Kwantyfikacja wielkości wątroby u larw danio pręgowanego za pomocą mikroskopii jasnego pola
2 lutego 2020
Tutaj demonstrujemy metodę ilościowego określania wielkości wątroby u larw danio pręgowanego, umożliwiając ocenę wpływu manipulacji genetycznych i farmakologicznych na wzrost i rozwój wątroby.
Metoda ta umożliwia ilościowe określenie wielkości wątroby u larw danio pręgowanego. Pozwala również na ocenę wpływu manipulacji genetycznych i farmakologicznych na wzrost i rozwój wątroby. Technika ta zapewnia szybki i precyzyjny sposób wizualizacji i pomiaru wątroby, a także jelit i trzustki.
Oprócz ilościowego określenia wielkości wątroby, ta metoda preparacji może być pomocna w przygotowaniu wątroby, jelit i trzustki do hybrydyzacji in situ lub obrazowania konfokalnego. Zanim podejmiesz próbę przeprowadzenia badań na eksperymentalnych larwach, upewnij się, że poświęciłeś wystarczająco dużo czasu na ćwiczenie na próbkach nieeksperymentalnych i masz znaczny wskaźnik sukcesu. Bardzo ważne jest uwidocznienie prawidłowej orientacji i ruchu larw danio pręgowanego i kleszczy w celu usunięcia skóry bez naruszania otaczających narządów.
Po trzech do siedmiu dniach od zapłodnienia, po eutanazji larw, użyj szklanej pipety i pompki do pipet, aby zebrać do 15 larw w dwumililitrowej probówce. Umyj larwy dwukrotnie jednym mililitrem zimnego 1X PBS na lodzie. Usuń jak najwięcej PBS za pomocą szklanej pipety i pompki do pipet, a następnie dodaj jeden mililitr zimnego czteroprocentowego PFA w PBS.
Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza co najmniej przez noc, delikatnie kołysząc. Za pomocą szklanej pipety i pompki do pipet usuń PFA z probówki i spłucz trzykrotnie jednym mililitrem zimnego PBS. Kołysz przez pięć minut między płukaniami.
Odpipetować kilka larw z PBS do jednej studzienki z dziewięciodołkowym szklanym naczyniem o okrągłym dnie. Pod mikroskopem usuń skórę otaczającą wątrobę za pomocą cienkich kleszczy, aby przytrzymać jedną larwę na grzbiecie, chwytając po obu stronach głowy tak delikatnie, jak to możliwe. Następnie użyj bardzo cienkich kleszczyków w drugiej ręce, aby chwycić skórę tuż nad sercem.
Pociągnij skórę w dół po przekątnej w kierunku ogona ryby na dnie naczynia po lewej lub prawej stronie ryby. Powtórz dla drugiej strony. Kontynuuj chwytanie płatów skóry i ciągnięcie w dół, aż cała skóra i melanofory leżące nad wątrobą lub w jej pobliżu zostaną usunięte.
Jeśli żółtko jest obecne przez pięć do sześciu dni po zapłodnieniu, podnieś żółtko w jednym kawałku, trzymając rybę cienkimi kleszczami na grzbiecie i używając bardzo cienkich kleszczyków do delikatnego szturchania żółtka. W przypadku trzech do czterech larw DPF trzymaj rybę cienkimi kleszczami na grzbiecie i bardzo cienkimi kleszczami głaskaj żółtko, zaczynając od strony brzusznej. Zeskrob żółtko na kawałki.
Umieść wypreparowane larwy w świeżym, zimnym PBS w dwumililitrowej probówce za pomocą szklanej pipety i pompki do pipet. Aby zamontować larwy, wlej kilka mililitrów trzyprocentowej metylocelulozy na pokrywkę czystej, plastikowej szalki Petriego. Użyj szklanej pipety i pompki do pipet, aby dodać larwy do metylocelulozy, dodając jak najmniej PBS z larwami.
Pod mikroskopem preparacyjnym przy małym powiększeniu użyj drobnych kleszczy, aby ustawić rybę tak, aby leżała na prawym boku zwrócona w lewo. Upewnij się, że ryba, która ma być sfotografowana, jest idealnie wyrównana, jednym okiem bezpośrednio na drugim oku. Jeśli ogon ryby jest zgięty, usuń ogon, mocno ściskając go kleszczami, aby usunąć go tak, aby ryba leżała płasko.
Powiększ obraz w dużym powiększeniu i skup się na wątrobie, upewniając się, że kontur wątroby jest wyraźnie widoczny. Naciśnij przycisk Przechwyć obraz, aby zrobić zdjęcie i zapisać plik. Powtórz tę czynność dla wszystkich ryb, upewniając się, że powiększenie jest takie samo dla każdego obrazu.
