Wizualizacja zagęszczenia DNA u sinic za pomocą wysokonapięciowej krioelektronowej tomografii
17 lipca 2018
Ten protokół opisuje, jak wizualizować przejściowe zagęszczenie DNA u cyjanobakterii. Stosuje się hodowlę synchroniczną, monitorowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, szybkie zamrażanie i wysokonapięciową kriotomografię elektronową. Przedstawiono protokół dla tych metodologii oraz omówiono przyszłe zastosowania i rozwój.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny mikrobiologii, takie jak to, jak zmienia się struktura DNA podczas cyklu komórkowego bakterii. Główną zaletą tej techniki jest to, że możliwe jest uwidocznienie ultrastruktury całych komórek bakteryjnych w stanie zbliżonym do stanu żywego w odpowiednich punktach czasowych bez konieczności wykonywania dodatkowych zabiegów. Procedurę zademonstrują Chihong Song, doktor habilitowany z mojego laboratorium, oraz Mako Hayashi, doktorant z laboratorium dr Kaneko.
Zacznij od wyhodowania sinic na dziewięciocentymetrowych, wysterylizowanych płytkach BG-11 zawierających 1,5% agaru i 0,3% tiosiarczanu sodu. Inkubuj płytki w temperaturze 23 stopni Celsjusza w cyklu świetlnym 12-12 z 50 mikro-E światła na metr kwadratowy na sekundę. Aby utrzymać komórki, co tydzień przenoś je na świeże płytki agarowe BG-11.
W ciągu tygodnia kultury pojawiają się jako zielone paski. Przenieś zielone grudki komórek za pomocą wysterylizowanej płomieniowo pętli i rozłóż je na nowej płytce. Aby zaobserwować zagęszczenie DNA, należy zebrać komórki hodowane przez sześć dni pod koniec okresu świetlnego.
Aby uwolnić komórki z płytki, dodaj jeden mililitr 0,2-molowej sacharozy. Następnie zebrać zawiesinę komórkową i powtarzać dodawanie i usuwanie sacharozy, aż roztwór zmieni kolor na zielony. Zmiana koloru wskazuje, że większość komórek została zwolniona.
Teraz przenieś 500 mikrolitrów roztworu zawieszonych komórek do probówki Microfuge i dodaj barwnik Hoechst, aby uzyskać końcowe stężenie jednego mikrograma na mililitr. Następnie pozwól komórkom inkubować w ciemności przez 10 minut. Następnie odwiruj komórki, wyrzuć supernatant i zawieś je ponownie w 10 mikrolitrach 0,2-molowej sacharozy.
Następnie przenieść jeden mikrolitr zawiesiny na szkiełko podstawowe, założyć szkiełko nakrywkowe i obserwować komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w filtr UV. Używając obiektywu 100-krotnego zanurzenia w olejku, poszukaj dowodów na zagęszczenie DNA, które powinny być widoczne w większości komórek. Najpierw przygotuj urządzenie do zamrażania wgłębnego.
Następnie ustaw pojemnik na ciekły azot, wkładając pojemnik na etan i nasadkę pręta chłodzącego. Następnie napełnij pojemnik ciekłym azotem i ostudź go do temperatury ciekłego azotu. Następnie załaduj etan do kontenera.
Pamiętaj, aby nosić okulary ochronne, ponieważ ciekły etan jest wybuchowy. Na koniec zdejmij nasadkę pręta chłodzącego i przykryj pojemnik plastikową pokrywką, aby uniknąć przyklejenia szronu. Aby kontynuować, jarzenie rozładowuje się po stronie węglowej pokrytej węglem siatki EM przez 30 sekund przy 50 miliamperach za pomocą bariery jonów plazmowych.
Następnie przygotuj Vitrobota zgodnie z protokołem testu. Użyj pęsety, aby ustawić wstępnie obrobioną siatkę EM w komorze. Przed nałożeniem próbki należy potraktować siatkę EM jednym mikrolitrowym, 15-nanometrowym znacznikiem złota BSA, który posłuży jako marker odniesienia.
Teraz podnieś 2,5 mikrolitra zawiesiny komórek na siatkę. Zetrzyj nadmiar roztworu za pomocą bibuły filtracyjnej i natychmiast zamroź siatkę w ciekłym etanie. Zamrożoną siatkę należy przechowywać w ciekłym azocie do czasu, gdy będzie można ją zbadać.
Następnie uruchom HVEM i ustaw go na wysokie napięcie jednego megawolta. Następnie schłodzić uchwyt siatki próbki do minus 150 stopni Celsjusza za pomocą ciekłego azotu. Po schłodzeniu zamontuj zamrożoną siatkę w schłodzonym uchwycie na próbkę kriogeniczną i załaduj ją do HVEM.
Uważaj, aby nie zanieczyścić zestawu lodem. Teraz wybierz obszar obrazowania przy małym powiększeniu 1,000 razy. Następnie wyreguluj eucentryczną wysokość osi Z i przechyl stolik próbki do minus 60 stopni.
