Przygotowanie próbki do kriotomografii in situ komórek ssaków
December 15th, 2023
Ta metoda zapewnia dostępny i elastyczny protokół do przygotowania siatek mikroskopii elektronowej (EM) do kriotomografii komórkowej in situ oraz korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM).
Zakres tych badań polega na opracowaniu metodologii przygotowania próbek, która będzie zarówno dostępna, jak i niezawodnie odtwarzalna. Osiągając to, moc bezpośredniej komórkowej krioelektronowej tomografii może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na wiele różnych pytań biologicznych. Wyzwania związane z przygotowaniem sieci są rozległe.
Komórki nie przyczepiają się łatwo do siatek, a manipulacja może spowodować uszkodzenie warstwy węgla, co skutkuje utratą obszarów siatki możliwych do obrazowania. Dodatkowo częstość występowania cienkich wypukłości komórkowych jest zmniejszona bez zwracania uwagi na odpowiednie warunki przygotowania próbki. Obecne protokoły zazwyczaj wymagają specjalistycznego sprzętu do rozwiązania głównych wąskich gardeł wysiewu, takich jak odpowiednio mikrowzory i drukowane w 3D uchwyty do mocowania komórek i manipulacji.
Protokół ten zapewnia rozwiązania o większej dostępności przy jednoczesnym zachowaniu elastyczności dla tych specjalistycznych narzędzi do wykorzystania w dalszych aplikacjach. Aby rozpocząć przygotowanie siatek mikroskopii elektronowej do kriotomografii komórkowej, umieść siatkę obciążoną perforowaną folią nośną z włókna węglowego w urządzeniu do wyładowywania jarzeniowego, stroną węglową siatki skierowaną do góry. Następnie jarzenie rozładowuje siatkę pod ciśnieniem 15 miliamperów pod ciśnieniem atmosferycznym 0,39 milibara przez 45 sekund.
Po zakończeniu umieść siatkę w czystym pojemniku wyłożonym bibułą filtracyjną. Następnie przenieś siatkę wraz z fibronektyną, solą fizjologiczną buforowaną fosforanem lub PBS, płytkami i pęsetą do szafki bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą mikropipety odlej dwie duże kropki fibronektyny bydlęcej na sterylną powierzchnię, taką jak wieczko z sześciodołkową płytką.
Upewnij się, że kropki są wystarczająco duże, aby objąć całą siatkę. Następnie zaopatrz się w pęsetę 5/15 i potraktuj obie strony siatki roztworem przylegającym do fibronektyny. Po potraktowaniu fibronektyną bydlęcą siatka stanie się lepka.
Delikatnie dotknij niewęglowej powierzchni siatki do dna pustej studzienki w sześciodołkowej płytce i zwolnij pęsetę, aby przymocować siatkę do nowej powierzchni. Następnie inkubuj siatkę przez 30 minut w roztworze do przylegania fibronektyny Aby zapobiec wysychaniu siatek, co 15 minut dodawaj jedną do dwóch kropli roztworu przylegającego na siatkę za pomocą mikropipety. Po inkubacji usunąć nadmiar przylegającego roztworu za pomocą mikropipety.
Umyj siatki, dodając krople PBS bezpośrednio na kratki za pomocą mikropipety dwa do trzech razy. Sterylizuj siatki pod wpływem światła UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez godzinę. Umieść kratki jak najbliżej promieniowania UV, aby uzyskać maksymalną sterylizację.
Zapobiegaj wysychaniu siatek podczas sterylizacji, mikropipetując jedną lub dwie krople PBS na wierzchu siatki co 10 minut. Aby rozpocząć wysiewanie komórek, policz komórki po ich odłączeniu metodami mechanicznymi lub enzymatycznymi. Za pomocą mikropipety dodać obliczoną liczbę komórek na studzienkę do sześciodołkowej płytki zawierającej wstępnie przygotowane siatki do mikroskopii elektronowej, unikając pęcherzyków.
Upewnij się, że utrzymujesz od 1,5 do 2,0 mililitrów zawiesiny komórek na studzienkę. W celu transfekcji klonów molekularnych wirusa HIV należy inkubować komórki przez 16 do 24 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj 50 mikrolitrów DMEM bez surowicy i jeden mikrogram DNA do czystej probówki do mikrowirówki.
Dla każdej studzienki rozcieńczyć trzy mikrolitry odczynnika do transfekcji w DMEM bez surowicy do oddzielnej, czystej probówki do mikrowirówki. Homogenizować mieszaniny oddzielnie za pomocą mikropipety. Następnie dodać mieszaninę odczynników do transfekcji do mieszaniny DNA za pomocą mikropipety i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie dodaj kroplami 100 mikrolitrów odczynnika do transfekcji i mieszaniny DNA do każdej studzienki bezpośrednio na siatkach. Wymień pożywkę wzrostową 16 do 24 godzin po transfekcji. 24 godziny po kotransfekcji, mikroskopia światła fazowego i mikroskopia światła fluorescencyjnego wykazały, że wszystkie siatki miały minimalne rozdarcia w warstwie węgla.
Komórki zarówno na makietach siatek, jak i na siatkach współtransfekowanych zawierały żywotne komórki w wielu kwadratach siatki. Przed zamrożeniem wgłębnym siatek mikroskopii elektronowej zawierających komórki, należy sprawdzić siatki pod odwróconym mikroskopem optycznym. Zapisz gęstość komórek na każdej siatce, aby dostosować czasy osuszania podczas zamrażania wgłębnego.
