Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej
7 marca 2018
Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest wyznaczenie głównych warstw regulacji RNA i DNA w celu odkrycia podstawowych mechanizmów molekularnych występujących w odpowiedzi na bodziec lub leczenie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w wielu różnych dziedzinach biologii, takich jak ogólne reakcje immunologiczne, ale także odpowiedzi molekularne na leczenie farmakologiczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona jednoczesne wyświetlanie wielu warstw regulacji genów w czasie.
Dlatego ważne jest, aby używać tej samej puli komórek dla każdej metody. Ogólnie rzecz biorąc, te trzy protokoły polegają najpierw na manipulowaniu interesującymi komórkami w różnych punktach czasowych. Po każdej manipulacji komórki są łączone i dzielone na trzy grupy, po jednej dla każdego testu.
Ta część filmu opisuje etykietowanie i oczyszczanie ostatnio wytworzonych transkryptów przy użyciu etykietowania 4sU. Każdy protokół ostatecznie wytwarza próbki gotowe do sekwencjonowania. Najpierw sprawdź wymagane stężenie 4sU i czas inkubacji potrzebny dla interesującej nas linii komórkowej.
Na przykład 200 mikromolowych 4sU stosuje się na limfocytach T przez jedną godzinę. Oddziel pulę komórek po leczeniu do jednego osobnego naczynia dla każdej metody i punktu czasowego. Następnie całkowicie rozmrozić wymaganą liczbę podwielokrotności 4sU i dodać 4sU bezpośrednio do pożywki komórkowej i inkubować kultury zgodnie z zaleceniami.
Następnie zbierz komórki oznaczone 4sU w probówkach polipropylenowych. Następnie odwiruj komórki. Ponownie zawiesić osad w TRIzolu w ilości około trzech milionów komórek na mililitr i inkubować komórki w TRIzolu w temperaturze pokojowej przez pięć minut.
Teraz przygotuj od 30 do 80 mikrogramów RNA lub więcej, korzystając z metody Radle i spółki. Następnie wymieszaj reakcję biotynylacji specyficzną dla tiolu w tej kolejności. Zacznij od wody wolnej od nukleaz, następnie 10-krotnego buforu, następnie RNA, a na końcu biotyny-HPDP.
Następnie wymieszać pipetując i inkubować. Kontynuuj etap oczyszczania, aby wyprodukować próbki nowo transkrybowanego biotynylowanego RNA zmieszanego z nieznakowanym, wcześniej istniejącym RNA. Następnie podgrzewaj próbki do 65 stopni Celsjusza przez 10 minut.
Następnie natychmiast umieść je na lodzie. Gdy każda próbka ostygnie, dodaj 100 mikrolitrów kulek streptawidyny i inkubuj je w temperaturze pokojowej z rotacją przez 15 minut. Teraz wyizoluj koraliki ozdobione nowo transkrybowanym RNA za pomocą kolumny magnetycznej, a następnie wymyj RNA w 11 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz w celu sekwencji.
W tej sekcji opisano, jak wyizolować RNA, które jest aktywnie translowane. Sekwencjonowanie tych transkryptów bada dynamiczny translatosom. W połączeniu z danymi z sekwencjonowania RNA, test ten pozwala na obliczenie rotacji RNA i szybkości translacji.
Zacznij od dodania cykloheksymidu do zawiesiny i wymieszania go za pomocą inwersji. Po jednej minucie w temperaturze pokojowej odwirować komórki, usunąć pożywkę i umyć komórki co najmniej 10 mililitrami PBS uzupełnionymi cykloheksymidem. Następnie odessaj pożywkę i zastąp ją 100 mikrolitrami buforu do lizy komórek ssaków na 10 milionów komórek.
Rozetrzeć mieszaninę w celu lizy komórek za pomocą igły o rozmiarze od 20 do 25. Następnie przenieś lizat komórkowy do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,50 mililitra i inkubuj lizat na lodzie przez 10 minut z okresowymi inwersjami. Po 10 minutach odwirować lizat i przenieść supernatant do chłodnej, 1,5-mililitrowej probówki.
Następnie przygotuj rozcieńczenie lizatu od 1 do 10 w wodzie wolnej od nukleaz i zmierz absorbancję przy 260 nanometrach. Następnie utwórz 200-mikrolitrowe podwielokrotności nierozcieńczonego lizatu i potraktuj każdą z nich 7,5 jednostki nukleazy na każdą jednostkę absorbancji. Pozwól nukleazie reagować przez 45 minut, a następnie zakończ reakcję za pomocą 15 mikrolitrów inhibitora RNazy lub przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Następnie oczyść RNA RPF za pomocą komercyjnego zestawu, a następnie zubożenie rRNA, również za pomocą zestawu. Następnie wykonaj oczyszczanie PAGE na 500 nanogramach wyizolowanego RNA RPF. Po przygotowaniu próbek do załadowania do żelu, należy je zdenaturować, ten ostatni i kontrolę, w pięciominutowej inkubacji w temperaturze 95 stopni Celsjusza.
