiednich kwadratowych obrazów mapy.Wirtualne mapy widoków zostały wykorzystane do wstępnego wyśrodkowania celu, a następnie do końcowego wyśrodkowania wykonanego przy rzeczywistym powiększeniu serii nachylenia przy użyciu wirtualnej mapy podglądu. Użytkownicy powinni dać sobie dużo czasu na zapoznanie się z przykładowym krajobrazem. Po przeszukaniu kilku map można lepiej wyczuć obszary dobrej jakości, z których można zbierać dane.

strategies-for-optimization-cryogenic-electron-tomography-data

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten artykuł opisuje metodologię mikroskopii krioelektronowej, która jest używana do uzyskiwania wysokiej jakości mikroskopowych obrazów makrocząsteczek w ich stanie zbliżonym do natywnego. Metoda ta pozwala uzyskać obrazy nadające się do dalszego przetwarzania komputerowego przy użyciu podejścia pojedynczej cząstki, opracowanego w celu wygenerowania rekonstrukcji 3D makrocząsteczki.

Co robić, a czego nie robić w mikroskopii krioelektronowej: podstawa przygotowania próbek i gromadzenia wysokiej jakości danych do makromolekularnej rekonstrukcji 3D

Przedstawiamy protokół, jak wykorzystać wysokoprzepustową tomografię krioelektronową do określenia wysokiej rozdzielczości struktur in situ maszyn molekularnych. Protokół pozwala na przetwarzanie dużych ilości danych, pozwala uniknąć typowych wąskich gardeł i skraca przestoje zasobów, pozwalając użytkownikowi skupić się na ważnych kwestiach biologicznych.

Korzystanie z Tomoauto: protokół dla wysokowydajnej zautomatyzowanej tomografii krioelektronowej

Ten protokół opisuje, jak wizualizować przejściowe zagęszczenie DNA u cyjanobakterii. Stosuje się hodowlę synchroniczną, monitorowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, szybkie zamrażanie i wysokonapięciową kriotomografię elektronową. Przedstawiono protokół dla tych metodologii oraz omówiono przyszłe zastosowania i rozwój.

Wizualizacja zagęszczenia DNA u sinic za pomocą wysokonapięciowej krioelektronowej tomografii

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek wymaga odpowiedniego pakietu oprogramowania i przyjaznego dla użytkownika potoku do wysokowydajnej automatycznej akwizycji danych. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie w pełni zautomatyzowanego pakietu oprogramowania do akwizycji obrazu, Latitude-S, oraz praktycznego potoku do gromadzenia danych o zeszklonych biomolekułach w warunkach niskich dawek.

Przyjazne dla użytkownika, wysokowydajne i w pełni zautomatyzowane oprogramowanie do akwizycji danych do mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Mapy krio-EM makromolekuł o wysokiej rozdzielczości można również uzyskać za pomocą mikroskopów TEM 200 kV. Protokół ten przedstawia najlepsze praktyki w zakresie ustawiania dokładnych wyrównań optyki, schematów akwizycji danych i wyboru obszarów obrazowania, które są niezbędne do pomyślnego zbierania zestawów danych o wysokiej rozdzielczości przy użyciu TEM 200 kV.

Rutynowe zbieranie zestawów danych krio-EM o wysokiej rozdzielczości przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego 200 KV

Obecny protokół opisuje zdalne pozyskiwanie danych za pomocą tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości za pomocą Tomo5 oraz późniejsze przetwarzanie danych i uśrednianie subtomogramowe za pomocą emClarity. Apoferrytyna jest używana jako przykład do zilustrowania szczegółowych procesów krok po kroku w celu uzyskania struktury krio-ET o rozdzielczości 2,86 A.

Tomografia krioelektronowa: zdalne zbieranie danych i uśrednianie subtomogramu

To jest metoda trenowania wielowarstwowego U-Net do wieloklasowej segmentacji tomogramów krioelektronowych przy użyciu części jednego tomogramu jako danych wejściowych do treningu. Opisujemy, jak wywnioskować tę sieć z innymi tomogramami i jak wyodrębnić segmentacje do dalszych analiz, takich jak uśrednianie subtomogramu i śledzenie włókien.

Segmentacja tomogramów krioelektronowych oparta na głębokim uczeniu

Ta metoda zapewnia dostępny i elastyczny protokół do przygotowania siatek mikroskopii elektronowej (EM) do kriotomografii komórkowej in situ oraz korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM).

Przygotowanie próbki do kriotomografii in situ komórek ssaków

Ten protokół przedstawia praktyczną metodę wykorzystującą Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) jako przykład rozwiązania problemu nierównomiernego rozkładu cząstek poprzez optymalizację przygotowania próbki, stanowiąc punkt odniesienia dla badaczy do efektywnego wyjaśniania struktur makromolekularnych za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryo-EM).

Optymalizacja przygotowania próbek do kriogenicznej mikroskopii elektronowej

Protokół ten standaryzuje tomografię krioelektronową (cryo-ET) dla grubych tkanek poprzez integrację zamrażania pod wysokim ciśnieniem (HPF) z metodą gofrową, wyciąganie kriogenicznej wiązki jonowej (krio-FIB) oraz równoległe pobieranie pod względem dawki, co daje jednolicie cienkie lamele i próbki zwitryfikowane do powtarzalnej analizy in situ w hipokampie myszy.

Workflow tomografii krioelektronowej dla grubych tkanek wykazany u hipokampa myszy

Poznaj strategie optymalizacji pozyskiwania danych z kriogenicznej tomografii elektronowej przy użyciu automatyzacji SerialEM i PyEM. Ta metoda znacząco zwiększa efektywność czasową mikroskopii i usprawnia wybór celów akwizycji.

Strategie optymalizacji pozyskiwania danych z kriogenicznej tomografii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów