Name: Analiza wieloczynnikowych eksperymentów sekwencyjnych RNA za pomocą DiCoExpress (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Poznaj narzędzie DiCoExpress do analizy RNA-Seq w języku R, od kontroli jakości po koekspresję. Umożliwia analizę różnicową i wzbogacenia bez zaawansowanej wiedzy statystycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była głównie wspierana przez ANR PSYCHE (ANR-16-CE20-0009). Autorzy dziękują F. Desprezowi za budowę kontenera DiCoExpress. Prace KB są wspierane przez program Inwestycja w przyszłość ANR-10-BTBR-01-01 Amaizing. Laboratoria GQE i IPS2 korzystają ze wsparcia Saclay Plant Sciences-SPS (ANR-17-EUR-0007).

1. DiCoExpress
<ol>
	<li>Otwórz sesję programu R Studio i ustaw katalog na Template_scripts.</li>
	<li>Otwórz skrypt DiCoExpress_Tutorial.R w programie R studio.</li>
	<li>Załaduj funkcje DiCoExpress w sesji języka R za pomocą następujących poleceń: 
	> źródło(".. /Źródła/Load_Functions.R") 
	> Load_Functions() 
	> Data_Directory = ".. /Dane" 
	> Results_Directory = ".. /Wyniki/"</li>
	<li>Załaduj pliki danych w sesji języka R za pomocą następujących poleceń: 
	> Project_Name = "Samouczek" 
	> Filtr = NULL 
	> Sep="\t" 
	> Data_Files = Load_Data_Files(Data_Directory, Project_Name, Filtr, wrzesień)</li>
	<li>Podziel Data_Files obiektu na kilka obiektów, aby łatwo nimi manipulować: 
	> Project_Name = Data_Files$Project_Name 
	> Cel = Data_Files$Cel 
	> Raw_Counts = Data_Files$Raw_Counts 
	> Adnotacja = Data_Files$Adnotacja 
	> Reference_Enrichment = Data_Files$Reference_Enrichment</li>
	<li>Wybierz strategię spośród "NbConditions", "NbReplicates" lub "filterByExpr" oraz próg, aby filtrować geny o niskiej ekspresji. Tutaj wybieramy 
	> Filter_Strategy = "NbReplicates" 
	> CPM_Cutoff = 1</li>
	<li>Określ kolory grupy za pomocą polecenia 
	> Color_Group = NULL 
	UWAGA: Gdy jest ustawiona na NULL, R automatycznie przypisuje kolory do warunków biologicznych. W przeciwnym razie wprowadź wektor wskazujący kolor dla każdej grupy biologicznej.</li>
	<li>Wybierz metodę normalizacji spośród akceptowanych przez funkcję calcNormFactors edgeR. Na przykład 
	> Normalization_Method = "TMM"</li>
	<li>Przeprowadź kontrolę jakości, wykonując następującą funkcję 
	> Quality_Control(Data_Directory, Results_Directory, Project_Name, Element docelowy, Raw_Counts, Filter_Strategy, Color_Group, CPM_Cutoff Normalization_Method)</li>
	<li>Stan Replikacja = PRAWDA, jeśli dane są sparowane zgodnie ze współczynnikiem replikacji, FAŁSZ w przeciwnym razie.</li>
	<li>Przypisz interakcję = PRAWDA, aby rozważyć interakcję między dwoma czynnikami biologicznymi, FAŁSZ w przeciwnym razie.</li>
	<li>Określ model statystyczny za pomocą następujących poleceń 
	> Model = GLM_Contrasts(Results_Directory, Project_Name, Cel, Replikacja, Interakcja) 
	> GLM_Model = Model$GLM_Model 
	> Kontrasty = Model$Kontrasty</li>
	<li>Zdefiniuj próg współczynnika fałszywych wykryć, tutaj 0,05 
	> Alpha_DiffAnalysis =0,05</li>
	<li>Wykonaj analizę różnicową za pomocą następujących poleceń 
	> Index_Contrast=1:nrow(Kontrasty) 
	> NbGenes_Profiles = 20 
	> NbGenes_Clustering = 50 
	> DiffAnalysis.edgeR (Data_Directory, Results_Directory, Project_Name, Element docelowy, Raw_Counts, GLM_Model, Kontrasty, Index_Contrast, Filter_Strategy, Alpha_DiffAnalysis, NbGenes_Profiles, NbGenes_Clustering, CPM_Cutoff Normalization_Method)</li>
	<li>Ustal próg dla analizy wzbogacenia, tutaj 0,01 
	> Alpha_Enrichment = 0,01</li>
	<li>Przeprowadzić analizę wzbogacenia list genów o zróżnicowanej ekspresji (DEG) 
	> Tytuł = NULL 
	> Wzbogacenie(Results_Directory, Project_Name, Tytuł, Reference_Enrichment, Alpha_Enrichment)</li>
	<li>Wybierz listy DEG do porównania. Na przykład, 
	> Grupy = Kontrasty$Kontrasty[24:28]</li>
	<li>Podaj nazwę porównania list. Ta nazwa jest używana dla katalogu, w którym zostaną zapisane pliki wyjściowe 
	> Tytuł = "Interaction_with_Genotypes_1_and_2"</li>
	<li>Określ akcję, która ma zostać wykonana na listach DEG, ustawiając parametr Operation na union lub intercin. Wybieramy 
	> Operation = "Unia"</li>
	<li>Porównaj listy stopni Celsjusza 
	> Venn_IntersectUnion(Data_Directory, Results_Directory, Project_Name, Tytuł, Grupy, Operacja)</li>
	<li>Wykonaj analizę współwyrażeń za pomocą funkcji 
	> Coexpression_coseq(Data_Directory, Results_Directory, Project_Name, tytuł, element docelowy, Raw_Counts, Color_Group)</li>
	<li>Wykonaj analizę wzbogacania klastrów koekspresji 
	> Wzbogacenie(Results_Directory, Project_Name, Tytuł, Reference_Enrichment, Alpha_Enrichment)</li>
	<li>Wygeneruj dwa pliki dziennika zawierające wszystkie informacje niezbędne do odtworzenia analizy 
	> Save_Parameters( ) 