Następnie badaj próbki pod napięciem 180 woltów przez około 75 minut i oceń wyniki. W przypadku kolekcji plasterków żelu przebij otwory na dnie 0,5-mililitrowej tubki za pomocą sterylnej igły o rozmiarze 20. Następnie należy wyciąć plastry żelu akcyzowego odpowiadające regionowi nukleotydów zasadowych od 28 do 30 i przenieść je do przygotowanych probówek o pojemności 0,5 mililitra.
Dołączyć próbkę kontrolnego RNA i próbkę kontroli ujemnej w celu sprawdzenia pod kątem zanieczyszczenia. Następnie załaduj małe, zakryte probówki na próbki do większych probówek do mikrowirówek. Następnie odwiruj zespoły, aby rozdrobnić żel i przenieś próbkę do probówki o pojemności 1,5 mililitra.
Następnie dodaj wodę, octan amonu i SDS do probówek z próbkami, aby wymyć RNA w nocnej reakcji w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie użyj komercyjnego zestawu, aby utworzyć bibliotekę cDNA z małego RNA i przystąp do sekwencjonowania biblioteki cDNA. ChIP-seq służy do mapowania wiązania czynnika transkrypcyjnego będącego przedmiotem zainteresowania w całym genomie.
W połączeniu z danymi z profilowania rybosomów i badania wszystkich nowych transkryptów, ChIP-seq ujawnia rzeczywisty wpływ wiązania czynnika transkrypcyjnego. Na początek usieciuj próbki komórek za pomocą formaldehydu do końcowego stężenia 1%Po 10 minutach w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem zatrzymaj reakcję, podnosząc stężenie glicyny do 0,125 mola. Następnie zbierz komórki i umyj je trzykrotnie lodowatym PBS i zamroź osad komórek w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Później ponownie zawieś osad komórkowy w jednym mililitrze lodowatego buforu do lizy komórek ze świeżo dodanymi inhibitorami proteazy i inkubuj komórki na lodzie przez 10 minut. Po 10 minutach odwirować komórki, odessać supernatant i powtórzyć dodawanie buforu do lizy i inkubację. Następnie użyj sonikacji, aby wygenerować ściętą chromatynę między 200 a 1 000 par zasad.
Następnie sprzęgnij chromatynę z kulkami magnetycznymi pokrytymi przeciwciałami i eluuj kompleksy białko-DNA w 50 mikrolitrach buforu elucyjnego. Następnie dodaj pięć mikrolitrów 40% RNazy i buforu elucyjnego i inkubuj próbkę przez 30 minut. Następnie dodaj jedną jednostkę proteinazy K i 20 mikrogramów glikogenu do próbki i inkubuj ją przez dwie godziny.
Następnie przenieś próbkę do 65 stopni Celsjusza na noc, aby ją odwrócić sieciowanie. Następnego dnia umieść próbkę na magnesie na co najmniej 30 sekund, a następnie zbierz supernatant, który zawiera interesujące nas DNA. Następnie oczyść DNA, użyj ilościowego PCR do weryfikacji i zsekwencjonuj DNA.
Znakowanie 4sU może stresować komórki i prowadzić do apoptozy. Barwienie aneksyną V i 7-AAD zastosowano do identyfikacji komórek apoptotycznych i martwych. Po znakowaniu komórek Th1 za pomocą 4sU przy użyciu 30 lub 60-minutowych zabiegów, komórki nie umierały ani nie ulegały apoptozie.
Integralność RNA była zawsze sprawdzana przed sekwencjonowaniem przy użyciu standardowego testu, ponieważ ma to ogromne znaczenie podczas przetwarzania RNA. Amplifikowane biblioteki miały zdrowy zakres nukleotydów. Nadmiar dimerów adapterowych wymagał dalszego oczyszczenia przez PAGE.
Zbyt duża matryca lub zbyt wiele cykli skutkuje ciężkimi nukleotydami, rozmazanymi produktami i produktami dimerów adapterowych Stwierdzono, że ścinanie chromatyny działa najlepiej, gdy główna frakcja ściętej chromatyny wynosi około 1,000 par zasad lub nieco mniej. Ilościowy PCR zastosowano do zbadania możliwości zastosowania przeciwciała do sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny. Startery kontroli ujemnej są przeznaczone dla genów, które nie ulegają ekspresji w komórkach będących przedmiotem zainteresowania.
Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby pamiętać o sporządzeniu szczegółowego planu konfiguracji eksperymentalnej, w tym harmonogramu czasu, kiedy dodać 4sU i kiedy zebrać komórki dla każdej metody. Zawsze sprawdzaj optymalne warunki znakowania 4sU, testując z wyprzedzeniem wpływ 4sU na żywotność komórek i reakcję na stres. Podsumowując, takie podejście pozwala nam zobrazować wszystkie zdarzenia regulacji genów, które mogą wystąpić podczas procesu aktywacji komórkowej.
Metoda ta może być również stosowana w przypadku pierwotnych komórek odpornościowych i ich odpowiedzi na bodźce lub leki.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje kombinacyjne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq oraz profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia on śledzenie zmian w wiązaniu czynników transkrypcyjnych, transkrypcji de novo, procesowaniu RNA, obrocie RNA i translacji w czasie, a także przedstawienie ogólnego przebiegu zdarzeń w komórkach aktywowanych i/lub szybko zmieniających się.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biologia molekularna
Wstęp
- Ta metoda pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytania w różnych dziedzinach biologii.
