Name: Optymalizacja przygotowania próbek do kriogenicznej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-11T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Poznaj metodę optymalizacji przygotowania próbek do kriomikroskopii elektronowej, która rozwiązuje problem nierównomiernego rozkładu cząsteczek. Protokół zapewnia lepszą rozdzielczość w analizie struktur makromolekularnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Cooperative Center for Research Facilities (CCRF) (Sungkyunkwan University, Korea) za hojne udzielenie nam dostępu do ich obiektu kriogenicznego. Praca ta była wspierana przez grant National Research Foundation of Korea (NRF) finansowany przez rząd Korei (MSIT) dla K.K.K. (nr 2021M3A9I4022936). Wykorzystanie urządzeń kriogenicznych przez konsorcjum NEXUS było wspierane przez grant National Research Foundation of Korea RS-2024-00440289.

Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Oczyszczanie białka
<ol>
	<li>Indukuj ekspresję rekombinowanego MjsHSP16.5 w E. coli BL21(DE3) i oczyść białko za pomocą kolumny chromatograficznej chelatującej nikiel, jak opisano wcześniej26. Po oczyszczeniu w kolumnie chromatografii wykluczania wielkości (SEC)26, zbadaj czystość białka, ładując 5 μl frakcji pikowych na 12,5% żel SDS-PAGE i wizualizując za pomocą standardowego barwienia na niebiesko Coomassie28 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Zagęścić frakcje puli zawierające MjsHSP16,5 w temperaturze 4 °C do około 65 mg/ml za pomocą filtrów odśrodkowych o masie cząsteczkowej 50 kDa, zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: Delikatnie pipetować roztwór białka co 5 minut podczas wirowania, aby zapobiec agregacji białek.</li>
	<li>Po zagęszczeniu odwirować próbkę o stężeniu 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia agregatów, podzielić supernatant na objętość 50 μl w cienkościennych probówkach do PCR o pojemności 0,2 ml, błyskawicznie zamrozić probówki w ciekłym azocie i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie białka do obrazowania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)
<ol>
	<li>Rozmrozić dwie zamrożone rurki białkowe na lodzie. Po rozmrożeniu delikatnie wymieszać roztwór, kilkakrotnie przesuwając probówkę, aby zapewnić jednorodność, a następnie odwirować roztwór białka o sile 16 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia agregatów.</li>
	<li>Wstrzyknąć supernatant do kolumny SEC i zebrać 0,5 ml frakcji elucyjnej.</li>
	<li>Zebrać frakcje elucyjne odpowiadające pikowi wykazującemu najwyższą absorbancję UV przy 280 nm i zmierzyć stężenie białka w tych frakcjach za pomocą testu Bradforda29. 
	UWAGA: Aby zapewnić wystarczające stężenie białka w pojedynczej frakcji szczytowej do dalszych zastosowań, konieczne jest załadowanie dużej ilości próbki białka do kolumny SEC przy jednoczesnym zachowaniu zalecanej pojemności kolumny.</li>
</ol>
3. Wymiana bufora
<ol>
	<li>Przygotować żądany roztwór buforowy (9 mM MOPS-Tris (pH 7,2), 50 mM NaCl i 0,1 mM EDTA), podzielić na zlewki o pojemności 50 ml i utrzymywać zlewki buforowe w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Opierając się na wcześniejszej wiedzy na temat biochemii białka docelowego, przygotuj różne roztwory buforowe o różnym składzie (typy, pH i siła jonowa), takie jak 20 mM HEPES (pH 7,5), 100 mM NaCl i 0-5 mM DTT, aby zidentyfikować warunki, które promują optymalną rozpuszczalność, jednorodność i stabilność białek w dalszym przygotowaniu siatki.</li>
	<li>Przygotować membranę do dializy zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Pociąć membranę dializacyjną na kawałki o wymiarach 30 mm x 30 mm za pomocą nożyczek. Zrównoważ te błony, inkubując je w wodzie destylowanej lub roztworach buforowych (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A).</li>
	<li>Dodać 55 μl roztworu białkowego (około 2,5 mg/ml) do komory z 50-μl guzikami do mikrodializy (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</li>
	<li>Trzymaj membranę dializacyjną pionowo za pomocą kleszczy i delikatnie dotknij jedną krawędzią membrany o bibułę, aby odsączyć nadmiar płynu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3C). Ostrożnie przykryj przycisk mikrodializy membraną, upewniając się, że do komory mikrodializy nie dostały się pęcherzyki powietrza (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3D). Umieść O-ring na membranie dializy. Delikatnie wtocz O-ring w rowek na krawędzi przycisku.</li>
	<li>Alternatywna metoda: Umieść O-ring wzdłuż osi koszulki golfowej i ustaw koszulkę golfową do góry nogami na membranie (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3E). Delikatnie przesuń O-ring w dół koszulki golfowej, aż zsunie się na krawędź przycisku (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3F). Ostrożnie wprowadź O-ring w rowek na krawędzi przycisku (Rysunek 3G).</li>
	<li>Zanurz każdy przycisk dializy w oddzielnej zlewce zawierającej bufor docelowy stroną z membraną skierowaną do góry (<silna klasa="xfig">Rysunek 3H).</li>
	<li>Podczas procesu dializy należy utrzymywać zlewki w temperaturze 4 °C. Po 2 godzinach należy zmienić bufor dializacyjny i kontynuować dializę przez noc.</li>
	<li>Użyj strzykawki z cienką igłą (np. strzykawki Hamilton lub strzykawki insulinowej), aby ostrożnie przebić membranę i odzyskać roztwór białka z komory mikrodializy (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 3I). Przechowuj próbkę białka w probówce do mikrowirówki na lodzie do czasu dalszego użycia. Zmierz stężenie białka za pomocą testu Bradforda29.</li>
</ol>
4. Przygotowanie siatki
<ol>
	<li>Wybierz odpowiedni typ siatki. 
	UWAGA: Powszechnie stosuje się amorficzną, dziurawą folię węglową na miedzianym podłożu. Grubość folii węglowej, rozmiar otworu i liczbę oczek należy dobrać na podstawie żądanej grubości lodu. Do przygotowania próbki MjsHSP16.5 użyto siatek pokrytych węglem Holey.</li>
