Name: Przygotowanie próbki do kriotomografii in situ komórek ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Poznaj metodę przygotowania próbek do kriotomografii komórek ssaków z wykorzystaniem fibronektyny wołowej i zanurzeniowego mrożenia. Protokół zapewnia skuteczne przyczepianie komórek do siatek EM z minimalnym uszkodzeniem warstwy węglowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować laboratorium Mansky'ego za dostęp do sprzętu do zamrażania wgłębnego. Część tych prac została przeprowadzona w ośrodku charakteryzacji Uniwersytetu Minnesoty, który otrzymuje częściowe wsparcie od Narodowej Fundacji Nauki (NSF) za pośrednictwem Centrum Badań Materiałowych i Inżynierii (MRSEC; Numer nagrody DMR-2011401) oraz National Neuroscience Curriculum Initiative (NNCI; Numer grantu ECCS-2025124). Chcielibyśmy podziękować za dofinansowanie z Centrum Zachowania HIV w Środowiskach Wirusowych (B-HIVE; 1U54AI170855-01) oraz Duke Center for HIV Structural Biology (DCHSB; U54AI170752) środek.

1. Przygotowanie siatki
UWAGA: W projekcie eksperymentalnym zaplanuj maksymalnie 8-12 siatek na sesję zamrażania wgłębnego i 4-5 siatek na odwiert. Co więcej, doprowadzi to do bardzo długiej sesji zamrażania wgłębnego, co może spowodować zwiększony stres komórek, zanieczyszczenie lodem i błędy użytkownika.
<ol>
	<li>Wyładowanie jarzeniowe
	<ol>
		<li>Załadować odpowiednią liczbę kratek perforowaną folią nośną z węgla, która ma być rozładowywana jarzeniowo pod ciśnieniem 15 mA przez 45 s w atmosferze 0,39 mBar w urządzeniu do rozładowywania jarzeniowego.</li>
		<li>Upewnij się, że strona siatki z włókna węglowego jest skierowana do góry. Po zakończeniu przenieś siatki do czystego pojemnika wyłożonego bibułą filtracyjną (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A1). 
		UWAGA: Można stosować inne siatki, o ile materiał nie jest toksyczny dla komórek (co wyklucza jakąkolwiek siatkę miedzianą). Siatki szukacza są przydatne w badaniach korelacyjnych. Możliwe są również kratki wykonane z innych materiałów. Wiele laboratoriów uzyskało dobre wyniki hodowli komórek na siatkach nośnych SiO28,9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie adherekcyjne
	<ol>
		<li>Przenieś siatki, fibronektynę, PBS, płytki i pęsetę do szafki bezpieczeństwa biologicznego. Potraktuj obie strony kratek 20 μg/ml fibronektyny bydlęcej, mikropipetując dwie obfite kropki przylegającego roztworu na sterylnej powierzchni, takiej jak wieczko płytki 6-dołkowej. Upewnij się, że kropki są wystarczająco duże, aby objąć całą siatkę (zalecane jest około 100 μl). 
		UWAGA: Przed przystąpieniem do leczenia wybranym roztworem przylegającym istnieje możliwość fotomikromodelowania siatki w celu optymalizacji przylegania komórek do środka kwadratów siatki. Zmniejszenie zdolności komórek do dołączania do pasków spowoduje zwiększenie liczby komórek, które można obrazować. Jest to idealne rozwiązanie do eksperymentów związanych z mieleniem krioFIB.</li>
		<li>Użyj pęsety 5/15, aby manipulować siatkami. Pamiętaj, aby potraktować obie strony siatki w roztworze. 
		UWAGA: Można stosować inne roztwory adhezyjne (fibrynogen, kolagen, inne składniki macierzy zewnątrzkomórkowej itp.). Stosuje się tutaj fibronektynę, ponieważ daje dobre wyniki przy szerokiej gamie linii komórkowych. (U2OS, HeLa, Vero, Calu-3, Tzm-bl). Pęseta 5/15 jest przydatna, ponieważ jej geometria pozwala na lepszą manewrowość wokół płytek 6-dołkowych, szalek 35 mm i mikroszkiełek. Skutkuje to mniejszymi naprężeniami mechanicznymi rusztów i bardziej nienaruszoną warstwą węglową. Przed rozpoczęciem upewnij się, że wszystkie wymagane materiały zostały umieszczone w komorze bezpieczeństwa biologicznego, ponieważ zmniejsza to możliwość zanieczyszczenia siatki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mocowanie siatek
	<ol>
		<li>Po potraktowaniu fibronektyną bydlęcą siatka stanie się lepka. Za pomocą pęsety 5/15 delikatnie dotknij niewęglowej powierzchni siatki do dna pustego naczynia/talerza i otwórz pęsetę. Siatka powinna łatwo przymocować się do nowej powierzchni (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A2). 
		UWAGA: Staraj się unikać umieszczania kratek w bezpośrednim środku lub na krawędziach naczynia/talerza. Podczas dodawania komórek występuje tendencja do gromadzenia się gęstości komórek w środku płytki. Może to spowodować powstanie siatek o nadmiernej gęstości komórkowej. Alternatywnie, drukowane w 3D uchwyty siatki mogą być tutaj używane zamiast dołączania komórek bezpośrednio do powierzchni naczynia/talerza12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja
	<ol>
		<li>Inkubować siatki przez 30 minut w roztworze przylegającym do fibronektyny (20 μg/ml). Aby upewnić się, że kratki nie wyschną podczas tego procesu, mikropipety 1-2 krople bardziej przylegającego roztworu bezpośrednio na kratki co 15 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A3). 
		UWAGA: Okres inkubacji będzie się różnić w zależności od użytego przylegającego roztworu. W przypadku fibronektyny bydlęcej zalecany czas to 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>mycie
	<ol>
		<li>Po okresie inkubacji usunąć nadmiar przylegającego roztworu za pomocą mikropipetowania. Umyj kratki, mikropipetując krople PBS bezpośrednio na kratkach. Powtórz to 2-3 razy. (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>sterylizacja
	<ol>
		<li>Użyj światła UV do sterylizacji siatek w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 1 godzinę. Umieść siatki jak najbliżej źródła UV, aby zmaksymalizować sterylizację (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A5). Aby upewnić się, że kratki nie wyschną podczas tego procesu, należy co 10 minut mikropipetować 1-2 krople PBS bezpośrednio na kratkach. 
		UWAGA: Kroki 1.4-1.6 można wykonać jednocześnie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Siatki wysiewu
<ol>
	<li>Policz komórki:
	<ol>
		<li>Odłącz i policz komórki metodami mechanicznymi lub enzymatycznymi. Określ optymalną liczbę komórek do użycia do wysiewu przed liczeniem. W przypadku U2OS wysiewanego na płytce 6-dołkowej użyj od 6 x 10 4 do 1,6 x 105 komórek na dołek (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B1). 
		UWAGA: Liczba wysianych komórek będzie się różnić w zależności od typu komórek, powierzchni studzienki, użytej płytki lub mikroszkiełka, czasu między wysiewem a zamrażaniem wgłębnym oraz projektu eksperymentalnego. Przetestuj zakres numerów komórek, aby zidentyfikować warunki, które spowodują 0,25-1 komórek na kwadrat siatki w momencie zamrażania wgłębnego. Ważne jest, aby pamiętać, że duża gęstość komórek zmniejsza szybkość wymiany ciepła i może wpływać na proces witryfikacji. Aby temu zaradzić, niektóre laboratoria odniosły sukces dzięki sitom komórkowym, które zapobiegają tworzeniu się grudek komórek13. Wreszcie, protokół ten powoduje losowe przyłączanie komórek do warstwy węglowej. Jeśli konieczne jest celowe doczepienie, można zastosować foto-mikrowzorzec (patrz krok 1.3)14.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodawanie komórek i pożywki wzrostowej: Dodaj komórki za pomocą mikropipety do studzienek, unikając pęcherzyków (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B2). W płytce 6-dołkowej zalecana jest całkowita objętość dołka 1,5-2,0 ml. 
	UWAGA: Zaleca się dokładne zwilżenie wokół kratek przed dodaniem całej objętości. Pomoże to zapobiec odłączaniu się i unoszeniu się siatek w roztworze. Delikatnie przesuwaj płytkę na boki, aby ułatwić równomierne rozmieszczenie komórek w studzience. Nie obracaj płytką ruchem okrężnym, ponieważ spowoduje to nadmierne zagęszczenie komórek w środku studzienki.</li>
	<li>Inkubacja: Inkubować szkiełka w temperaturze 37 °C przez odpowiedni czas, zgodnie z planem doświadczalnym, który będzie zależał od dalszych zastosowań. W tym przykładzie (transfekcja klonów molekularnych wirusa HIV) inkubuj między 16 a 24 godzinami (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B3). 
	UWAGA: Dłuższy czas inkubacji spowoduje więcej cykli podziału komórek. Dlatego odpowiednio dostosuj początkową liczbę komórek do wysiewu.</li>
</ol>
3. Transfekcja
<ol>
	<li>Przygotowanie mieszaniny transfekcyjnej:
	<ol>
		<li>Przygotuj odpowiedni kationowy odczynnik liposomowy do transfekcji plazmidu do wybranej linii komórkowej.</li>
		<li>W tym przykładzie transfekcji użyj 1 μg całkowitego plazmidowego DNA na studzienkę (na płytce 6-dołkowej), która ma być transfekowana w stosunku 1:3 plazmidu HIViΔEnv do plazmidu psPAX2. Dla każdego dołka rozcieńczyć 1 μg DNA w 50 μl DMEM bez surowicy. Homogenizować mieszaninę poprzez wielokrotne mikropipetowanie lub delikatne obracanie płytki.</li>
		<li>Dla każdej studzienki rozcieńczyć 3 μl odczynnika do transfekcji w DMEM bez surowicy, a następnie ponownie homogenizować mieszaninę przez mikropipetowanie lub delikatne wirowanie. Dodać całą rozcieńczoną mieszaninę odczynników do transfekcji do rozcieńczonej mieszaniny DNA (krok 3.1.2) i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 15 minut (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C1). 
		UWAGA: Podczas inkubacji tej mieszaniny zastąp pożywkę w studzienkach 1,5 ml świeżego DMEM. Uważaj, aby nie usunąć kratek z dna studni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby nanieść mieszaninę do transfekcji, należy odpipetować 100 μl mieszaniny z kroku 3.1.3 kroplami do każdej studzienki, koncentrując krople na siatkach, aby zapewnić kontakt (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C2). Zmień pożywkę 16-24 godziny po transfekcji (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C3).</li>
</ol>
4. Zamrażanie wgłębne
UWAGA: Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C, dopóki nie będą potrzebne do osuszania. Dodatkowo pamiętaj, aby zwrócić uwagę na węglową stronę kratek podczas całego procesu.
<ol>
	<li>Zagęszczenie komórek
	<ol>
		<li>Sprawdź siatki w odwróconym mikroskopie optycznym i zanotuj gęstość komórek na każdej siatce. 
		UWAGA: Siatki z mniej niż 0,25 komórki na kwadrat siatki (lub jedna komórka na 4 kwadraty siatki) są uważane za "puste". Siatki z 0,25-1 komórkami na kwadrat siatki są uważane za "normalne". Siatki z więcej niż 1 komórką na kwadrat siatki są uważane za "pełne".</li>
		<li>Zwróć uwagę na gęstość komórek na każdej siatce, aby umożliwić późniejsze ustawienie czasu blotowania podczas zamrażania wgłębnego. Dodać 2-3 ml PBS do pustego talerza/naczynia i ogrzać do 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie powierników
	<ol>
		<li>Aby przygotować złote referencje do dalszych zastosowań kriotomografii, należy pobrać pipetę z 50 μl koloidalnego roztworu kulek złota o długości 10 nm do czystej probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 2 μl 1 mg/ml BSA do probówki i wielokrotnie homogenizować przez mikropipetowanie.</li>
		<li>Odwirować probówkę o sile 15 000-20 000 x g przez 15 minut. Mikropipeta, aby usunąć jak najwięcej supernatantu bez naruszania osadu. 
		UWAGA: Pellet będzie bardzo luźny.</li>
		<li>Dodać 50 μl PBS do osadu i ponownie zawiesić. Ponownie odwirować probówkę przy 15 000-20 000 x g przez 15 minut.</li>
		<li>Za pomocą końcówki o pojemności 10 μl bezpośrednio odessać 4 μl granulki i przenieść ją do czystej probówki o pojemności 1,5 ml (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1D1). Użyj 1 μl umytego i skoncentrowanego złota na siatkę. 
		UWAGA: Rodzaj używanych powierników zależy od dalszych zastosowań. Do tomografii TEM użyj złotych koralików o długości fali 10 nm. Do miękkiej tomografii rentgenowskiej użyj złotych koralików o długości fali 200 nm. Do mikroskopii korelacyjnej użyj fluorescencyjnych kulek lateksowych. Fiduciale zwykle nie są konieczne do eksperymentów z udziałem mielenia krioFIB, ponieważ proces mielenia je zniszczy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blotting
	<ol>
		<li>Ustaw komorę środowiskową na 95% wilgotności i 30°C (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1D1). Wybierz siatkę za pomocą pęsety 5/15.</li>
		<li>Umyj kratki PBS i przenieś je do pęsety wgłębnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D2). Po zabezpieczeniu wyjmij pęsetę 5/15 i przesuń zacisk na pęsetę wgłębną.</li>
		<li>Włóż kratkę do zamrażarki wgłębnej, trzymając zacisk bezpiecznie (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1D3). Dodaj 1 μl złotych powierników na tylną stronę siatki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D4). Dodaj 2-3 μl PBS po stronie węglowej siatki. Użyj automatycznego bibuły, aby osuszyć tylną stronę siatki i zanurzyć zamrażanie w ciekłym etanie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D5). 
		UWAGA: Zaleca się, aby mieć od 3 do 4 μl objętości na siatkę dla optymalnego osuszania. Kratki mogą zachować zmienną ilość PBS po umyciu. Dostosuj dodaną objętość PBS, aby uwzględnić istniejące wcześniej zatrzymywanie cieczy na siatce. Zaleca się, aby złote powierniki zostały dodane na odwrocie siatki. Dodawanie z przodu może powodować tworzenie się puli złotych fiduciali w pobliżu miejsca włożenia, podczas gdy dodawanie z tyłu powoduje bardziej homogeniczne roztwór. Czas trwania blottingu zależy od stomatologii komórkowej siatki. 2 s dla pustych, 3 s dla normalnych i 4 s dla pełnych siatek. Rodzaj dostępnej zamrażarki wgłębnej może decydować o tym, w jaki sposób podchodzi się do blottingu: Zamrażarka wgłębna Leica GP2 jest używana w tym protokole i domyślnie jest w stanie automatycznie blokować jednostronne blotting. Thermo Fisher Vitrobot wykonuje automatyczne dwustronne bibułowanie, choć często uszkadza to komórki przymocowane po stronie węglowej. Możliwe jest również ręczne bibułowanie w Vitrobot, a także ręczne tłoki grawitacyjne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Preparation of Electron Microscopy Grids for In Situ Cellular Cryotomography