	UWAGA: Wiersze poleceń używane w tym protokole są pokazane w Rysunek 2. Wiersze, które muszą zostać zmodyfikowane w celu przeanalizowania innego zestawu danych, są wyróżnione.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Yang, I. S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Whole+Transcriptome+Sequencing+Data%3A+Workflow+and+Software%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+%26+Informatics%22%5BJournal%5D)">Analysis of Whole Transcriptome Sequencing Data: Workflow and Software.</a> Genomics & Informatics. 13 (4), 119-125 (2015).</li>
<li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R%3A+A+language+and+environment+for+statistical+computing%5BTitle%5D)+AND+%22R+Foundation+for+Statistical+Computing%22%5BJournal%5D)">R: A language and environment for statistical computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. https://www.R-project.org/ (2020).</li>
<li>Huber, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrating+high-throughput+genomic+analysis+with+Bioconductor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Orchestrating high-throughput genomic analysis with Bioconductor.</a> Nature Methods. 12 (2), 115-121 (2015).</li>
<li>Smith, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+battle+for+user-friendly+bioinformatics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">The battle for user-friendly bioinformatics.</a> Frontiers in Genetics. 4, 187(2013).</li>
<li>Pavelin, K., Cham, J. A., de Matos, P., Brooksbank, C., Cameron, G., Steinbeck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+Meets+User-Centred+Design%3A+A+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics Meets User-Centred Design: A Perspective.</a> PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002554(2012).</li>
<li>Shiny: web application framework. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://rdrr.io/cran/shiny/">https://rdrr.io/cran/shiny/</a> (2021).</li>
<li>RStudio Team. RStudio: Integrated Development for R. RStudio, PBC. , Boston, MA. at (n.d (2020).</li>
<li>Lambert, I., Roux, C. P. -L., Colella, S., Martin-Magniette, M. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiCoExpress%3A+a+tool+to+process+multifactorial+RNAseq+experiments+from+quality+controls+to+co-expression+analysis+through+differential+analysis+based+on+contrasts+inside+GLM+models%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+methods%22%5BJournal%5D)">DiCoExpress: a tool to process multifactorial RNAseq experiments from quality controls to co-expression analysis through differential analysis based on contrasts inside GLM models.</a> Plant methods. 16 (1), 68(2020).</li>
<li>Dillies, M. -A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+evaluation+of+normalization+methods+for+Illumina+high-throughput+RNA+sequencing+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A comprehensive evaluation of normalization methods for Illumina high-throughput RNA sequencing data analysis.</a> Briefings in bioinformatics. 14 (6), 671-683 (2012).</li>
<li>Rigaill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+data+sets+for+the+identification+of+key+ingredients+for+RNA-seq+differential+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Synthetic data sets for the identification of key ingredients for RNA-seq differential analysis.</a> Briefings in Bioinformatics. 19 (1), (2016).</li>
<li>Rau, A., Maugis-Rabusseau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+and+model+choice+for+RNA-seq+co-expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Transformation and model choice for RNA-seq co-expression analysis.</a> Briefings in Bioinformatics. 19 (3), (2017).</li>
<li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((edgeR%3A+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2009).</li>
<li>Wilkinson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FAIR+Guiding+Principles+for+scientific+data+management+and+stewardship%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">The FAIR Guiding Principles for scientific data management and stewardship.</a> Scientific Data. 3 (1), 160018(2016).</li>
<li>Stark, R., Grzelak, M., Hadfield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing%3A+the+teenage+years%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing: the teenage years.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (11), 631-656 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Ponieważ sekwencjonowanie RNA stało się wszechobecną metodą w badaniach biologicznych, istnieje ciągła potrzeba opracowywania wszechstronnych i przyjaznych dla użytkownika narzędzi analitycznych. Krytycznym krokiem w większości procesów analitycznych jest często pewna identyfikacja genów ulegających zróżnicowanej ekspresji w różnych warunkach biologicznych i/lub leczeniu15. Uzyskanie wiarygodnych wyników wymaga odpowiedniego modelowania statystycznego, co było motywacją do opracowania DiCoExpress....