	<li>Delikatnie chwyć kratki za krawędzie za pomocą pęsety, aby uniknąć uszkodzenia otworów siatki. Umieść kratki na uchwycie siatki stroną z włókna węglowego skierowaną do góry. Umieść uchwyt siatki w komorze systemu wyładowań jarzeniowych.</li>
	<li>Wykonaj wyładowanie jarzeniowe przez 60 s przy 15 mA, aby siatka stała się hydrofilowa. Podczas tego procesu zaleca się zastosowanie ładunku ujemnego. 
	UWAGA: Zalecane parametry służą jako punkt wyjścia dla systemu wyładowań jarzeniowych zastosowanego w tym badaniu. Optymalizacja może być konieczna w zależności od typu przyrządu do wyładowań jarzeniowych i w celu osiągnięcia pożądanego poziomu hydrofilowości dla określonych materiałów siatek. W przypadku czyszczenia plazmowego należy rozważyć przetestowanie alternatywnych gazów lub mieszanin gazów, takich jak wodór lub mieszaniny argonu i tlenu.</li>
	<li>Opcjonalny krok: wprowadzić dodatkowe roztwory chemiczne, takie jak 99% amylaminy w otwartej szklanej butelce, do komory przylegającej do uchwytu siatki, aby specyficznie wytworzyć dodatni ładunek netto na siatce.</li>
	<li>Użyj rozładowanych kratek w ciągu 0,5-1 godziny, aby zapewnić optymalną wydajność.</li>
</ol>
5. Przygotowanie siatki do barwienia negatywnego
<ol>
	<li>Załadować 5 μl próbki (50-300 nM lub 20-120 ng/ml) na rozżarzoną siatkę. Pozostawić próbkę w spokoju na powierzchni siatki przez 1 minutę, aby ułatwić osadzanie się białek.</li>
	<li>Przygotuj trzy krople wody po 50 μl każda na arkuszu folii parafinowej. Delikatnie umyj próbkę na siatce, pocierając powierzchnię siatki o powierzchnię pierwszej kropli wody. Powtórz krok prania z pozostałymi dwiema kroplami wody. 
	UWAGA: Czas prania może być zoptymalizowany zgodnie ze specyficznymi wymaganiami każdego eksperymentu.</li>
	<li>Załadować 5 μl przefiltrowanego 1% (w/v) roztworu octanu uranylu na siatkę i natychmiast odpipetować roztwór octanu uranylu.</li>
	<li>Załadować kolejne 5 μl 1% (w/v) roztworu octanu uranylu na siatkę. Pozostawić siatkę do inkubacji w roztworze octanu uranylu przez 90 s w celu barwienia. 
	UWAGA: Czas barwienia można dostosować i zoptymalizować w zależności od konkretnych próbek.</li>
	<li>Delikatnie dotknij strony pęsety siatki bibułą filtracyjną, aby usunąć nadmiar roztworu barwiącego. Pozostaw kratkę do całkowitego wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej. Przechowuj wysuszoną siatkę w pojemniku z siatką w temperaturze pokojowej do czasu obserwacji.</li>
</ol>
6. Witryfikacja próbki
<ol>
	<li>Rozcieńczyć próbkę białka do pożądanego stężenia. 
	UWAGA: Stężenie białka powinno być wystarczająco wysokie, aby zmaksymalizować liczbę cząstek w każdym otworze, ale wystarczająco niskie, aby zapewnić rozkład pojedynczych cząstek. Stężenia białek Cryo-EM zwykle wahają się od 0,5 do 2 mg/ml. Jednak niektóre białka, w zależności od ich masy cząsteczkowej i specyficznych warunków przygotowania próbki, mogą wymagać stężeń spoza tego zakresu.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 16 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia wszelkich osadów.</li>
	<li>Włącz przyrząd do zamrażania wgłębnego. Napełnij zbiornik nawilżacza wodą destylowaną. Zamontuj bibułę filtracyjną z pierścieniami na podkładkach do bibuły. Ustaw parametry witryfikacji (temperatura: 4 °C, wilgotność: 100%, czas osuszania: 6 s, siła klestania: 5 jednostek, czas oczekiwania: 10 s). 
	UWAGA: Czas i siła osuszania są ważnymi parametrami dla optymalizacji urządzenia do witryfikacji, ponieważ usuwanie wody z siatki i narażenie cząstek na granicę faz powietrze-woda może wywołać dysocjację lub odchylenie orientacji.</li>
	<li>Zamontuj elementy pojemnika kriogenicznego, w tym mosiężny kubek, uchwyt na siatkę, jednostkę pająka i pierścień zapobiegający skażeniu, w tacce podstawowej. Schłodzić zespół pojemnika, napełniając tackę ciekłym azotem. Napełnij mosiężny kubek kriogenem (ciekłym etanem). Usuń jednostkę pająka, gdy kriogen osiągnie temperaturę topnienia.</li>
	<li>Zamontuj pęsetę i zespół siatki na instrumencie, załaduj próbkę (zwykle 4 μl) na węglową stronę siatki i rozpocznij proces zamrażania wgłębnego.</li>
	<li>Ostrożnie odczep pęsetę od instrumentu, umieść siatkę na siatce do przechowywania i zamknij pudełko pokrywką. Pojemnik siatkowy zawierający zeszklone próbki należy przechowywać w ciekłym azocie.</li>
</ol>
7. Wczytywanie siatek do TEM
<ol>
	<li>Zmontuj stację montażową autogrid i schłodź ją ciekłym azotem.</li>
	<li>Umieść pudełko kratowe zawierające zeszklone kratki i ostrożnie odkręć pokrywę, aby uzyskać dostęp do kratek. Umieść w pobliżu pustą skrzynkę do przechowywania automatycznej siatki, aby łatwo przenieść zmontowane siatki.</li>
	<li>Umieść pierścień automatycznej siatki w wyznaczonym miejscu na pierścień na stanowisku montażowym. Ostrożnie przesuń zeszkloną siatkę z pudełka z siatką i włóż ją do pierścienia automatycznej siatki. Upewnij się, że siatka i pierścień są wyrównane.</li>
	<li>Wyrównaj dysk, aby ustawić otwór w okręgu na górze pierścienia automatycznej siatki i zespołu siatki. Aby zamocować siatkę w pierścieniu automatycznej siatki, umieść narzędzie do wstawiania C-clip na górze siatki i delikatnie dociśnij, aby zatrzasnąć C-clip w środku.</li>
	<li>Obróć dysk z powrotem i przenieś zmontowane siatki do schowka automatycznej siatki.</li>
	<li>Zmontuj kasetową stację ładowania i schłodzić stację ładowania ciekłym azotem.</li>
	<li>Umieść schowek na autosiatkę w stacji załadowczej. Przenieś zespół siatki ze skrzynki do przechowywania automatycznej siatki do kasety i delikatnie postukaj w siatkę, aby zapewnić prawidłowe umieszczenie.</li>
	<li>Użyj uchwytu, aby umieścić kasetę w kapsule automatycznego podajnika. Sprawdź pin w autoloaderze, aby potwierdzić jego swobodny ruch i upewnić się, że nie jest zamrożony.</li>
	<li>Zadokuj kapsułę automatycznego ładowania do TEM w celu obserwacji siatki.</li>
</ol>

