Name: Kwantyfikacja wielkości wątroby u larw danio pręgowanego za pomocą mikroskopii jasnego pola (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji wielkości wątroby u larw Danio rerio za pomocą mikroskopii jasnego pola. Technika ta umożliwia szybkie i precyzyjne pomiary oraz ocenę wpływu manipulacji genetycznych i farmakologicznych na rozwój narządów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Maurine Hobbs i Centralized Zebrafish Animal Resource (CZAR) na Uniwersytecie Utah za udostępnienie hodowli danio pręgowanego, przestrzeni laboratoryjnej i sprzętu do przeprowadzenia części tych badań. Rozbudowa CZAR jest częściowo wspierana przez grant NIH # 1G20OD018369-01. Chcielibyśmy również podziękować Rodneyowi Stewartowi, Chloe Lim, Lance'owi Grahamowi, Cody'emu Jamesowi, Garrettowi Nickumowi i Huntsman Cancer Institute (HCI) Zebrafish Facility za opiekę nad danio pręgowanym. Chcielibyśmy podziękować Kennethowi Kompassowi za pomoc w programowaniu w języku R. Praca ta została częściowo sfinansowana z grantów Huntsman Cancer Foundation (w połączeniu z grantem P30 CA042014 przyznanym Huntsman Cancer Institute) (KJE) i NIH/NCI R01CA222570 (KJE).

