Przyjazne dla użytkownika, wysokowydajne i w pełni zautomatyzowane oprogramowanie do akwizycji danych do mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek
July 29th, 2021
Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek wymaga odpowiedniego pakietu oprogramowania i przyjaznego dla użytkownika potoku do wysokowydajnej automatycznej akwizycji danych. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie w pełni zautomatyzowanego pakietu oprogramowania do akwizycji obrazu, Latitude-S, oraz praktycznego potoku do gromadzenia danych o zeszklonych biomolekułach w warunkach niskich dawek.
Oprogramowanie do automatycznego gromadzenia danych jest niezwykle potrzebne do gromadzenia ogromnych ilości danych kriogenicznych w celu charakterystyki strukturalnej makrocząsteczek biologicznych. Wykorzystano tutaj pakiet oprogramowania do automatycznej akwizycji danych do scharakteryzowania struktury różnych makrocząsteczek biologicznych, które są bezpośrednio związane z biologią patogenów. Na przykład prątki, HIV i SASCO 2.
Na początek uruchom oprogramowanie do automatycznego gromadzenia danych Latitude-S, klikając DigitalMicrograph w menu Start. Następnie wybierz Menedżer technik, a następnie ikonę Latitude-S dla automatycznego zbierania danych dotyczących pojedynczych cząstek. Aby utworzyć sesję na podstawie ustawień poprzedniej sesji, zaznacz pole wyboru Na podstawie poprzedniej sesji na palecie, a następnie wybierz nowy przycisk lub aby kontynuować istniejącą sesję, naciśnij przycisk kontynuuj.
Aby rozpocząć zupełnie nową sesję, kliknij nową zakładkę w palecie. Wybierz folder zawierający sesję, która ma być kontynuowana, a następnie wybierz folder, w którym chcesz zapisać dane. Następnie kliknij ikonę ustawień i w wyświetlonym oknie eksploracji stanu zarządzanego dodaj stan, ustaw warunek TEM, stan kamery oraz opcję obrazu lub zapasów.
A następnie nazwij stan lub otwórz podsumowanie konfiguracji stanu, aby otworzyć ustawienia zapisywania. Następnie skonfiguruj stan Atlasu, klikając paletę Stan Atlasu i ustaw parametry powiększenia, warunków oświetlenia i czasu ekspozycji kamery, a następnie kliknij Dalej, aby przejść do następnego stanu. Następnie skonfiguruj stan siatki, klikając paletę stanu siatki, ustaw parametry optyki obrazowania mikroskopu, warunki oświetlenia i czas ekspozycji kamery, a następnie kliknij Dalej.
Skonfiguruj stan otworu, klikając paletę otworów i ustaw optykę obrazowania, warunki oświetlenia, binning i parametry czasu ekspozycji kamery. Po kliknięciu Dalej, skonfiguruj następny stan ostrości, klikając paletę ostrości i ustaw ustawienia mikroskopu dla optyki obrazowania, warunków oświetlenia, binningu i czasu ekspozycji kamery. Następnie skup się na obszarze węgla amorficznego w pobliżu otworu i kliknij dalej, aby przejść do następnego stanu.
Skonfiguruj stan danych, klikając paletę danych i ustaw parametry ustawień mikroskopu, a następnie kliknij Dalej. Kliknij paletę konfiguracji ostrości określającą zakres wartości rozmycia i rozmiar kroku w danej zakładce i naciśnij przycisk dalej, aby przejść do następnego kroku. Skoncentruj się na wymaganych funkcjach na siatce i kliknij przycisk przechwytywania.
Następnie umieść czerwony krzyżyk na tym samym obiekcie na każdym obrazie różnych stanów. Zacznij od stanów Fokus, Dane i Otwór, ponieważ pole widzenia jest większe niż stany Atlasu i Siatki. Następnie powiększ stany atlasu i siatki, aby umieścić czerwony krzyżyk na tym samym obiekcie.
Aby obliczyć pozycje i odsunięcie między każdym z pięciu różnych stanów oraz odzwierciedlić pozycje i przesunięcia w oknie wyjściowym, kliknij przycisk Oblicz. Kliknij paletę przechwytywania i wybierz rozmiar atlasu, aby pokryć całą siatkę lub część siatki w zależności od wymagań. Aby przechwycić atlas, nawiguj po atlasie i wybierz kwadrat siatki na podstawie grubości lodu.
Po wybraniu żądanych kwadratów siatki kliknij przycisk harmonogramu i obserwuj, jak kafelki w kwadracie siatki wypełniają się, gdy każdy kwadrat siatki jest przechwytywany. Po kliknięciu przycisku harmonogramu wybierz reprezentatywny otwór w kwadracie siatki, dodając położenie otworu. Po uzyskaniu obrazu otworu zdefiniuj dane i pozycje ostrości, a następnie zapisz układ jako szablon.
Kliknij automatyczne wyszukiwanie, wprowadź rozmiar otworu i kliknij przycisk wyszukiwania w programie, aby automatycznie znaleźć otwory na podstawie średnicy. Ustaw intensywność, aby usunąć otwory z kwadratu siatki i zanieczyszczenia lodem. A po dodaniu wybranych i żółtych narzędzi do oznaczania za pomocą automatycznego wyszukiwania kliknij przycisk harmonogramu w zadaniach współrzędnych.
Zgodnie ze wstępnym ręcznym badaniem przesiewowym mikrofotografii z korekcją ruchu przy użyciu oprogramowania cisTEM, stwierdzono, że większość danych mieści się w pożądanym zakresie sygnału. Dodatkowo, obrazy zebrane w zakresach rozmycia, były również ręcznie sprawdzane przez cisTEM. Cząstki kolców zostały ręcznie wybrane w celu obliczenia średnich klas 2D do wizualizacji strukturalnej, co zdecydowanie sugerowało, ale charakterystyka strukturalna w wysokiej rozdzielczości była możliwa przy użyciu odpowiedniego zestawu danych.