<ol><li>Faruqi, A. R., Mcmullan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+detectors+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Electronic detectors for electron microscopy.</a> Q Rev Biophys. 44 (3), 357-390 (2011).</li>
<li>Hamaguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+cryo-EM+system+for+single+particle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">A new cryo-EM system for single particle analysis.</a> J Struct Biol. 207 (1), 40-48 (2019).</li>
<li>Kimanius, D., Dong, L., Sharov, G., Nakane, T., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+automated+cryo-Em+single-particle+analysis+in+relion-4.0%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">New tools for automated cryo-Em single-particle analysis in relion-4.0.</a> Biochem J. 478 (24), 4169-4185 (2021).</li>
<li>Punjani, A., Fleet, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3Dflex%3A+Determining+structure+and+motion+of+flexible+proteins+from+cryo-Em%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">3Dflex: Determining structure and motion of flexible proteins from cryo-Em.</a> Nat Methods. 20 (6), 860-870 (2023).</li>
<li>Chen, M., Schmid, M. F., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+resolution+and+resolvability+of+single-particle+cryo-EM+structures+using+gaussian+mixture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving resolution and resolvability of single-particle cryo-EM structures using gaussian mixture models.</a> Nat Methods. 21 (1), 37-40 (2024).</li>
<li>Arnold, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturizing+em+sample+preparation%3A+Opportunities%2C+challenges%2C+and+%26%2334%3Bvisual+proteomics%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Miniaturizing em sample preparation: Opportunities, challenges, and &#34;visual proteomics&#34;.</a> Proteomics. 18 (5-6), e1700176(2018).</li>
<li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (Pt 6), 560-571 (2018).</li>
<li>Han, B. G., Avila-Sakar, A., Remis, J., Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+making+ideal+cryo-Em+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Challenges in making ideal cryo-Em samples.</a> Curr Opin Struct Biol. 81, 102646(2023).</li>
<li>Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+in+cryo-em+single-particle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities in cryo-em single-particle analysis.</a> J Biol Chem. 294 (13), 5181-5197 (2019).</li>
<li>Naydenova, K., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+effects+of+particle+orientation+to+improve+the+efficiency+of+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Measuring the effects of particle orientation to improve the efficiency of electron cryomicroscopy.</a> Nat Commun. 8 (1), 629(2017).</li>
<li>Tan, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressing+preferred+specimen+orientation+in+single-particle+cryo-em+through+tilting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-em through tilting.</a> Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).</li>
<li>Liu, Y. T., Hu, J., Zhou, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+preferred+orientation+problem+in+cryo-EM+reconstruction+with+self-supervised+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Microanal%22%5BJournal%5D)">Resolving the preferred orientation problem in cryo-EM reconstruction with self-supervised deep learning.</a> Microsc Microanal. 29 (Supplement_1), 1918-1919 (2023).</li>
<li>Choy, B. C., Cater, R. J., Mancia, F., Pryor, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+10-year+meta-analysis+of+membrane+protein+structural+biology%3A+Detergents%2C+membrane+mimetics%2C+and+structure+determination+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">A 10-year meta-analysis of membrane protein structural biology: Detergents, membrane mimetics, and structure determination techniques.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1863 (3), 183533(2021).</li>
<li>Li, B., Zhu, D., Shi, H., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+charge+on+protein+preferred+orientation+at+the+air-water+interface+in+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Effect of charge on protein preferred orientation at the air-water interface in cryo-electron microscopy.</a> J Struct Biol. 213 (4), 107783(2021).</li>
<li>Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eliminating+effects+of+particle+adsorption+to+the+air%2Fwater+interface+in+single-particle+cryo-electron+microscopy%3A+Bacterial+RNA+polymerase+and+CHAPSO%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol+X%22%5BJournal%5D)">Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO.</a> J Struct Biol X. 1, 100005(2019).</li>
<li>Da Fonseca, P. C. A., Morris, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+reveals+the+conformation+of+a+substrate+analogue+in+the+human+20s+proteasome+core%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Commun%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM reveals the conformation of a substrate analogue in the human 20s proteasome core.</a> Nature Commun. 6 (1), 7575(2015).</li>
<li>Nguyen, T. H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+the+yeast+u4%2Fu6.U5+tri-snrnp+at+3.7+%C3%A5+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of the yeast u4/u6.U5 tri-snrnp at 3.7 å resolution.</a> Nature. 530 (7590), 298-302 (2016).</li>
<li>Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+oxide%3A+A+substrate+for+optimizing+preparations+of+frozen-hydrated+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples.</a> J Struct Biol. 170 (1), 152-156 (2010).</li>
<li>Palovcak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+robust+procedure+for+preparing+graphene-oxide+cryo-em+grids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-em grids.</a> J Struct Biol. 204 (1), 80-84 (2018).</li>
<li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+monolayers+improve+protein+distribution+on+holey+carbon+cryo-EM+supports%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports.</a> Sci Rep. 4 (1), 7084(2014).</li>
<li>Patel, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+human+tfiid+and+mechanism+of+TBP+loading+onto+promoter+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of human tfiid and mechanism of TBP loading onto promoter DNA.</a> Science. 362 (6421), eaau8872(2018).</li>
<li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+subunit+architecture+of+the+proteasome+regulatory+particle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle.</a> Nature. 482 (7384), 186-191 (2012).</li>
<li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressing+preferred+specimen+orientation+in+single-particle+cryo-em+through+tilting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-em through tilting.</a> Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).</li>
<li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+outcomes+when+optimizing+%27standard%27+sample+preparation+for+single-particle+cryo-em%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-em.</a> J Microsc. 276 (1), 39-45 (2019).</li>
<li>Xu, Y., Dang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+technical+advances+in+sample+preparation+for+single-particle+cryo-em%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Recent technical advances in sample preparation for single-particle cryo-em.</a> Front Mol Biosci. 9, 892459(2022).</li>
<li>Lee, J., Ryu, B., Kim, T., Kim, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-em+structure+of+a+16.5-kda+small+heat-shock+protein+from+Methanocaldococcus+jannaschii%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Cryo-em structure of a 16.5-kda small heat-shock protein from Methanocaldococcus jannaschii.</a> Int J Biol Macromol. 258 (Pt 1), 128763(2024).</li>
<li>Kim, K. K., Kim, R., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+small+heat-shock+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a small heat-shock protein.</a> Nature. 394 (6693), 595-599 (1998).</li>
<li>Chakavarti, B., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+separation+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic separation of proteins.</a> J Vis Exp. (16), e758(2008).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Kim, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((crystallization%2C+and+preliminary+x-ray+crystallographic+data+analysis+of+small+heat+shock+protein+homolog+from+Methanococcus+jannaschii%2C+a+hyperthermophile%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">crystallization, and preliminary x-ray crystallographic data analysis of small heat shock protein homolog from Methanococcus jannaschii, a hyperthermophile.</a> J Struct Biol. 121 (1), 76-80 (1998).</li>
<li>Kim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+chaperone+activity+of+the+small+heat-shock+protein+of+Methanococcus+jannaschii%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of chaperone activity of the small heat-shock protein of Methanococcus jannaschii.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (14), 8151-8155 (2003).</li>
<li>Shi, J., Koteiche, H. A., Mchaourab, H. S., Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryoelectron+microscopy+and+EPR+analysis+of+engineered+symmetric+and+polydisperse+hsp16.5+assemblies+reveals+determinants+of+polydispersity+and+substrate+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cryoelectron microscopy and EPR analysis of engineered symmetric and polydisperse hsp16.5 assemblies reveals determinants of polydispersity and substrate binding.</a> J Biol Chem. 281 (52), 40420-40428 (2006).</li>
<li>Kim, R., Kim, K. K., Yokota, H., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+heat+shock+protein+of+Methanococcus+jannaschii%2C+a+hyperthermophile%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Small heat shock protein of Methanococcus jannaschii, a hyperthermophile.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95 (16), 9129-9133 (1998).</li>
<li>Zbacnik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+buffers+in+protein+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of buffers in protein formulations.</a> J Pharm Sci. 106 (3), 713-733 (2017).</li>
<li>Collins, B., Stevens, R. C., Page, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+optimum+solubility+screening%3A+Using+crystallization+results+to+identify+the+optimal+buffer+for+protein+crystal+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">Crystallization optimum solubility screening: Using crystallization results to identify the optimal buffer for protein crystal formation.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 61 (Pt 12), 1035-1038 (2005).</li>
<li>D'arcy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+proteins+-+A+rational+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Crystallizing proteins - A rational approach.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50 (Pt 4), 469-471 (1994).</li>
<li>Jancarik, J., Pufan, R., Hong, C., Kim, S. H., Kim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimum+solubility+%28os%29+screening%3A+An+efficient+method+to+optimize+buffer+conditions+for+homogeneity+and+crystallization+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Optimum solubility (os) screening: An efficient method to optimize buffer conditions for homogeneity and crystallization of proteins.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60 (Pt 9), 1670-1673 (2004).</li>
<li>Zhang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+selecting+the+ph+of+protein+solutions+to+enhance+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">A strategy for selecting the ph of protein solutions to enhance crystallization.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 69 (Pt 7), 821-826 (2013).</li>
<li>Basanta, B., Hirschi, M. M., Grotjahn, D. A., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+case+for+glycerol+as+an+acceptable+additive+for+single-particle+cryo-EM+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">A case for glycerol as an acceptable additive for single-particle cryo-EM samples.</a> Acta Crystallogr D Struct Biol. 78 (Pt 1), 124-135 (2022).</li>
<li>Michon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+surfactants+in+electron+cryo-microscopy+film+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Role of surfactants in electron cryo-microscopy film preparation.</a> Biophys J. 122 (10), 1846-1857 (2023).</li>
<li>Chen, S., Li, J., Vinothkumar, K. R., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+human+erythrocyte+catalase+with+air-water+interface+in+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Interaction of human erythrocyte catalase with air-water interface in cryo-EM.</a> Microscopy (Oxf). 71 (Supplement_1), i51-i59 (2022).</li>
<li>Vinothkumar, K. R., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+particle+electron+cryomicroscopy%3A+Trends%2C+issues+and+future+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Single particle electron cryomicroscopy: Trends, issues and future perspective.</a> Q Rev Biophys. 49, e13(2016).</li>
<li>Kim, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+cryo-em+single+particle+analysis+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Benchmarking cryo-em single particle analysis workflow.</a> Front Mol Biosci. 5, 50(2018).</li>
<li>Bagby, S., Tong, K. I., Liu, D., Alattia, J. R., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+button+test%3A+A+small+scale+method+using+microdialysis+cells+for+assessing+protein+solubility+at+concentrations+suitable+for+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+NMR%22%5BJournal%5D)">The button test: A small scale method using microdialysis cells for assessing protein solubility at concentrations suitable for NMR.</a> J Biomol NMR. 10 (3), 279-282 (1997).</li>
<li>Gewering, T., Januliene, D., Ries, A. B., Moeller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Know+your+detergents%3A+A+case+study+on+detergent+background+in+negative+stain+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Know your detergents: A case study on detergent background in negative stain electron microscopy.</a> J Struct Biol. 203 (3), 242-246 (2018).</li>
<li>Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+sample+preparation+and+imaging+by+cryo-electron+microscopy+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology.</a> Methods. 100, 3-15 (2016).</li>
<li>Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+invisible+hands+of+sample+preparation+for+cryo-em%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-em.</a> Nat Methods. 18 (5), 463-471 (2021).</li>
<li>Earl, L. A., Falconieri, V., Milne, J. L., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM%3A+Beyond+the+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM: Beyond the microscope.</a> Curr Opin Struct Biol. 46, 71-78 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wszystkie badania strukturalne białek rozpoczynają się od oczyszczania białek, iteracyjnego procesu mającego na celu osiągnięcie równowagi między izolacją celów białkowych o wysokiej czystości i jednorodności przy jednoczesnym zachowaniu ich naturalnej funkcjonalności. Mimo że kompozycje buforowe do oczyszczania i konserwacji próbek białek są starannie wybierane podczas procesu oczyszczania, te często stanowią wyzwanie podczas późniejszego przygotowywania próbek krio-EM i obrazowania6. Problem ten...