Badania na zwierzętach są przeprowadzane zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu w Utah.
1. Naprawianie larw
<ol>
	<li>Po 3–7 dniach od zapłodnienia (DPF) należy poddać larwy eutanazji metanosulfonianem trikainy (0,03%) i zebrać do 15 larw w probówce o pojemności 2 ml za pomocą szklanej pipety i pompki do pipet.</li>
	<li>Przemyć larwy dwukrotnie 1 ml zimnej (4 °C) soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na lodzie. Przy każdym płukaniu usuń jak najwięcej płynu z probówki za pomocą szklanej pipety i pompki do pipet, a następnie dodaj 1 ml zimnego PBS do probówki.</li>
	<li>Usunąć jak najwięcej PBS za pomocą szklanej pipety i pompki do pipet, a następnie dodać 1 ml zimnego (4 °C) 4% paraformaldehydu (PFA) do PBS. 
	UWAGA: PFA jest substancją drażniącą i podejrzewaną o działanie rakotwórcze. Podczas obchodzenia się z PFA należy nosić rękawice, a stężone roztwory należy obchodzić się w okapie oparów chemicznych.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 4 °C co najmniej przez noc (ale do kilku miesięcy) z delikatnym kołysaniem.</li>
</ol>
2. Sekcja tkanek otaczających wątrobę
<ol>
	<li>Usunąć larwy z PFA, spłukując 3x 1 ml zimnego (4 °C) PBS i kołysząc przez 5 minut między płukaniami. 
	UWAGA: Opłukane larwy można przechowywać w PBS przez dzień lub dwa w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odpipetować kilka larw z PBS do jednego dołka 9-dołkowego szklanego naczynia z okrągłym dnem.</li>
	<li>Usuń skórę otaczającą wątrobę.
	<ol>
		<li>Użyj cienkich kleszczy, aby trzymać larwę na plecach (brzuchem do góry), chwytając po obu stronach głowy tak delikatnie, jak to możliwe. Następnie użyj bardzo cienkich kleszczyków w drugiej ręce, aby chwycić skórę tuż nad sercem.</li>
		<li>Pociągnij skórę w dół po przekątnej w kierunku ogona ryby i dna naczynia po lewej lub prawej stronie ryby. Powtórz dla drugiej strony (prawej lub lewej strony).</li>
		<li>Kontynuuj chwytanie płatów skóry i ciągnięcie w dół/do tyłu, aż cała skóra i melanofory leżące nad wątrobą lub w jej pobliżu zostaną usunięte.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń żółtko, jeśli jest obecne.
	<ol>
		<li>W przypadku larw o objętości 5–6 dpf należy zdjąć żółtko w jednym kawałku, przytrzymując rybę cienkimi kleszczami na grzbiecie i delikatnie szturchając żółtko bardzo cienkimi kleszczami.</li>
		<li>W przypadku 3–4 larw dpf zeskrob żółtko na kawałki. Trzymaj rybę cienkimi kleszczami na grzbiecie i bardzo cienkimi kleszczami głaskaj żółtko, zaczynając od strony brzusznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypreparowane larwy umieścić w świeżym, zimnym PBS za pomocą szklanej pipety i pompki do pipet.</li>
</ol>
3. Obrazowanie
<ol>
	<li>Aby zamontować larwy, wlej kilka ml 3% metylocelulozy na pokrywkę czystej plastikowej szalki Petriego.</li>
	<li>Użyj szklanej pipety i pompki do pipet, aby dodać larwy do metylocelulozy, dodając jak najmniej PBS z larwami.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym przy małym powiększeniu użyj drobnych kleszczy, aby ustawić rybę tak, aby leżała na prawym boku, zwrócona w lewo. 
	UWAGA: Upewnij się, że ryby są idealnie ułożone na boku, w przeciwnym razie pomiary wątroby mogą nie być dokładne.</li>
	<li>Zrób zdjęcie każdej ryby.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że ryba, która ma być sfotografowana, jest idealnie wyrównana, z jednym okiem bezpośrednio na drugim oku. W razie potrzeby użyj cienkich kleszczy, aby lekko postukać w głowę lub ogon ryby, aby dostosować orientację. Jeśli ogon ryby jest zgięty, usuń ogon, mocno ściskając go kleszczami, aby usunąć go tak, aby ryba leżała płasko.</li>
		<li>Powiększ obraz w dużym powiększeniu i skup się na wątrobie, upewniając się, że kontur wątroby jest wyraźnie widoczny.</li>
		<li>Zrób zdjęcie i zapisz plik.</li>
		<li>Powtórz tę czynność dla wszystkich ryb, upewniając się, że powiększenie jest takie samo dla każdego obrazu.</li>
		<li>Zrób zdjęcie mikrometru przy użyciu tego samego powiększenia (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2H).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Zmierz obszar wątroby każdej ryby za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu.
	<ol>
		<li>Zaślep wszystkie zdjęcia wątroby, aby uniknąć potencjalnej stronniczości badacza i promować rygor naukowy15. Ten krok może być wykonany ręcznie przez innego członka laboratorium lub za pomocą programu komputerowego (Materiał uzupełniający). Zmieniaj losowo nazwy plików i utwórz "plik losowy" zawierający listę oryginalnych nazw plików i odpowiadających im zaślepionych nazw plików.</li>
		<li>Otwieraj losowe pliki w kolejności, zaczynając od pliku 1.</li>
		<li>Wybierz narzędzie do zaznaczania odręcznego i obrysuj każdą wątrobę.</li>
		<li>Naciśnij Ctrl-M, aby zmierzyć obszar każdej wątroby.</li>
		<li>W przypadku każdej wątroby, której nie można dokładnie zmierzyć, należy wprowadzić pomiar zastępczy (bardzo mały lub bardzo duży, aby można go było później łatwo wykluczyć).</li>
		<li>Zapisz pomiary w pliku tekstowym ("plik pomiarów").</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odślepianie i analizowanie danych
	<ol>
		<li>Otwórz "plik pomiarów" i "plik randomizacji" w arkuszu kalkulacyjnym.</li>
		<li>Wstaw nową kolumnę w "pliku pomiarów" i dodaj oryginalne nazwy plików dla zaślepionych plików, używając "pliku randomizacji". Zapisz ten plik jako "plik pomiarów odślepionych".</li>
		<li>Sortuj dane według oryginalnej nazwy pliku.</li>
		<li>Pamiętaj, aby wykluczyć wszelkie pomiary wątroby, dla których zdjęcia były nieodpowiednie (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2A–G).</li>
		<li>W razie potrzeby przelicz wartości pomiarów na żądaną skalę (np. mm2).
		<ol>
			<li>Otwórz pasek skali w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu.</li>
			<li>Użyj narzędzia do linii prostej, aby zmierzyć 1 mm na pasku skali. Oprogramowanie do przetwarzania obrazu będzie mierzyć w tych samych jednostkach co wątroby (piksele), podając współczynnik konwersji.</li>
			<li>Użyj współczynnika konwersji, aby przekonwertować pomiary w "niezaślepionym pliku pomiarów".</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Korzystając z arkusza kalkulacyjnego lub wklejając dane do naukowego oprogramowania do tworzenia wykresów i statystyk, określ średnią i odchylenie standardowe oraz oblicz wartość p.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lin, D. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+Epigenomic+Heterogeneity+of+Hepatocellular+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).</li>
<li>Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+hepatocellular+carcinoma%3A+Epidemiology%2C+etiology%2C+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis.</a> Journal of Carcinogenesis. 16, 1(2017).</li>
<li>Evason, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Chemical+Inhibitors+of+%CE%B2-Catenin-Driven+Liver+Tumorigenesis+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (7), 1005305(2015).</li>
<li>Kalasekar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+beta-catenin+activation+is+sufficient+to+cause+hepatocellular+carcinoma+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish.</a> Biology Open. 8 (10), (2019).</li>
<li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+level+of+liver-specific+expression+of+oncogenic+Kras%28V12%29+drives+robust+liver+tumorigenesis+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish.</a> Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).</li>
<li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+kras%28V12%29+transgenic+zebrafish+model+for+liver+tumorigenesis+and+chemical+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening.</a> Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+liver+tumor+model+with+inducible+Myc+expression+reveals+conserved+Myc+signatures+with+mammalian+liver+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors.</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).</li>
<li>Cox, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yap+reprograms+glutamine+metabolism+to+increase+nucleotide+biosynthesis+and+enable+liver+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth.</a> Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).</li>
<li>Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+the+mutants+vps18%2C+nf2+and+foie+gras+as+models+of+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease.</a> Development. 132 (15), Cambridge, England. 3561-3572 (2005).</li>
<li>Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+tumor+models+in+transgenic+zebrafish%3A+an+alternative+in+vivo+approach+to+study+hepatocarcinogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncology%22%5BJournal%5D)">Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes.</a> Future Oncology. 8 (1), London, England. 21-28 (2012).</li>
<li>Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-Associated+Neutrophils+and+Macrophages+Promote+Gender+Disparity+in+Hepatocellular+Carcinoma+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish.</a> Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageJ+ecosystem%3A+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).</li>
<li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).</li>
<li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+plus+high+cholesterol+diet+lead+to+hepatic+steatosis+in+zebrafish+larvae%3A+a+novel+model+for+screening+anti-hepatic+steatosis+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs.</a> Nutrition & Metabolism. 12, 42(2015).</li>
<li>Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+model+of+tuberous+sclerosis+complex+reveals+cell-autonomous+and+non-cell-autonomous+functions+of+mutant+tuberin%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin.</a> Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).</li>
<li>Delous, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9b+is+a+key+regulator+of+pancreaticobiliary+ductal+system+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development.</a> PLoS Genetics. 8 (6), 1002754(2012).</li>
<li>Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+of+hepatic+competence+by+Fgf+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restriction of hepatic competence by Fgf signaling.</a> Development. 138 (7), Cambridge, England. 1339-1348 (2011).</li>
<li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+helix-loop-helix+transcription+factor%2C+heart+and+neural+crest+derivatives+expressed+transcript+2%2C+marks+hepatic+stellate+cells+in+zebrafish%3A+analysis+of+stellate+cell+entry+into+the+developing+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. 56 (5), Baltimore, Md. 1958-1970 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kwantyfikacja wielkości wątroby ma kluczowe znaczenie w badaniach mających na celu zrozumienie rozwoju, regeneracji i onkogenezy wątroby. Opisany tutaj protokół jest stosunkowo szybką, łatwą i tanią techniką ilościowego oznaczania wielkości wątroby u larw danio pręgowanego. Zachowanie odpowiedniej ostrożności podczas wykonywania niektórych aspektów protokołu może pomóc w zwiększeniu dokładności wyników i zmniejszeniu frustracji.
Właściwe utrwalenie larw ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dobr...

Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest najczęstszym pierwotnym nowotworem złośliwym wątroby1 i trzecią najczęstszą przyczyną śmiertelności związanej z rakiem2. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy hepatokarcynogenezy i zidentyfikować potencjalne terapie HCC, wraz z innymi opracowaliśmy transgenicznego danio pręgowanego, u którego ekspresja onkogenów specyficzna dla hepatocytów, takich jak β-katenina3,4, Kras(V12)5,6, Myc7, lub Yap18 prowadzi do HCC u dorosłych zwierząt. U tych danio pręgowanego powiększenie wątroby obserwuje się już po 6 dniach od zapłodnienia (dpf), co stanowi łatwą platformę do testowania wpływu leków i zmian genetycznych na przerost wątroby spowodowany onkogenami. Dokładny i precyzyjny pomiar wielkości wątroby larw jest niezbędny do określenia skutków tych manipulacji.
Rozmiar i kształt wątroby można ocenić półilościowo u stałych larw danio pręgowanego za pomocą CY3-SA labeling9 lub u żywych larw danio pręgowanego za pomocą specyficznych dla hepatocytów reporterów fluorescencyjnych i mikroskopii preparacyjnej fluorescencji5,6. Ta ostatnia metoda jest stosunkowo szybka, a jej brak precyzji można rozwiązać, fotografując i mierząc obszar każdej wątroby za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu7,10. Jednak równomierne rozmieszczenie wszystkich żywych larw w eksperymencie w taki sposób, aby dwuwymiarowy obszar wątroby był dokładnym odwzorowaniem wielkości wątroby, może być technicznie trudne. Podobna technika ilościowego określania wielkości wątroby polega na użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem lekkiego arkusza do ilościowego określenia objętości wątroby larw8, co może być dokładniejsze do wykrywania różnic w wielkości, gdy wątroba jest rozszerzona nierównomiernie w różnych wymiarach. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) może być używane do zliczania liczby znakowanych fluorescencyjnie hepatocytów i innych typów komórek wątroby w wątrobach larwalnych8,11. W tej metodzie wątroby larwalne są łączone i dysocjowane, więc informacje o indywidualnej wielkości i kształcie wątroby są tracone. W połączeniu z inną metodą określania wielkości wątroby, FACS umożliwia różnicowanie między zwiększoną liczbą komórek (hiperplazja) a zwiększoną wielkością komórek (hipertrofią). Wszystkie te metody wykorzystują kosztowną technologię fluorescencji (mikroskop lub sorter komórek) i, z wyjątkiem znakowania CY3-SA, wymagają znakowania hepatocytów za pomocą reportera fluorescencyjnego.
Tutaj szczegółowo opisujemy metodę ilościowego określania obszaru wątroby larw danio pręgowanego za pomocą mikroskopii jasnego pola i oprogramowania do przetwarzania obrazów3,12,13,14. Protokół ten umożliwia precyzyjne określenie ilościowe obszaru poszczególnych wątrob in situ bez użycia mikroskopii fluorescencyjnej. Analizując rozmiar wątroby, zaślepiamy tożsamość obrazu, aby zmniejszyć stronniczość badaczy i poprawić rygor naukowy15.

<table><tbody><tr><td>Kamera do mikroskopu preparacyjnego</td><td>Leica, na przykład</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Leica, na przykład</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cienkie (Dumont #5) kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Pipety szklane</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>Obraz J/FIJI</td><td></td><td>ImageJ/FIJI można pobrać za darmo: <a href="https://imagej.net/Welcome" target="_blank">https://imagej.net/Welcome</a></td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Różni dostawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa do pipet</td><td>VWR</td><td>53502-233</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe szalki Petriego</td><td>USA Scientific Inc</td><td>2906</td><td></td></tr><tr><td>9-dołkowa szklana miska z okrągłym dnem Pyrex</td><td>VWR</td><td>89090-482</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do zaślepiania plików</td><td>R projekt</td><td></td><td>R można pobrać za darmo: <a href="https://www.r-project.org/" target="_blank">https://www.r-project.org/</a></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do tworzenia wykresów naukowych i statystyk</td><td>Program arkusza kalkulacyjnego GraphPad Prism</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanosulfonian trikainy (Tricaine-S)</td><td>Western Chemical</td><td>200-226</td><td></td></tr><tr><td>Bardzo cienkie (Dumont #55) kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki pięknej</td><td>11255-20</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja wielkości wątroby u larw danio pręgowanego za pomocą mikroskopii jasnego pola

