Kwantyfikacja wielkości wątroby u larw danio pręgowanego za pomocą mikroskopii jasnego pola

Metoda ta umożliwia ilościowe określenie wielkości wątroby u larw danio pręgowanego. Pozwala również na ocenę wpływu manipulacji genetycznych i farmakologicznych na wzrost i rozwój wątroby. Technika ta zapewnia szybki i precyzyjny sposób wizualizacji i pomiaru wątroby, a także jelit i trzustki.

Oprócz ilościowego określenia wielkości wątroby, ta metoda preparacji może być pomocna w przygotowaniu wątroby, jelit i trzustki do hybrydyzacji in situ lub obrazowania konfokalnego. Zanim podejmiesz próbę przeprowadzenia badań na eksperymentalnych larwach, upewnij się, że poświęciłeś wystarczająco dużo czasu na ćwiczenie na próbkach nieeksperymentalnych i masz znaczny wskaźnik sukcesu. Bardzo ważne jest uwidocznienie prawidłowej orientacji i ruchu larw danio pręgowanego i kleszczy w celu usunięcia skóry bez naruszania otaczających narządów.

Po trzech do siedmiu dniach od zapłodnienia, po eutanazji larw, użyj szklanej pipety i pompki do pipet, aby zebrać do 15 larw w dwumililitrowej probówce. Umyj larwy dwukrotnie jednym mililitrem zimnego 1X PBS na lodzie. Usuń jak najwięcej PBS za pomocą szklanej pipety i pompki do pipet, a następnie dodaj jeden mililitr zimnego czteroprocentowego PFA w PBS.

Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza co najmniej przez noc, delikatnie kołysząc. Za pomocą szklanej pipety i pompki do pipet usuń PFA z probówki i spłucz trzykrotnie jednym mililitrem zimnego PBS. Kołysz przez pięć minut między płukaniami.

Odpipetować kilka larw z PBS do jednej studzienki z dziewięciodołkowym szklanym naczyniem o okrągłym dnie. Pod mikroskopem usuń skórę otaczającą wątrobę za pomocą cienkich kleszczy, aby przytrzymać jedną larwę na grzbiecie, chwytając po obu stronach głowy tak delikatnie, jak to możliwe. Następnie użyj bardzo cienkich kleszczyków w drugiej ręce, aby chwycić skórę tuż nad sercem.

Pociągnij skórę w dół po przekątnej w kierunku ogona ryby na dnie naczynia po lewej lub prawej stronie ryby. Powtórz dla drugiej strony. Kontynuuj chwytanie płatów skóry i ciągnięcie w dół, aż cała skóra i melanofory leżące nad wątrobą lub w jej pobliżu zostaną usunięte.

Jeśli żółtko jest obecne przez pięć do sześciu dni po zapłodnieniu, podnieś żółtko w jednym kawałku, trzymając rybę cienkimi kleszczami na grzbiecie i używając bardzo cienkich kleszczyków do delikatnego szturchania żółtka. W przypadku trzech do czterech larw DPF trzymaj rybę cienkimi kleszczami na grzbiecie i bardzo cienkimi kleszczami głaskaj żółtko, zaczynając od strony brzusznej. Zeskrob żółtko na kawałki.

Umieść wypreparowane larwy w świeżym, zimnym PBS w dwumililitrowej probówce za pomocą szklanej pipety i pompki do pipet. Aby zamontować larwy, wlej kilka mililitrów trzyprocentowej metylocelulozy na pokrywkę czystej, plastikowej szalki Petriego. Użyj szklanej pipety i pompki do pipet, aby dodać larwy do metylocelulozy, dodając jak najmniej PBS z larwami.

Pod mikroskopem preparacyjnym przy małym powiększeniu użyj drobnych kleszczy, aby ustawić rybę tak, aby leżała na prawym boku zwrócona w lewo. Upewnij się, że ryba, która ma być sfotografowana, jest idealnie wyrównana, jednym okiem bezpośrednio na drugim oku. Jeśli ogon ryby jest zgięty, usuń ogon, mocno ściskając go kleszczami, aby usunąć go tak, aby ryba leżała płasko.