Dzięki najnowszym postępom zarówno w sprzęcie instrumentalnym1,2 i oprogramowaniu do przetwarzania obrazów3,4,5, kriogeniczna mikroskopia elektronowa (cryo-EM) stała się popularnym i potężnym narzędziem w nowoczesnej biologii strukturalnej. Pomimo tych przełomowych odkryć, nadal istnieją wąskie gardła w uzyskiwaniu struktur makromolekularnych o wysokiej rozdzielczości za pomocą cryo-EM. Jednym z takich istotnych wyzwań jest nierównomierny rozkład cząstek, w tym zjawisko preferencji orientacji, które obserwuje się głównie na granicy faz powietrze-woda6,7,8,9.
Podczas witryfikacji próbki, niektóre cząsteczki wykazują tendencję do ustawiania się wzdłuż określonych osi na siatce. Prowadzi to do nierównomiernego rozkładu widoków cząstek w końcowym zbiorze danych. Niektóre orientacje mogą być nadreprezentowane, podczas gdy inne są niedostatecznie reprezentowane lub całkowicie nieobecne, co skutkuje niepełnym próbkowaniem całkowitej architektury białka. Regiony białka, które są preferencyjnie zorientowane w kierunku wiązki elektronów, będą bardziej widoczne na mapie gęstości, podczas gdy regiony zorientowane z dala od wiązki mogą być słabo rozdzielone lub całkowicie ich brakować10,11. W związku z tym nierównomierny rozkład cząstek wprowadza potencjalne odchylenia i artefakty do końcowej, zrekonstruowanej struktury trójwymiarowej (3D). Warto zauważyć, że kluczowe elementy strukturalne, takie jak helisy alfa i arkusze beta, mogą ulec przekrzywieniu, łańcuchy aminokwasów lub nukleotydów mogą wydawać się pofragmentowane, a gęstości określonych segmentów białek lub kwasów nukleinowych mogą wykazywać zniekształcenia12. Ostatecznie, te błędne interpretacje stanowią poważne wyzwanie dla dokładnego rozwikłania struktury i funkcji cząsteczek biologicznych.
Różne eksperymentalne podejścia są obecnie stosowane w celu przezwyciężenia takich wyzwań, w tym optymalizacja przygotowania próbek13,14,15, leczenie siatki16,17,18,19,20,21,22, oraz strategia zbierania danych23. W szczególności zaleca się, aby w miarę możliwości zająć się tym wyzwaniem na etapie przygotowania próbki7. Typowe optymalizacje w przygotowaniu próbek obejmują modyfikację składu buforu, wprowadzanie małocząsteczkowych lub makromolekularnych partnerów wiążących, generowanie wewnątrzcząsteczkowych wiązań krzyżowych i różne detergenty. Dotyczy to również białek błonowych24,25, chociaż detergenty muszą być używane specjalnie do celów oczyszczania i stabilizacji. Wśród nich możliwość dostosowania, opłacalność i powszechna dostępność optymalizacji białkowych sprawiają, że jest to preferowana strategia w większości laboratoriów. Takie podejście pozwala na precyzyjne i natychmiastowe dostosowanie różnych parametrów w celu dopasowania do specyficznych wymagań każdej próbki białka. Dzięki iteracyjnemu doskonaleniu naukowcy mogą systematycznie testować różne warunki buforowe i dostosowywać różne parametry w celu zminimalizowania preferowanych orientacji i poprawy ogólnej jakości danych krio-EM. Proste zmienianie składników bufora białkowego i dostosowywanie ich stężeń wykazało skuteczność w wpływaniu na stabilność białek poprzez modulację ładunku powierzchniowego, co w konsekwencji wpływa na zachowanie białek w ciele szklistym lodu25. Dlatego optymalizacja składu buforu białkowego jest uważana za jedno z najwygodniejszych i najprostszych podejść do rozwiązywania typowych problemów w cryo-EM.
Tutaj sugerowany jest protokół do rozwiązania powszechnej przeszkody w cryo-em - pokonania nierównomiernego rozkładu cząstek. W tym protokole przedstawiono kluczowe procedury przygotowania białek i badań przesiewowych, uzupełnione przygotowaniem siatki, przy użyciu małego białka szoku cieplnego z Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5)26 jako studium przypadku (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Ten sHSP jest natywnie stabilny, ma masę cząsteczkową 16,5 kDa na monomer i składa się w 24-merową klatkę oktaedryczną26,27, co czyni go atrakcyjnym kandydatem do analizy strukturalnej za pomocą cryo-EM. Jednak obserwacja nierównomiernego rozkładu cząstek podczas zbierania danych kriogenicznych nie była przewidziana i okazało się to poważnym wyzwaniem podczas eksperymentów. Ponadto omówiono potencjalne podejścia przydatne dla naukowców zajmujących się podobnymi wyzwaniami, ułatwiając w ten sposób skuteczne wyjaśnienie struktur makromolekularnych za pomocą cryo-EM.