Technologia sekwencjonowania RNA nowej generacji (RNA-Seq) jest teraz złotym standardem analizy transkryptomu1. Od początków tej technologii połączone wysiłki bioinformatyków i biostatystyków zaowocowały opracowaniem licznych metod zajmujących się wszystkimi istotnymi etapami analiz transkryptomicznych, od mapowania po kwantyfikację transkryptu2. Większość narzędzi dostępnych obecnie dla biologów jest opracowywana w środowisku oprogramowania R do obliczeń statystycznych i wykresów3, a wiele pakietów do analizy danych biologicznych jest dostępnych w repozytorium Bioconductor4. Pakiety te oferują pełną kontrolę i dostosowywanie analizy, ale kosztem szerokiego wykorzystania interfejsu wiersza poleceń. Ponieważ wielu biologów czuje się bardziej komfortowo z podejściem "wskaż i kliknij"5, demokratyzacja analiz RNA-Seq wymaga opracowania bardziej przyjaznych dla użytkownika interfejsów lub protokołów6. Na przykład, możliwe jest budowanie interfejsów internetowych pakietów R za pomocą Shiny7, a analiza danych wiersza poleceń jest bardziej intuicyjna dzięki interfejsowi R-studio8. Opracowanie dedykowanych samouczków krok po kroku może również pomóc nowemu użytkownikowi. W szczególności samouczek wideo uzupełnia klasyczny samouczek tekstowy, prowadząc do głębszego zrozumienia wszystkich etapów procedury.
Niedawno opracowaliśmy DiCoExpress9, narzędzie do analizy wieloczynnikowych eksperymentów RNA-Seq w R przy użyciu metod uważanych za najlepsze oparte na neutralnych badaniach porównawczych10,11,12. Zaczynając od tabeli zliczania, DiCoExpress proponuje etap kontroli jakości danych, po którym następuje różnicowa analiza ekspresji genów (edgeR package13) przy użyciu uogólnionego modelu liniowego (GLM) oraz generowanie klastrów koekspresji przy użyciu modeli mieszanin Gaussa (pakiet coseq12). DiCoExpress obsługuje kompletne i niezrównoważone projektowanie do 2 czynników biologicznych (tj. genotypu i leczenia) oraz jednego czynnika technicznego (tj. replikacji). Oryginalność DiCoExpress polega na architekturze katalogów przechowujących i organizujących dane, skrypty i wyniki oraz na automatyzacji zapisu kontrastów, co pozwala użytkownikowi badać wiele pytań w ramach tego samego modelu statystycznego. Dołożono również starań, aby dostarczyć graficzne wyniki ilustrujące wyniki statystyczne.
Przestrzeń robocza DiCoExpress jest dostępna pod adresem https://forgemia.inra.fr/GNet/dicoexpress. Zawiera cztery katalogi, dwa pliki pdf i dwa pliki tekstowe. Katalog Data/ zawiera wejściowe zestawy danych; W przypadku tego protokołu użyjemy zestawu danych "Tutorial". Katalog Sources/ zawiera siedem funkcji R niezbędnych do przeprowadzenia analizy i nie może być modyfikowany przez użytkownika. Analiza jest uruchamiana za pomocą skryptów przechowywanych w katalogu Template_scripts/. Ten używany w tym protokole nazywa się DiCoExpress_Tutorial_JoVE.R i można go łatwo dostosować do dowolnego projektu transkryptomicznego. Wszystkie wyniki są zapisywane w katalogu Results/ i przechowywane w podkatalogu o nazwie zgodnej z projektem. Plik README.md zawiera przydatne informacje dotyczące instalacji, a wszelkie szczegółowe informacje dotyczące metody i jej zastosowania można znaleźć w pliku DiCoExpress_Reference_Manual.pdf.
