Wizualizacja zagęszczenia DNA u sinic za pomocą wysokonapięciowej krioelektronowej tomografii

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny mikrobiologii, takie jak to, jak zmienia się struktura DNA podczas cyklu komórkowego bakterii. Główną zaletą tej techniki jest to, że możliwe jest uwidocznienie ultrastruktury całych komórek bakteryjnych w stanie zbliżonym do stanu żywego w odpowiednich punktach czasowych bez konieczności wykonywania dodatkowych zabiegów. Procedurę zademonstrują Chihong Song, doktor habilitowany z mojego laboratorium, oraz Mako Hayashi, doktorant z laboratorium dr Kaneko.

Zacznij od wyhodowania sinic na dziewięciocentymetrowych, wysterylizowanych płytkach BG-11 zawierających 1,5% agaru i 0,3% tiosiarczanu sodu. Inkubuj płytki w temperaturze 23 stopni Celsjusza w cyklu świetlnym 12-12 z 50 mikro-E światła na metr kwadratowy na sekundę. Aby utrzymać komórki, co tydzień przenoś je na świeże płytki agarowe BG-11.

W ciągu tygodnia kultury pojawiają się jako zielone paski. Przenieś zielone grudki komórek za pomocą wysterylizowanej płomieniowo pętli i rozłóż je na nowej płytce. Aby zaobserwować zagęszczenie DNA, należy zebrać komórki hodowane przez sześć dni pod koniec okresu świetlnego.

Aby uwolnić komórki z płytki, dodaj jeden mililitr 0,2-molowej sacharozy. Następnie zebrać zawiesinę komórkową i powtarzać dodawanie i usuwanie sacharozy, aż roztwór zmieni kolor na zielony. Zmiana koloru wskazuje, że większość komórek została zwolniona.

Teraz przenieś 500 mikrolitrów roztworu zawieszonych komórek do probówki Microfuge i dodaj barwnik Hoechst, aby uzyskać końcowe stężenie jednego mikrograma na mililitr. Następnie pozwól komórkom inkubować w ciemności przez 10 minut. Następnie odwiruj komórki, wyrzuć supernatant i zawieś je ponownie w 10 mikrolitrach 0,2-molowej sacharozy.

Następnie przenieść jeden mikrolitr zawiesiny na szkiełko podstawowe, założyć szkiełko nakrywkowe i obserwować komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w filtr UV. Używając obiektywu 100-krotnego zanurzenia w olejku, poszukaj dowodów na zagęszczenie DNA, które powinny być widoczne w większości komórek. Najpierw przygotuj urządzenie do zamrażania wgłębnego.

Następnie ustaw pojemnik na ciekły azot, wkładając pojemnik na etan i nasadkę pręta chłodzącego. Następnie napełnij pojemnik ciekłym azotem i ostudź go do temperatury ciekłego azotu. Następnie załaduj etan do kontenera.

Pamiętaj, aby nosić okulary ochronne, ponieważ ciekły etan jest wybuchowy. Na koniec zdejmij nasadkę pręta chłodzącego i przykryj pojemnik plastikową pokrywką, aby uniknąć przyklejenia szronu. Aby kontynuować, jarzenie rozładowuje się po stronie węglowej pokrytej węglem siatki EM przez 30 sekund przy 50 miliamperach za pomocą bariery jonów plazmowych.

Następnie przygotuj Vitrobota zgodnie z protokołem testu. Użyj pęsety, aby ustawić wstępnie obrobioną siatkę EM w komorze. Przed nałożeniem próbki należy potraktować siatkę EM jednym mikrolitrowym, 15-nanometrowym znacznikiem złota BSA, który posłuży jako marker odniesienia.

Teraz podnieś 2,5 mikrolitra zawiesiny komórek na siatkę. Zetrzyj nadmiar roztworu za pomocą bibuły filtracyjnej i natychmiast zamroź siatkę w ciekłym etanie. Zamrożoną siatkę należy przechowywać w ciekłym azocie do czasu, gdy będzie można ją zbadać.

Następnie uruchom HVEM i ustaw go na wysokie napięcie jednego megawolta. Następnie schłodzić uchwyt siatki próbki do minus 150 stopni Celsjusza za pomocą ciekłego azotu. Po schłodzeniu zamontuj zamrożoną siatkę w schłodzonym uchwycie na próbkę kriogeniczną i załaduj ją do HVEM.

Uważaj, aby nie zanieczyścić zestawu lodem. Teraz wybierz obszar obrazowania przy małym powiększeniu 1,000 razy. Następnie wyreguluj eucentryczną wysokość osi Z i przechyl stolik próbki do minus 60 stopni.

Następnie usuń luz związany z obrotem przechyłu. Teraz ustaw ostrość w pobliżu miejsca docelowego w powiększeniu 10 000 razy. Ustaw niedostateczną ostrość od sześciu do 10 mikronów przez odchylenie od ostrego obrazu.