<table><tbody><tr><td>14-mililitrowa probówka z okrągłym dnem</td><td>SPL Nauki Przyrodnicze</td><td>40114</td><td></td></tr><tr><td>250 &micro; L Strzykawka gazoszczelna Model 1725 LTN</td><td>Hamilton</td><td>81100</td><td>Igła cementowa, rozmiar 22s, 2 cale, styl punktowy 2</td></tr><tr><td>50 i mikro; L Przycisk do dializy</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-326</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Szklana zlewka</td><td>DIAMOND</td><td>HA.1010D.50</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTA pure 25 L</td><td>Cytiva</td><td>29018224</td><td>FPLC</td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15</td><td>Millipore</td><td>UFC905024</td><td>50-KDa NMWL</td></tr><tr><td>Bradford Odczynnik</td><td>Supelco</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>Dumoxel Style N5</td><td>Dumont</td><td>0103-N5-PO</td><td></td></tr><tr><td>Glacios 2 Cryo-TEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>GLACIOSTEM</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td><td>Cytiva</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówka wirówkowa 1,5 ml</td><td>HD Micro</td><td>H23015</td><td></td></tr><tr><td>Probówki PCR 0,2 ml, płaska nakrętka</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>PELCO easiGlow Jednostka wyładowcza</td><td>Ted Pella</td><td>91000</td><td></td></tr><tr><td>PELCO TEM Blok uchwytu siatkowego</td><td>Ted Pella</td><td>16820-25</td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil R 1.2/1.3 200 Mesh, Cu</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>Q2100CR1.3</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 3 RC Rurki membranowe do dializy&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>086705B</td><td>3500 Dalton MWCO</td></tr><tr><td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td><td>Cytiva</td><td>29091596</td><td></td></tr><tr><td>octan uranylu</td><td>Merck</td><td>8473</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>VITROBOT</td><td></td></tr><tr><td>VitroEase Zestaw do przesiewania i detergenty</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A49856</td><td></td></tr></tbody></table>