Zrób zdjęcie mikrometru przy użyciu tego samego powiększenia. Aby użyć programu R do zaślepienia wszystkich obrazów wątroby, aby uniknąć potencjalnej stronniczości badacza i promować rygor naukowy, losowo zmień nazwy plików i utwórz plik randomizacji zawierający listę oryginalnych nazw plików i odpowiadających im zaślepionych nazw plików. Otwieraj losowe pliki w kolejności, zaczynając od pliku pierwszego.
Wybierz narzędzie Zaznaczania odręczne i obrysuj każdą wątrobę. Naciśnij Control-M, aby zmierzyć obszar każdej wątroby. W przypadku wszelkich wątrób, których nie można dokładnie zmierzyć, ponieważ mają resztki skóry, żółtka, są nieostre lub nie są nienaruszone, należy wstawić pomiar zastępczy.
Zapisz pomiary w pliku tekstowym. Aby odślepić i przeanalizować dane, otwórz plik pomiarów i plik randomizacji w programie arkusza kalkulacyjnego. Wstaw nową kolumnę do pliku pomiarów i dodaj oryginalne nazwy plików zaślepionych za pomocą pliku Randomization.
Zapisz ten plik jako plik Pomiary niezaślepione. Posortuj dane według oryginalnej nazwy pliku. Wyklucz wszelkie pomiary wątroby, dla których zdjęcia nie były odpowiednie.
W razie potrzeby przelicz wartości pomiarów na żądaną skalę w milimetrach kwadratowych. Otwórz pasek skali w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu. Użyj narzędzia Linia prosta, aby zmierzyć jeden milimetr na pasku podziałki.
Oprogramowanie do przetwarzania obrazu mierzy następnie w tych samych jednostkach co wątroba, podając współczynnik konwersji. Użyj współczynnika konwersji, aby przekonwertować pomiary w pliku Pomiary niezaślepione. Określ średnią i odchylenie standardowe oraz oblicz wartości P.
Po sześciu dniach od zapłodnienia nietransgeniczne larwy danio pręgowanego wykazywały naturalne położenie i kształt wątroby pokrywającej jelito. Transgeniczne danio pręgowane mają znacznie większy rozmiar wątroby w porównaniu z ich nietransgenicznym rodzeństwem. Poniżej przedstawiono kilka przykładów nieodpowiednich obrazów i mikrometrów.
Larwa ze skórą pokrywającą wątrobę, larwa z żółtkiem zasłaniającym wątrobę, larwa z odciętymi częściami wątroby oraz larwa z przemieszczoną i odpadającą wątrobą, larwa z brakującą wątrobą, larwa z trudnym do zidentyfikowania zarysem wątroby oraz larwa z niewłaściwym ułożeniem. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby używać małych i kontrolowanych ruchów, aby zapobiec uszkodzeniu wątroby. Oprócz mikroskopii jasnego pola możemy również wykorzystać wypreparowane w ten sposób larwy do mikroskopii konfokalnej, do wizualizacji fluorescencyjnych białek reporterowych lub barwienia immunofluorescencyjnego oraz do hybrydyzacji in situ.
Formaldehyd lub PFA jest substancją drażniącą i podejrzewaną o działanie rakotwórcze. Podczas obchodzenia się z PFA należy nosić rękawice, a stężone roztwory należy obchodzić w okapie oparów chemicznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Metoda ta umożliwia ilościowe określenie wielkości wątroby u larw zebrafish, co pozwala na ocenę wpływu manipulacji genetycznych i farmakologicznych na wzrost i rozwój tego narządu. Ułatwia ona również wizualizację i pomiar wątroby, jelit oraz trzustki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwoju
- Genetyka
Wstęp
- Kwantyfikacja wielkości wątroby jest kluczowa dla zrozumienia rozwoju organów.
- Larwy danio pręgowanego służą jako organizm modelowy w badaniach nad rozwojem.
- Manipulacje genetyczne i farmakologiczne mogą wpływać na wzrost organów.
- Właściwa technika jest niezbędna do pomyślnej sekcji i wizualizacji.
Cel badania
- Opracowanie metody ilościowego pomiaru wielkości wątroby u larw zebrafish.
- Ocena wpływu interwencji genetycznych i farmakologicznych na rozwój wątroby.
- Przygotowanie organów do dalszych technik analitycznych, takich jak hybrydyzacja in situ.
Zastosowane metody
- Disekcja larw zebrafish w celu odsłonięcia wątroby, jelita i trzustki.
- Techniki wizualizacji służące do pomiaru wielkości organów.
- Ćwiczenia na próbkach nieeksperymentalnych w celu zapewnienia biegłości w technice.
- Orientacja i kontrola ruchów podczas disekcji w celu uniknięcia uszkodzenia organów.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na szybki i precyzyjny pomiar wielkości wątroby.
