Name: Wizualizacja zagęszczenia DNA u sinic za pomocą wysokonapięciowej krioelektronowej tomografii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji zagęszczenia DNA u sinic za pomocą krioelektronowej tomografii. Technika umożliwia obserwację ultrastruktury komórek bakteryjnych w stanie zbliżonym do żywego bez dodatkowych zabiegów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Tammo Reisewitzowi za krytyczne przeczytanie manuskryptu, a także Mako Hayashi i Sayuri Hagiwara za staranną hodowlę i obserwację cyjanobakterii, Yoshitaka Kimori za przetwarzanie obrazu, Chihong Song, Naoyuki Miyazaki i Miyoko Nagayoshi za pomoc w segmentacji struktur. Prace te były wspierane przez Program Badań Zespołowych Narodowego Instytutu Nauk Fizjologicznych (NIPS) dla Y.K.

1. Synchroniczna hodowla sinic
<ol>
	<li>Kultura S. elongatus PCC 7942 na sterylizowanej płytce BG 11 (na sterylnej plastikowej szalce Petriego o średnicy 9 cm) zawierającej 1,5% (w/v) agaru i 0,3% (w/v) tiosiarczanu sodu8.</li>
	<li>Umieścić płytki w komorze wzrostowej w temperaturze 23 °C o natężeniu światła 50 μE/m2/s i poddać cyklom 12 godzin światła/12 godzin ciemności.</li>
	<li>Raz w tygodniu przenosić komórki na świeże płytki agarowe BG11. 
	UWAGA: Kultury na agarze pojawią się jako zielone pasma aktywnie proliferujących komórek po tygodniu w tych warunkach hodowli.</li>
	<li>Weź zielone grudki komórek za pomocą wysterylizowanej płomieniem pętli drucianej i rozłóż komórki na świeżej płytce agarowej BG11. Zrób to na czystej ławce.</li>
</ol>
2. Monitorowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
<ol>
	<li>Użyj komórek hodowanych na płytce agarowej przez 6 dni, aby obserwować zagęszczenie DNA. Zebrać komórki z płytki pod koniec okresu światła, wlewając 1 ml 0,2 M roztworu sacharozy na komórki. Powtórz wlewanie roztworu na komórki, tak aby większość komórek została zebrana. Przenieś roztwór zawieszonych komórek do mikroprobówki w celu barwienia DNA.</li>
	<li>Dodać roztwór barwnika barwiącego DNA (np. Hoechst 33342) do 500 μl zawieszonego roztworu komórkowego w mikroprobówce do końcowego stężenia 1 μg/ml. Następnie trzymaj probówkę w ciemności przez 10 minut.</li>
	<li>Wirować przez 1 minutę przy 2 000 x g w celu osadzenia komórek. Odrzucić supernatant i dodać 10 μl 0,2 M roztworu sacharozy w celu uzyskania gęstej zawiesiny komórek.</li>
	<li>Przenieść 1 μl roztworu zawierającego barwione komórki do szkiełka szkiełkowego, nałożyć szkiełko nakrywkowe i obserwować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtr UV przy użyciu soczewki obiektywowej o powiększeniu 100X i olejku immersyjnego.</li>
	<li>Upewnij się, że w tym momencie w większości komórek obserwuje się zagęszczenie DNA, a następnie przygotuj próbkę do następnego etapu zamrażania.</li>
</ol>
3. Zamrażanie próbek dla Cryo-HVET
<ol>
	<li>Ustaw urządzenie do zamrażania wgłębnego. Napełnij zbiornik ciekłym azotem i rozpocznij chłodzenie kriokomory po połączeniu zbiornika i komory rurką teflonową.</li>
	<li>Wlej ciekły etan do małego garnka wewnątrz komory po schłodzeniu komory do temperatury ciekłego azotu. Podczas pracy należy nosić okulary, ponieważ ciekły etan jest wybuchowy.</li>
	<li>Wyładowanie jarzeniowe po stronie węglowej dziurawej, pokrytej węglem siatki EM (dziurawa siatka) przez 30 s przy 50 mA za pomocą bombardera z jonami plazmy.</li>
	<li>Nanieść 1 μl złotego znacznika BSA (15 nm) na dziurawą siatkę jako znacznik odniesienia.</li>
	<li>Nałożyć 2,5 μl podwielokrotności komórek na etapie zagęszczania DNA na dziurawą siatkę. Zetrzyj nadmiar roztworu bibułą filtracyjną. Natychmiast zanurz siatkę w ciekłym etanie za pomocą tłoka w urządzeniu do zamrażania wgłębnego.</li>
	<li>Zamrożone kratki należy przechowywać w zbiorniku ciekłego azotu do czasu ich zbadania.</li>
</ol>
4. Krio-HVET
<ol>
	<li>Ustaw HVEM na wysokie napięcie 1 MV.</li>
	<li>Zamontuj zamrożoną siatkę w uchwycie na próbki kriogeniczne dla HVEM wstępnie schłodzonego do -150 °C ciekłym azotem wewnątrz stacji kriogenicznej i załaduj ją do HVEM. Uważaj, aby uniknąć zanieczyszczenia lodem.</li>
	<li>Wybierz obszar obrazowania przy mniejszym powiększeniu 1,000X. Dostosuj wysokość eucentrycznej osi z.</li>
	<li>Przechylić stolik na próbkę do -60° i usunąć luz związany z obrotem przechyłu.</li>
	<li>Dostosuj ostrość w pobliżu miejsca docelowego przy powiększeniu 10 000X. Ustaw niedostateczną ostrość od 6 do 10 μm poprzez odchylenie od ostrości obrazu. W celu obrazowania należy wcześniej ustawić dawkę na 2 e-/Å-2 lub mniej na próbce.</li>
	<li>Zmierz dawkę elektronów przez gęstość prądu na ekranie obrazu w HVEM. Zrób zdjęcie na kliszy elektronowej lub aparatem cyfrowym przy takim samym powiększeniu, jak w procesie ustawiania ostrości.</li>
	<li>Obrazy nachylenia należy zbierać ręcznie, postępując zgodnie z tą samą procedurą, co w (4.5) od -60° do +60° z przyrostem kąta nachylenia od 2° do 4°, 
	UWAGA: W wielu nowoczesnych mikroskopach elektronowych akwizycja serii pochylenia jest zautomatyzowana przez połączenie kamery cyfrowej. W takim przypadku postępuj zgodnie z instrukcją obsługi. W przypadku filmów negatywowych wywoływać filmy przez 12 minut w temperaturze 20°C w zbiorniku wywoływacza za pomocą wywoływacza o pełnej mocy i utrwalać w utrwalaczu na 10 minut. Digitalizuj filmy w rozdzielczości 4 000 dpi (0,635 nm/piksel na obrazie) za pomocą skanera płaskiego. W przypadku aparatu cyfrowego zebrane obrazy należy poddać bezpośrednio kolejnemu etapowi przetwarzania obrazu. W razie potrzeby zmniejsz rozmiar obrazu za pomocą filtra mediany, używając dwóch do czterech kategoryzacji (współczynnik zmniejszania rozmiaru) i odpowiedniego oprogramowania (np. ImageJ).</li>
</ol>
5. Rekonstrukcja tomograficzna
<ol>
	<li>Utwórz plik obrazu stosu z poszczególnych obrazów pochylenia za pomocą polecenia "tif2mrc" lub "newstack" w oprogramowaniu IMOD 9.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie eTomo GUI w IMOD i ustaw parametry obrazu: rozmiar piksela, średnicę odniesienia, obrót obrazu itp. Następnie utwórz skrypty.</li>
	<li>Poszczególne programy należy wykonywać zgodnie z oprogramowaniem wymienionym w tabelach materiałów, gdzie seria pochylenia jest wyrównana za pomocą znaczników odniesienia (ze średnim błędem resztkowym mniejszym niż 0,5). Na koniec zrekonstruuj tomogram 3D za pomocą algorytmu SIRT w IMOD.</li>
	<li>Wyodrębnij obszar zainteresowania (ROI) z tomogramu i odszumiaj go za pomocą filtra odszumiającego: anizotropowego filtra dyfuzyjnego w IMOD, filtra dwustronnego w EMAN10 lub matematycznego filtra morfologicznego11, itd., z odpowiednimi parametrami zwiększającymi kontrast.</li>
</ol>
6. Segmentacja interesującej nas cechy
UWAGA: Procedura opisana poniżej jest specyficzna dla używanego oprogramowania (zobacz Tabela materiałów), ale zamiast tego można użyć innych pakietów oprogramowania. Zapoznaj się z ich instrukcją obsługi.
<ol>
	<li>W oknie Przeglądarka 3D otwórz plik tomogramu w oprogramowaniu Amira i wygeneruj OrthoSlice.</li>
	<li>W oknie Edytor segmentacji utwórz plik segmentacji, wybierając nowe "pole etykiety".</li>
	<li>Ręcznie prześledź obramowanie obiektu zainteresowania (FOI). Podążaj za FOI przez wszystkie plastry tomogramu. W przypadku drugiego FOI utwórz nowy "materiał" i powtórz tę samą operację.</li>
	<li>Wygeneruj renderowanie powierzchni, wybierając menu "SurfaceGen". Aby zwizualizować podzieloną na segmenty objętość, wybierz menu "SurfaceView". Aby przesuwać, obracać i powiększać objętość 3D, użyj narzędzi dostępnych w oknie Przeglądarka 3D.</li>
	<li>Aby uzyskać automatyczną segmentację, użyj narzędzia Magiczna różdżka. Kliknij obiekt i dostosuj suwaki w opcjach Wyświetlanie i maskowanie, aby pokryć zakres wartości, tak aby obiekt był w pełni zaznaczony przez jego cechy.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, R. M., Williams, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms+in+gene+transcription+imparted+by+chromosome+compaction+in+the+cyanobacterium+Synechococcus+elongatus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms in gene transcription imparted by chromosome compaction in the cyanobacterium Synechococcus elongatus.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 103 (22), 8564-8569 (2006).</li>
<li>Kondo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cyanobacterial+circadian+clock+based+on+the+kai+oscillator%5BTitle%5D)+AND+%22CSHS+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">A cyanobacterial circadian clock based on the kai oscillator.</a> CSHS Quant. Biol. 72, 47-55 (2007).</li>
<li>Seki, Y., Nitta, K., Kaneko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+polyphosphate+bodies+and+DNA+during+the+cell+division+cycle+of+Synechococcus+elongatus+PCC+7942%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+biol%22%5BJournal%5D)">Observation of polyphosphate bodies and DNA during the cell division cycle of Synechococcus elongatus PCC 7942.</a> Plant biol. 16 (1), Stuttgart, Germany. 258-263 (2014).</li>
<li>Murata, K., Hagiwara, S., Kimori, Y., Kaneko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+compacted+DNA+in+cyanobacteria+by+high-voltage+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of compacted DNA in cyanobacteria by high-voltage cryo-electron tomography.</a> Sci. Rep. 6, 34934(2016).</li>
<li>Koster, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+of+molecular+and+cellular+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+struct.+boil%22%5BJournal%5D)">Perspectives of molecular and cellular electron tomography.</a> J. struct. boil. 120 (3), 276-308 (1997).</li>
<li>Lučić, V., Rigort, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography%3A+The+challenge+of+doing+structural+biology+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography: The challenge of doing structural biology in situ.</a> J. Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).</li>