optymalizacja przygotowania próbek do kriogenicznej mikroskopii elektronowej

Optimizing Sample Preparation for Cryogenic Electron Microscopy

Kriogeniczna mikroskopia elektronowa (cryo-EM) zrewolucjonizowała biologię strukturalną, umożliwiając badanie struktur makromolekularnych w warunkach zbliżonych do rodzimych, zawieszonych w szklistym lodzie. Technika ta pozwala na wizualizację białek i innych biomolekuł w wysokiej rozdzielczości bez konieczności krystalizacji, oferując istotny wgląd w ich funkcję i mechanizm. Ostatnie postępy w analizie pojedynczych cząstek, w połączeniu z ulepszonym przetwarzaniem danych obliczeniowych, sprawiły, że cryo-EM stał się nieodzownym narzędziem we współczesnej biologii strukturalnej. Pomimo rosnącego zastosowania, cryo-EM stoi w obliczu ciągłych wyzwań, które mogą ograniczać jego skuteczność, w szczególności nierównomiernego rozkładu cząstek. Problem ten często prowadzi do słabej rozdzielczości i zmniejszonej dokładności w zrekonstruowanych strukturach białkowych. W tym artykule przedstawiono proste, praktyczne podejście do rozwiązania tego problemu, na przykładzie małego białka szoku cieplnego z Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5). Metoda optymalizuje przygotowanie próbki w celu zminimalizowania preferencyjnej adsorpcji, zapewniając bardziej jednorodny rozkład cząstek i wyższej jakości struktury krio-EM białek. Technika ta stanowi cenne wskazówki dla badaczy dążących do przezwyciężenia podobnych wyzwań w badaniach strukturalnych.

Aby zidentyfikować optymalne warunki przygotowania siatek dla MjsHSP16.5, przeprowadzono wstępne badania przesiewowe metodą cryo-EM, koncentrując się przede wszystkim na badaniu różnych warunków buforu białkowego: (1) końcowego buforu oczyszczania, który zapewnia stabilność i homogeniczność MjsHSP16.5 i jest istotny dla jego krystalizacji30; (2) buforów dostosowanych do warunków niezbędnych do wzrostu kryształów MjsHSP16.5 o wysokiej jakości dyfrakcyjnej30; oraz (3) buforów...

Ten protokół przedstawia praktyczną metodę wykorzystującą Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) jako przykład rozwiązania problemu nierównomiernego rozkładu cząstek poprzez optymalizację przygotowania próbki, stanowiąc punkt odniesienia dla badaczy do efektywnego wyjaśniania struktur makromolekularnych za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryo-EM).

Optymalizacja przygotowania próbek do kriogenicznej mikroskopii elektronowej

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native ...