- Umożliwia ona jednoczesną prezentację wielu warstw regulacji genów w czasie.
- Użycie tej samej puli komórek dla każdej metody jest kluczowe dla uzyskania dokładnych wyników.
- Protokoły obejmują manipulowanie komórkami w różnych punktach czasowych.
Cel badania
- Określenie głównych warstw regulacji RNA i DNA.
- Ujawnienie głównych mechanizmów molekularnych w odpowiedzi na bodźce lub terapie.
- Analiza odpowiedzi immunologicznych i odpowiedzi molekularnych na leczenie farmakologiczne.
Zastosowane metody
- Znakowanie 4sU w celu izolacji nowo syntetyzowanego RNA.
- Profilowanie rybosomów w celu analizy dynamicznego translatosomu.
- ChIP-seq do mapowania wiązania czynników transkrypcyjnych w całym genomie.
- Sekwencjonowanie próbek RNA w celu analizy regulacji genów.
Główne wyniki
- Symultaniczna analiza wiązania czynników transkrypcyjnych i dynamiki RNA.
- Wgląd w tempo obrotu RNA i tempo translacji.
- Ujawnienie wpływu wiązania czynników transkrypcyjnych na ekspresję genów.
- Zapewnienie kompleksowego obrazu odpowiedzi komórkowych na bodźce.
Wnioski
- Zintegrowane podejście pogłębia zrozumienie regulacji genów.
- Stanowi ono potężne narzędzie do badania odpowiedzi komórkowych w różnych kontekstach.
- Przyszłe zastosowania mogą objąć inne dziedziny biologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Symultaniczna analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji oraz obrotu RNA zapewnia kompleksowy wgląd w dynamikę regulacji genów podczas aktywacji komórkowej. To zintegrowane podejście zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów i ograniczaniu ryzyka mechanistycznego w krytycznych punktach zwrotnych procesu odkrywania leków. Metoda ta wspiera badania i rozwój (R&D) w przedsiębiorstwach, umożliwiając solidne, wielowarstwowe profilowanie molekularne w odpowiedzi na bodźce lub ekspozycję na lek.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę wiązania czynników transkrypcyjnych oraz zdarzeń regulacji genów w dół szlaku.
- Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie zmian transkrypcyjnych z funkcjonalną syntezą białek.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celu poprzez genomowe, rozdzielone w czasie profilowanie molekularne.
- Zwiększa pewność predykcyjną przy selekcji portfolio dzięki integracji wielu warstw regulacyjnych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszego screeningu związków poprzez kwantyfikację odpowiedzi transkrypcyjnych i translacyjnych.
- Standaryzuje wyniki testów dzięki powtarzalnym, ilościowym danym sekwencjonowania na różnych poziomach regulacji.
- Umożliwia skalowalną, wysokoprzepustową analizę ekspresji genów i translacji w celu przygotowania do screeningu.
- Wspiera niezawodną ocenę wpływu związków na regulację genów i syntezę białek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje odczyty molekularne z modelami aktywacji komórkowej i odpowiedzi na leki istotnymi dla danej choroby.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej poprzez monitorowanie zdarzeń regulacji genów w czasie.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektów z uwzględnieniem analizy ryzyka, dostarczając kompleksowych danych molekularnych.
- Usprawnia predykcyjne ograniczanie ryzyka w rozwoju biomarkerów translacyjnych, gdy jest to poparte danymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten kombinatoryjny proces sekwencjonowania łączy wczesną fazę odkryć, identyfikację związków wiodących oraz badania przedkliniczne, umożliwiając wielowarstwową analizę molekularną w czasie rzeczywistym w ramach jednego kontinuum eksperymentalnego.
- Biologia odkrywcza: Integruje testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez mapowanie wiązania czynników transkrypcyjnych oraz efektów downstream.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki do rozwoju testów i oceny związków chemicznych.
- Analityka: Zapewnia pomiary transkrypcji, translacji i obrotu RNA o wysokiej rozdzielczości do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Łączy zdarzenia molekularne z odpowiedziami komórkowymi istotnymi dla przebiegu chorób oraz z mechanizmami działania leków.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do profilowania multiomicznego w różnych typach komórek i pod wpływem różnych bodźców.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje wielowarstwowe testy molekularne w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) oraz efektywne zarządzanie portfelem kapitałowym.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój programów odkrywczych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu biologii molekularnej, sekwencjonowania oraz analizy bioinformatycznej.
- Wymaga dostępu do platform sekwencjonowania wysokoprzepustowego oraz infrastruktury analitycznej.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja przygotowania próbek i przetwarzania danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest adaptowalna do różnych systemów modelowych, w tym pierwotnych kultur komórkowych i różnych organizmów.
- Potencjalne ograniczenia obejmują stres komórkowy wywołany znakowaniem oraz konieczność starannego kontrolowania żywotności i jakości próbek.