Ten film instruktażowy prowadzi użytkownika przez różne funkcje DiCoExpress, mając na celu przezwyciężenie niechęci odczuwanej przez biologów korzystających z narzędzi opartych na wierszu poleceń. Przedstawiamy tutaj analizę sztucznego zestawu danych RNA-Seq opisującego ekspresję genów w trzech replikacjach biologicznych czterech genotypów, z leczeniem lub bez. Przejdziemy teraz przez różne etapy przepływu pracy DiCoExpress zilustrowane na rysunku 1. Skrypt opisany w sekcji Protokół oraz pliki wejściowe są dostępne na stronie: https://forgemia.inra.fr/GNet/dicoexpress
Przygotuj pliki danych 
Cztery pliki csv przechowywane w katalogu Data/ powinny być nazwane zgodnie z nazwą projektu. W naszym przykładzie wszystkie nazwy zaczynają się od "Samouczek", a my ustawimy Project_Name = "Samouczek" w kroku 4 protokołu. Separator używany w plikach csv musi być wskazany w zmiennej Sep w kroku 4. W naszym zbiorze danych "samouczka" separatorem jest tabela. W przypadku zaawansowanych użytkowników pełny zestaw danych można zredukować do podzbioru, udostępniając listę instrukcji i nowy Project_Name za pomocą zmiennej Filter. Ta opcja pozwala uniknąć nadmiarowych kopii plików wejściowych i weryfikuje zasady FAIR14.
Spośród czterech plików csv, tylko pliki COUNTS i TARGET są obowiązkowe. Zawierają one surowe liczby dla każdego genu (tutaj Tutorial_COUNTS.csv) oraz opis projektu eksperymentalnego (tutaj Tutorial_TARGET.csv). Plik TARGET.csv opisuje każdą próbkę (jedna próbka w rzędzie) z podaniem modalności dla każdego czynnika biologicznego lub technicznego (w kolumnach). Zdecydowanie zalecamy, aby imiona wybrane dla modalności zaczynały się od litery, a nie cyfry. Nie można zmienić nazwy ostatniej kolumny ("Replikuj"). Na koniec przykładowe nazwy (pierwsza kolumna) muszą być zgodne z nazwami w nagłówkach pliku COUNTS.csv (Genotype1_control_rep1 w naszym przykładzie). Plik Enrichment.csv, w którym każdy wiersz zawiera jeden Gene_ID i jeden termin adnotacji, jest wymagany tylko wtedy, gdy użytkownik planuje uruchomić analizę wzbogacania. Jeśli jeden gen ma kilka adnotacji, będą one musiały być zapisane w różnych liniach. Plik Annotation.csv jest opcjonalny i służy do dodawania krótkiego opisu każdego genu w plikach wyjściowych. Najlepszym sposobem na uzyskanie pliku adnotacji jest pobranie informacji z dedykowanych baz danych (np. Thalemine: https://bar.utoronto.ca/thalemine/begin.do dla Arabidopsis).
Instalacja DiCoExpress 
DiCoExpress wymaga określonych pakietów języka R. Użyj wiersza poleceń source(".. /Sources/Install_Packages.R") w konsoli języka R, aby sprawdzić stan instalacji wymaganego pakietu. Dla użytkowników na Linuksie innym rozwiązaniem jest zainstalowanie kontenera dedykowanego dla DiCoExpress i dostępnego pod adresem https://forgemia.inra.fr/GNet/dicoexpress/container_registry. Z definicji ten kontener zawiera DiCoExpress ze wszystkimi potrzebnymi częściami, takimi jak biblioteki i inne zależności.