<ol><li>Zhang, P., Mendonça, L. Analysis of Viruses in the Cellular Context by Electron Tomography. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+P+%22Encyclopedia+of+Virology%22">Encyclopedia of Virology</a>. 1, Elsevier, Academic Press. 242-247 (2021).</li>
<li>Fäßler, F., Dimchev, G., Hodirnau, V. -V., Wan, W., Schur, F. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography+structure+of+Arp2%2F3+complex+in+cells+reveals+new+insights+into+the+branch+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography structure of Arp2/3 complex in cells reveals new insights into the branch junction.</a> Nature Communications. 11, 6437(2020).</li>
<li>McDowall, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+frozen+hydrated+sections+of+vitreous+ice+and+vitrified+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of frozen hydrated sections of vitreous ice and vitrified biological samples.</a> Journal of Microscopy. 131 (Pt 1), 1-9 (1983).</li>
<li>Stewart, M., Vigers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+frozen-hydrated+biological+material%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of frozen-hydrated biological material.</a> Nature. 319 (6055), 631-636 (1986).</li>
<li>Gan, L., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+tomography+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Electron tomography of cells.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 45 (1), 27-56 (2012).</li>
<li>Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CorRelator%3A+Interactive+software+for+real-time+high+precision+cryo-correlative+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 213 (2), 107709(2021).</li>
<li>Mendonça, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+multi-scale+cryo-imaging+unveils+SARS-CoV-2+assembly+and+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Correlative multi-scale cryo-imaging unveils SARS-CoV-2 assembly and egress.</a> Nature Communications. 12 (1), 4629(2021).</li>
<li>Klumpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+platform+for+automated+cryo-FIB+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A modular platform for automated cryo-FIB workflows.</a> eLife. 10, e70506(2021).</li>
<li>Wagner, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+samples+from+whole+cells+using+focused-ion-beam+milling+for+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography.</a> Nature Protocols. 15 (6), 2041-2070 (2020).</li>
<li>Klein, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFITM3+blocks+influenza+virus+entry+by+sorting+lipids+and+stabilizing+hemifusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">IFITM3 blocks influenza virus entry by sorting lipids and stabilizing hemifusion.</a> Cell Host & Microbe. 31 (4), 616.e20-633.e20 (2023).</li>
<li>Shah, P. N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+rotavirus+assembly+pathway+in+situ+using+cryoelectron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Characterization of the rotavirus assembly pathway in situ using cryoelectron tomography.</a> Cell Host & Microbe. 31 (4), 604.e4-615.e4 (2023).</li>
<li>Fäßler, F., Zens, B., Hauschild, R., Schur, F. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printed+cell+culture+grid+holders+for+improved+cellular+specimen+preparation+in+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">3D printed cell culture grid holders for improved cellular specimen preparation in cryo-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 212 (3), 107633(2020).</li>
<li>Hoffmann, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryo-tomography+reveals+the+subcellular+architecture+of+growing+axons+in+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Electron cryo-tomography reveals the subcellular architecture of growing axons in human brain organoids.</a> eLife. 10, e70269(2021).</li>
<li>Toro-Nahuelpan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+cryo-electron+microscopy+grids+by+photo-micropatterning+for+in-cell+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies.</a> Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