<li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Adsorption+of+Cyanophage+P-SSP7+onto+Marine+Prochlorococcus%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Visualizing Adsorption of Cyanophage P-SSP7 onto Marine Prochlorococcus.</a> Sci. Rep. 7, 44176(2017).</li>
<li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://mic.microbiologyresearch.org/content/journal/micro/10.1099/00221287-111-1-1">Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of Cyanobacteria.</a> J. Gen. Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+struct.+boil%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. struct. boil. 116, 71-76 (1996).</li>
<li>Jiang, W., Baker, M. L., Wu, Q., Bajaj, C., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+a+bilateral+denoising+filter+in+biological+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Applications of a bilateral denoising filter in biological electron microscopy.</a> J. Struct. Biol. 144, 114-122 (2003).</li>
<li>Kimori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+image+processing+for+quantitative+shape+analysis+of+biomedical+structures%3A+effective+contrast+enhancement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sync.+Rad%22%5BJournal%5D)">Morphological image processing for quantitative shape analysis of biomedical structures: effective contrast enhancement.</a> J. Sync. Rad. 20, 848-853 (2013).</li>
<li>Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Ga Gibson,, Watkins, S. C., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+microscopy+for+3D+structural+analysis+of+dynamic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Visual.+Exper%22%5BJournal%5D)">Correlative microscopy for 3D structural analysis of dynamic interactions.</a> J. Visual. Exper. 76, e50386(2013).</li>
<li>Murata, K., Esaki, M., Ogura, T., Arai, S., Yamamoto, Y., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+imaging+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+by+high-voltage+scanning+transmission+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicros%22%5BJournal%5D)">Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography.</a> Ultramicros. 146, 39-45 (2014).</li>
<li>Kortje, K. H., Paulus, U., Ibsch, M., Rahmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+thick+sections+of+nervous+tissue+with+energy-filtering+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Imaging of thick sections of nervous tissue with energy-filtering transmission electron microscopy.</a> J. Microsc. 183, 89-101 (1996).</li>
<li>Bouwer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+most-probable+loss+tomography+of+thick+selectively+stained+biological+specimens+with+quantitative+measurement+of+resolution+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated most-probable loss tomography of thick selectively stained biological specimens with quantitative measurement of resolution improvement.</a> J. Struct. Biol. 148 (3), 297-306 (2004).</li>
<li>Egerton, R. F., Li, P., Malac, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+damage+in+the+TEM+and+SEM%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Radiation damage in the TEM and SEM.</a> Micron. 35 (6), 399-409 (2004).</li>
<li>Danev, R., Buijsse, B., Khoshouei, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volta+potential+phase+plate+for+in-focus+phase+contrast+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Volta potential phase plate for in-focus phase contrast transmission electron microscopy.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 111 (44), 15635-15640 (2014).</li>
<li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zernike+phase+contrast+cryo-electron+microscopy+and+tomography+for+structure+determination+at+nanometer+and+subnanometer+resolutions%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Zernike phase contrast cryo-electron microscopy and tomography for structure determination at nanometer and subnanometer resolutions.</a> Structure. 18 (8), 903-912 (2010).</li>
<li>Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nmeth/journal/v11/n4/abs/nmeth.2842.html">Cryo-scanning transmission electron tomography of biological cells.</a> Nat. Methods. 11 (4), 423-428 (2014).</li>
<li>Ophus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+linear+phase+contrast+in+scanning+transmission+electron+microscopy+with+matched+illumination+and+detector+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Comm%22%5BJournal%5D)">Efficient linear phase contrast in scanning transmission electron microscopy with matched illumination and detector interferometry.</a> Nat. Comm. 7, 1-7 (2016).</li>
<li>Schertel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+FIB-SEM%3A+Volume+imaging+of+cellular+ultrastructure+in+native+frozen+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens.</a> J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Przedstawiliśmy sekwencję protokołów do wizualizacji przejściowego zagęszczenia DNA u sinic. Podstawowa koncepcja jest podobna do koncepcji korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM)12. Ponadto w tej metodzie żywe cyjanobakterie monitorowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, szybko zamrażano na siatkach EM i bezpośrednio wizualizowano za pomocą wysokonapięciowej kriotomografii elektronowej. W pierwszej kolejności udało się zobrazować szczegółową strukturę zbitych komórek bakteryjnych DNA w 3D. Obecnie procedura ta jest specyficzna dla tego tematu, ale będzie stosowana w szerszym zakresie, w niektórych przypadkach ze zmodyfikowaną metodyką. W tym miejscu omówiono zalety, ograniczenia i przyszłe możliwości tej metody.
Jedną z zalet tej metody jest wizualizacja 3D całej komórki. 1 MV HVEM z powodzeniem zobrazował dynamiczną strukturę organelli subkomórkowych w komórkach zagęszczonych DNA. Jednak drobna struktura wewnątrz normalnych komórek nie mogła być rozróżniona ze względu na niski kontrast obrazu. Rosnące rozproszenie nieelastyczne i wielokrotne w grubych próbkach powoduje rozmycie obrazu13. Filtrowanie obrazów o zerowej stracie i najbardziej prawdopodobnych stratach za pomocą filtra energetycznego może poprawić kontrast obrazu poprzez zmniejszenie rozpraszania nieelastycznego14,15, ale nie zadziała w przypadku próbek grubszych niż iMFP. Szczyty zerowej straty i najbardziej prawdopodobnej straty drastycznie zmniejszają się wraz z grubością próbki. Szczególnie trudno jest uzyskać wystarczający stosunek sygnału do szumu dla wrażliwych na elektrony próbek zanurzonych w lodzie. Murata i wsp. wykazali, że skaningowa mikroskopia transmisyjna 1MV (STEM) daje wyższy kontrast obrazu niż obraz jasnego pola w osadzonych w plastiku komórkach drożdży o grubości 5 μm, gdzie kontrast obrazu jest przede wszystkim określany przez kontrast amplitudy13. Oczekuje się jednak, że wpływ uszkodzeń typu knock-on na bardziej przyspieszone elektrony tworzy kolejne ograniczenie dawki promieniowania dla wrażliwych na uszkodzenia próbek kriogenicznych16. Zastosowanie płytek fazowych Volta i Zernike17,18 dla HVEM może być w stanie zmniejszyć uszkodzenia spowodowane efektem domina poprzez zmniejszenie całkowitej dawki w przyszłości. Innym ograniczeniem w stosowaniu HVEM do grubych próbek jest fakt, że obiekty użytkowników, które zapewniają HVEM, są rzadkie na całym świecie.
Wykorzystując alternatywną metodologię obserwacji grubych próbek, tomografia krio-STEM przy napięciu 300 kV wykazała obrazy o wysokim kontraście na zamrożonych i uwodnionych próbkach o grubości przekraczającej kilkaset nanometrów19. Aby uzyskać kontrast fazowy w cryo-STEM, wprowadzono również mikroskopię ptychograficzną elektronową, w której płytka fazowa w soczewce kondensatora transponuje dyfrakcję modulowaną fazowo do rozpikselowanego detektora2D 20. Obrazy są uzyskiwane za pomocą obliczeń z wielu dyfrakcji. Do bezpośredniego i szybkiego krioobrazowania 3D dużych natywnych zamrożonych próbek, można również zastosować cryo-FIB-SEM21, gdzie stosuje się seryjne cięcie ze skupioną wiązką jonów i blokowym obrazowaniem twarzy do obrazowania w pełni uwodnionych zamrożonych próbek. Chociaż technologie te rozszerzają zakres widzenia próbek biologicznych, trudno jest znaleźć docelową lokalizację bakterii, np. bakterii oznakowanych, ponieważ cel znajduje się całkowicie pod lodem i nie można go zidentyfikować przed przycięciem.
Zagęszczenie DNA wytwarza wyraźną strukturę u sinic. Komórki zagęszczone DNA można łatwo odróżnić, nawet bez barwienia, ze względu na duże odchylenie gęstości w komórkach, które nie występuje w normalnych komórkach. Jednak, aby uwidocznić bardziej lokalne zdarzenia w komórce, konieczne jest przeniesienie fluorescencyjnie znakowanego ROI do mikroskopu elektronowego. W przypadku korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM) obrazy z mikroskopu świetlnego i obrazy z mikroskopu elektronowego są na ogół korelowane za pomocą fluorescencyjnych kulek lateksowych lub kropek kwantowych na siatkach szukacza EM12. Znakowane cząstki muszą mieć nie tylko fluorescencję, ale także wysoką gęstość elektronów. Mogą one dokładnie i niezawodnie skorelować pozycje między dwoma obrazami. Ponadto, potwierdzając oznaczony obszar za pomocą mikroskopii krioświetlnej, można osiągnąć całkowite nałożenie się zwrotu z inwestycji między dwoma mikroskopami. Przy charakteryzowaniu bardziej szczegółowych zdarzeń strukturalnych w zagęszczeniu DNA, cząstki te i mikroskop krioświetlny będą niezastąpionym narzędziem do bardziej solidnej i dokładnej korelacji w przyszłości.
W artykule pokazano, jak scharakteryzować przejściową strukturę zagęszczenia DNA u sinic za pomocą połączenia hodowli synchronicznej, mikroskopii fluorescencyjnej i wysokonapięciowej krioelektronowej tomografii. Protokół ten koncentruje się na obserwacji zagęszczonego DNA. Dzięki połączeniu tej metody z innymi nowymi technologiami wymienionymi powyżej, możliwe będzie dokładniejsze zbadanie procesu zagęszczania DNA, a odpowiednio zmodyfikowane metody mają szerokie zastosowanie do innych dynamicznych zdarzeń strukturalnych u bakterii.