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

W kilku transgenicznych modelach raka wątrobowokomórkowego (HCC) zebryo można zaobserwować we wczesnych stadiach larwalnych. Kwantyfikacja wielkości wątroby larw w modelach HCC danio pręgowanego umożliwia szybką ocenę wpływu leków i innych manipulacji na fenotyp związany z onkogenem. Tutaj pokazujemy, jak naprawić larwy danio pręgowanego, wypreparować tkanki otaczające wątrobę, sfotografować wątroby za pomocą mikroskopii jasnego pola, zmierzyć obszar wątroby i przeanalizować wyniki. Protokół ten umożliwia szybkie i precyzyjne określenie ilościowe wielkości wątroby. Ponieważ metoda ta obejmuje pomiar obszaru wątroby, może zaniżać różnice w objętości wątroby i potrzebne są uzupełniające metodologie do rozróżnienia zmian wielkości komórek i zmian liczby komórek. Opisana tutaj technika preparacji jest doskonałym narzędziem do wizualizacji wątroby, jelit i trzustki w ich naturalnych pozycjach w niezliczonych dalszych zastosowaniach, w tym barwieniu immunofluorescencyjnym i hybrydyzacji in situ. Opisana strategia ilościowego określania wielkości wątroby larw ma zastosowanie do wielu aspektów rozwoju i regeneracji wątroby.

Transgeniczne danio pręgowane wykazujące hepatocytową specyficzną aktywację β-kateniny (ryby Tg(fabp10a:pt-β-cat))3 oraz nietransgeniczne rodzeństwo kontrolne zostały uśmiercone w 6 dpf, a powierzchnia wątroby została zmierzona przy użyciu mikroskopii w polu jasnym i oprogramowania do przetwarzania obrazów. Ryby transgeniczne wykazują istotnie zwiększony rozmiar wątroby (0.0006 cm2) w porównaniu z nietransgenicznym rodzeństwem (0.0004 cm2, p &lt; 0....

Tutaj demonstrujemy metodę ilościowego określania wielkości wątroby u larw danio pręgowanego, umożliwiając ocenę wpływu manipulacji genetycznych i farmakologicznych na wzrost i rozwój wątroby.

Kwantyfikacja wielkości wątroby u larw danio pręgowanego za pomocą mikroskopii jasnego pola

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Metoda ta umożliwia ilościowe określenie wielkości wątroby u larw danio pręgowanego. Pozwala również na ocenę wpływu manipulacji genetycznych i farmakologicznych na wzrost i rozwój wątroby. Technika ta zapewnia szybki i precyzyjny sposób wizualizacji i pomiaru wątroby, a także jelit i trzustki.Oprócz ilościowego określenia wielkości wątroby, ta metoda preparacji może być pomocna w przygotowaniu wątroby, jelit i trzustki do hybrydyzacji in situ lub obrazowania konfokalnego. Zanim podejmiesz próbę przeprowadzenia badań na eksperymentalnych larwach, upewnij się, że poświęciłeś wystarczająco dużo czasu na ćwiczenie na próbkach nieeksperymentalnych i masz znaczny wskaźnik sukcesu. Bardzo ważne jest uwidocznienie prawidłowej orientacji i ruchu larw danio pręgowanego i kleszczy w celu usunięcia skóry bez naruszania otaczających narządów.Po trzech do siedmiu dniach od zapłodnienia, po eutanazji larw, użyj szklanej pipety i pompki do pipet, aby zebrać do 15 larw w dwumililitrowej probówce. Umyj larwy dwukrotnie jednym mililitrem zimnego 1X PBS na lodzie. Usuń jak najwięcej PBS za pomocą szklanej pipety i pompki do pipet, a następnie dodaj jeden mililitr zimnego czteroprocentowego PFA w PBS.Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza co najmniej przez noc, delikatnie kołysząc. Za pomocą szklanej pipety i pompki do pipet usuń PFA z probówki i spłucz trzykrotnie jednym mililitrem zimnego PBS. Kołysz przez pięć minut między płukaniami.Odpipetować kilka larw z PBS do jednej studzienki z dziewięciodołkowym szklanym naczyniem o okrągłym dnie. Pod mikroskopem usuń skórę otaczającą wątrobę za pomocą cienkich kleszczy, aby przytrzymać jedną larwę na grzbiecie, chwytając po obu stronach głowy tak delikatnie, jak to możliwe. Następnie użyj bardzo cienkich kleszczyków w drugiej ręce, aby chwycić skórę tuż nad sercem.Pociągnij skórę w dół po przekątnej w kierunku ogona ryby na dnie naczynia po lewej lub prawej stronie ryby. Powtórz dla drugiej strony. Kontynuuj chwytanie płatów skóry i ciągnięcie w dół, aż cała skóra i melanofory leżące nad wątrobą lub w jej pobliżu zostaną usunięte.Jeśli żółtko jest obecne przez pięć do sześciu dni po zapłodnieniu, podnieś żółtko w jednym kawałku, trzymając rybę cienkimi kleszczami na grzbiecie i używając bardzo cienkich kleszczyków do delikatnego szturchania żółtka. W przypadku trzech do czterech larw DPF trzymaj rybę cienkimi kleszczami na grzbiecie i bardzo cienkimi kleszczami głaskaj żółtko, zaczynając od strony brzusznej. Zeskrob żółtko na kawałki.Umieść wypreparowane larwy w świeżym, zimnym PBS w dwumililitrowej probówce za pomocą szklanej pipety i pompki do pipet. Aby zamontować larwy, wlej kilka mililitrów trzyprocentowej metylocelulozy na pokrywkę czystej, plastikowej szalki Petriego. Użyj szklanej pipety i pompki do pipet, aby dodać larwy do metylocelulozy, dodając jak najmniej PBS z larwami.Pod mikroskopem preparacyjnym przy małym powiększeniu użyj drobnych kleszczy, aby ustawić rybę tak, aby leżała na prawym boku zwrócona w lewo. Upewnij się, że ryba, która ma być sfotografowana, jest idealnie wyrównana, jednym okiem bezpośrednio na drugim oku. Jeśli ogon ryby jest zgięty, usuń ogon, mocno ściskając go kleszczami, aby usunąć go tak, aby ryba leżała płasko.Powiększ obraz w dużym powiększeniu i skup się na wątrobie, upewniając się, że kontur wątroby jest wyraźnie widoczny. Naciśnij przycisk Przechwyć obraz, aby zrobić zdjęcie i zapisać plik. Powtórz tę czynność dla wszystkich ryb, upewniając się, że powiększenie jest takie samo dla każdego obrazu.Zrób zdjęcie mikrometru przy użyciu tego samego powiększenia. Aby użyć programu R do zaślepienia wszystkich obrazów wątroby, aby uniknąć potencjalnej stronniczości badacza i promować rygor naukowy, losowo zmień nazwy plików i utwórz plik randomizacji zawierający listę oryginalnych nazw plików i odpowiadających im zaślepionych nazw plików. Otwieraj losowe pliki w kolejności, zaczynając od pliku pierwszego.Wybierz narzędzie Zaznaczania odręczne i obrysuj każdą wątrobę. Naciśnij Control-M, aby zmierzyć obszar każdej wątroby. W przypadku wszelkich wątrób, których nie można dokładnie zmierzyć, ponieważ mają resztki skóry, żółtka, są nieostre lub nie są nienaruszone, należy wstawić pomiar zastępczy.Zapisz pomiary w pliku tekstowym. Aby odślepić i przeanalizować dane, otwórz plik pomiarów i plik randomizacji w programie arkusza kalkulacyjnego. Wstaw nową kolumnę do pliku pomiarów i dodaj oryginalne nazwy plików zaślepionych za pomocą pliku Randomization.Zapisz ten plik jako plik Pomiary niezaślepione. Posortuj dane według oryginalnej nazwy pliku. Wyklucz wszelkie pomiary wątroby, dla których zdjęcia nie były odpowiednie.W razie potrzeby przelicz wartości pomiarów na żądaną skalę w milimetrach kwadratowych. Otwórz pasek skali w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu. Użyj narzędzia Linia prosta, aby zmierzyć jeden milimetr na pasku podziałki.Oprogramowanie do przetwarzania obrazu mierzy następnie w tych samych jednostkach co wątroba, podając współczynnik konwersji. Użyj współczynnika konwersji, aby przekonwertować pomiary w pliku Pomiary niezaślepione. Określ średnią i odchylenie standardowe oraz oblicz wartości P.Po sześciu dniach od zapłodnienia nietransgeniczne larwy danio pręgowanego wykazywały naturalne położenie i kształt wątroby pokrywającej jelito. Transgeniczne danio pręgowane mają znacznie większy rozmiar wątroby w porównaniu z ich nietransgenicznym rodzeństwem. Poniżej przedstawiono kilka przykładów nieodpowiednich obrazów i mikrometrów.Larwa ze skórą pokrywającą wątrobę, larwa z żółtkiem zasłaniającym wątrobę, larwa z odciętymi częściami wątroby oraz larwa z przemieszczoną i odpadającą wątrobą, larwa z brakującą wątrobą, larwa z trudnym do zidentyfikowania zarysem wątroby oraz larwa z niewłaściwym ułożeniem. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby używać małych i kontrolowanych ruchów, aby zapobiec uszkodzeniu wątroby. Oprócz mikroskopii jasnego pola możemy również wykorzystać wypreparowane w ten sposób larwy do mikroskopii konfokalnej, do wizualizacji fluorescencyjnych białek reporterowych lub barwienia immunofluorescencyjnego oraz do hybrydyzacji in situ.Formaldehyd lub PFA jest substancją drażniącą i podejrzewaną o działanie rakotwórcze. Podczas obchodzenia się z PFA należy nosić rękawice, a stężone roztwory należy obchodzić w okapie oparów chemicznych.