W tym miejscu udostępniliśmy dostępny, elastyczny i powtarzalny protokół do sadzenia komórek na siatkach mikroskopii elektronowej do zastosowań w tomografii krioelektronowej in situ . Metodę tę można łatwo dostosować do potrzeb dalszych zastosowań i/lub wymagań eksperymentalnych. Oprócz dużej elastyczności opisaliśmy przepływ pracy, który optymalizuje i redukuje typowe pułapki w zasiewaniu siatki, w szczególności rozległe uszkodzenia warstwy węglowej, niską gęstość komórek i słabą integralność strukturalną projekcji cienkich komórek.
Chociaż opisany tutaj protokół zapewnia kilka alternatyw, istnieje kilka krytycznych kroków, które należy wykonać, aby zoptymalizować ogólne wyniki. Jednym z największych problemów związanych z wysiewaniem komórek siatki jest odrywanie się i unoszenie siatek od studzienki lub mikrozjeżdżalni. Dlatego ważne jest, aby całkowicie zwilżyć siatkę przylegającym roztworem z obu stron i zapobiec jej wysychaniu w okresie inkubacji. W przypadku korzystania z uchwytów siatkowych wydrukowanych w 3D, należy pamiętać, że wielokrotne zmiany nośników na te uchwyty mogą potencjalnie spowodować powstanie pływających siatek, ponieważ powietrze uwięzione pod siatką może wypchnąć je z uchwytu. 
Nasz wybór pęsety poprawia również jakość siatki, zapewniając geometrycznie korzystny sposób manipulowania siatką bez rozległego wyginania siatki, które uszkodziłoby warstwę węgla. Utrzymywanie komórek w temperaturze 37 °C tak długo, jak to możliwe przed zanurzeniem, zmniejsza cierpienie komórek i zwiększa liczbę cienkich komórek do obrazowania na siatce. Wreszcie, blotting od strony złota ochroni ogniwa przed silnymi siłami mechanicznymi, które mogą prowadzić do uszkodzenia delikatnych struktur komórkowych.
Chociaż nie jest to uwzględnione w tym protokole, wykazano, że mikrowzorce fotograficzne w siatce zwiększają liczbę komórek do obrazowania poprzez optymalizację ich przyłączenia do środka kwadratów siatki14. Wreszcie, drukowane w 3D uchwyty siatki zostały ostatnio wykorzystane do zmniejszenia uszkodzeń siatki poprzez ograniczenie bezpośredniej manipulacji siatką12.
Ważne jest, aby pamiętać, że protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem obrazowania cienkich krawędzi i wypukłości komórek w celu zastosowania kriotomografii. Sugerujemy rozwiązywanie różnych warunków z naszych zaleceń w protokole, aby znaleźć najlepszy wynik dla wybranych aplikacji podrzędnych. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten zapewnia niezawodną, ale wszechstronną metodę umieszczania komórek na siatkach, które można dostosować do konkretnych potrzeb.