Zagęszczenie DNA to dramatyczne zdarzenie cytoplazmatyczne, które zostało zidentyfikowane u niektórych cyjanobakterii. Kiedy Synechococcus elongatus był hodowany w ciągu 12 godzin każdego cyklu światła/ciemności, DNA wydawało się skondensowane pod koniec okresu światła, co wyraźnie różniło się od jego wyglądu w innych punktach czasowych1. Sugeruje się, że proces ten jest kontrolowany przez zegar okołodobowy oparty na białkach Kai2. Seki i wsp. donieśli, że DNA wybarwione Hoechst 33342 zostało zagęszczone w komórkach S. elongatus pod koniec okresu światła i wykazało falisty kształt pręcika pod mikroskopem fluorescencyjnym. Skompresowane DNA następnie rozdzieliło się na dwie części w środku pręcika, gdy komórka się podzieliła, a na koniec powróciło do normalnego równomiernego rozkładu w każdej komórce potomnej3. Jednak jego przejściowy charakter i duży rozmiar do mikroskopii elektronowej utrudniały analizę strukturalną. Murata i wsp. połączyli kilka metod, w tym hodowlę synchroniczną, mikroskopię fluorescencyjną, szybkie zamrażanie i kriotomografię elektronową wysokiego napięcia (cryo-HVET), i udało im się zidentyfikować strukturę przejściowego zagęszczenia DNA, w tym kinetykę ciał polifosforanowych (PPB)4. Manuskrypt zawiera wizualne wyjaśnienie tak trudnego materiału w szczegółach poprzez połączenie procedur eksperymentalnych.
S. elongatus ma kształt kapsułki, długość od 2 do 5 μm, szerokość około 0,5 μm, a doskonałe zagęszczenie DNA pojawia się w żywych komórkach tylko na bardzo krótki czas. W związku z tym zmiany strukturalne zachodzące w zagęszczeniu DNA sinic nie były znane w szczegółach. Aby zbadać te struktury za pomocą mikroskopii elektronowej, konieczne jest przezwyciężenie dwóch głównych problemów technicznych. Jednym z nich jest obserwacja tak grubego okazu całej bakterii w warunkach zbliżonych do rodzimych, a drugim szybkie utrwalenie dynamicznej struktury. Jeśli chodzi o pierwszy problem, nieelastyczna średnia droga swobodna elektronów (iMFP) zależy od napięcia przyspieszającego mikroskopu elektronowego5. W transmisyjnym mikroskopie elektronowym (TEM) o napięciu 300 kV jest to mniej niż 350 nm. Na przykład, gdy w 200 kV TEM (iMFP ≈ 250 nm) obserwuje się zanurzoną w lodzie sinicę (grubość próbki ≈ 600 nm), struktury wewnątrz komórki są trudne do zaobserwowania. Natomiast 1 MV TEM (iMFP ≈ 500 nm) może dać obraz struktury cytoplazmatycznej w całej komórce (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). W tym protokole, jako jedną z części rozwiązania, zastosowano wysokonapięciowy mikroskop elektronowy (HVEM) o napięciu przyspieszającym 1 MV. Jednak obiekty, które wdrażają HVEM, są ograniczone na całym świecie. Możliwe alternatywne rozwiązania są również omówione w sekcji Dyskusja. Drugi problem został rozwiązany za pomocą mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM). Jest to potężne narzędzie do wizualizacji dynamicznych struktur w warunkach zbliżonych do natywnych, gdzie próbka jest szybko zamrażana w ciekłym etanie za pomocą urządzenia do szybkiego zamrażania, a moment zamrożenia jest bezpośrednio obserwowany przy minimalnych modyfikacjach6. W połączeniu z tomografią, migawka trójwymiarowych (3D) struktur może zostać zrekonstruowana z serii tilt7. W tym eksperymencie zagęszczenie DNA odtworzono u S. elongatus przy użyciu hodowli synchronicznej w ciągu 12 godzin każdego cyklu światła/ciemności, a czas zamrożenia próbki określono przez monitorowanie pod mikroskopem fluorescencyjnym.
Opisane tutaj podejścia mają szerokie zastosowanie do badania dynamicznych struktur w komórkach bakteryjnych, np. podziału komórek, segregacji chromosomów i infekcji fagowej, i mają potencjał, aby otworzyć nowe drogi w badaniach mikrobiologicznych.