analiza wieloczynnikowych eksperymentów sekwencyjnych rna za pomocą dicoexpress

Analyzing Multifactorial RNA-Seq Experiments with DiCoExpress

Właściwe wykorzystanie modelowania statystycznego w analizie danych NGS wymaga zaawansowanego poziomu wiedzy. Ostatnio obserwuje się rosnący konsensus co do stosowania uogólnionych modeli liniowych do analizy różnicowej danych sekwencyjnych RNA-Seq oraz zalety modeli mieszanin do przeprowadzania analizy koekspresji. Aby zaoferować zarządzane środowisko do korzystania z tych podejść do modelowania, opracowaliśmy DiCoExpress, który zapewnia ustandaryzowany potok języka R do przeprowadzania analizy sekwencyjnej RNA. Bez szczególnej wiedzy ze strony statystyk lub programowania w języku R, początkujący mogą przeprowadzić pełną analizę sekwencyjną RNA, od kontroli jakości po koekspresję poprzez analizę różnicową opartą na kontrastach wewnątrz uogólnionego modelu liniowego. Proponuje się analizę wzbogacenia zarówno w odniesieniu do wykazów genów o zróżnicowanej ekspresji, jak i klastrów genów o współekspresji. Ten samouczek wideo został pomyślany jako protokół krok po kroku, który ma pomóc użytkownikom w pełni wykorzystać DiCoExpress i jego potencjał w zakresie wzmacniania biologicznej interpretacji eksperymentu RNA-Seq.

Wszystkie wyniki generowane przez DiCoExpress są zapisywane w katalogu Tutorial/, który z kolei znajduje się w katalogu Results/. Poniżej przedstawiamy wskazówki dotyczące oceny ogólnej jakości przeprowadzonej analizy.
Kontrola jakości 
Wyniki kontroli jakości, znajdujące się w katalogu Quality_Control/, są niezbędne do zweryfikowania wiarygodności wyników analizy RNA-Seq. Plik Data_Quality_Control.pdf zawiera kilka wykresów sporządzonych na podstawie danych surowych i zn...

DiCoExpress to narzędzie oparte na skryptach zaimplementowane w R do przeprowadzania analizy sekwencyjnej RNA, od kontroli jakości do koekspresji. DiCoExpress obsługuje kompletną i niezrównoważoną konstrukcję do 2 czynników biologicznych. Ten samouczek wideo prowadzi użytkownika przez różne funkcje DiCoExpress.

Analiza wieloczynnikowych eksperymentów sekwencyjnych RNA za pomocą DiCoExpress

The proper use of statistical modeling in NGS data analysis requires an advanced level of expertise. There has recently been a growing consensus on using ...