W przypadku obrazowania ustaw dawkę na dwa elektrony na angstrem kwadratowy na sekundę lub mniej. Miej oko na dawkę elektronów, która jest odbijana przez gęstość prądu, i zrób zdjęcie aparatem cyfrowym lub na kliszy elektronowej. Następnie zbierz obrazy nachylenia od ujemnych 60 do dodatnich 60 stopni w krokach od dwóch do czterech stopni.

Jeśli to możliwe, korzystaj ze zautomatyzowanych funkcji mikroskopu. Otwórz komercyjny pakiet oprogramowania i załaduj obrazy pochylenia do rekonstrukcji tomograficznej. Następnie utwórz plik stosu obrazów z poszczególnych obrazów za pomocą polecenia tif2mrc lub newstack.

Następnie uruchom oprogramowanie eTomo GUI i wprowadź parametry obrazu dotyczące rozmiaru piksela, średnicy odniesienia, obrotu obrazu i tak dalej. W ten sposób utwórz skrypt edycji. Teraz użyj sugerowanego oprogramowania, aby utworzyć serię pochylenia, wyrównaną za pomocą znaczników odniesienia, ze średnim błędem resztkowym mniejszym niż 0,5.

Na koniec zrekonstruuj tomogram 3D za pomocą algorytmu SIRT. Teraz wyodrębnij obszar zainteresowania z tomogramu i zastosuj filtr odszumiający, taki jak anizotropowy filtr dyfuzyjny, filtr dwustronny lub filtr morfologii matematycznej. Filtrowanie należy wykonać przy użyciu parametrów, które zwiększają kontrast obrazu.

Następnie podziel na segmenty interesujący Cię obiekt. Użyj funkcji krojenia, aby otworzyć tomogram. Następnie przejdź do okna Edytor segmentacji i wybierz nowe pole etykiety, aby utworzyć plik segmentacji.

Następnie ręcznie prześledź obramowanie interesującego obiektu w pierwszym wycinku, a następnie w każdym z pozostałych wycinków. Dodatkową interesującą funkcję można dodać za pomocą tych samych operacji. Teraz, aby wygenerować renderowanie powierzchni przy użyciu opcji w menu SurfaceGen w celu wizualizacji segmentowanej objętości, wybierz menu SurfaceView.

Aby przesuwać, obracać i powiększać objętość 3D, użyj narzędzi dostępnych w oknie Przeglądarka 3D. Automatyczną segmentację można wykonać za pomocą narzędzia Magic Wand. Kliknij obiekt i dostosuj suwaki w opcjach Wyświetlanie i maskowanie, tak aby funkcje obiektu były w pełni zaznaczone.

W precyzyjnej hodowli synchronicznej DNA znakowane Hoechstem wykazuje normalny równomierny rozkład w ciemnych warunkach, a następnie stopniowo zagęszcza się w komórce w okresie światła, przyjmując falistą strukturę przypominającą pręcik pod koniec okresu światła. Wreszcie pręcik dzieli się w środku, a jego dwie części są rozprowadzane do komórek potomnych. Po podziale komórki zbite DNA natychmiast znika, a DNA powraca do normalnego równomiernego rozkładu.

Kiedy komórki w końcowej fazie zagęszczenia DNA zostały zamrożone i obserwowane za pomocą mikroskopii elektronowej wysokiego napięcia, wiele z nich wykazywało wyraźne zagęszczenie DNA, które można było łatwo odróżnić od normalnych komórek. Niektóre wykazywały zwężenie w środku komórek, zgodnie z oczekiwaniami przed podziałem komórek. Z tomogramów 3D zwarte DNA jest widocznie oddzielone w cytoplazmie i otoczone materiałem o niskiej gęstości.

Warstwy błony tylakoidowej są zniekształcone wzdłuż falistego pręta zagęszczonego DNA. Co ciekawe, wiele małych ciałek fosforanowych przylega do zagęszczonego DNA i zwykle pojawia się w parach. Te ciała polifosforanowe mogą być dostawcami fosforanów do syntezy DNA.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować ultrastrukturę całych komórek bakteryjnych w pobliżu stanu żywego w odpowiednim punkcie czasowym za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej wysokiego napięcia bez żadnych dodatkowych zabiegów, takich jak barwienie. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że stan zagęszczenia DNA zmienia się z każdą minutą pod koniec cyklu świetlnego. Upewnij się, że nie przegapisz najlepszego momentu na zamrożenie próbki.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak CLEM, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące lokalizacji określonych białek lub nukleotydów w zagęszczonym DNA. Po jej opracowaniu, technika ta powinna utorować drogę naukowcom w dziedzinie mikrobiologii do badania podziału komórek, segregacji DNA i infekcji wirusowych u bakterii lub małych eukariontów.