<table><tbody><tr><td>Roztwór Hoechst 33342</td><td>Dojindo</td><td>346-07951</td><td>1 mg / ml w H2O</td></tr><tr><td>Agar w proszku (do hodowli roślin)</td><td>Wako</td><td>016-11875</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Wako</td><td>027-02192</td><td>99,5%</td></tr> <tr><td>Czterowodny chlorek manganu</td><td>Wako</td><td>139-00722</td><td>99%</td></tr> <tr><td>Siarczan siedmiowodny</td><td>Wako</td><td>264-00405</td><td>99,5%</td></tr><tr><td>Molibdenian sodu</td><td>Wako</td><td>196-02472</td><td>99%</td></tr><tr><td>Siarczan miedzi pięciowodny</td><td>Wako</td><td>039-04412</td><td>99,5%</td></tr><tr><td>Sześciowodny azotan kobaltu</td><td>Wako</td><td>031-03752</td><td>99,5%</td></tr><tr><td>Azotan sodu</td><td>Wako</td><td>191-02542</td><td>99%</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Wako</td><td>131-00405</td><td>99,5%</td></tr><tr><td>Wapń chlorek odwadniający</td><td>Wako</td><td>031-00435</td><td>99,5%</td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Wako</td><td>036-05522</td><td>98%</td></tr><tr><td>EDTA-2Na</td><td>Dojindo</td><td>343-01861</td><td>99,5%</td></tr><tr><td>Węglan sodu</td><td>Wako</td><td>197-01581</td><td>99,8%</td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Wako</td><td>164-04295</td><td>99%</td></tr><tr><td>TES (Dobry' bufor s)</td> <td>Dojindo</td><td>344-02653</td><td>99%</td></tr> <tr><td>Cytrynian żelazowo-amonowy</td><td>Wako</td><td>092-00802</td><td>1. gatunek</td></tr><tr><td>Tiosiarczan sodu pentahydrat</td><td>Wako</td><td>197-03585</td><td>99%</td></tr> <tr><td>BSA złoty znacznik 15nm</td><td>Aurion</td><td>215.133</td><td></td></tr><tr><td>Siatka Quantifoil EM</td><td>Quantifoil</td><td>MicroTools R3.5/1 Siatka</td><td></td>miedziana</tr><tr><td>Folie elektronowe</td><td>Kodak</td><td>SO-163</td><td></td></tr><tr><td>Developer</td><td>Kodak</td><td>D19</td><td></td></tr><tr><td>Fixer</td><td>Kodak</td><td>Rapid fixer</td><td>Solution</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Whatman</td><td>Grade 1</td><td></td></tr><tr><td>Komora wzrostowa</td><td>NKsystem</td><td>LH-100SP</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE 50i</td> Wysokonapięciowy <td></td></tr><tr><td></td><td>TEM HItachi</td><td>H1250M</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na próbki kriogeniczne do</td> urządzenia do zamrażania wgłębnego HVEM <td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>EM CPC</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Ion Bombarder</td><td>Urządzenie próżniowe</td><td>PIB-10</td><td></td></tr><tr><td>Przechowywanie ciekłego azotu</td><td>Taylor-Wharton</td><td>25LDB</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik rozwijający</td><td>Dosaka EM</td><td>TB-3-75</td><td></td></tr><tr>skaner<td>płaski</td><td>Nikon</td><td>Oprogramowanie do segmentacji Coolscan 9000ED</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FEI</td><td>Amira</td><td>https://www.fei.com/software/amira</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do rekonstrukcji tomograficznej</td><td>eTOMO</td><td></td><td>http://bio3d.colorado.edu/imod</td></tr></tbody></table>

