Przygotowanie próbki do kriotomografii in situ komórek ssaków

Zakres tych badań polega na opracowaniu metodologii przygotowania próbek, która będzie zarówno dostępna, jak i niezawodnie odtwarzalna. Osiągając to, moc bezpośredniej komórkowej krioelektronowej tomografii może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na wiele różnych pytań biologicznych. Wyzwania związane z przygotowaniem sieci są rozległe.

Komórki nie przyczepiają się łatwo do siatek, a manipulacja może spowodować uszkodzenie warstwy węgla, co skutkuje utratą obszarów siatki możliwych do obrazowania. Dodatkowo częstość występowania cienkich wypukłości komórkowych jest zmniejszona bez zwracania uwagi na odpowiednie warunki przygotowania próbki. Obecne protokoły zazwyczaj wymagają specjalistycznego sprzętu do rozwiązania głównych wąskich gardeł wysiewu, takich jak odpowiednio mikrowzory i drukowane w 3D uchwyty do mocowania komórek i manipulacji.

Protokół ten zapewnia rozwiązania o większej dostępności przy jednoczesnym zachowaniu elastyczności dla tych specjalistycznych narzędzi do wykorzystania w dalszych aplikacjach. Aby rozpocząć przygotowanie siatek mikroskopii elektronowej do kriotomografii komórkowej, umieść siatkę obciążoną perforowaną folią nośną z włókna węglowego w urządzeniu do wyładowywania jarzeniowego, stroną węglową siatki skierowaną do góry. Następnie jarzenie rozładowuje siatkę pod ciśnieniem 15 miliamperów pod ciśnieniem atmosferycznym 0,39 milibara przez 45 sekund.

Po zakończeniu umieść siatkę w czystym pojemniku wyłożonym bibułą filtracyjną. Następnie przenieś siatkę wraz z fibronektyną, solą fizjologiczną buforowaną fosforanem lub PBS, płytkami i pęsetą do szafki bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą mikropipety odlej dwie duże kropki fibronektyny bydlęcej na sterylną powierzchnię, taką jak wieczko z sześciodołkową płytką.

Upewnij się, że kropki są wystarczająco duże, aby objąć całą siatkę. Następnie zaopatrz się w pęsetę 5/15 i potraktuj obie strony siatki roztworem przylegającym do fibronektyny. Po potraktowaniu fibronektyną bydlęcą siatka stanie się lepka.

Delikatnie dotknij niewęglowej powierzchni siatki do dna pustej studzienki w sześciodołkowej płytce i zwolnij pęsetę, aby przymocować siatkę do nowej powierzchni. Następnie inkubuj siatkę przez 30 minut w roztworze do przylegania fibronektyny Aby zapobiec wysychaniu siatek, co 15 minut dodawaj jedną do dwóch kropli roztworu przylegającego na siatkę za pomocą mikropipety. Po inkubacji usunąć nadmiar przylegającego roztworu za pomocą mikropipety.

Umyj siatki, dodając krople PBS bezpośrednio na kratki za pomocą mikropipety dwa do trzech razy. Sterylizuj siatki pod wpływem światła UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez godzinę. Umieść kratki jak najbliżej promieniowania UV, aby uzyskać maksymalną sterylizację.

Zapobiegaj wysychaniu siatek podczas sterylizacji, mikropipetując jedną lub dwie krople PBS na wierzchu siatki co 10 minut. Aby rozpocząć wysiewanie komórek, policz komórki po ich odłączeniu metodami mechanicznymi lub enzymatycznymi. Za pomocą mikropipety dodać obliczoną liczbę komórek na studzienkę do sześciodołkowej płytki zawierającej wstępnie przygotowane siatki do mikroskopii elektronowej, unikając pęcherzyków.

Upewnij się, że utrzymujesz od 1,5 do 2,0 mililitrów zawiesiny komórek na studzienkę. W celu transfekcji klonów molekularnych wirusa HIV należy inkubować komórki przez 16 do 24 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj 50 mikrolitrów DMEM bez surowicy i jeden mikrogram DNA do czystej probówki do mikrowirówki.

Dla każdej studzienki rozcieńczyć trzy mikrolitry odczynnika do transfekcji w DMEM bez surowicy do oddzielnej, czystej probówki do mikrowirówki. Homogenizować mieszaniny oddzielnie za pomocą mikropipety. Następnie dodać mieszaninę odczynników do transfekcji do mieszaniny DNA za pomocą mikropipety i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie dodaj kroplami 100 mikrolitrów odczynnika do transfekcji i mieszaniny DNA do każdej studzienki bezpośrednio na siatkach. Wymień pożywkę wzrostową 16 do 24 godzin po transfekcji. 24 godziny po kotransfekcji, mikroskopia światła fazowego i mikroskopia światła fluorescencyjnego wykazały, że wszystkie siatki miały minimalne rozdarcia w warstwie węgla.

Komórki zarówno na makietach siatek, jak i na siatkach współtransfekowanych zawierały żywotne komórki w wielu kwadratach siatki. Przed zamrożeniem wgłębnym siatek mikroskopii elektronowej zawierających komórki, należy sprawdzić siatki pod odwróconym mikroskopem optycznym. Zapisz gęstość komórek na każdej siatce, aby dostosować czasy osuszania podczas zamrażania wgłębnego.

Podgrzej dwa do trzech mililitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanami lub PBS na pustej płytce w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby przygotować powierników złota, odpipetuj 50 mikrolitrów 10-nanometrowego roztworu koloidalnej kulki złota do czystej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodać do niego dwa mikrolitry albuminy surowicy bydlęcej i homogenizować przez wielokrotne mikropipetowanie.

Odwirować probówkę o masie od 15 000 do 20 000 g przez 15 minut. Ostrożnie usunąć sklarowany osad za pomocą mikropipety, nie naruszając jego osadu. Zawiesić osad w 50 mikrolitrach PBS i ponownie odwirować probówkę, jak pokazano wcześniej.

Zassać cztery mikrolitry granulatu za pomocą końcówki o pojemności 10 mikrolitrów i przenieść go do czystej rurki o pojemności 1,5 mililitra. Ustaw komorę środowiskową na 95% wilgotności i 30 stopni Celsjusza. Za pomocą pęsety 5/15 wybierz siatkę i umyj ją PBS.

Przenieś umytą siatkę do pęsety zanurzającej. Po zabezpieczeniu siatki wyjmij pęsetę 5/15 i wsuń zacisk na pęsetę zanurzającą. Włóż kratkę do zamrażarki wgłębnej, trzymając zacisk bezpiecznie.

Dodaj jeden mikrolitr złotych powierników z tyłu siatki. Następnie dodaj dwa do trzech mikrolitrów PBS po stronie węglowej siatki. Wykorzystaj automatyczne bibułowanie, aby osuszyć tylną stronę siatki przed zanurzeniem w ciekłym etanie.

Kriokorelacyjny obraz z mikroskopii świetlnej i elektronowej transfekowanych komórek U-2 OS ujawnił obecność komórek wytwarzających wirusa HIV. Obraz kriotomografii elektronowej wykazał wiele cząsteczek HIV wyrastających z błony plazmatycznej komórek U-2 OS.