Kriotomografia komórkowa in situ to potężna technika pozwalająca na badanie biologicznie istotnych struktur w komórkach bez chemicznej fiksacji. Poprzez przymocowanie komórek do siatek EM i zamrożenie ich w kriogenie, obiekty zainteresowania są zamrażane w swoim naturalnym kontekście komórkowym bez tworzenia się krystalicznego lodu z wody wewnątrzkomórkowej1,2. Zarówno utrwalenie chemiczne, jak i tworzenie się lodu krystalicznego mogą zakłócić struktury odpowiednich cząsteczek, takich jak białka i lipidy, zmniejszając biologiczną dokładność obrazów uzyskanych przy użyciu tych technik3,4. W tomografii siatki są obrazowane pod kątami przyrostowymi za pomocą mikroskopii elektronowej, a obrazy te są następnie wykorzystywane do konstruowania trójwymiarowych reprezentacji obrazowanego obszaru docelowego 5. Kriotomografia in situ może być stosowana wraz z innymi technikami mikroskopowymi do obrazowania integracyjnego i korelacyjnego, takimi jak obrazowanie kriofluorescencyjne, miękka tomografia rentgenowska i krioFIB/SEM (kriogeniczna skupiona wiązka jonów/skaningowa mikroskopia elektronowa)6,7,8,9,10,11. Integracja wielu technik pozwala na uzyskanie większej ilości informacji o strukturze lub procesie, niż mogłaby to osiągnąć jakakolwiek pojedyncza technika mikroskopowa.
Pomimo wszystkich korzyści płynących z kriotomografii komórkowej in situ, przygotowanie próbki może okazać się wyzwaniem z wielu powodów. Ze względu na ich kruchość, siłowa manipulacja siatkami mikroskopii elektronowej może prowadzić do uszkodzeń, przy czym w szczególności cienka warstwa węgla jest delikatna i podatna na rozdarcie, co zmniejsza obszar obrazowania siatek. Siatki mikroskopii elektronowej są również trudne do manipulowania ze względu na ich niewielkie rozmiary i są podatne na odklejanie się od powierzchni studzienek lub mikroszkiełek używanych do hodowli komórek. Manipulowanie siatkami w studzienkach lub mikroszkiełkach może okazać się trudne ze względu na ich geometrię. Niewłaściwe przygotowanie siatek (np. umożliwienie im unoszenia się na wodzie) może prowadzić do niskiej gęstości komórek i zmniejszenia liczby potencjalnych obszarów obrazowania, zwłaszcza gdy komórki nie są podatne na przyczepianie się do samych siatek. W przypadku bezpośredniej kriotomografii komórkowej komórki muszą rozprzestrzeniać się bardzo cienko, co może zostać zakłócone z wielu powodów, w tym z powodu niewłaściwej temperatury lub nieostrożnego obchodzenia się z siatkami.
Dzięki różnorodnym optymalizacjom, techniki przedstawione w tym artykule mają na celu radzenie sobie z tymi najczęstszymi pułapkami, które pojawiają się podczas przygotowywania siatek mikroskopii elektronowej do kriotomografii. Zastosowanie pęsety pod kątem 5/15 pozwala na manipulowanie kratkami w płytkach studzienek lub mikroszkiełkach. Roztwór fibronektyny nałożony po obu stronach siatek przed posiewem zmniejsza prawdopodobieństwo powstania siatek pływających, co jest korzystne w zapewnieniu, że siatki mają odpowiednią gęstość komórek i że siatki są mniej podatne na uszkodzenie w wyniku manipulacji. Utrzymując siatki w inkubacji w temperaturze 37°C do momentu tuż przed zamrożeniem wgłębnym, zapewniamy również, że komórki są trzymane w komfortowym środowisku, aby zapobiec cofaniu się komórek ich cienkich krawędzi. Osuszanie kratek od tyłu zapobiega również uszkodzeniom komórek przez siłę mechaniczną. Ogólnie rzecz biorąc, środki te zwiększają wskaźnik powodzenia przygotowania próbek do badań kriotomografii komórkowej in situ, zwiększając dostępność tego podejścia do obrazowania.

<table><tbody><tr><td>Roztwór kulek złota koloidalnego 10 nm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>741957</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowy wielotalerzowy, 100/CS</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012927</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa Allegra V-15R, IVD 120 V 60 Hz</td><td>Beckman-Coulter</td><td>C63125</td><td></td></tr><tr><td>Au G300F1 z węglem R2/2 Quantifoil</td><td>Quantifoil</td><td>TEM-G300F1-AU</td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td> <td>surowicy bydlęcejMarka MilliporeSigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; komora licząca BLAUBRAND&nbsp; Neubauer ulepszył</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR717805-1EA</td><td></td></tr><tr><td>DMi1 Mikroskop odwrócony</td><td>Leica</td><td>22A00G119</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany orł Dulbecco średnio - wysoki poziom glukozy, bez glutaminy</td><td>Gibco</td><td>11-960-044</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta Dumont 5/15</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>0103-5/15-PO</td><td></td></tr><tr><td>EM GP2</td><td>Leica</td><td>587085</td><td>Automatyczne zagłębianie zamrażarka</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>A5209</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna z osocza bydlęcego, klasa hodowli komórkowych</td><td>MilliporeSigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>GenJet wersja II odczynnik do transfekcji DNA in vitro</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100489</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX I 100x</td><td>Suplement Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Media</td></tr><tr><td>Neslab EX-211 Cyrkulator grzewczy</td><td>Neslab</td><td>Poza produkcją</td><td>Kąpiel wodna do podgrzewania mediów</td></tr><tr><td>Oryginalny przenośny kontroler pipet Pipet-Aid</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Urządzenie Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pelco easyGlow</td><td>Pelco</td><td>91000S</td><td>Urządzenie do wyładowywania jarzeniowego</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>Suplement medialny</td></tr><tr><td>Pipetman P1000, 100&ndash; 1000 &mikro; L, Wyrzutnik metalowy</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P2, 0,2&ndash; 2 i mikro; L, Wyrzutnik metalowy</td><td>Gilson</td><td>F144054M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P20, 2&ndash; 20 &mikro; L, Wyrzutnik metalowy</td><td>Gilson</td><td>F144056M</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtracyjny Whatman numer 2, 55 mm</td><td>Whatman</td><td>28455-041</td><td>Bibuła</td></tr></tbody></table>

przygotowanie próbki do kriotomografii in situ komórek ssaków

Sample Preparation for In Situ Cryotomography of Mammalian Cells

>jove_content<Kriotomografia komórkowa in situ jest potężną techniką do badania złożonych obiektów w ich naturalnym, uwodnionym kontekście komórkowym, co czyni ją bardzo istotną dla biologii komórkowej i wirusologii. Potencjał połączenia kriotomografii z innymi metodami mikroskopii sprawia, że jest to doskonała technika do obrazowania integracyjnego i korelacyjnego. Jednak przygotowanie próbki do tomografii komórkowej in situ nie jest proste, ponieważ komórki nie przyczepiają się łatwo i nie rozciągają się na siatce mikroskopii elektronowej. Ponadto same siatki są delikatne i mogą pęknąć, jeśli są obsługiwane zbyt mocno, co powoduje utratę obszarów obrazowania. Geometria naczyń do hodowli tkankowych może również stanowić wyzwanie podczas manipulowania siatkami za pomocą pęsety. Poniżej opisujemy wskazówki i porady, jak pokonać te (i inne) wyzwania i przygotować dobrej jakości próbki do kriotomografii komórkowej in situ i obrazowania korelacyjnego przylegających komórek ssaków. Dzięki ciągłemu postępowi w technologii kriomikroskopii, technika ta jest niezwykle obiecująca dla naszego zrozumienia złożonych systemów biologicznych.