DiCoExpress zapewnia kompletną analizę aorystyczną od kontroli jakości do koekspresji. Przeprowadza analizę różnicową na podstawie kontrastów wewnątrz uogólnionego modelu liniowego. Co więcej, może również przeprowadzić analizę wzbogacenia listy genów o zróżnicowanej ekspresji i klastrów genów o współekspresji.Główną zaletą DiCoExpress jest to, że mogą z niego korzystać osoby takie jak ja, bez szczególnej wiedzy ze statystyki czy programowania lotniczego. To naprawdę pomaga użytkownikowi niebędącemu specjalistą w napisaniu kontrastu niezbędnego do różnicowej analizy ekspresji genów. Zapewnia również graficzne wyniki ilustrujące wyniki gotowe do publikacji.DiCoExpress nie jest narzędziem dedykowanym do planów. Może być stosowany w odniesieniu do każdego organizmu, o ile projekt eksperymentalny jest kompletny z maksymalnie dwoma czynnikami biologicznymi. Co więcej, możliwa jest również konstrukcja membrany z nierówną liczbą powtórzeń między warunkami.Początkujący powinien mieć wstępną wiedzę w R. Powinieneś wiedzieć, jak korzystać z funkcji i identyfikować wymagane i opcjonalne argumenty. Następnie krytycznym krokiem jest poprawne dostarczenie plików zawierających i projekt eksperymentalny. Aby rozpocząć, otwórz sesję R studio.Ustaw katalog na skrypty szablonów i otwórz skrypt DiCoExpress tutorial dot R. Załaduj funkcje DiCoExpress w sesji języka R. Następnie załaduj pliki danych w sesji języka R i podziel pliki danych obiektowych na kilka obiektów w celu łatwego manipulowania plikami.Następnie wybierz strategię spośród warunków NB lub replikatów NB i progu filtrowania genów o niskiej ekspresji. Określ kolory grupy i wybierz metodę normalizacji. Następnie przeprowadź kontrolę jakości.Jeśli dane są sparowane zgodnie z czynnikiem replikacji, stan replikuje się jako prawda, w przeciwnym razie stan jest fałszywy. Przypisz interakcję jako prawdziwą, aby rozważyć interakcję między dwoma czynnikami biologicznymi. W przeciwnym razie przypisz wartość false, a następnie określ model statystyczny i zdefiniuj próg współczynnika fałszywych odnajdywań.Przeprowadzić analizę różnicową, a następnie ustalić próg dla analizy wzbogacenia i przeprowadzić analizę wzbogacenia list genów o zróżnicowanej ekspresji. Wybierz listy stopni szczegółowości do porównania. Podaj nazwę porównania listy i użyj tej samej nazwy dla katalogu, w którym zostaną zapisane pliki wyjściowe.Ustaw operację parametru na union lub intercin, aby określić akcję, która ma zostać wykonana na listach DEG i porównaj listy. Przeprowadź analizę koekspresji, a następnie przeprowadź analizę wzbogacenia klastrów koekspresji. Na koniec wygeneruj dwa pliki dziennika zawierające wszystkie informacje niezbędne do odtworzenia analizy.Całkowita znormalizowana liczba próbek powinna być podobna, gdy porównuje się zarówno warunki wewnętrzne, jak i pośrednie. Znormalizowana liczba ekspresji genów wykazywała podobną medianę i wariancję, zarówno w warunkach wewnętrznych, jak i pośrednich. W celu zidentyfikowania potencjalnych struktur danych bazowych wygenerowano wykresy PCA.Zaobserwowano wyraźne rozróżnienie między terapiami i brak było grupowania, co wskazuje na dobrą jakość zestawu danych. Surowe histogramy pvalue zostały wykreślone w celu oceny jakości modelowania. Rozkład surowych wartości p-line był jednolity, z wartością szczytową po lewej stronie rozkładu, zgodnie z oczekiwaniami.Brak piku po prawej stronie końcowej wskazuje, że modelowanie statystyczne wydaje się poprawne. Przedstawiono profil ekspresji genu CIG62301.1, w każdym genotypie i stanie. Oprócz liczby genów o zróżnicowanej ekspresji w górę i w dół, wykreślono również dla każdego badanego kontrastu.Analizę koekspresji przeprowadzono na unii pięciu list DEG. Zidentyfikowany przez kontrast, szukając zmienności odpowiedzi na leczenie między genotypem pierwszym lub drugim w porównaniu z innymi. Geny o koekspresji dla każdego zidentyfikowanego klastra wydrukowano w indywidualnych plikach tekstowych i wykreślono profil ekspresji genów.Dzięki DiCoExpress biolodzy uzyskają analizę ekspresji genów, która jest statystycznie poprawna. Następnym krokiem jest nadanie tym wynikom sensu biologicznego.

analyzing-multifactorial-rna-seq-experiments-with-dicoexpress

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne zostały wykorzystane do identyfikacji znacząco i różnicowo wyrażonych czynników transkrypcyjnych w subpopulacjach Lin-CD34+ i Lin-CD34- mysich komórek EML. Te czynniki transkrypcyjne mogą odgrywać ważną rolę w określaniu przełączania między samoodnawiającymi się komórkami Lin-CD34 + a częściowo zróżnicowanymi komórkami Lin-CD34.

