Optymalizacja przygotowania próbek do kriogenicznej mikroskopii elektronowej

Przygotowanie próbek kriogenicznych wiąże się z wyzwaniami, które mogą ograniczyć ich skuteczność, w szczególności z nierównomiernym rozkładem cząstek. Problem ten często prowadzi do słabej rozdzielczości i zmniejszonej dokładności w nowo konstruowanych strukturach białkowych. W celu przezwyciężenia nierównomiernego rozkładu cząstek stosuje się różne podejścia eksperymentalne, w tym dodawanie detergentów lub naśladowców membran do próbki, modyfikację folii nośnej siatki i przechylanie określonego etapu podczas zbierania danych.

Protokół ten analizuje prostą, praktyczną metodę rozwiązywania problemów związanych z nierównomiernym rozkładem cząstek poprzez optymalizację przygotowania próbek, zapewniając naszym odniesieniem dla naukowców do skutecznego zilustrowania struktur makromolekuł za pomocą kriogenu. Aby rozpocząć, zbierz zbiorcze frakcje białkowe zawierające małe białko szoku cieplnego MJ 16.5. Użyj filtrów odśrodkowych z granicą masy cząsteczkowej 50 kilodaltonów, aby skoncentrować frakcje w temperaturze czterech stopni Celsjusza do około 65 miligramów.

Po zagęszczeniu odwirować próbkę o stężeniu 16 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu usunięcia kruszyw. Podzielić 50 mikrolitrów objętości supernatantu na 0,2 mililitra cienkościennych probówek PCR. W przypadku transmisyjnej mikroskopii elektronowej rozmrozić dwie zamrożone probówki białkowe na lodzie.

Po rozmrożeniu przesuń rurkę kilka razy, aby wymieszać. Następnie odwirować roztwór białka o stężeniu 16 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu usunięcia agregatów. Następnie wstrzyknąć supernatant do kolumny chromatograficznej wykluczającej wielkość i zebrać 0,5 mililitra frakcji elucyjnej.

Zbierz frakcje elucjańskie odpowiadające pikowi, wykazujące najwyższą absorbancję ultrafioletu przy 280 nanometrach. W celu wymiany buforu za pomocą nożyczek pokrój membranę dializacyjną na kawałki o wymiarach 30 na 30 milimetrów. Inkubować kawałki w wodzie destylowanej lub roztworach buforowych, aby je zrównoważyć.

Następnie dodaj 55 mikrolitrów roztworu białkowego do komory z przyciskami do mikrodializy o pojemności 50 mikrolitrów. Trzymaj membranę dializacyjną pionowo za pomocą kleszczy i delikatnie dotknij jedną krawędzią membrany o bibułę, aby odsączyć nadmiar płynu. Ostrożnie przykryj przycisk do mikrodializy membraną.

Umieść pierścień uszczelniający o przekroju okrągłym na membranie dializacyjnej i delikatnie zwiń go w rowek na krawędzi przycisku. Zanurzyć każdy przycisk dializy w oddzielnej zlewce zawierającej bufor docelowy, stroną z membraną skierowaną do góry. Za pomocą strzykawki z cienką igłą ostrożnie przebić membranę i odzyskać roztwór białka z komory do mikrodializy.

Załaduj pięć mikrolitrów próbki o stężeniu od 20 do 120 nanogramów na mililitr na siatkę rozżarzenia. Przygotuj trzy krople wody po 50 mikrolitrów każda na arkuszu folii parafinowej. Pocieraj powierzchnię siatki o krople wody, aby umyć próbkę.

Teraz załaduj pięć mikrolitrów przefiltrowanego 1% roztworu octanu pisuaru na siatkę i natychmiast odpipetuj roztwór octanu pisuaru. Załaduj kolejne pięć mikrolitrów roztworu octanu pisuaru na siatkę. Delikatnie dotknij strony pęsety siatki bibułą filtracyjną, aby usunąć nadmiar roztworu barwiącego i pozostaw siatkę do wyschnięcia.

Zamontuj pęsetę i zespół siatki wyładowczej jarzeniowej na instrumencie. Następnie załaduj cztery mikrolitry próbki na węglową stronę siatki. Zainicjuj proces zamrażania wgłębnego.

Aby przygotować siatki do załadowania do transmisyjnego mikroskopu elektronowego lub TEM, najpierw umieść skrzynkę siatkową zawierającą zeszklone siatki w stacji montażu automatycznej siatki i odkręć pokrywę pudełka siatkowego zawierającego zeszklone siatki. Umieść pierścień automatycznej siatki w wyznaczonym miejscu do wycięcia na stanowisku montażowym. Ostrożnie przenieś zeszkloną siatkę z pudełka z siatką i umieść ją w pierścieniu automatycznej siatki.

Teraz wyrównaj dysk, aby ustawić okrągły otwór na górze pierścienia automatycznej siatki i zespołu siatki. Aby przymocować siatkę do pierścienia automatycznej siatki, umieść narzędzie do wkładania zacisku C na górze siatki i delikatnie dociśnij, aby zabezpieczyć zacisk C w środku. Obróć dysk z powrotem i przenieś zmontowane siatki do schowka z automatyczną siatką.

Zmontuj kasetową stację ładowania i schłodź ją ciekłym azotem. Umieść skrzynkę magazynową z automatyczną siatką w stacji załadowczej. Przenieś zespół siatki ze skrzynki do przechowywania automatycznej siatki do kasety.

Użyj uchwytu, aby umieścić kasetę w kapsule automatycznego podajnika. Sprawdź pin w automatycznej ładowarce, aby potwierdzić jego swobodny ruch i upewnić się, że nie jest zamrożony. Akumulację cząstek w układach obserwowano na wszystkich badanych siatkach, niezależnie od warunków buforowych czy modyfikacji ładunku powierzchniowego.

Wyższe stężenie białka w połączeniu z ujemnie naładowanymi siatkami w dziewięciu milimolach mobstress, 50 milimolach chlorku sodu i 0,1 milimola buforu EDTA spowodowało pożądany rozkład pojedynczych cząstek w otworach siatki, zmniejszając tworzenie się macierzy białkowej. Ten zoptymalizowany warunek doprowadził do uzyskania wysokiej wartości współczynnika powierzchni stożkowej FSC wynoszącej 0,80 i wartości SCF wynoszącej 0,859, co potwierdza równomierny rozkład cząstek.