Po kotransfekcji HIViGFPΔEnv i psPAX2 we wszystkich siatkach stwierdzono minimalne przerwania warstwy węglowej. Obrazowanie siatek przeprowadzono za pomocą mikroskopii fazowej oraz mikroskopii fluorescencyjnej 24 h po inkubacji z odczynnikiem do transfekcji (Rycina 2). Zarówno na siatkach kontrolnych (mock), jak i na siatkach kotransfekowanych, w wielu polach siatki znajdowały się żywe komórki.
psPAX2 koduje wszystkie białka strukturalne i enzymatyczne HIV-1 bez żadnego znakowania fluorescencyjnego. HIViGFPΔEnv jest podobny do psPAX2, ale zawiera kody dla białka Gag HIV znakowanego GFP. Oba plazmidy są typu ΔEnvelope. Kotransfekcja prowadzi do montażu i pączkowania fluorescencyjnych cząsteczek HIV-1 w sposób zbliżony do naturalnego, co czyni ten układ doskonałym systemem do badań CLEM nad HIV w warunkach 1. poziomu bezpieczeństwa biologicznego. Siatki po kotransfekcji wykazały podzbiór komórek wykazujących zieloną fluorescencję, co wskazuje na pomyślną kotransfekcję. Żadne komórki na siatce kontrolnej nie wykazywały fluorescencji, co dodatkowo potwierdza skuteczność kotransfekcji z użyciem HIViGFPΔEnv i psPAX2. Po obejrzeniu siatek przy użyciu mikroskopii świetlnej, zostały one zamrożone metodą plunge freezing i przeniesione do długoterminowego przechowywania w ciekłym azocie.
Rycina 3 przedstawia wyniki z siatek przygotowanych tą samą metodą eksperymentalną, lecz z wykorzystaniem nieco innych konstruktów plazmidowych. Siatki zawierające komórki U2OS zostały kotransfekowane różnymi klonami HIV (HIVmCherryΔEnv oraz NL4-3ΔEnvGFP w stosunku 1:6). Dzięki zastosowaniu większej masy plazmidów z etykietą fluorescencyjną, siatki te umożliwiły obserwację większej liczby transfektowanych komórek, co stanowiło zaletę podczas obrazowania metodami cryoCLEM i cryoET. Za pomocą cryoCLEM wygenerowano pełne atlasy każdej siatki, wykorzystując mikroskopię kriofluorescencyjną do zarejestrowania lokalizacji wszystkich kotransfekowanych komórek. Po ustaleniu lokalizacji komórek przeprowadzono cryoET. Zebrano pełny atlas siatki przy niskim powiększeniu i nałożono go na atlas fluorescencyjny uzyskany metodą kriofluorescencji (Rycina 3A). Kriotomogramy wykonano w miejscach występowania komórek, rejestrując szczegółowe etapy cyklu życiowego wirusa, w tym montaż i pączkowanie HIV z komórek (Rycina 3B).
<img alt="Schemat przygotowania siatek, wysiewania, transfekcji i szybkiego mrożenia; etapy procesu hodowli komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65697/65697fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Procedura wysiewania komórek na siatki. Schemat przedstawiający ogólną procedurę wysiewania komórek na siatki do cryoEM. Proces jest podzielony na cztery główne etapy, obejmujące (A) przygotowanie siatek w dołkach do wysiewania, (B) dodanie odpowiedniej ilości komórek do każdego dołka, (C) opcjonalną transfekcję komórek do obrazowania fluorescencyjnego oraz (D) szybkie mrożenie siatek w celu witryfikacji próbki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65697/65697fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza komórek kotransfekowanych i kontrolnych; obrazy z mikroskopii fazowej, fluorescencyjnej GFP oraz kompozytowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65697/65697fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Kotransfekcja komórek U2OS za pomocą HIViGFPΔEnv i psPAX2. Komórki U2OS zostały kotransfekowane HIViGFPΔEnv zawierającym GFP oraz psPAX2 w stosunku 1:3. Obrazy siatek wykonano za pomocą mikroskopii fazowej i fluorescencyjnej. Komórki wykazujące ekspresję GFP świadczą o udanej kotransfekcji. Pasek skali: 500 µm. Pasek skali (powiększenia): 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65697/65697fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii; (A) komórkowy wzór siatki, powiększony wstawka; (B) struktury mitochondrialne, skala nano." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65697/65697fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Potencjalne metody krio-mikroskopowe stosowane w dalszych etapach. (A) Obraz cryoCLEM z kotransfekowanymi komórkami U2OS. Komórki zaznaczone na zielono reprezentują komórki produkujące HIV i służą do pomiaru sukcesu kotransfekcji. Czerwone punkty reprezentują białko HIV-1 Gag znakowane mCherry. Pasek skali: 250 µm. Pasek skali (wstawka): 25 µm (B) Obraz cryoET przedstawiający wiele cząsteczek HIV pączkujących z błony plazmatycznej komórek U2OS. Pasek skali: 50 nm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65697/65697fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ta metoda zapewnia dostępny i elastyczny protokół do przygotowania siatek mikroskopii elektronowej (EM) do kriotomografii komórkowej in situ oraz korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM).

Przygotowanie próbki do kriotomografii in situ komórek ssaków

In situ cellular cryotomography is a powerful technique for studying complex objects in their native frozen-hydrated cellular context, making it highly ...