quantifying-liver-size-larval-zebrafish-using-brightfield

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisany tutaj jest protokół półautomatycznego obrazowania specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego.

Półautomatyczne obrazowanie specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego

Prezentujemy protokół do uchwycenia dynamiki regeneracji płetw ogonowych larw danio pręgowanego w skali całej tkanki za pomocą stereomikroskopii opartej na jasnym polu. Technika ta umożliwia uchwycenie dynamiki regeneracji z rozdzielczością pojedynczej komórki. Metodologię tę można dostosować do każdego mikroskopu stereoskopowego wyposażonego w kamerę CCD i oprogramowanie do filmów poklatkowych.

Uchwycenie naprawy tkanek u larw danio pręgowanego za pomocą stereomikroskopii poklatkowej w jasnym polu

Mikroskopia fluorescencyjna z lekkim arkuszem jest doskonałym narzędziem do obrazowania rozwoju embrionalnego. Pozwala na nagrywanie długich filmów poklatkowych żywych zarodków w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Demonstrujemy jego zastosowanie do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego w szerokich skalach czasoprzestrzennych i przedstawiamy potok do fuzji i dekonwolucji zestawów danych multiview.

Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego

Danio pręgowany staje się cennym modelem przetwarzania lipidów w diecie i chorób metabolicznych. Opisano protokoły żywienia larw bogatych w lipidy, obrazowanie na żywo fluorescencyjnych analogów lipidów w diecie oraz ilościowe oznaczanie spożycia pokarmu. Techniki te można zastosować do różnych technik badań przesiewowych, obrazowania i dociekań opartych na hipotezach.

Paradygmat żywienia wysokotłuszczowego dla larw danio pręgowanego: karmienie, obrazowanie na żywo i kwantyfikacja spożycia pokarmu

Tutaj opisujemy metodę zmniejszania wielkości zarodków danio pręgowanego bez zakłócania normalnych procesów rozwojowych. Technika ta umożliwia badanie skalowania wzorca i odporności rozwojowej na zmiany rozmiaru.

Chirurgiczne zmniejszanie rozmiaru danio pręgowanego w celu zbadania skalowania wzorca embrionalnego

Ten protokół opisuje procedurę usuwania brzusznego płata wątroby u dorosłego danio pręgowanego, aby umożliwić badanie regeneracji wątroby.

Częściowa hepatektomia u dorosłych danio pręgowanego

Tutaj udostępniamy protokół krok po kroku, z poradami dotyczącymi generowania ksenoprzeszczepów i wytycznymi do analizy zachowania guza, immunofluorescencji całego montażu i kwantyfikacji obrazowania konfokalnego.

Generowanie ksenoprzeszczepów larw danio pręgowanego i analiza zachowania guza

Tutaj prezentujemy, jak wygenerować model danio pręgowanego związanego z niealkoholową stłuszczeniową chorobą wątroby (NAFLD) w celu zbadania wpływu nadwyżki cholesterolu na mikrośrodowisko wątroby i krajobraz komórek odpornościowych.

Analiza mikrośrodowiska wątroby we wczesnej progresji niealkoholowego raka wątrobowokomórkowego związanego z stłuszczeniową chorobą wątroby u danio pręgowanego

Przejrzystość optyczna jest główną zaletą dla biologicznej i fizjologicznej pracy komórek u danio pręgowanego. Opisano solidne metody pomiaru wzrostu komórek u poszczególnych zwierząt, które pozwalają na nowy wgląd w to, w jaki sposób wzrost mięśni szkieletowych i sąsiednich tkanek jest zintegrowany ze wzrostem całego ciała.

Wielokrotne pomiary wzrostu mięśni szkieletowych w czasie rzeczywistym u poszczególnych żywych ryb danio pręgowanych poddanych zmienionej aktywności elektrycznej

Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania in vivo całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej. Procedura eksperymentalna obejmuje przygotowanie próbki, akwizycję obrazu i wizualizację.

In vivo (in vivo) Obrazowanie całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej

Ten protokół wykorzystuje obrazowanie za pomocą arkusza świetlnego do badania funkcji skurczu serca u larw danio pręgowanego i uzyskania wglądu w mechanikę serca poprzez śledzenie komórek i interaktywną analizę.

Obrazowanie 4D Light-sheet skurczu serca danio pręgowanego

Poznaj metodę kwantyfikacji wielkości wątroby u larw Danio rerio za pomocą mikroskopii jasnego pola. Technika ta umożliwia szybkie i precyzyjne pomiary oraz ocenę wpływu manipulacji genetycznych i farmakologicznych na rozwój narządów.

Kwantyfikacja wielkości wątroby u larw danio pręgowanego za pomocą mikroskopii jasnego pola

Przeglądaj więcej filmów