- Ułatwia badanie rozwoju narządów w odpowiedzi na manipulacje.
- Stanowi podstawę do dalszych badań obrazowych.
- Wykazuje znaczenie techniki dla wyników eksperymentalnych.
Wnioski
- Metoda ta jest skuteczna w ilościowym określaniu wielkości wątroby u larw zebrafish.
- Umożliwia ona ocenę wpływu czynników genetycznych i farmakologicznych na wzrost organu.
- Właściwa technika sekcji jest kluczowa dla uzyskania pomyślnych wyników eksperymentalnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Kwantyfikacja wielkości wątroby larw w modelach zebrafish umożliwia szybką ocenę wpływu leków na fenotypy związane z onkogenami, co wspiera wczesny etap walidacji celów w badaniach nad rakiem wątrobowokomórkowym. Metoda ta zapewnia pewność prognostyczną poprzez powiązanie interwencji genetycznych lub farmakologicznych z mierzalnymi zmianami wzrostu narządu, co pomaga w podejmowaniu decyzji dotyczących selekcji projektów w portfolio. Podejście to wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego, oferując ilościowy i powtarzalny odczyt modulacji szlaków w przedklinicznych modelach chorobowych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez pomiar zmian powierzchni wątroby w odpowiedzi na modulację onkogenów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia szybką i precyzyjną metodę kwantyfikacji, odpowiednią do wysokoprzepustowego przesiewu interwencji genetycznych lub farmakologicznych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki obiektywnym, mierzalnym fenotypom, które korelują z hepatomegalią związaną z chorobą.
Przesiewanie i opracowywanie testu
- Gotowość do analizy: Protokół sekcji przygotowuje wątrobę, jelita i trzustkę do dalszych zastosowań, takich jak immunofluorescencja i hybrydyzacja in situ.
- Powtarzalność: Zstandaryzowane etapy utrwalania, sekcji i obrazowania zapewniają spójne pomiary powierzchni wątroby w grupach eksperymentalnych.
- Skalowalność: Metoda pozwala na przetwarzanie do 15 larw w jednej probówce, co umożliwia analizę seryjną w celu oceny związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Metoda jest stosowalna w transgenicznych modelach raka wątrobowokomórkowego u danio pręgowanego, w których hepatomegalia stanowi wczesny fenotyp larwalny.
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia płynne przejście od fazy odkryć do walidacji przedklinicznej poprzez dostarczenie mierzalnych danych dotyczących wielkości organów.
- Decyzje korygowane o ryzyko: Pomiary wielkości wątroby stanowią podstawę do decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o efekty wzrostu zależne od dawki lub genotypu.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesów odkrywczych – od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną – stanowiąc ilościowy pomost między manipulacją genetyczną a wynikiem fenotypowym.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez powiązanie ekspresji onkogenów z mierzalnymi zmianami powierzchni wątroby u larw zebrafish.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowanych, ilościowych wyników (powierzchnia wątroby w mm²), które umożliwiają wiarygodne porównywanie różnych warunków traktowania.
- Analityka: Generuje mierzalne dane (średnia, odchylenie standardowe, wartości P) odpowiednie do analizy statystycznej i potwierdzania trafień.
- Badania translacyjne: Łączy wczesne przesiewanie fenotypowe z ciągłością przedkliniczną poprzez odczyty przerostu wątroby istotne dla przebiegu choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Procedura sekcji i obrazowania jest adaptowalna dla wielu układów narządowych (wątroba, jelita, trzustka) i kompatybilna z multipleksowymi analizami następczymi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną, zapewniając bezpośredni, mierzalny odczyt wzrostu wątroby w odpowiedzi na modulację ścieżek sygnałowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki ślepej analizie obrazów oraz kalibracji paska skali.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnej oceny fenotypowej, co ogranicza nakłady na nieefektywne cele.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez identyfikację związków lub genotypów, które znacząco zmieniają wielkość wątroby w stosunku do grup kontrolnych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z danio pręgowanym, przeprowadzaniu sekcji oraz w mikroskopii w polu jasnym, aby uniknąć uszkodzenia tkanek.
- Zależy od instrumentacji, w tym od mikroskopów sekcyjnych, pipet szklanych, pęset oraz oprogramowania do przetwarzania obrazów (np. R, ImageJ).
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji techniki sekcji, anonimizacji plików oraz protokołów pomiarowych w celu zminimalizowania błędu badacza.
- Kwestie adaptacyjne obejmują dostosowanie czasu sekcji w zależności od wieku larw (3–7 dpf) oraz obecności żółtka.
- Ograniczenie praktyczne: pomiar powierzchni wątroby może niedoszacować zmian objętości; konieczne są metody uzupełniające, aby odróżnić hipertrofię od hiperplazji.