Zakres tych badań polega na opracowaniu metodologii przygotowania próbek, która będzie zarówno dostępna, jak i niezawodnie odtwarzalna. Osiągając to, moc bezpośredniej komórkowej krioelektronowej tomografii może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na wiele różnych pytań biologicznych. Wyzwania związane z przygotowaniem sieci są rozległe.Komórki nie przyczepiają się łatwo do siatek, a manipulacja może spowodować uszkodzenie warstwy węgla, co skutkuje utratą obszarów siatki możliwych do obrazowania. Dodatkowo częstość występowania cienkich wypukłości komórkowych jest zmniejszona bez zwracania uwagi na odpowiednie warunki przygotowania próbki. Obecne protokoły zazwyczaj wymagają specjalistycznego sprzętu do rozwiązania głównych wąskich gardeł wysiewu, takich jak odpowiednio mikrowzory i drukowane w 3D uchwyty do mocowania komórek i manipulacji.Protokół ten zapewnia rozwiązania o większej dostępności przy jednoczesnym zachowaniu elastyczności dla tych specjalistycznych narzędzi do wykorzystania w dalszych aplikacjach. Aby rozpocząć przygotowanie siatek mikroskopii elektronowej do kriotomografii komórkowej, umieść siatkę obciążoną perforowaną folią nośną z włókna węglowego w urządzeniu do wyładowywania jarzeniowego, stroną węglową siatki skierowaną do góry. Następnie jarzenie rozładowuje siatkę pod ciśnieniem 15 miliamperów pod ciśnieniem atmosferycznym 0,39 milibara przez 45 sekund.Po zakończeniu umieść siatkę w czystym pojemniku wyłożonym bibułą filtracyjną. Następnie przenieś siatkę wraz z fibronektyną, solą fizjologiczną buforowaną fosforanem lub PBS, płytkami i pęsetą do szafki bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą mikropipety odlej dwie duże kropki fibronektyny bydlęcej na sterylną powierzchnię, taką jak wieczko z sześciodołkową płytką.Upewnij się, że kropki są wystarczająco duże, aby objąć całą siatkę. Następnie zaopatrz się w pęsetę 5/15 i potraktuj obie strony siatki roztworem przylegającym do fibronektyny. Po potraktowaniu fibronektyną bydlęcą siatka stanie się lepka.Delikatnie dotknij niewęglowej powierzchni siatki do dna pustej studzienki w sześciodołkowej płytce i zwolnij pęsetę, aby przymocować siatkę do nowej powierzchni. Następnie inkubuj siatkę przez 30 minut w roztworze do przylegania fibronektyny Aby zapobiec wysychaniu siatek, co 15 minut dodawaj jedną do dwóch kropli roztworu przylegającego na siatkę za pomocą mikropipety. Po inkubacji usunąć nadmiar przylegającego roztworu za pomocą mikropipety.Umyj siatki, dodając krople PBS bezpośrednio na kratki za pomocą mikropipety dwa do trzech razy. Sterylizuj siatki pod wpływem światła UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez godzinę. Umieść kratki jak najbliżej promieniowania UV, aby uzyskać maksymalną sterylizację.Zapobiegaj wysychaniu siatek podczas sterylizacji, mikropipetując jedną lub dwie krople PBS na wierzchu siatki co 10 minut. Aby rozpocząć wysiewanie komórek, policz komórki po ich odłączeniu metodami mechanicznymi lub enzymatycznymi. Za pomocą mikropipety dodać obliczoną liczbę komórek na studzienkę do sześciodołkowej płytki zawierającej wstępnie przygotowane siatki do mikroskopii elektronowej, unikając pęcherzyków.Upewnij się, że utrzymujesz od 1,5 do 2,0 mililitrów zawiesiny komórek na studzienkę. W celu transfekcji klonów molekularnych wirusa HIV należy inkubować komórki przez 16 do 24 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj 50 mikrolitrów DMEM bez surowicy i jeden mikrogram DNA do czystej probówki do mikrowirówki.Dla każdej studzienki rozcieńczyć trzy mikrolitry odczynnika do transfekcji w DMEM bez surowicy do oddzielnej, czystej probówki do mikrowirówki. Homogenizować mieszaniny oddzielnie za pomocą mikropipety. Następnie dodać mieszaninę odczynników do transfekcji do mieszaniny DNA za pomocą mikropipety i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Następnie dodaj kroplami 100 mikrolitrów odczynnika do transfekcji i mieszaniny DNA do każdej studzienki bezpośrednio na siatkach. Wymień pożywkę wzrostową 16 do 24 godzin po transfekcji. 24 godziny po kotransfekcji, mikroskopia światła fazowego i mikroskopia światła fluorescencyjnego wykazały, że wszystkie siatki miały minimalne rozdarcia w warstwie węgla.Komórki zarówno na makietach siatek, jak i na siatkach współtransfekowanych zawierały żywotne komórki w wielu kwadratach siatki. Przed zamrożeniem wgłębnym siatek mikroskopii elektronowej zawierających komórki, należy sprawdzić siatki pod odwróconym mikroskopem optycznym. Zapisz gęstość komórek na każdej siatce, aby dostosować czasy osuszania podczas zamrażania wgłębnego.Podgrzej dwa do trzech mililitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanami lub PBS na pustej płytce w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby przygotować powierników złota, odpipetuj 50 mikrolitrów 10-nanometrowego roztworu koloidalnej kulki złota do czystej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodać do niego dwa mikrolitry albuminy surowicy bydlęcej i homogenizować przez wielokrotne mikropipetowanie.Odwirować probówkę o masie od 15 000 do 20 000 g przez 15 minut. Ostrożnie usunąć sklarowany osad za pomocą mikropipety, nie naruszając jego osadu. Zawiesić osad w 50 mikrolitrach PBS i ponownie odwirować probówkę, jak pokazano wcześniej.Zassać cztery mikrolitry granulatu za pomocą końcówki o pojemności 10 mikrolitrów i przenieść go do czystej rurki o pojemności 1,5 mililitra. Ustaw komorę środowiskową na 95% wilgotności i 30 stopni Celsjusza. Za pomocą pęsety 5/15 wybierz siatkę i umyj ją PBS.Przenieś umytą siatkę do pęsety zanurzającej. Po zabezpieczeniu siatki wyjmij pęsetę 5/15 i wsuń zacisk na pęsetę zanurzającą. Włóż kratkę do zamrażarki wgłębnej, trzymając zacisk bezpiecznie.Dodaj jeden mikrolitr złotych powierników z tyłu siatki. Następnie dodaj dwa do trzech mikrolitrów PBS po stronie węglowej siatki. Wykorzystaj automatyczne bibułowanie, aby osuszyć tylną stronę siatki przed zanurzeniem w ciekłym etanie.Kriokorelacyjny obraz z mikroskopii świetlnej i elektronowej transfekowanych komórek U-2 OS ujawnił obecność komórek wytwarzających wirusa HIV. Obraz kriotomografii elektronowej wykazał wiele cząsteczek HIV wyrastających z błony plazmatycznej komórek U-2 OS.

sample-preparation-for-in-situ-cryotomography-of-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiamy tutaj sposób wykorzystania kriotomografii elektronowej (ECT) do badania ultrastruktury komórek bakteryjnych w stanach zbliżonych do naturalnych, z rozdzielczością „makrocząsteczkową” (~4 nm).