Podgrzej dwa do trzech mililitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanami lub PBS na pustej płytce w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby przygotować powierników złota, odpipetuj 50 mikrolitrów 10-nanometrowego roztworu koloidalnej kulki złota do czystej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodać do niego dwa mikrolitry albuminy surowicy bydlęcej i homogenizować przez wielokrotne mikropipetowanie.
Odwirować probówkę o masie od 15 000 do 20 000 g przez 15 minut. Ostrożnie usunąć sklarowany osad za pomocą mikropipety, nie naruszając jego osadu. Zawiesić osad w 50 mikrolitrach PBS i ponownie odwirować probówkę, jak pokazano wcześniej.
Zassać cztery mikrolitry granulatu za pomocą końcówki o pojemności 10 mikrolitrów i przenieść go do czystej rurki o pojemności 1,5 mililitra. Ustaw komorę środowiskową na 95% wilgotności i 30 stopni Celsjusza. Za pomocą pęsety 5/15 wybierz siatkę i umyj ją PBS.
Przenieś umytą siatkę do pęsety zanurzającej. Po zabezpieczeniu siatki wyjmij pęsetę 5/15 i wsuń zacisk na pęsetę zanurzającą. Włóż kratkę do zamrażarki wgłębnej, trzymając zacisk bezpiecznie.
Dodaj jeden mikrolitr złotych powierników z tyłu siatki. Następnie dodaj dwa do trzech mikrolitrów PBS po stronie węglowej siatki. Wykorzystaj automatyczne bibułowanie, aby osuszyć tylną stronę siatki przed zanurzeniem w ciekłym etanie.
Kriokorelacyjny obraz z mikroskopii świetlnej i elektronowej transfekowanych komórek U-2 OS ujawnił obecność komórek wytwarzających wirusa HIV. Obraz kriotomografii elektronowej wykazał wiele cząsteczek HIV wyrastających z błony plazmatycznej komórek U-2 OS.
Przegląd
Metoda ta zapewnia dostępny i elastyczny protokół przygotowywania siatek do mikroskopii elektronowej (EM) do in situ kriotomografii komórkowej oraz korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM). Protokół rozwiązuje problemy związane z przygotowaniem siatek, zapewniając przyczepność komórek i minimalizując uszkodzenia warstwy węglowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia komórkowa
- Mikroskopia elektronowa
Wprowadzenie
- Bezpośrednia krioelektronotomografia komórkowa jest potężnym narzędziem do badań biologicznych.
- Przygotowanie siatek ma kluczowe znaczenie dla udanego obrazowania i analizy.
- Obecne metody często wymagają specjalistycznego sprzętu, ograniczając dostępność.
- Celem tego protokołu jest uproszczenie procesu przy jednoczesnym zachowaniu elastyczności.
Cel badania
- Opracowanie powtarzalnej i dostępnej metodologii przygotowywania siatek EM.
- Zwiększenie użyteczności krioelektronotomografii w badaniach biologicznych.
- Rozwiązanie typowych problemów związanych z przyczepnością komórek i integralnością siatki.
Wykorzystane metody
- Traktowanie siatek wyładowaniami jarzeniowymi w celu zwiększenia adhezji komórek.
- Zastosowanie fibronktyny wołowej w celu promowania przyczepności komórek.
- Procedury zasiewu komórek i transfekcji dla klonów molekularnych HIV.
- Zamrażanie siatek bez zanurzania do obrazowania krioelektronotomograficznego.
Główne wyniki
- Pomyślna przyczepność komórek do siatek EM przy minimalnych uszkodzeniach.
- Obserwacja komórek produkujących HIV za pomocą kriokorelaционной mikroskopii.
- Skuteczne zachowanie integralności siatki podczas procesu przygotowania.
- Wykażenie powtarzalności protokołu podczas wielu prób.
Wnioski
- Opracowany protokół zwiększa dostępność przy przygotowywaniu siatek EM.
- Umożliwia skuteczne badanie procesów komórkowych za pomocą krioelektronotomografii.
- Przyszłe zastosowania mogą wykorzystać tę metodę do różnych zapytań biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Robust sample preparation for in situ cryotomography of mammalian cells is critical for enabling high-resolution structural studies in native cellular contexts. This protocol addresses key bottlenecks in grid handling, cell attachment, and reproducibility, directly impacting the reliability of downstream imaging and integrative analyses. Improved accessibility and standardization in sample preparation enhance predictive confidence and portfolio decision-making in early discovery and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of cellular ultrastructure for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by preserving native cell environments.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of molecular assemblies in situ.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological samples for correlative imaging workflows.
- Standardizes grid preparation to ensure reproducibility and quantitative imaging outputs.
- Improves readiness for high-content screening and integrative microscopy platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant cellular models for translational continuity.
- Enables structural assessment of viral and cellular interactions in preclinical systems.
- Supports risk-adjusted advancement by providing high-fidelity morphological data.
Pipeline & Workflow Integration
This sample preparation protocol integrates at the interface of discovery biology and advanced imaging, supporting workflows from early mechanistic studies to preclinical model validation.
- Discovery Biology: Provides reproducible sample preparation for hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Delivers standardized, high-quality grids for quantitative imaging and assay development.
- Analytics: Enables acquisition of robust structural data for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by maintaining cellular context in imaging outputs.
- Enterprise Reuse: Establishes a flexible, accessible protocol adaptable to diverse cell types and imaging modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in structural target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of sample preparation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing imaging failures.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, grid handling, and microscopy techniques.
- Needs access to glow discharge devices, biosafety cabinets, and plunge-freezing instrumentation.
- Demands cross-team standardization for reproducible grid preparation and imaging quality.
- Adaptable to various adherent mammalian cell types with protocol modifications as needed.
- Grid fragility and manipulation remain practical limitations requiring careful handling.