Klasyfikacja 3D wykazała, że białko kolca ma 1RBD w potwierdzeniu otwartym i wszystkie inne RBD w potwierdzeniu w dół w dół. Otwarte potwierdzenia białka kolca 1RBD zrekonstruowano przy użyciu symetrii C1. Mapa białka kolca jest reprezentowana w widoku z boku, z góry i z dołu.
Mapa EM jest wyposażona w strukturę atomową dla lepszej wizualizacji łańcuchów bocznych. Potwierdzenia RBD w dół zostały udoskonalone za pomocą symetrii C3 i wyrafinowanego modelu 3D spike oraz mapy EM, wyposażonej w strukturę atomową, jak pokazano. Pośrednie potwierdzenie białka kolca zidentyfikowanego jako poddomena S2 wskazywało na łańcuchy boczne poszczególnych reszt aminokwasowych.
Wyniki sugerują, że Latitude-S może zbierać dane kriogeniczne EM o wysokiej rozdzielczości dotyczące makrocząsteczek biologicznych. To oprogramowanie do automatycznego gromadzenia danych może być używane do dowolnego innego systemu mikroskopii elektronowej w celu automatycznego zbierania danych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł omawia implementację Latitude-S, zautomatyzowanego oprogramowania do pozyskiwania danych dla mikroskopii krioelektronowej. Podkreśla znaczenie przyjaznego dla użytkownika potoku dla wysokowydajnego zbierania danych biocząsteczk.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Mikroskopia krioelektronowa
- Biologia strukturalna
- Zautomatyzowane pozyskiwanie danych
Tło
- Krioelektronowa mikroskopia pojedynczych cząstek jest kluczowa dla charakteryzacji strukturalnej.
- Zautomatyzowane oprogramowanie jest niezbędne do efektywnego zbierania danych.
- Szklistowane biocząsteczki wymagają warunków obrazowania o niskiej dawce.
- Biologia patogenów jest istotnym obszarem zastosowań.
Cel badania
- Prezentacja w pełni zautomatyzowanego pakietu oprogramowania do pozyskiwania obrazów.
- Ustanowienie praktycznego potoku dla zbierania danych.
- Poprawa wydajności przepływów pracy w mikroskopii krioelektronowej.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie oprogramowania Latitude-S do zautomatyzowanego pozyskiwania danych.
- Konfiguracja sesji na podstawie poprzednich ustawień.
- Techniki obrazowania o niskiej dawce dla biocząsteczk.
- Charakteryzacja różnych biologicznych makrocząsteczek.
Główne wyniki
- Skuteczne wdrożenie Latitude-S dla wysokowydajnego pozyskiwania danych.
- Skuteczna charakteryzacja struktur związanych z patogenami, takimi jak mykobakteria i HIV.
- Strumienizowany przepływ pracy dla zautomatyzowanego zbierania danych.
- Wykazana zdolność oprogramowania do pracy w warunkach niskiej dawki.
Wnioski
- Latitude-S znacznie poprawia wydajność mikroskopii krioelektronowej.
- Zautomatyzowane pozyskiwanie danych jest niezbędne dla badań w dziedzinie biologii strukturalnej.
- Oprogramowanie ułatwia badania ważnych biologicznych makrocząsteczk.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Automated data acquisition in cryo-EM enables high-throughput structural characterization of pathogen-associated macromolecules, supporting target validation and lead identification in early discovery. The Latitude-S software streamlines workflow efficiency, reducing manual intervention and increasing data reproducibility for structural biology teams. This capability enhances predictive confidence in mechanistic de-risking by providing reliable, quantitative structural data for infectious disease targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through high-resolution structural visualization of pathogen proteins like SARS-CoV-2 spike.
- Operational Value: Supports biological de-risking by clarifying conformational states and functional mechanisms of macromolecular targets.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by delivering atomic-resolution data that informs target druggability and mechanism of action.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating consistent, high-quality cryo-EM datasets.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through fully automated imaging under controlled low-dose conditions.
- Scalability: Enables screening readiness and platform reuse, as demonstrated by acquisition of ~3,000 movie images in a single 48-hour session.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from discovery through preclinical validation by providing structural insights into pathogen biology.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by identifying conformational states (e.g., 1-RBD up/open and all RBD down/closed) that inform functional assays.
- Risk-Adjusted Advancement: Connects structural data to decision-making for target prioritization in antiviral development programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization, where structural data informs hit-to-lead progression and mechanism elucidation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling structural characterization of macromolecular complexes involved in pathogen entry and replication.
- Screening: Describes assay readiness through automated, high-throughput data collection that yields quantitative, reproducible outputs for downstream analysis.
- Analytics: Highlights measurements such as defocus values, image quality metrics, and 3D classification outputs that enable comparison of structural states and conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via structural models that inform functional assays and biomarker alignment for pathogen targets.
- Enterprise Reuse: Frames the software as a reusable capability across multiple targets and projects, reducing redundancy in data acquisition setup.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in structural studies of pathogenic macromolecules.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of data acquisition across sessions and users.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early structural insights.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on high-confidence structural data.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in cryo-EM operation, software configuration, and structural data interpretation.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including 200 keV cryo-TEM, direct electron detector, and computing resources for image processing.
- Cross-team standardization requirements for session templates, parameter settings, and data naming conventions.
- Adaptation considerations across model systems, including vitrified samples of varying size, symmetry, and stability.
- Practical limitations include dependency on sample quality, ice thickness, and initial manual screening for motion correction and particle picking.