Kriotomografia elektronowa komórek bakteryjnych

Tutaj oferujemy łatwy, tani i efektywny czasowo protokół chemicznego utrwalania tkanki mózgowej naczelnych za pomocą utrwalacza akroleiny, co pozwala na długoterminową konserwację, która jest zgodna z immunohistochemią dla transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Przygotowanie tkanki mózgowej naczelnych innych niż ludzie do wstępnego zatopienia immunohistochemii i mikroskopii elektronowej

Przedstawiono instrument i metody do przygotowania objętości próbek o rozmiarach nanolitrów do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nie są wymagane żadne etapy papierowego blottingu, co pozwala uniknąć szkodliwych konsekwencji, jakie może to mieć dla białek, znacznie zmniejszając utratę próbki i umożliwiając analizę lizatu pojedynczej komórki do wizualnej proteomiki.

Zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Prezentujemy protokół przygotowania lameli zamrożonych próbek biologicznych metodą kriogenicznej mikroobróbki wiązki jonów do wysokorozdzielczych badań strukturalnych makrocząsteczek in situ za pomocą krioelektronowej tomografii. Przedstawiony protokół zawiera wytyczne do przygotowania wysokiej jakości blaszek o wysokiej odtwarzalności do charakterystyki strukturalnej makrocząsteczek wewnątrz Saccharomyces cerevisiae.

Przygotowanie i mikroobróbka Cryo-FIB Saccharomyces cerevisiae do krioelektronowej tomografii

Rosnące zapotrzebowanie na gromadzenie danych na dużą skalę w kriogenicznej tomografii elektronowej wymaga wysokoprzepustowych procedur akwizycji obrazów. Opisano tutaj protokół, który wdraża najnowsze osiągnięcia zaawansowanych strategii akwizycji mających na celu maksymalizację efektywności czasowej i przepustowości gromadzenia danych tomograficznych.

Strategie optymalizacji pozyskiwania danych z kriogenicznej tomografii elektronowej

Tutaj prezentujemy proces frezowania wiązki jonów z korelacją 3D, który kieruje przygotowaniem próbek komórkowych do tomografii krioelektronowej. Pozycja 3D fluorescencyjnie znakowanych białek będących przedmiotem zainteresowania jest najpierw określana za pomocą mikroskopii kriofluorescencyjnej, a następnie kierowana do mielenia. Protokół jest odpowiedni dla komórek ssaków, drożdży i bakterii.

Przygotowanie próbki za pomocą korelacyjnego mielenia wiązki jonów w 3D do tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości

Celem tego protokołu jest skierowanie adhezji i wzrostu komórek do docelowych obszarów siatek do mikroskopii krioelektronowej. Osiąga się to poprzez nałożenie warstwy przeciwporostowej, która jest ablowana w określonych przez użytkownika wzorach, a następnie osadzanie się białek macierzy zewnątrzkomórkowej w obszarach wzorzystych przed wysiewem komórek.

Mikrowzorce Transmisyjne siatki mikroskopii elektronowej do bezpośredniego pozycjonowania komórek w przepływach pracy kriotomografii elektronowej całej komórki

Tomografia krio-STEM umożliwia wizualizację organelli nienaruszonych komórek bez osadzania, cięcia lub innych inwazyjnych przygotowań. Uzyskana rozdzielczość 3D mieści się obecnie w zakresie kilku nanometrów, przy polu widzenia kilku mikrometrów i dostępnej grubości rzędu 1 μm.

Wizualizacja organelli in situ za pomocą tomografii krio-STEM

Tutaj opisujemy protokół ekstrakcji endogennej tubuliny z komórek ssaków, które mogą nie mieć lub zawierać specyficzne enzymy modyfikujące mikrotubule, w celu uzyskania mikrotubul wzbogaconych o określoną modyfikację. Następnie opisujemy, w jaki sposób wyekstrahowane mikrotubule można ozdobić oczyszczonymi białkami wiążącymi mikrotubule w celu przygotowania siatek do mikroskopii krioelektronowej.

Ekstrakcja zmodyfikowanych mikrotubul z komórek ssaków w celu badania kompleksów mikrotubula-białko za pomocą mikroskopii krioelektronowej

Protokół ten standaryzuje tomografię krioelektronową (cryo-ET) dla grubych tkanek poprzez integrację zamrażania pod wysokim ciśnieniem (HPF) z metodą gofrową, wyciąganie kriogenicznej wiązki jonowej (krio-FIB) oraz równoległe pobieranie pod względem dawki, co daje jednolicie cienkie lamele i próbki zwitryfikowane do powtarzalnej analizy in situ w hipokampie myszy.

Workflow tomografii krioelektronowej dla grubych tkanek wykazany u hipokampa myszy

Poznaj metodę przygotowania próbek do kriotomografii komórek ssaków z wykorzystaniem fibronektyny wołowej i zanurzeniowego mrożenia. Protokół zapewnia skuteczne przyczepianie komórek do siatek EM z minimalnym uszkodzeniem warstwy węglowej.

Przygotowanie próbki do kriotomografii in situ komórek ssaków

Przeglądaj więcej filmów