Powiększ obraz w dużym powiększeniu i skup się na wątrobie, upewniając się, że kontur wątroby jest wyraźnie widoczny. Naciśnij przycisk Przechwyć obraz, aby zrobić zdjęcie i zapisać plik. Powtórz tę czynność dla wszystkich ryb, upewniając się, że powiększenie jest takie samo dla każdego obrazu.

Zrób zdjęcie mikrometru przy użyciu tego samego powiększenia. Aby użyć programu R do zaślepienia wszystkich obrazów wątroby, aby uniknąć potencjalnej stronniczości badacza i promować rygor naukowy, losowo zmień nazwy plików i utwórz plik randomizacji zawierający listę oryginalnych nazw plików i odpowiadających im zaślepionych nazw plików. Otwieraj losowe pliki w kolejności, zaczynając od pliku pierwszego.

Wybierz narzędzie Zaznaczania odręczne i obrysuj każdą wątrobę. Naciśnij Control-M, aby zmierzyć obszar każdej wątroby. W przypadku wszelkich wątrób, których nie można dokładnie zmierzyć, ponieważ mają resztki skóry, żółtka, są nieostre lub nie są nienaruszone, należy wstawić pomiar zastępczy.

Zapisz pomiary w pliku tekstowym. Aby odślepić i przeanalizować dane, otwórz plik pomiarów i plik randomizacji w programie arkusza kalkulacyjnego. Wstaw nową kolumnę do pliku pomiarów i dodaj oryginalne nazwy plików zaślepionych za pomocą pliku Randomization.

Zapisz ten plik jako plik Pomiary niezaślepione. Posortuj dane według oryginalnej nazwy pliku. Wyklucz wszelkie pomiary wątroby, dla których zdjęcia nie były odpowiednie.

W razie potrzeby przelicz wartości pomiarów na żądaną skalę w milimetrach kwadratowych. Otwórz pasek skali w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu. Użyj narzędzia Linia prosta, aby zmierzyć jeden milimetr na pasku podziałki.

Oprogramowanie do przetwarzania obrazu mierzy następnie w tych samych jednostkach co wątroba, podając współczynnik konwersji. Użyj współczynnika konwersji, aby przekonwertować pomiary w pliku Pomiary niezaślepione. Określ średnią i odchylenie standardowe oraz oblicz wartości P.

Po sześciu dniach od zapłodnienia nietransgeniczne larwy danio pręgowanego wykazywały naturalne położenie i kształt wątroby pokrywającej jelito. Transgeniczne danio pręgowane mają znacznie większy rozmiar wątroby w porównaniu z ich nietransgenicznym rodzeństwem. Poniżej przedstawiono kilka przykładów nieodpowiednich obrazów i mikrometrów.

Larwa ze skórą pokrywającą wątrobę, larwa z żółtkiem zasłaniającym wątrobę, larwa z odciętymi częściami wątroby oraz larwa z przemieszczoną i odpadającą wątrobą, larwa z brakującą wątrobą, larwa z trudnym do zidentyfikowania zarysem wątroby oraz larwa z niewłaściwym ułożeniem. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby używać małych i kontrolowanych ruchów, aby zapobiec uszkodzeniu wątroby. Oprócz mikroskopii jasnego pola możemy również wykorzystać wypreparowane w ten sposób larwy do mikroskopii konfokalnej, do wizualizacji fluorescencyjnych białek reporterowych lub barwienia immunofluorescencyjnego oraz do hybrydyzacji in situ.

Formaldehyd lub PFA jest substancją drażniącą i podejrzewaną o działanie rakotwórcze. Podczas obchodzenia się z PFA należy nosić rękawice, a stężone roztwory należy obchodzić w okapie oparów chemicznych.