Przygotowanie próbek kriogenicznych wiąże się z wyzwaniami, które mogą ograniczyć ich skuteczność, w szczególności z nierównomiernym rozkładem cząstek. Problem ten często prowadzi do słabej rozdzielczości i zmniejszonej dokładności w nowo konstruowanych strukturach białkowych. W celu przezwyciężenia nierównomiernego rozkładu cząstek stosuje się różne podejścia eksperymentalne, w tym dodawanie detergentów lub naśladowców membran do próbki, modyfikację folii nośnej siatki i przechylanie określonego etapu podczas zbierania danych.Protokół ten analizuje prostą, praktyczną metodę rozwiązywania problemów związanych z nierównomiernym rozkładem cząstek poprzez optymalizację przygotowania próbek, zapewniając naszym odniesieniem dla naukowców do skutecznego zilustrowania struktur makromolekuł za pomocą kriogenu. Aby rozpocząć, zbierz zbiorcze frakcje białkowe zawierające małe białko szoku cieplnego MJ 16.5. Użyj filtrów odśrodkowych z granicą masy cząsteczkowej 50 kilodaltonów, aby skoncentrować frakcje w temperaturze czterech stopni Celsjusza do około 65 miligramów.Po zagęszczeniu odwirować próbkę o stężeniu 16 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu usunięcia kruszyw. Podzielić 50 mikrolitrów objętości supernatantu na 0,2 mililitra cienkościennych probówek PCR. W przypadku transmisyjnej mikroskopii elektronowej rozmrozić dwie zamrożone probówki białkowe na lodzie.Po rozmrożeniu przesuń rurkę kilka razy, aby wymieszać. Następnie odwirować roztwór białka o stężeniu 16 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu usunięcia agregatów. Następnie wstrzyknąć supernatant do kolumny chromatograficznej wykluczającej wielkość i zebrać 0,5 mililitra frakcji elucyjnej.Zbierz frakcje elucjańskie odpowiadające pikowi, wykazujące najwyższą absorbancję ultrafioletu przy 280 nanometrach. W celu wymiany buforu za pomocą nożyczek pokrój membranę dializacyjną na kawałki o wymiarach 30 na 30 milimetrów. Inkubować kawałki w wodzie destylowanej lub roztworach buforowych, aby je zrównoważyć.Następnie dodaj 55 mikrolitrów roztworu białkowego do komory z przyciskami do mikrodializy o pojemności 50 mikrolitrów. Trzymaj membranę dializacyjną pionowo za pomocą kleszczy i delikatnie dotknij jedną krawędzią membrany o bibułę, aby odsączyć nadmiar płynu. Ostrożnie przykryj przycisk do mikrodializy membraną.Umieść pierścień uszczelniający o przekroju okrągłym na membranie dializacyjnej i delikatnie zwiń go w rowek na krawędzi przycisku. Zanurzyć każdy przycisk dializy w oddzielnej zlewce zawierającej bufor docelowy, stroną z membraną skierowaną do góry. Za pomocą strzykawki z cienką igłą ostrożnie przebić membranę i odzyskać roztwór białka z komory do mikrodializy.Załaduj pięć mikrolitrów próbki o stężeniu od 20 do 120 nanogramów na mililitr na siatkę rozżarzenia. Przygotuj trzy krople wody po 50 mikrolitrów każda na arkuszu folii parafinowej. Pocieraj powierzchnię siatki o krople wody, aby umyć próbkę.Teraz załaduj pięć mikrolitrów przefiltrowanego 1% roztworu octanu pisuaru na siatkę i natychmiast odpipetuj roztwór octanu pisuaru. Załaduj kolejne pięć mikrolitrów roztworu octanu pisuaru na siatkę. Delikatnie dotknij strony pęsety siatki bibułą filtracyjną, aby usunąć nadmiar roztworu barwiącego i pozostaw siatkę do wyschnięcia.Zamontuj pęsetę i zespół siatki wyładowczej jarzeniowej na instrumencie. Następnie załaduj cztery mikrolitry próbki na węglową stronę siatki. Zainicjuj proces zamrażania wgłębnego.Aby przygotować siatki do załadowania do transmisyjnego mikroskopu elektronowego lub TEM, najpierw umieść skrzynkę siatkową zawierającą zeszklone siatki w stacji montażu automatycznej siatki i odkręć pokrywę pudełka siatkowego zawierającego zeszklone siatki. Umieść pierścień automatycznej siatki w wyznaczonym miejscu do wycięcia na stanowisku montażowym. Ostrożnie przenieś zeszkloną siatkę z pudełka z siatką i umieść ją w pierścieniu automatycznej siatki.Teraz wyrównaj dysk, aby ustawić okrągły otwór na górze pierścienia automatycznej siatki i zespołu siatki. Aby przymocować siatkę do pierścienia automatycznej siatki, umieść narzędzie do wkładania zacisku C na górze siatki i delikatnie dociśnij, aby zabezpieczyć zacisk C w środku. Obróć dysk z powrotem i przenieś zmontowane siatki do schowka z automatyczną siatką.Zmontuj kasetową stację ładowania i schłodź ją ciekłym azotem. Umieść skrzynkę magazynową z automatyczną siatką w stacji załadowczej. Przenieś zespół siatki ze skrzynki do przechowywania automatycznej siatki do kasety.Użyj uchwytu, aby umieścić kasetę w kapsule automatycznego podajnika. Sprawdź pin w automatycznej ładowarce, aby potwierdzić jego swobodny ruch i upewnić się, że nie jest zamrożony. Akumulację cząstek w układach obserwowano na wszystkich badanych siatkach, niezależnie od warunków buforowych czy modyfikacji ładunku powierzchniowego.Wyższe stężenie białka w połączeniu z ujemnie naładowanymi siatkami w dziewięciu milimolach mobstress, 50 milimolach chlorku sodu i 0,1 milimola buforu EDTA spowodowało pożądany rozkład pojedynczych cząstek w otworach siatki, zmniejszając tworzenie się macierzy białkowej. Ten zoptymalizowany warunek doprowadził do uzyskania wysokiej wartości współczynnika powierzchni stożkowej FSC wynoszącej 0,80 i wartości SCF wynoszącej 0,859, co potwierdza równomierny rozkład cząstek.

optimizing-sample-preparation-for-cryogenic-electron-microscopy

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Kriomikroskopy elektronowe, zarówno skaningowe (SEM), jak i transmisyjne (TEM), są szeroko stosowane do charakteryzowania próbek biologicznych lub innych materiałów o wysokiej zawartości wody1. SEM/Focused Ion Beam (FIB) służy do identyfikacji interesujących cech próbek i ekstrakcji cienkiej, przezroczystej dla elektronów blaszki w celu przeniesienia do krio-TEM.