Identyfikacja kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie w hematopoetycznych komórkach prekursorowych EML za pomocą analizy sekwencjonowania RNA

Ten protokół przedstawia porównawczy proces tworzenia transkryptomu i adnotacji de novo dla początkujących bioinformatyków. Przepływ pracy jest dostępny bezpłatnie całkowicie za pośrednictwem CyVerse i połączony przez magazyn danych. Używany jest wiersz poleceń i graficzne interfejsy użytkownika, ale cały potrzebny kod jest dostępny do skopiowania i wklejenia.

Wykorzystanie zasobów CyVerse do transkryptomiki porównawczej de novo organizmów nieobjętych modelem

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Przedstawiona tutaj jest stopniowa procedura różnicowania in vitro ludzkich pierwotnych keratynocytów poprzez hamowanie kontaktu, a następnie charakterystykę na poziomie molekularnym za pomocą analizy sekwencyjnej RNA.

Charakterystyka różnicowania in vitro ludzkich keratynocytów pierwotnych za pomocą analizy RNA-Seq

Ta metoda opisuje kroki mające na celu poprawę jakości i ilości danych sekwencyjnych, które można uzyskać z próbek RNA zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie. Opisujemy metodologię dokładniejszej oceny jakości próbek FFPE-RNA, przygotowania bibliotek sekwencjonowania i analizy danych z próbek FFPE-RNA.

Optymalizacja sekwencjonowania i analizy zdegradowanych próbek FFPE-RNA

Domeny wewnętrznie nieuporządkowane są ważne dla funkcji czynnika transkrypcyjnego fuzji onkogennej. Aby terapeutycznie ukierunkować te białka, konieczne jest bardziej szczegółowe zrozumienie mechanizmów regulacyjnych stosowanych przez te domeny. Tutaj używamy transkryptomiki do mapowania ważnych cech strukturalnych wewnętrznie nieuporządkowanej domeny EWS w mięsaku Ewinga.

Mapowanie zależności struktura-funkcja zaburzonych onkogennych czynników transkrypcyjnych za pomocą analizy transkryptomicznej

Dostarczono szczegółowy protokół metod analizy różnicowej ekspresji dla sekwencjonowania RNA: limma, EdgeR, DESeq2.

Trzy metody analizy różnicowej ekspresji do sekwencjonowania RNA: limma, EdgeR, DESeq2

Alternatywny splicing (AS) i alternatywna poliadenylacja (APA) rozszerzają różnorodność izoform transkryptu i ich produktów. W tym miejscu opisujemy protokoły bioinformatyczne do analizy masowych testów sekwencjonowania RNA i sekwencjonowania końca 3' w celu wykrycia i wizualizacji AS i APA różniących się w różnych warunkach eksperymentalnych.

Identyfikacja alternatywnego splicingu i poliadenylacji w danych sekwencyjnych RNA

Obecne prace opisują protokół uruchamiania algorytmu Pathway2Targetes, skryptu R, który przewiduje i priorytetowo nadaje cele terapeutyczne na podstawie profilu szlaków sygnalizacji wewnątrzkomórkowej generowanej przez porównanie próbek przypadków i kontrolnych z eksperymentu sekwencjonowania RNA w masowym składzie.

Wykorzystanie list genów wyrażanych różnicowo ekspresyjnie u człowieka do analizy wzbogacania szlaków w dalszej części i priorytetyzacji celów

Protokół ten umożliwia początkową kontrolę jakości eksperymentów RNA-seq dla biologów laboratoryjnych z ograniczonym doświadczeniem w bioinformatyce.

Rup (RNA-seq Benchmark Assessment Pipeline) – Kontrola jakości eksperymentów masowych RNA-seq u eukariontów

Poznaj narzędzie DiCoExpress do analizy RNA-Seq w języku R, od kontroli jakości po koekspresję. Umożliwia analizę różnicową i wzbogacenia bez zaawansowanej wiedzy statystycznej.

Analiza wieloczynnikowych eksperymentów sekwencyjnych RNA za pomocą DiCoExpress

Przeglądaj więcej filmów