Następnie usuń luz związany z obrotem przechyłu. Teraz ustaw ostrość w pobliżu miejsca docelowego w powiększeniu 10 000 razy. Ustaw niedostateczną ostrość od sześciu do 10 mikronów przez odchylenie od ostrego obrazu.
W przypadku obrazowania ustaw dawkę na dwa elektrony na angstrem kwadratowy na sekundę lub mniej. Miej oko na dawkę elektronów, która jest odbijana przez gęstość prądu, i zrób zdjęcie aparatem cyfrowym lub na kliszy elektronowej. Następnie zbierz obrazy nachylenia od ujemnych 60 do dodatnich 60 stopni w krokach od dwóch do czterech stopni.
Jeśli to możliwe, korzystaj ze zautomatyzowanych funkcji mikroskopu. Otwórz komercyjny pakiet oprogramowania i załaduj obrazy pochylenia do rekonstrukcji tomograficznej. Następnie utwórz plik stosu obrazów z poszczególnych obrazów za pomocą polecenia tif2mrc lub newstack.
Następnie uruchom oprogramowanie eTomo GUI i wprowadź parametry obrazu dotyczące rozmiaru piksela, średnicy odniesienia, obrotu obrazu i tak dalej. W ten sposób utwórz skrypt edycji. Teraz użyj sugerowanego oprogramowania, aby utworzyć serię pochylenia, wyrównaną za pomocą znaczników odniesienia, ze średnim błędem resztkowym mniejszym niż 0,5.
Na koniec zrekonstruuj tomogram 3D za pomocą algorytmu SIRT. Teraz wyodrębnij obszar zainteresowania z tomogramu i zastosuj filtr odszumiający, taki jak anizotropowy filtr dyfuzyjny, filtr dwustronny lub filtr morfologii matematycznej. Filtrowanie należy wykonać przy użyciu parametrów, które zwiększają kontrast obrazu.
Następnie podziel na segmenty interesujący Cię obiekt. Użyj funkcji krojenia, aby otworzyć tomogram. Następnie przejdź do okna Edytor segmentacji i wybierz nowe pole etykiety, aby utworzyć plik segmentacji.
Następnie ręcznie prześledź obramowanie interesującego obiektu w pierwszym wycinku, a następnie w każdym z pozostałych wycinków. Dodatkową interesującą funkcję można dodać za pomocą tych samych operacji. Teraz, aby wygenerować renderowanie powierzchni przy użyciu opcji w menu SurfaceGen w celu wizualizacji segmentowanej objętości, wybierz menu SurfaceView.
Aby przesuwać, obracać i powiększać objętość 3D, użyj narzędzi dostępnych w oknie Przeglądarka 3D. Automatyczną segmentację można wykonać za pomocą narzędzia Magic Wand. Kliknij obiekt i dostosuj suwaki w opcjach Wyświetlanie i maskowanie, tak aby funkcje obiektu były w pełni zaznaczone.
W precyzyjnej hodowli synchronicznej DNA znakowane Hoechstem wykazuje normalny równomierny rozkład w ciemnych warunkach, a następnie stopniowo zagęszcza się w komórce w okresie światła, przyjmując falistą strukturę przypominającą pręcik pod koniec okresu światła. Wreszcie pręcik dzieli się w środku, a jego dwie części są rozprowadzane do komórek potomnych. Po podziale komórki zbite DNA natychmiast znika, a DNA powraca do normalnego równomiernego rozkładu.
Kiedy komórki w końcowej fazie zagęszczenia DNA zostały zamrożone i obserwowane za pomocą mikroskopii elektronowej wysokiego napięcia, wiele z nich wykazywało wyraźne zagęszczenie DNA, które można było łatwo odróżnić od normalnych komórek. Niektóre wykazywały zwężenie w środku komórek, zgodnie z oczekiwaniami przed podziałem komórek. Z tomogramów 3D zwarte DNA jest widocznie oddzielone w cytoplazmie i otoczone materiałem o niskiej gęstości.
Warstwy błony tylakoidowej są zniekształcone wzdłuż falistego pręta zagęszczonego DNA. Co ciekawe, wiele małych ciałek fosforanowych przylega do zagęszczonego DNA i zwykle pojawia się w parach. Te ciała polifosforanowe mogą być dostawcami fosforanów do syntezy DNA.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować ultrastrukturę całych komórek bakteryjnych w pobliżu stanu żywego w odpowiednim punkcie czasowym za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej wysokiego napięcia bez żadnych dodatkowych zabiegów, takich jak barwienie. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że stan zagęszczenia DNA zmienia się z każdą minutą pod koniec cyklu świetlnego. Upewnij się, że nie przegapisz najlepszego momentu na zamrożenie próbki.
Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak CLEM, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące lokalizacji określonych białek lub nukleotydów w zagęszczonym DNA. Po jej opracowaniu, technika ta powinna utorować drogę naukowcom w dziedzinie mikrobiologii do badania podziału komórek, segregacji DNA i infekcji wirusowych u bakterii lub małych eukariontów.
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę wizualizacji przejściowego zagęszczania DNA w sinicach przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego i tomografii kryo-elektronowej. Badanie opisuje uprawę i przygotowanie komórek sinic do obrazowania, podkreślając znaczenie obserwacji zmian struktury DNA w cyklu komórkowym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Biologia komórki
- Biologia strukturalna
Tło
- Rozumienie zagęszczania DNA jest kluczowe dla wnikliwego rozumienia cykli komórek bakteryjnych.
- Mikroskopia fluorescencyjna umożliwia obserwację procesów komórkowych w czasie rzeczywistym.
- Tomografia kryo-elektronowa zapewnia wysokiej rozdzielczości obrazy ultrastruktury komórkowej.
- Ta metoda umożliwia wizualizację bliską stanu żywego bez dodatkowych obróbek.
Cel badania
- Aby wizualizować zagęszczanie DNA w sinicach podczas cyklu komórkowego.
- Aby opracować protokół stosowania mikroskopii fluorescencyjnej i tomografii kryo-elektronowej.
- Aby omówić przyszłe zastosowania tej techniki obrazowania.
Zastosowane metody
- Uprawa sinic na płytkach agarowych BG-11.
- Mikroskopia fluorescencyjna z barwieniem Hoechst do obserwacji zagęszczania DNA.
- Szybkie zamrażanie próbek do tomografii kryo-elektronowej.
- 3D rekonstrukcja tomogramów do analizy struktur komórkowych.
Główne wyniki
- DNA oznakowane Hoechst pokazuje jednolitą dystrybucję w ciemności.
- Podczas okresu świetlnego DNA stopniowo zagęszcza się w falistą strukturę przypominającą pręt.
- Zajęty DNA dzieli się i dystrybuuje do komórek potomnych.
- Wysokiej rozdzielczości obrazy ujawniają szczegółową ultrastrukturę komórkową.
Wnioski
- Ta metoda skutecznie wizualizuje zagęszczanie DNA w sinicach.
- Dostarcza wglądu w dynamikę cykli komórek bakteryjnych.
- Protokół można dostosować do różnych zastosowań w mikrobiologii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables visualization of transient DNA compaction in cyanobacteria, a dynamic process linked to cell division. By combining fluorescence monitoring with high-voltage cryo-electron tomography, it provides a reproducible workflow to capture and resolve short-lived subcellular events in near-native state. The approach supports mechanistic de-risking in antimicrobial target validation by revealing structural dynamics of bacterial chromosome segregation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of DNA structural dynamics during bacterial cell cycle, supporting target validation for chromosome segregation mechanisms.
- Operational Value: Provides a correlative light and electron microscopy (CLEM)-compatible workflow to link functional fluorescence signals with ultrastructural context.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of synchronized bacterial cultures for time-resolved imaging, enabling assay-ready systems for compound-induced structural perturbations.
- Operational Value: Standardizes sample preparation via sucrose-based release and Hoechst staining, improving reproducibility across microscopy platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Visualizes DNA-protein interactions and membrane remodeling during compaction, informing translational biomarker discovery related to cell division fidelity.
- Operational Value: Supports continuity from discovery to preclinical by providing a platform to evaluate genetic or chemical perturbations on DNA dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing in early biology to mechanistic validation in lead optimization, particularly for targets involved in bacterial cell cycle regulation.
- Discovery Biology: Enables direct observation of DNA compaction dynamics, supporting hypothesis testing of cell cycle regulators and structural proteins.
- Screening: Produces synchronized, fluorescence-competent cells suitable for high-content imaging and compound screening assays.
- Analytics: Generates quantitative 3D tomograms and segmentation data enabling morphometric analysis of DNA structure, membrane distortion, and phosphate body association.
- Translational Research: Links observed DNA compaction phenotypes to downstream phenotypes like division fidelity, supporting biomarker alignment in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for investigating transient bacterial structures such as phage infection, septum formation, or plasmid segregation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target mechanism by visualizing native-state DNA architecture and its temporal changes.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized synchronization, staining, and cryo-fixation protocols.
- Strategic Value: Reduces biological de-risking uncertainty in antibiotic target validation by providing direct structural evidence of target engagement effects.
- Portfolio Impact: Enables data-driven go/no-go decisions based on ultrastructural phenotypes linked to essential cellular processes.
Implementation Considerations
- Expertise in microbial culture synchronization, fluorescence microscopy, and cryo-electron tomography instrumentation.
- Access to high-voltage electron microscope (HVEM) capable of 1 MV operation and cryo-specimen handling.
- Standardization of fluorescence timing and freezing protocols across laboratories to capture transient events.
- Adaptation considerations for other bacterial species with varying cell size, wall structure, or DNA dynamics.
- Practical limitations include the transient nature of DNA compaction requiring precise timing and the need for specialized HVEM infrastructure.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:43
Synchronous Culture of Cyanobacteria and Monitoring by Fluorescence Microscopy
2:31
Sample Freezing and Cryo-HVET
5:16
Tomographic Reconstruction and Segmentation of the Feature of Interest
7:20
Results: Observations of Compacted DNA in Cyanobacteria
8:36
Conclusion