wizualizacja zagęszczenia dna u sinic za pomocą wysokonapięciowej krioelektronowej tomografii

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Ten protokół opisuje, jak wizualizować przejściowe zagęszczenie DNA u cyjanobakterii. Zagęszczenie DNA to dramatyczne zdarzenie cytoplazmatyczne, które niedawno stwierdzono u niektórych cyjanobakterii przed podziałem komórki. Jednak ze względu na duży rozmiar komórki i przejściowy charakter trudno jest szczegółowo zbadać strukturę. Aby przezwyciężyć te trudności, po pierwsze, zagęszczenie DNA jest wytwarzane w sposób powtarzalny w sinicy Synechococcus elongatus PCC 7942 poprzez hodowlę synchroniczną przy użyciu 12 godzin każdego cyklu jasnego/ciemnego. Po drugie, zagęszczenie DNA jest monitorowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i wychwytywane przez szybkie zamrażanie. Po trzecie, szczegółowa struktura zagęszczonych komórek DNA jest wizualizowana w trzech wymiarach (3D) za pomocą wysokonapięciowej tomografii krioelektronowej. Ten zestaw metod ma szerokie zastosowanie do badania przejściowych struktur bakterii, np. podziału komórek, segregacji chromosomów, infekcji fagowej itp., które są monitorowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i bezpośrednio wizualizowane za pomocą tomografii krioelektronowej w odpowiednich punktach czasowych.

W precyzyjnej kulturze synchronicznej poddanej 12-godzinnemu cyklowi światło/ciemność, DNA znakowane barwnikiem Hoechst wykazuje normalny, jednolity rozkład w warunkach ciemności (Rycina 2a). Jednakże w okresie naświetlania ulega ono stopniowej kondensacji wewnątrz komórki i pod koniec tego okresu przybiera postać pofalowanej struktury przypominającej pręt (Rycina 2b). Ostatecznie pręt dzieli się w centrum (strzałki na Rycynie 2c), a jego dwie części zostają rozdzielone do komórek potomnych (Rycina 2d). Po podziale komórki skondensowane DNA natychmiast znika, a DNA powraca do normalnego, jednolitego rozkładu.
Gdy alikwot komórek znajdujących się w końcowej fazie kondensacji DNA przeniesiono niezwłocznie na siatkę dziurkowaną i szybko zamrożono w ciekłym etanie, a następnie zamrożoną siatkę obserwowano za pomocą krio-HVEM o napięciu 1 MV, struktury wewnętrzne cyjanobakterii, w tym DNA, warstwy błon tylakoidów, ściany komórkowe i PPB, pojawiły się jako obraz uchwycony w momencie zamrażania (Rycina 3a). W wielu komórkach widoczna była wyraźna kondensacja DNA (białe strzałki na Rycynie 3a), co pozwoliło na łatwe odróżnienie ich od komórek prawidłowych (białe groty strzałek na Rycynie 3b). Niektóre wykazywały przewężenie w centrum komórki, co jest spodziewane przed podziałem komórkowym (żółta strzałka na Rycynie 3a).
W tomogramach 3D można było przeprowadzić segmentację głównych organelli komórki; rozróżniono ścianę komórkową, warstwy błony tylakoidów, DNA oraz PPB (Rysunek 4). W szczególności skondensowane DNA było oddzielone wyraźną przerwą w cytoplazmie, gdzie DNA było otoczone materiałem o niskiej gęstości, a warstwy błony tylakoidów były zdeformowane wzdłuż pofalowanego pręta skondensowanego DNA. Zaobserwowano nową dynamiczną charakterystykę PPB: w komórkach ze skondensowanym DNA zauważono, że wiele małych PPB przylega do DNA, podczas gdy w normalnych komórkach są one większe i występują w mniejszej liczbie. Ponadto większość PPB występowała w parach, a niektóre fragmenty DNA zdawały się być w procesie oddzielania od PPB. Sugeruje to, że same PPB dzielą się na dwie części podczas replikacji DNA i pełnią funkcję dostarczycieli fosforanu niezbędnego do syntezy DNA.
<img alt="Obraz mikroskopowy, komórki bakteryjne, mikroskopia elektronowa, analiza strukturalna, badanie morfologii komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1. Obrazy cryo-EM prawidłowych cyjanobakterii zatopionych w lodzie, *S. elongatus* PCC 7942 przy różnych napięciach przyspieszających. a) 20 kV i b) 10 kV. Pasek skali = 50 nm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57197/57197fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna dynamiki chromosomowej, wyniki eksperymentów, metody analizy DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: Mikroskopia fluorescencyjna cyjanobakterii *S. elongatus* komórki Po synchronicznej hodowli w 12-godzinnych cyklach światła i ciemności komórki barwiono Hoechst 3342. (a) Komórki po 2 godzinach od wystąpienia stanu ciemności wykazują jednorodne znakowanie DNA. DNA w wielu komórkach stopniowo kondensowało podczas okresu naświetlania. Ostatecznie utworzyło ono gruby, falisty pręt. (b) charakterystyczne dla kondensacji DNA. Po tym etapie skondensowane struktury DNA szybko podzieliły się w swoich centrach (groty strzałek) podczas podziału komórkowego (c), a dwa fragmenty rozdzieliły się pomiędzy komórki potomne (d). Komórki potomne ponownie powróciły do jednorodnego znakowania DNA w okresie ciemności. Pasek skali = 2 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57197/57197fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Mikroskopia komórek bakteryjnych; obrazy z mikroskopii elektronowej; analiza struktury komórki; widok w przekroju." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Obraz cryo-HVEM sinic zatopionych w lodzie amorficznym. (a) pokazuje surowy obraz w 0° pochylenie. Obrazy wykonano pod koniec okresu oświetlenia. W niektórych komórkach widoczne są pofalowane, pręcikowate ciała DNA, przypominające kondensowane chromosomy eukariotyczne (białe strzałki). W normalnych komórkach cyjanobakterii w cytoplazmie dostrzegalna jest struktura DNA (białe groty strzałek). Niektóre wykazują przewężenie w centrum komórek, co jest spodziewane przed podziałem komórkowym (żółta strzałka). (b) przekroje xy, xz, yz tomogramu 3D. Żółte linie przerywane wskazują przecięcia przekrojów. Pasek skali = 2 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57197/57197fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Struktura komórki bakteryjnej – TEM i schemat modelu 3D z zaznaczeniem komponentów wewnętrznych i morfologii." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Ultrastruktura komórek zawierających skondensowane DNA. Główne komponenty zostały podzielone na segmenty: ściana komórkowa (jasnożółta), błony tylakoidów (czerwone) i DNA (niebieskie). (a) przedstawia przekrój w osi z tomogramu 3D. (b) wszystkie segmenty. Przewężenie wskazujące separację komórek pojawia się w centrum komórki (strzałka). PPB są zamodelowane jako żółte lub pomarańczowe sfery; każda pomarańczowa sfera reprezentuje odpowiednik najbliższej żółtej sfery. Pasek skali = 50 nm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57197/57197fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>

Ten protokół opisuje, jak wizualizować przejściowe zagęszczenie DNA u cyjanobakterii. Stosuje się hodowlę synchroniczną, monitorowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, szybkie zamrażanie i wysokonapięciową kriotomografię elektronową. Przedstawiono protokół dla tych metodologii oraz omówiono przyszłe zastosowania i rozwój.

Wizualizacja zagęszczenia DNA u sinic za pomocą wysokonapięciowej krioelektronowej tomografii

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny mikrobiologii, takie jak to, jak zmienia się struktura DNA podczas cyklu komórkowego bakterii. Główną zaletą tej techniki jest to, że możliwe jest uwidocznienie ultrastruktury całych komórek bakteryjnych w stanie zbliżonym do stanu żywego w odpowiednich punktach czasowych bez konieczności wykonywania dodatkowych zabiegów. Procedurę zademonstrują Chihong Song, doktor habilitowany z mojego laboratorium, oraz Mako Hayashi, doktorant z laboratorium dr Kaneko.Zacznij od wyhodowania sinic na dziewięciocentymetrowych, wysterylizowanych płytkach BG-11 zawierających 1,5% agaru i 0,3% tiosiarczanu sodu. Inkubuj płytki w temperaturze 23 stopni Celsjusza w cyklu świetlnym 12-12 z 50 mikro-E światła na metr kwadratowy na sekundę. Aby utrzymać komórki, co tydzień przenoś je na świeże płytki agarowe BG-11.W ciągu tygodnia kultury pojawiają się jako zielone paski. Przenieś zielone grudki komórek za pomocą wysterylizowanej płomieniowo pętli i rozłóż je na nowej płytce. Aby zaobserwować zagęszczenie DNA, należy zebrać komórki hodowane przez sześć dni pod koniec okresu świetlnego.Aby uwolnić komórki z płytki, dodaj jeden mililitr 0,2-molowej sacharozy. Następnie zebrać zawiesinę komórkową i powtarzać dodawanie i usuwanie sacharozy, aż roztwór zmieni kolor na zielony. Zmiana koloru wskazuje, że większość komórek została zwolniona.Teraz przenieś 500 mikrolitrów roztworu zawieszonych komórek do probówki Microfuge i dodaj barwnik Hoechst, aby uzyskać końcowe stężenie jednego mikrograma na mililitr. Następnie pozwól komórkom inkubować w ciemności przez 10 minut. Następnie odwiruj komórki, wyrzuć supernatant i zawieś je ponownie w 10 mikrolitrach 0,2-molowej sacharozy.Następnie przenieść jeden mikrolitr zawiesiny na szkiełko podstawowe, założyć szkiełko nakrywkowe i obserwować komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w filtr UV. Używając obiektywu 100-krotnego zanurzenia w olejku, poszukaj dowodów na zagęszczenie DNA, które powinny być widoczne w większości komórek. Najpierw przygotuj urządzenie do zamrażania wgłębnego.Następnie ustaw pojemnik na ciekły azot, wkładając pojemnik na etan i nasadkę pręta chłodzącego. Następnie napełnij pojemnik ciekłym azotem i ostudź go do temperatury ciekłego azotu. Następnie załaduj etan do kontenera.Pamiętaj, aby nosić okulary ochronne, ponieważ ciekły etan jest wybuchowy. Na koniec zdejmij nasadkę pręta chłodzącego i przykryj pojemnik plastikową pokrywką, aby uniknąć przyklejenia szronu. Aby kontynuować, jarzenie rozładowuje się po stronie węglowej pokrytej węglem siatki EM przez 30 sekund przy 50 miliamperach za pomocą bariery jonów plazmowych.Następnie przygotuj Vitrobota zgodnie z protokołem testu. Użyj pęsety, aby ustawić wstępnie obrobioną siatkę EM w komorze. Przed nałożeniem próbki należy potraktować siatkę EM jednym mikrolitrowym, 15-nanometrowym znacznikiem złota BSA, który posłuży jako marker odniesienia.Teraz podnieś 2,5 mikrolitra zawiesiny komórek na siatkę. Zetrzyj nadmiar roztworu za pomocą bibuły filtracyjnej i natychmiast zamroź siatkę w ciekłym etanie. Zamrożoną siatkę należy przechowywać w ciekłym azocie do czasu, gdy będzie można ją zbadać.Następnie uruchom HVEM i ustaw go na wysokie napięcie jednego megawolta. Następnie schłodzić uchwyt siatki próbki do minus 150 stopni Celsjusza za pomocą ciekłego azotu. Po schłodzeniu zamontuj zamrożoną siatkę w schłodzonym uchwycie na próbkę kriogeniczną i załaduj ją do HVEM.Uważaj, aby nie zanieczyścić zestawu lodem. Teraz wybierz obszar obrazowania przy małym powiększeniu 1,000 razy. Następnie wyreguluj eucentryczną wysokość osi Z i przechyl stolik próbki do minus 60 stopni.Następnie usuń luz związany z obrotem przechyłu. Teraz ustaw ostrość w pobliżu miejsca docelowego w powiększeniu 10 000 razy. Ustaw niedostateczną ostrość od sześciu do 10 mikronów przez odchylenie od ostrego obrazu.W przypadku obrazowania ustaw dawkę na dwa elektrony na angstrem kwadratowy na sekundę lub mniej. Miej oko na dawkę elektronów, która jest odbijana przez gęstość prądu, i zrób zdjęcie aparatem cyfrowym lub na kliszy elektronowej. Następnie zbierz obrazy nachylenia od ujemnych 60 do dodatnich 60 stopni w krokach od dwóch do czterech stopni.Jeśli to możliwe, korzystaj ze zautomatyzowanych funkcji mikroskopu. Otwórz komercyjny pakiet oprogramowania i załaduj obrazy pochylenia do rekonstrukcji tomograficznej. Następnie utwórz plik stosu obrazów z poszczególnych obrazów za pomocą polecenia tif2mrc lub newstack.Następnie uruchom oprogramowanie eTomo GUI i wprowadź parametry obrazu dotyczące rozmiaru piksela, średnicy odniesienia, obrotu obrazu i tak dalej. W ten sposób utwórz skrypt edycji. Teraz użyj sugerowanego oprogramowania, aby utworzyć serię pochylenia, wyrównaną za pomocą znaczników odniesienia, ze średnim błędem resztkowym mniejszym niż 0,5.Na koniec zrekonstruuj tomogram 3D za pomocą algorytmu SIRT. Teraz wyodrębnij obszar zainteresowania z tomogramu i zastosuj filtr odszumiający, taki jak anizotropowy filtr dyfuzyjny, filtr dwustronny lub filtr morfologii matematycznej. Filtrowanie należy wykonać przy użyciu parametrów, które zwiększają kontrast obrazu.Następnie podziel na segmenty interesujący Cię obiekt. Użyj funkcji krojenia, aby otworzyć tomogram. Następnie przejdź do okna Edytor segmentacji i wybierz nowe pole etykiety, aby utworzyć plik segmentacji.Następnie ręcznie prześledź obramowanie interesującego obiektu w pierwszym wycinku, a następnie w każdym z pozostałych wycinków. Dodatkową interesującą funkcję można dodać za pomocą tych samych operacji. Teraz, aby wygenerować renderowanie powierzchni przy użyciu opcji w menu SurfaceGen w celu wizualizacji segmentowanej objętości, wybierz menu SurfaceView.Aby przesuwać, obracać i powiększać objętość 3D, użyj narzędzi dostępnych w oknie Przeglądarka 3D. Automatyczną segmentację można wykonać za pomocą narzędzia Magic Wand. Kliknij obiekt i dostosuj suwaki w opcjach Wyświetlanie i maskowanie, tak aby funkcje obiektu były w pełni zaznaczone.W precyzyjnej hodowli synchronicznej DNA znakowane Hoechstem wykazuje normalny równomierny rozkład w ciemnych warunkach, a następnie stopniowo zagęszcza się w komórce w okresie światła, przyjmując falistą strukturę przypominającą pręcik pod koniec okresu światła. Wreszcie pręcik dzieli się w środku, a jego dwie części są rozprowadzane do komórek potomnych. Po podziale komórki zbite DNA natychmiast znika, a DNA powraca do normalnego równomiernego rozkładu.Kiedy komórki w końcowej fazie zagęszczenia DNA zostały zamrożone i obserwowane za pomocą mikroskopii elektronowej wysokiego napięcia, wiele z nich wykazywało wyraźne zagęszczenie DNA, które można było łatwo odróżnić od normalnych komórek. Niektóre wykazywały zwężenie w środku komórek, zgodnie z oczekiwaniami przed podziałem komórek. Z tomogramów 3D zwarte DNA jest widocznie oddzielone w cytoplazmie i otoczone materiałem o niskiej gęstości.Warstwy błony tylakoidowej są zniekształcone wzdłuż falistego pręta zagęszczonego DNA. Co ciekawe, wiele małych ciałek fosforanowych przylega do zagęszczonego DNA i zwykle pojawia się w parach. Te ciała polifosforanowe mogą być dostawcami fosforanów do syntezy DNA.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować ultrastrukturę całych komórek bakteryjnych w pobliżu stanu żywego w odpowiednim punkcie czasowym za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej wysokiego napięcia bez żadnych dodatkowych zabiegów, takich jak barwienie. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że stan zagęszczenia DNA zmienia się z każdą minutą pod koniec cyklu świetlnego. Upewnij się, że nie przegapisz najlepszego momentu na zamrożenie próbki.Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak CLEM, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące lokalizacji określonych białek lub nukleotydów w zagęszczonym DNA. Po jej opracowaniu, technika ta powinna utorować drogę naukowcom w dziedzinie mikrobiologii do badania podziału komórek, segregacji DNA i infekcji wirusowych u bakterii lub małych eukariontów.

visualization-dna-compaction-cyanobacteria-high-voltage-cryo-electron

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy tutaj sposób wykorzystania kriotomografii elektronowej (ECT) do badania ultrastruktury komórek bakteryjnych w stanach zbliżonych do naturalnych, z rozdzielczością „makrocząsteczkową” (~4 nm).

Kriotomografia elektronowa komórek bakteryjnych

Źródło: Biller, S. J., et al. Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic. J. Vis. Exp. (2022)Ten film przedstawia przygotowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic do transmisyjnej mikroskopii elektronowej za pomocą barwienia ujemnego, umożliwiając wizualizację morfologii, wielkości i czystości pęcherzyków w wysokiej rozdzielczości do analiz strukturalnych i porównawczych.

Wizualizacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Źródło: Murata, K. i wsp., Wizualizacja zagęszczenia DNA u cyjanobakterii za pomocą wysokonapięciowej krioelektronowej tomografii. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje synchroniczną hodowlę cyjanobakterii w cyklach światła i ciemności w celu zbadania regulowanego okołodobowo zagęszczenia DNA. Mikroskopia fluorescencyjna ujawnia skondensowane DNA w określonych punktach czasowych, potwierdzając wyrównanie cyklu komórkowego w całej populacji.

Synchronizacja kultur sinic i zagęszczenie DNA napędzane przez cykle światło-ciemność

Przedstawiamy protokół zbierania i przetwarzania krio-tomogramów elektronowych całych mitochondriów. Technika ta zapewnia szczegółowy wgląd w strukturę, funkcję i organizację dużych kompleksów białek błonowych w natywnych błonach biologicznych.

Wizualizacja dimerów syntazy ATP w mitochondriach za pomocą kriotomografii elektronowej

Przedstawiamy protokół, jak wykorzystać wysokoprzepustową tomografię krioelektronową do określenia wysokiej rozdzielczości struktur in situ maszyn molekularnych. Protokół pozwala na przetwarzanie dużych ilości danych, pozwala uniknąć typowych wąskich gardeł i skraca przestoje zasobów, pozwalając użytkownikowi skupić się na ważnych kwestiach biologicznych.

Korzystanie z Tomoauto: protokół dla wysokowydajnej zautomatyzowanej tomografii krioelektronowej

Obrazowanie komórek bakteryjnych to nowe podejście do biologii systemowej, skoncentrowane na definiowaniu statycznych i dynamicznych procesów, które dyktują funkcjonowanie dużych maszyn makromolekularnych. W tym przypadku integracja ilościowego obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej jest wykorzystywana do badania architektury i funkcji systemu wydzielania Legionella pneumophila typu IV.

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

Tutaj przedstawiono protokół opisujący etapy przygotowania próbki i zbierania danych wymagane w kriogenicznej tomografii rentgenowskiej (SXT) do obrazowania ultrastruktury całych komórek kriokonserwowanych w rozdzielczości połowy tonu 25 nm.

Kartograficzny opis 3D komórki za pomocą kriomiękkiej tomografii rentgenowskiej

Prezentujemy protokół przygotowania lameli zamrożonych próbek biologicznych metodą kriogenicznej mikroobróbki wiązki jonów do wysokorozdzielczych badań strukturalnych makrocząsteczek in situ za pomocą krioelektronowej tomografii. Przedstawiony protokół zawiera wytyczne do przygotowania wysokiej jakości blaszek o wysokiej odtwarzalności do charakterystyki strukturalnej makrocząsteczek wewnątrz Saccharomyces cerevisiae.

Przygotowanie i mikroobróbka Cryo-FIB Saccharomyces cerevisiae do krioelektronowej tomografii

Obecny protokół opisuje zdalne pozyskiwanie danych za pomocą tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości za pomocą Tomo5 oraz późniejsze przetwarzanie danych i uśrednianie subtomogramowe za pomocą emClarity. Apoferrytyna jest używana jako przykład do zilustrowania szczegółowych procesów krok po kroku w celu uzyskania struktury krio-ET o rozdzielczości 2,86 A.

Tomografia krioelektronowa: zdalne zbieranie danych i uśrednianie subtomogramu

Tomografia krio-STEM umożliwia wizualizację organelli nienaruszonych komórek bez osadzania, cięcia lub innych inwazyjnych przygotowań. Uzyskana rozdzielczość 3D mieści się obecnie w zakresie kilku nanometrów, przy polu widzenia kilku mikrometrów i dostępnej grubości rzędu 1 μm.

Wizualizacja organelli in situ za pomocą tomografii krio-STEM

Poznaj metodę wizualizacji zagęszczenia DNA u sinic za pomocą krioelektronowej tomografii. Technika umożliwia obserwację ultrastruktury komórek bakteryjnych w stanie zbliżonym do żywego bez dodatkowych zabiegów.

Wizualizacja zagęszczenia DNA u sinic za pomocą wysokonapięciowej krioelektronowej tomografii

Przeglądaj więcej filmów