Przygotowanie próbki do mikroskopii krioelektronowej za pomocą skupionej wiązki jonów

Ten artykuł opisuje metodologię mikroskopii krioelektronowej, która jest używana do uzyskiwania wysokiej jakości mikroskopowych obrazów makrocząsteczek w ich stanie zbliżonym do natywnego. Metoda ta pozwala uzyskać obrazy nadające się do dalszego przetwarzania komputerowego przy użyciu podejścia pojedynczej cząstki, opracowanego w celu wygenerowania rekonstrukcji 3D makrocząsteczki.

Co robić, a czego nie robić w mikroskopii krioelektronowej: podstawa przygotowania próbek i gromadzenia wysokiej jakości danych do makromolekularnej rekonstrukcji 3D

Przedstawiono instrument i metody do przygotowania objętości próbek o rozmiarach nanolitrów do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nie są wymagane żadne etapy papierowego blottingu, co pozwala uniknąć szkodliwych konsekwencji, jakie może to mieć dla białek, znacznie zmniejszając utratę próbki i umożliwiając analizę lizatu pojedynczej komórki do wizualnej proteomiki.

Zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy protokół łączenia dwóch technik przetwarzania próbek, zamrażania wysokociśnieniowego i przetwarzania próbek wspomaganego mikrofalami, a następnie minimalnego zatapiania żywicy w celu pozyskiwania danych za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego z skupioną wiązką jonów (FIB-SEM). Wykazano to przy użyciu próbki nerwu piszczelowego myszy i Caenorhabditis elegans.

Przygotowanie próbki biologicznej poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem, wspomagane mikrofalami wzmocnienie kontrastu i minimalne zatapianie żywicy w celu obrazowania objętościowego

Ten protokół przedstawia szczegółową procedurę przygotowania biologicznych próbek kriogenicznych do eksperymentów z synchrotronową spektroskopią absorpcyjną promieniowania rentgenowskiego. Opisujemy wszystkie kroki wymagane do optymalizacji przygotowania próbek i kriokonserwacji wraz z przykładami protokołu z komórkami nowotworowymi i fitoplanktonem. Metoda ta zapewnia uniwersalny standard krioprzygotowania próbek.

Przygotowanie próbek biologicznych do specjacji w temperaturze kriogenicznej przy użyciu absorpcyjnej spektroskopii rentgenowskiej o wysokiej rozdzielczości

Techniki kriogenicznej skupionej wiązki jonów (FIB) i skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) mogą dostarczyć kluczowych informacji na temat chemii i morfologii nienaruszonych granic faz ciało stałe-ciecz. Szczegółowo omówiono metody sporządzania wysokiej jakości map spektroskopowych takich interfejsów z dyspersją energii (EDX), ze szczególnym uwzględnieniem urządzeń do magazynowania energii.

Charakterystyka granic faz ciecz-ciało stałe w nanoskali poprzez sprzężenie kriofokusowego mielenia wiązki jonów ze skaningową mikroskopią elektronową i spektroskopią

Stosunek sygnału do szumu danych jest jednym z najważniejszych czynników przy wykonywaniu pomiarów dyfrakcji rentgenowskiej z mikrokryształów. Linia badawcza VMXm zapewnia środowisko o niskim poziomie hałasu i mikrowiązkę do takich eksperymentów. W tym miejscu opisano metody przygotowania próbek do montażu i chłodzenia mikrokryształów dla VMXm i innych linii badawczych do krystalografii makromolekularnej mikrofokusowej.

Rurociąg przygotowania próbek mikrokryształów na linii badawczej VMXm

Określanie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą cryoEM stało się rutyną dla niektórych klas białek i kompleksów. W tym miejscu podsumowano ten proces (przygotowanie próbki, badanie przesiewowe, pozyskiwanie i przetwarzanie danych), a czytelnicy są kierowani do dalszych szczegółowych zasobów i zmiennych, które mogą ulec zmianie w przypadku trudniejszych próbek.

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Ten manuskrypt przedstawia metodę ręcznego zamrażania próbek biologicznych do kriogenicznej mikroskopii elektronowej z pojedynczymi cząstkami.

Ręczne zamrażanie próbek biologicznych metodą blot and plunge do kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek

Tutaj prezentujemy proces frezowania wiązki jonów z korelacją 3D, który kieruje przygotowaniem próbek komórkowych do tomografii krioelektronowej. Pozycja 3D fluorescencyjnie znakowanych białek będących przedmiotem zainteresowania jest najpierw określana za pomocą mikroskopii kriofluorescencyjnej, a następnie kierowana do mielenia. Protokół jest odpowiedni dla komórek ssaków, drożdży i bakterii.

Przygotowanie próbki za pomocą korelacyjnego mielenia wiązki jonów w 3D do tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości

Ta metoda zapewnia dostępny i elastyczny protokół do przygotowania siatek mikroskopii elektronowej (EM) do kriotomografii komórkowej in situ oraz korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM).

Przygotowanie próbki do kriotomografii in situ komórek ssaków

Poznaj metodę optymalizacji przygotowania próbek do kriomikroskopii elektronowej, która rozwiązuje problem nierównomiernego rozkładu cząsteczek. Protokół zapewnia lepszą rozdzielczość w analizie struktur makromolekularnych.

Optymalizacja przygotowania próbek do kriogenicznej mikroskopii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów