Name: Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Poznaj metodę analizy w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji i translacji w komórkach aktywowanych. Technika łączy ChIP-seq, 4sU-seq i ribosome profiling dla kompleksowego obrazu regulacji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Larsowi Dölkenowi za radę dotyczącą ustanowienia znakowania 4sU dla pierwotnych limfocytów T; Elisabeth Graf i Thomasowi Schwarzmayrowi za krytyczną pomoc w tworzeniu bibliotek i sekwencjonowaniu; Dirk Eick i Andrew Flatley za dostarczenie przeciwciał przeciwko RNAPII i limfocytom T; N. Henriette Uhlenhaut i Franzisce Greulich za pomoc w przygotowaniu biblioteki do ChIP-seq; Caroline C. Friedel otrzymała wsparcie w postaci grantów FR2938/7-1 i CRC 1123 (Z2) od Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG); Elke Glasmacher otrzymała wsparcie w postaci grantu GL 870/1-1 od Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) i Niemieckiego Centrum Badań nad Diabetologią (DZD), Helmholtz Zentrum München.

<ol><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat Methods. 5 (7), 621-628 (2008).</li>
<li>Chavez, S., Garcia-Martinez, J., Delgado-Ramos, L., Perez-Ortin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+controlling+mRNA+turnover+during+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">The importance of controlling mRNA turnover during cell proliferation.</a> Curr Genet. 62 (4), 701-710 (2016).</li>
<li>Rutkowski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+disruption+of+host+transcription+termination+in+HSV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Widespread disruption of host transcription termination in HSV-1 infection.</a> Nat Commun. 6, 7126(2015).</li>
<li>Ozsolak, F., Milos, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing%3A+advances%2C+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing: advances, challenges and opportunities.</a> Nat Rev Genet. 12 (2), 87-98 (2011).</li>
<li>Carninci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mammalian+promoter+architecture+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mammalian promoter architecture and evolution.</a> Nat Genet. 38 (6), 626-635 (2006).</li>
<li>Churchman, L. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+transcript+sequencing+visualizes+transcription+at+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution.</a> Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).</li>
<li>Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+RNA+sequencing+reveals+widespread+pausing+and+divergent+initiation+at+human+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters.</a> Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).</li>
<li>Hah, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+extensive%2C+and+transient+transcriptional+response+to+estrogen+signaling+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells.</a> Cell. 145 (4), 622-634 (2011).</li>
<li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).</li>
<li>Paulsen, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Bru-Seq+and+BruChase-Seq+for+genome-wide+assessment+of+the+synthesis+and+stability+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA.</a> Methods. 67 (1), 45-54 (2014).</li>
<li>Davari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Genome-wide+Recruitment+of+RNA+Polymerase+II+Drives+Transcription%2C+Splicing%2C+and+Translation+Events+during+T+Cell+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Rapid Genome-wide Recruitment of RNA Polymerase II Drives Transcription, Splicing, and Translation Events during T Cell Responses.</a> Cell Rep. 19 (3), 643-654 (2017).</li>
<li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Res. 22 (10), 2031-2042 (2012).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Blecher-Gonen, R., Barnett-Itzhaki, Z., Jaitin, D., Amann-Zalcenstein, D., Lara-Astiaso, D., Amit, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+chromatin+immunoprecipitation+for+genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+and+epigenomic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states.</a> Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).</li>
<li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (1), a012302(2013).</li>
<li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+reveals+the+what%2C+when%2C+where+and+how+of+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li>
<li>Radle, B., Rutkowski, A. J., Ruzsics, Z., Friedel, C. C., Koszinowski, U. H., Dolken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+newly+transcribed+RNA+for+high+resolution+gene+expression+profiling+of+RNA+synthesis%2C+processing+and+decay+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet.journal%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Bonfert, T., Kirner, E., Csaba, G., Zimmer, R., Friedel, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ContextMap+2%3A+fast+and+accurate+context-based+RNA-seq+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ContextMap 2: fast and accurate context-based RNA-seq mapping.</a> BMC Bioinformatics. 16, 122(2015).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+long-read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).</li>
<li>Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((featureCounts%3A+an+efficient+general+purpose+program+for+assigning+sequence+reads+to+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.</a> Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+genome+wide+binding+event+finding+and+motif+discovery+reveals+transcription+factor+spatial+binding+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints.</a> PLoS Comput Biol. 8 (8), e1002638(2012).</li>
<li>Team, R. D. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTeam%2C+RDC+%22R%3A+A+Language+and+Environment+for+Statistical+Computing%22">R: A Language and Environment for Statistical Computing</a>. , the R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2016).</li>
<li>Huber, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrating+high-throughput+genomic+analysis+with+Bioconductor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Orchestrating high-throughput genomic analysis with Bioconductor.</a> Nature Methods. 12 (2), 115-121 (2015).</li>
<li>Eisenberg, E., Levanon, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+housekeeping+genes%2C+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Human housekeeping genes, revisited.</a> Trends Genet. 29 (10), 569-574 (2013).</li>
<li>Friedel, C. C., Dolken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+tagging+and+purification+of+nascent+RNA%3A+implications+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics.</a> Mol Biosyst. 5 (11), 1271-1278 (2009).</li>
<li>Burger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-thiouridine+inhibits+rRNA+synthesis+and+causes+a+nucleolar+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response.</a> RNA Biol. 10 (10), 1623-1630 (2013).</li>
<li>Duffy, E. E., Rutenberg-Schoenberg, M., Stark, C. D., Kitchen, R. R., Gerstein, M. B., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Distinct+RNA+Populations+Using+Efficient+and+Reversible+Covalent+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry.</a> Mol Cell. 59 (5), 858-866 (2015).</li>
<li>Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+amplification+on+differential+expression+analyses+by+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq.</a> Sci Rep. 6, 25533(2016).</li>
<li>Baudrimont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+gene+control+reveals+rapid+mRNA+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Multiplexed gene control reveals rapid mRNA turnover.</a> Sci Adv. 3 (7), e1700006(2017).</li>
<li>Rabani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+RNA+uncovers+principles+of+RNA+production+and+degradation+dynamics+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).</li>
<li>Schlackow, M., Nojima, T., Gomes, T., Dhir, A., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+Patterns+of+Transcription+and+RNA+Processing+for+Human+lincRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinctive Patterns of Transcription and RNA Processing for Human lincRNAs.</a> Mol Cell. 65 (1), 25-38 (2017).</li>
<li>Mukherjee, N., Calviello, L., Hirsekorn, A., de Pretis, S., Pelizzola, M., Ohler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+classification+of+human+coding+and+noncoding+genes+through+RNA+metabolism+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrative classification of human coding and noncoding genes through RNA metabolism profiles.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (1), 86-96 (2017).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Analiza całego procesu regulacji genów jest konieczna, aby w pełni zrozumieć adaptacje komórkowe w odpowiedzi na określony bodziec lub leczenie. Połączenie całkowitego sekwencjonowania RNA, sekwencji 4sU, profilowania rybosomów i sekwencjonowania ChIP-w różnych punktach czasowych prowadzi do kompleksowej analizy głównych procesów regulacji genów w czasie. Dogłębne zrozumienie procesów biologicznych jest wymagane do zdefiniowania konfiguracji eksperymentu, a także optymalnych punktów czasowych.
Ponieważ metody badania regulacji genów szybko się poprawiają, protokoły te można dostosować do szybkich zmian. Niemniej jednak dostarczają one najważniejszych metod badania podstawowych mechanizmów regulacji genów w każdym typie komórki. Tutaj omawiamy niektóre pułapki i fakty, które należy wziąć pod uwagę podczas korzystania z tych metod.
Komórek: Komórki muszą być wysoce żywotne, a w przypadku stosowania pierwotnych izolowanych komórek musi być zagwarantowana czystość populacji komórek (np. analiza FACS dla pierwotnych limfocytów T). Nawet lekko zestresowane komórki mogą wpływać na wyniki tych bardzo czułych metod sekwencjonowania i zmniejszać ilość nowo transkrybowanego lub translowanego RNA, a także prowadzić do niepożądanych odczytów reakcji na stres w wynikach sekwencjonowania. Prędkość wirowania wspomniana w tym protokole do komórek osadzających jest zoptymalizowana dla pierwotnych limfocytów T. W ten sposób dostosuj prędkość do typu komórki.
Wpływ 4sU na fizjologię komórki: Oprócz wyżej wymienionych opcji weryfikacji minimalnych zaburzeń fizjologii komórkowej po dodaniu 4sU, można przeprowadzić dalszą i/lub dodatkową analizę, zwłaszcza gdy liczba komórek jest ograniczona. Wpływ na proliferację komórek można przetestować, weryfikując czas podwajania komórek, po prostu licząc komórki znakowane i nieznakowane. Indukcję stresu jąderkowego można również przetestować, analizując morfologię komórek za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego nukleoliny i jąder. Aby dokładniej zweryfikować wpływ 4sU, zmienioną globalną ekspresję genów można zmierzyć poprzez korelację liczby odczytów z znakowanego całkowitego RNA do nieznakowanego całkowitego RNA.
Numery komórek: W przypadku limfocytów T wytwarzanych in vitro zalecamy rozpoczęcie od co najmniej liczby komórek wskazanej w Tabeli 2. Wybierz odpowiednie liczby dla każdej metody w zależności od typu komórek. Ponieważ limfocyty T mają mniej cytoplazmy i RNA w porównaniu z innymi komórkami, najprawdopodobniej wystarczająca będzie mniejsza ilość innych komórek. W przypadku ChIP-seq liczba komórek w dużym stopniu zależy od użytego przeciwciała i poziomu ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania w komórkach. W przypadku histonów lub RNAPII ChIP można użyć komórek fewe, podczas gdy liczba komórek musi zostać zwiększona, gdy stosowane są czynniki transkrypcyjne, zwłaszcza jeśli ulegają one ekspresji na niskich poziomach.
Znakowanie 4 sU i biotynylacja RNA: W przypadku stosowania komórek adherentnych, znakowanie 4sU można kierować zgodnie z opisem Rädle i wsp. 19 Ponieważ komórki bardzo szybko zawierają 4sU, można go dodać bezpośrednio do podłoża komórek zawiesinowych, adherentnych lub częściowo przylegających.
Zaleca się rozpoczęcie biotynylacji od 60 - 80 μg RNA. Niemniej jednak można stosować mniejsze ilości RNA, chociaż nie testowaliśmy mniej niż 30 μg. Dodać współprecypitent (np. GlycoBlue) podczas wytrącania RNA, jeśli osadek jest trudny do zobaczenia. Duffy i wsp. wykazali również, że biotyna aktywowana metylotiosulfonianem (biotyna MTS) skuteczniej reaguje z RNA znakowanym 4sU niż HPDP-biotyna31. W związku z tym warto rozważyć przejście na MTS-biotynę, w szczególności w celu odzyskania małych RNA, które mają tendencję do zawierania mniejszej ilości reszt urydyny (patrz protokół biotynylacji wspomniany przez Duffy'ego i wsp.; patrz Oczyszczanie RNA znakowanego 4sU, Procedury eksperymentalne).
Do odzyskania nowo przepisanego RNA możliwe jest użycie kulek paramagnetycznych lub kulek RNA Cleanup według własnego uznania. Zawsze bierz pod uwagę, że te zestawy mogą, ale nie muszą, oczyszczać się pod kątem określonych RNA. Na przykład, jeśli interesują Cię miRNA, rozważ użycie specjalnych zestawów do wychwytywania i sekwencjonowania miRNA.
Kwantyfikacja nowo transkrybowanego RNA: Aby dokładnie określić ilościowo nowo transkrybowane RNA, pomiar należy wykonać za pomocą odpowiedniego fluorometru (patrz Tabela materiałów). W ciągu 1 godziny od ekspozycji na 4sU nowo transkrybowane RNA stanowi około 1 - 4% całkowitego RNA. Nowo transkrybowane RNA znakowane 1 h, aktywowane limfocyty T składają się z ~90 - 94% rRNA11.
Profilowanie rybosomów: Opracowując metodę, ustaliliśmy, że użycie 1,5 razy większej ilości nukleazy niż sugerowano w pierwotnym protokole gwarantuje prawidłowe trawienie. Nie zgłoszono również żadnych działań niepożądanych w przypadku zwiększonych ilości nukleazy. Ponieważ dość trudno jest nadmierne trawienie RPF, gdy są one częścią RNA związanego przez białka rybosomalne, nadal można nieznacznie zwiększyć ilość, aby miareczkować optymalne trawienie nukleazy.
Jeśli w kroku 4.4.2 odzyskano mniej niż 500 ng RNA RPF, powtórz zubożenie rRNA i połącz oczyszczone RPF z kolumnami RNA Clean & Concentrator-5. Alternatywnie, załadować dwie identyczne próbki obok siebie na żel (krok 4.5.3) i połączyć plastry żelu podczas elucji RNA z żelu (krok 4.5.6).
Zalecamy przycięcie RPF na żelu tak ciasno, jak to możliwe, do pasm 28 i 30 nt. Pomaga to w eliminowaniu niechcianych fragmentów z rRNA i tRNA, które później staną się częścią Twojej biblioteki i zmniejszą odczyty sekwencjonowania dla Twoich RPF.
Zaleca się również unikanie światła UV podczas oczyszczania żelu. Może to powodować powstawanie nacięć we fragmentach RNA, a także dimerów pirymidynowych, które w końcu mogą poważnie wpłynąć na przygotowanie biblioteki i wyniki sekwencjonowania.
Przygotowanie biblioteki i sekwencjonowanie danych: Protokół profilowania rybosomów umożliwia wygenerowanie biblioteki cDNA odpowiedniej do sekwencjonowania. Próbki wygenerowane przez znakowanie 4sU mogą być bezpośrednio wykorzystane do przygotowania biblioteki za pomocą dowolnego odpowiedniego zestawu do sekwencjonowania RNA. Ponieważ nowo transkrybowane RNA, zwłaszcza przy użyciu krótkich czasów znakowania, może nie być jeszcze poliadenylowane, nie należy przeprowadzać selekcji poli-A. Zamiast tego zdecydowanie zalecamy zubożenie rRNA, aby zapobiec zmniejszeniu głębokości sekwencjonowania dla rzeczywistej próbki. Używając limfocytów T, zaczęliśmy od 400 ng nowo transkrybowanego i całkowitego RNA (w zależności od zestawu, patrz materiały), przeprowadziliśmy zubożenie rRNA i zredukowaliśmy cykle amplifikacji PCR, aby zminimalizować błąd PCR. Przygotowanie biblioteki można wykonać przy użyciu mniejszej ilości materiału wyjściowego. Aby uwzględnić złożoność biblioteki, należy zoptymalizować liczbę cykli PCR.
Dla ChIP-seq dostępnych jest również wiele zestawów do przygotowania biblioteki. W naszych rękach przygotowanie biblioteki działało dobrze, zaczynając od 2 ng DNA ChIP (zobacz materiały, aby uzyskać sugestię, którego zestawu użyć). Pamiętaj, aby sprawdzić indeksy balansu kolorów podczas sekwencjonowania. Zalecamy głębokość sekwencjonowania ≥40 x 106 odczytów dla próbek 4sU-seq, total RNA-seq i ChIP-seq oraz ≥80 x 106 odczytów dla próbek profilowania rybosomów. Głębokość sekwencjonowania zależy od próbki i dalszej analizy bioinformatycznej i powinna być dokładnie rozważona. Aby przeanalizować odczyty introniczne pod kątem splicingu kotranskrypcyjnego, należy wybrać sekwencjonowanie sparowanych końców 100 pz.
Błąd systematyczny sekwencjonowania: Sekwencjonowanie stało się złotym standardem przy określaniu globalnych zmian w transkrypcji, translacji lub wiązaniu czynników transkrypcyjnych. W ostatnich latach dotychczasowe metody zostały doprowadzone do granic możliwości lub opracowano nowe techniki sekwencjonowania coraz mniejszych początkowych ilości RNA. Wymaga to amplifikacji cDNA, co wprowadza szum lub odchylenie. Niedawno opracowano unikalne identyfikatory molekularne (UMI) w celu eksperymentalnej identyfikacji duplikatów wprowadzonych przez PCR. Niedawno wykazano, że UMI tylko nieznacznie poprawiają moc sekwencjonowania i wskaźnik fałszywych odkryć dla zróżnicowanej ekspresji genów32. Niemniej jednak rozważ użycie unikalnych identyfikatorów molekularnych (UMI) dla wszystkich bibliotek sekwencjonowania w celu kontrolowania złożoności biblioteki, zwłaszcza gdy zaczynasz od małych ilości RNA i gdy potrzebnych jest wiele cykli PCR.
Roztwory buforowe i podstawowe: Wszystkie do sekwencji 4sU i profilowania rybosomów muszą być przygotowane w ścisłych warunkach wolnych od RNaz przy użyciu wody wolnej od nukleaz. Zaleca się kupowanie gotowych NaCl bez nukleaz, Tris-HCl, EDTA, cytrynianu sodu i wody. Aby zapewnić warunki wolne od nukleaz, do czyszczenia pipet lub powierzchni można użyć roztworu odkażającego RNazę. Wszystkie dla ChIP-seq muszą być co najmniej wolne od DNaz i mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej. Zawsze dodawaj inhibitory proteazy i opcjonalnie inhibitory fosfatazy bezpośrednio przed użyciem i trzymaj na lodzie.
Bioinformatyka: Analiza wszystkich danych sekwencjonowania (tj. sekwencjonowania ChIP, sekwencjonowania RNA i profilowania rybosomów) obejmuje kontrolę jakości (np. przy użyciu FastQC, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), przycinanie adapterem (np. za pomocą cutadapt20), a następnie mapowanie do genomu referencyjnego dla badanych komórek. W przypadku danych sekwencyjnych RNA (zarówno całkowitych, jak i sekwencyjnych 4sU), a także danych profilowania rybosomów, wymagany jest mapowanie sekwencjonowania RNA, takie jak ContextMap 221. W przypadku niepołączonych wyrównań danych ChIP-seq wystarczy użyć BWA-MEM22 . Ekspresję genów można obliczyć za pomocą modelu RPKM (Reads per Kilobase of Exon per Million Fragments Mapped)1, po określeniu liczby odczytów na gen za pomocą programu, np. featureCounts23. Dla szczytowych połączeń z danych ChIP-seq dostępnych jest wiele programów, np. MACS24 lub GEM25. Dalsze analizy można przeprowadzić w odniesieniu do R26, w szczególności przy użyciu narzędzi dostarczonych w ramach projektu Bioconductor27.
W tym przypadku głównym wyzwaniem w integracji poziomów 4sU i całkowitego RNA oraz aktywności translacyjnej z profilowania rybosomów jest normalizacja. Klasycznym podejściem do rozwiązania tego problemu jest normalizacja do poziomu genów odpowiedzialnych za utrzymanie domu. Aby zredukować szum spowodowany losowymi fluktuacjami dla poszczególnych genów związanych z prowadzeniem domu, zaleca się nie tylko użycie kilku genów związanych z prowadzeniem domu, ale także średnich poziomów dla większego zestawu, np. >3000 genów utrzymania domu opracowanych przez Eisenberga i Levanona28. W celu obliczenia szybkości obrotu RNA na podstawie stosunku 4sU- do całkowitego RNA, normalizacja opiera się na medianie szybkości obrotu (np. przy założeniu okresu półtrwania RNA wynoszącego 5h)29. Ponieważ jednak zakłada to brak ogólnych zmian w genach zajmujących się utrzymaniem porządku, zalecamy stosowanie podejść analitycznych niezależnych od normalizacji, np. opartego na korelacji grupowania szeregów czasowych różnych typów danych w celu zidentyfikowania grup genów o odmiennym zachowaniu w transkrypcji i translacji podczas aktywacji. Szczegółowy opis bioinformatycznej integracji różnych typów danych znajduje się w oryginalnej publikacji11.
Analiza wskaźników rotacji i integracja danych: Niedawno opublikowana praca33 porównująca okresy półtrwania wyznaczone za pomocą multipleksowanej kontroli genów (MGC) z metodami globalnymi może wykazać, że okresy półtrwania najlepiej korelują z tymi uzyskanymi za pomocą metod znakowania metabolicznego w porównaniu z innymi metodami (np. ogólnym hamowaniem transkrypcji przez leki). Należy jednak wspomnieć, że mogą wystąpić różnice między obliczeniami okresu półtrwania, które zostały opisane 15,34. Uwzględniamy większość problemów i różnic, które są wprowadzane przez reakcję na stres z powodu długotrwałej ekspozycji na 4sU. Dlatego niezbędne jest wykluczenie reakcji na stres wprowadzonej przez oznakowanie 4sU. Aby dokładniej zweryfikować wskaźniki rotacji, zalecamy użycie MGC.
Dodatkowo, wygenerowany tutaj zestaw danych może być również wykorzystany do bardziej zintegrowanej analizy danych (np. regulacji długich niekodujących RNA)35,36.

W ostatnich latach sekwencjonowanie RNA (sekwencjonowanie RNA) stało się standardowym narzędziem do analizy wszystkich wyrażonych RNA w komórce lub organizmie1. Jednak, aby zrozumieć cały proces adaptacji komórek w odpowiedzi na określony bodziec/lek, konieczne jest pełne określenie wszystkich podstawowych procesów, począwszy od transkrypcji mRNA po przetwarzanie, obrót i translację. Krótkoterminowe zmiany w transkrypcji RNA trudno zmierzyć za pomocą całkowitego RNAseq, ponieważ zmiany całkowitego RNA zależą od czynników, np. okresu półtrwania RNA i aktywności transkrypcyjnej, które są słabym szablonem do odzwierciedlenia adaptacji komórek do efektów środowiskowych2,3. Rzeczywiście, opracowano wiele nowych technik sekwencjonowania, które umożliwiają analizę różnych etapów procesu regulacji genów4, jeśli zostaną połączone we właściwy sposób. Protokół ten opisuje, w jaki sposób połączyć niektóre dość łatwe do zastosowania techniki sekwencjonowania, które umożliwiają śledzenie regulacji istotnych warstw mRNA w sposób porównawczy. Do analizy aktywności transkrypcyjnej opisano różne metody, takie jak analiza Cap ekspresji genów (CAGE)5, sekwencjonowanie transkryptu z natywnym wydłużeniem (NET-seq)6 oraz rozbieg jądrowy całego genomu (GRO-seq)7,8, a także sekwencjonowanie bromourydyny (Bru-seq) i sekwencjonowanie 4-tiourydyny (4sU-seq), które wykorzystują metabolity włączone do nowo transkrybowanego RNA9,10, żeby wymienić tylko kilka. Podczas gdy CAGE identyfikuje dokładne miejsce rozpoczęcia transkrypcji, NET-seq i GRO-seq dostarczają dokładniejszych informacji o kierunkach odczytu, a 4sU-seq (która jest metodą opisaną tutaj) wykrywa tylko nowo transkrybowane RNA. Jednak sekwencja 4sU jest bardzo czuła i może być stosowana w różnych ramach czasowych do pomiaru ilościowej aktywności transkrypcyjnej w aktywnie zmieniających się komórkach, a także ilościowych zmian w przetwarzaniu mRNA (co następuje w ciągu kilku minut)9,11,12. Co więcej, 4sU-seq idealnie nadaje się do połączenia z RNA-seq w celu obliczenia szybkości obrotu RNA dla genów9. Transkrypcja mRNA jest przeprowadzana przez polimerazę RNA II (RNAPII), na którą z kolei wpływa wiele czynników, takich jak czynniki transkrypcyjne, modyfikacje histonów i ogólne aktywatory/represory, które mogą być nawet częścią kompleksu transkrypcyjnego. Aby sprawdzić, ile regionów genu/promotora/wzmacniacza jest związanych przez jeden czynnik, opracowano ChIP-seq, który jest obecnie standardową metodą w tym celu, ze względu na wiele dostępnych na rynku przeciwciał13. Jednakże, chociaż ChIPseq daje jasne informacje o tym, gdzie wiążą się czynniki regulujące, nie odzwierciedla, czy rzeczywiście prowadzi to do zmian w transkrypcji14. Dlatego wykonanie ChIP-seq z 4sU-seq jest idealną kombinacją dla takich pytań biologicznych. Regulacja ekspresji genów może również zachodzić na późniejszym etapie, ponieważ poziomy mRNA i białek niekoniecznie są ze sobą skorelowane15,16, co wskazuje na potencjalnie istotną regulację na poziomie translacyjnym lub potranslacyjnym, w zależności od kontekstu. W roku 2011 profilowanie rybosomów zostało po raz pierwszy połączone z sekwencjonowaniem RNA i jest obecnie metodą z wyboru do ilościowego określania zmian, które szybko zachodzą w białku, ponieważ nadal istnieją pewne granice czułości w przypadku spektrometrii mas17. Rzeczywiście, wykazano, że szybkości translacji uzyskane za pomocą takich metod dostarczają stosunkowo dobrego oszacowania zmian w poziomach białek (przynajmniej mierzonych dla zmian długoterminowych) i pozwalają na jeszcze bardziej szczegółowy wgląd w proces translacji, np. określenie początkowych i alternatywnych ramek translacji17. Kombinatoryczne zastosowanie wszystkich czterech metod może być stosowane w stanie ustalonym, między różnymi typami komórek lub w eksperymencie czasowo-szeregowym szybko zmieniającej się komórki11. To zastosowanie zapewnia przegląd całego genomu zmian w wiązaniu czynników transkrypcyjnych wpływających na transkrypcję, przetwarzanie i translację RNA.

<table><tbody><tr><td>4sU-znakowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-tiourydyna (100 mg)</td><td>Carbosynth</td><td>13957-31-8</td><td>Przygotuj 50 mM zapasu w sterylnym H2O/PBS; Przechowuj w &ndash; 20&stopni; C w podwielokrotnościach 50-500 &mikro; l; Nie zamrażaj ponownie.</td></tr><tr><td>Probówki Safe-lock 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30121589</td><td>Opcjonalnie</td></tr><tr><td>1,5 ml zakręcane probówki polipropylenowe</td><td>Sarstedt</td><td>72692005</td><td>Kompatybilne z dimetyloformamidem</td></tr><tr><td>Probówki 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Kompatybilne z dimetyloformamidem</td></tr><tr><td>2,0 ml Zakręcane rurki polipropylenowe</td><td>Sarstedt</td><td>72694005</td><td>Kompatybilne z dimetyloformamidem</td></tr><tr><td>50 ml rurki</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Kompatybilne z dimetyloformamidem</td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>Zalecamy stosowanie tych koralików paramagnetycznych. Porcja i przechowywać w 4&deg; C</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldirch</td><td>372978</td><td>OSTRZEŻENIE &ndash; NIEBEZPIECZNE DLA ZDROWIA</td></tr><tr><td>Dimetyloformamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Roth</td><td>6908.1</td><td>Przygotuj jako 100 mM DTT w wolnym od nukleaz H2O; zawsze przygotuj świeży</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>1.00983.1000</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Biotyna-HPDP (50 mg)</td><td>Pierce</td><td>21341</td><td>Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml, rozpuszczając 50 mg Biotyny-HPDP w 50 ml DMF. Delikatne ocieplenie wspomaga solubilizację. Przechowywać w 4&deg; C w podwielokrotnościach 1 ml. DMF rozpuszcza niektóre tworzywa sztuczne. Zalecamy używanie szklanych pipet do przenoszenia DMF ze szklanej butelki do 50 ml probówek Falcon.</td></tr><tr><td>Zestaw DNA o wysokiej czułości</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Merck</td><td>1.09634.1011</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (5M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71386</td><td>Roztwór podstawowy</td></tr><tr><td>EDTA wolny od nukleaz (500 mM), pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>Roztwór podstawowy</td></tr><tr><td>Bez nukleaz H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502</td><td>Roztwór podstawowy</td></tr><tr><td>wolny od nukleaz Tris Cl (1M), pH 7,4</td><td>Lonza</td><td>51237</td><td>Roztwór podstawowy</td></tr><tr><td>Żel Phase Lock Ciężkie probówki (2,0 ml)</td><td>5Skierować</td><td>2302830</td><td>Użyć w kroku 1.3.4.</td></tr><tr><td>Polipropylen 15&nbsp; ml probówki wirówkowe</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>Lub równoważny; muszą tolerować do 15 000 &razy; g</td></tr><tr><td>Odczynnik do lizy QIAzol (200 ml)</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>Użyj tego lub równoważnego odczynnika TRI do izolacji RNA, OSTRZEŻENIE &NDASH; I NIEBEZPIECZNE DLA ZDROWIA! Zapewnij natychmiastowy dostęp do antidotum fenolowego (PEG-Metanol)</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania Qubit RNA HS</td><td>Life Technologies</td><td>Q32852</td><td>Użyj tego zestawu do ilościowego określania ilości RNA w kroku 1.4.11</td></tr><tr><td>Zestaw RNeasy MinElute</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Opcjonalnie; zawiera Bufor RLT</td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8532</td><td>Przygotuj 1,6 M roztwór podstawowy, używając wody wolnej od nukleaz</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr> <tr><td>i mikro; Macs Streptavidin Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-074-101</td><td>Sklep pod adresem 4&deg; C, zawiera i mikro; Kolumny komputerów Mac używane w kroku 1.4.6. (sklep w RT)</td></tr><tr><td>Test żywotności komórek i stresu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Zestaw do wykrywania apoptozy Aneksyna V I</td><td>BD Biosciences</td><td>559763</td><td>Opcjonalnie</td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td>Opcjonalnie</td></tr><tr><td>P53</td><td>ABCAM</td><td>AB26</td><td>Opcjonalnie</td></tr><tr><td>p-EIF2a (Ser51)Sygnalizacja komórkowa</td><td></td> <td>9721</td><td>Opcjonalnie</td></tr><tr><td>BH3I-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B 8809</td><td>Opcjonalnie</td></tr><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4sU Bufor</td><td></td> myjący <td>przechowywać w temperaturze RT</td><td>100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,1% Tween 20 w wolnym od nukleaz buforze biotynylacyjnym H2O</td></tr><tr><td>(10x)</td><td></td><td>przechowywać w temperaturze 4 stopni; C</td><td>100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA w wodzie wolnej od nukleaz; zrobić porcje 1 ml; przechowywać w temperaturze 4&deg; Bufor</td></tr><tr><td></td><td>wytrącania C RNA</td><td>przechowywać w RT</td><td>1,2 M NaCl, 0,8 M cytrynian sodu w wodzie wolnej od nukleaz. Przygotuj się z wyprzedzeniem w warunkach wolnych od nukleaz. Przechowywać w temperaturze pokojowej w probówkach Falcon o pojemności 50 ml.</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Instrument do bioanalizowania</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>Użyj tego zestawu, aby zweryfikować integralność RNA w kroku 1.3.10</td></tr><tr><td>RNA 6000 Zestaw Pico</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td>Opcjonalny</td></tr><tr><td>spektrofotometr UV/VIS</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 1000</td><td>Lub równoważny. Użyj w kroku 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3</td></tr><tr><td>Wirówka szybkoobrotowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>Lub równoważne urządzenie o zdolności do osiągnięcia 13 000&nbsp; &czasy; &nbsp; g</td></tr><tr><td>Wirnik szybkoobrotowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>Fiberlite F15-6 x 100y</td><td></td></tr><tr><td>Adaptery do probówek 15 ml Wirówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>stołowa z chłodzeniem</td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td>R Lub odpowiednik.</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer C</td><td>Lub odpowiednik.</td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>Jeden stojak mieści 8 i mikro; Kolumny komputerów Mac.</td></tr><tr><td>Ultra-dokładna waga</td><td>Mettler Toledo</td><td>ML204T</td><td>Lub równoważna.</td></tr><tr><td>E-Gel iBase Power System</td><td>Invitrogen</td><td>G6400UK</td><td>Do żeli RNA; lub równoważny.</td></tr><tr><td>E-Gel EX 1% prefabrykaty agarozowe</td><td>Invitrogen</td><td>G4020-01</td><td>Do żeli RNA; lub równoważne.</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet-1 każdy</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Sigma</td><td>R2020</td><td>Opcjonalny</td></tr><tr><td>zestaw do przygotowania całkowitej biblioteki RNA TruSeq</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2201</td><td>Lub odpowiednik. W przypadku limfocytów T użyliśmy 400 ng 4sU i całkowitego RNA z 11 cyklami do amplifikacji PCR. Zubożenie rRNA jest zawarte w tym zestawie</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>użyj Nanodrop lub równoważnego przyrządu do pomiaru stężenia RNA</td></tr><tr><td>Profilowanie rybosomów</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Zestaw profili rybosomów (ssaki lub drożdże)</td><td>Illumina</td><td>RPYSC12116 (drożdże)</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw profilowy TruSeq Ribo (ssaki lub drożdże)</td><td>Illumina</td><td>RPHMR12126 (ssaki)</td><td></td></tr><tr><td>Ilustruj kolumny MicroSpin S-400 HR</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5140-01</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean & Koncentrator-25 zestaw</td><td>Zymo Research</td><td>R1017</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean & Zestaw Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do usuwania rRNA Ribo-Zero Gold (człowiek/mysz/szczur)</td><td>Illumina</td><td>MRZG126 lub MRZG12324</td><td></td></tr> <tr><td>(zestaw DNA o wysokiej czułości)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>Już potrzebne do 4sU-seq</td></tr><tr><td>Wszystkie inne materiały eksploatacyjne i sprzęt są wymienione w Podręczniku użytkownika</td><td>!!</td><td></td><td>Uważnie przeczytaj instrukcję obsługi i zamów wymagane materiały eksploatacyjne z wyprzedzeniem (weź pod uwagę długi czas dostawy niektórych materiałów eksploatacyjnych, np. żeli)</td></tr><tr><td>ChIP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH 8,0)</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 pz Plus Marker</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM0323</td><td></td></tr><tr><td>16 % Formaldehyd</td><td>Thermo Fisher</td><td>28908</td><td>Dodać do końcowego stężenia 1 %</td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td>gereral lab dostawca</td><td></td><td>Zawsze przygotowuj świeże</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>gereral lab dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP koraliki</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>Zalecamy stosowanie tych paramagnetycznych kulek. Porcja i przechowywać w 4&deg; C</td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania biblioteki ChIP</td><td>KapaBiosystems</td><td>KK8504</td><td>Lub użyj wybranego zestawu</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek DNA o niskim poziomie wiązania</td><td>Eppendorf</td><td>Z666548-250EA</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td>Użyj tych superparamagnetycznych kulek sprzężonych z białkiem G w kroku 4.3.1.; Przynieś do RT przed użyciem</td></tr><tr>Dostawca <td></td><td>laboratoryjny Glycine</td><td>gereral</td><td>Przygotuj 2M roztwór podstawowy</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Roche</td><td>10-901-393-001</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Użyj tego zestawu (lub odpowiednika) do oczyszczenia chromatyny w kroku 4.2.4.</td></tr><tr><td>Inhibitor fosfatazy (PhosStop)</td><td>Roche</td><td>4906837001</td><td>Dodaj świeżo do buforu i trzymaj na lodzie</td></tr><tr><td>Power SYBRgreen Master mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy (cOmplete, EDTA-free)</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Dodaj świeżo do buforu i trzymaj na lodzie</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Zestaw testowy</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>Użyj tego zestawu do ilościowego określania ilości DNA w kroku 4.6.4. na fluorometrze kubitowym</td></tr><tr><td>Rnaza, wolne od DNazy</td><td>Roche</td><td>11-119915001</td><td></td></tr><tr><td>Nasienie łososia (sonikowane do około 100 pz)</td><td>Sigma</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>TE pH 8.0</td><td>dostawca laboratorium</td><td></td><td></td> gereral</tr><tr><td>Przeciwciała (stopień ChIP, jeśli to możliwe)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anty-RNA Pol II [8WG16]</td><td>abcam</td><td>ab817</td><td></td></tr><tr><td>anty-histon H3K36me3</td><td>abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>lub przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Binding/Blocking buffer</td><td></td><td>Przechowywać w RT</td><td>PBS z 0,5% BSA i 0,5</td></tr>% <tr><td>buforem do lizy komórkowej</td> Tween 20 <td></td><td>Przechowywać w</td><td>RT 5 mM Pipes [pH 8,0], 85 mM KCl i 0,5 % NP40</td></tr><tr><td>ChIP IP buffer</td><td></td><td>Przechowywać w RT</td><td>0,01 % SDS; 1. 1% Triton X-100; 1.2&nbsp; mM EDTA; 16,7&nbsp; mM Tris-HCl, pH 8,1; 16,7&nbsp; mM Bufor</td></tr><tr><td></td><td>elucyjny</td> NaCl <td>Przechowywać w temperaturze pokojowej do 6 miesięcy</td><td>10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM EDTA (pH 8,0), 300 mM NaCl i 0,5</td></tr>% <tr><td>bufor</td><td></td> do lizy jąder SDS <td>Przechowywać w temperaturze RT</td><td>50 mM Tris [pH 8,0], 10 mM EDTA i 1 % SDS</td></tr><tr><td>Bufor płuczący I</td><td></td><td>Przechowywać w RT</td><td>0,1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris-HCL pH 8,1; 150 mM NaCl</td></tr><tr><td>Bufor płuczący II</td><td></td><td>Przechowywać w RT</td><td>0,1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2&nbsp; mM EDTA; 20&nbsp; mM Tris-HCL pH 8,1; 500&nbsp; mM NaCl</td></tr><tr><td>Bufor płuczący III</td><td></td><td>Przechowywać w temperaturze RT</td><td>0,25&nbsp; M LiCl; 1% NP-40; 1&nbsp; mM EDTA; 10&nbsp; mM Tris-HCl, pH 8,1</td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Instrument do bioanalizacji</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>używaj tego przyrządu do analizy elektroforetycznej</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor TBX mikroprobówki 1,5 ml</td><td>Diagenode</td><td>C30010010</td><td></td></tr><tr><td>lub probówki specjalnie dla Twojego urządzenia do sonikacji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do sonikacji Bioruptor lub urządzenie do sonikacji do wyboru</td><td></td><td></td><td>Sonikacja limfocytów T za pomocą Bioruptor: 20 - 25 cykli (30 s wł., 30 s off na wysokim poziomie w dwóch mikroprobówkach Bioruptor o pojemności 1,5 ml z 500 &mikro; l każda probówka)</td></tr> <tr><td>Stojak magnetyczny do probówek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroforeza w żelu agarozowym</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorometr kubitowy</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Użyj tego fluorometru do ilościowego oznaczania niewielkich ilości RNA / DNA</td></tr></tbody></table>

analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Po aktywacji, komórki szybko zmieniają swoje programy funkcjonalne, a tym samym swój profil ekspresji genów. Ogromne zmiany w ekspresji genów zachodzą, na przykład, podczas różnicowania komórek, morfogenezy i stymulacji funkcjonalnej (takiej jak aktywacja komórek odpornościowych) lub po ekspozycji na leki i inne czynniki z lokalnego środowiska. W zależności od bodźca i typu komórki, zmiany te zachodzą szybko i na każdym możliwym poziomie regulacji genów. Przedstawienie wszystkich procesów molekularnych komórki reagującej na określony rodzaj bodźca/leku jest jednym z najtrudniejszych zadań w biologii molekularnej. W tym miejscu opisujemy protokół, który umożliwia jednoczesną analizę wielu warstw regulacji genów. Porównujemy w szczególności wiązanie czynników transkrypcyjnych (Chromatyna-immunoprecypitacja-sekwencjonowanie (ChIP-seq)), transkrypcję de novo (sekwencjonowanie 4-tiourydyny (4sU-seq)), przetwarzanie mRNA i obrót, a także translację (profilowanie rybosomów). Łącząc te metody, możliwe jest przedstawienie szczegółowego i obejmującego cały genom przebiegu działania.
Sekwencjonowanie nowo transkrybowanego RNA jest szczególnie zalecane podczas analizy szybko adaptujących się lub zmieniających systemów, ponieważ przedstawia to aktywność transkrypcyjną wszystkich genów w czasie ekspozycji na 4sU (niezależnie od tego, czy są one regulowane w górę czy w dół). Kombinatoryczne zastosowanie całkowitego sekwencjonowania RNA i profilowania rybosomów dodatkowo pozwala na obliczenie szybkości obrotu i translacji RNA. Bioinformatyczna analiza wyników sekwencjonowania wysokoprzepustowego pozwala na wielotorową analizę i interpretację danych. Wygenerowane dane umożliwiają również śledzenie splicingu kotranskrypcyjnego i alternatywnego, by wymienić tylko kilka możliwych wyników.
Opisane tutaj podejście łączone może być stosowane do różnych organizmów modelowych lub typów komórek, w tym komórek pierwotnych. Ponadto zapewniamy szczegółowe protokoły dla każdej zastosowanej metody, w tym kontrole jakości, oraz omawiamy potencjalne problemy i pułapki.

4znakowanie sU: Weryfikacja optymalna 4Warunki znakowania sU (apoptoza, stres jądrowy, stres cytoplazmatyczny), czas i stężenie: Wysokie stężenia 4sU mogą hamować produkcję i przetwarzanie rRNA oraz indukować stres cytoplazmatyczny oraz jądrowy30W związku z tym badane komórki należy poddać analizie pod kątem stresu indukowanego przez 4sU oraz apoptozy. Do wizualizacji akumulacji p53, która wskazuje na stres jądrowy, oraz wzrostu poziomu fosfo-EIF2a, świadczącego o stresie cytoplazmatycznym, zaleca się analizę Western blot, natomiast do badania apoptozy – analizę za pomocą sortownika komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). W celu wywołania stresu komórkowego można zastosować wysokie stężenia i długotrwałą ekspozycję na 4sU lub leki, takie jak tapsygargin lub arsenit. Aby indukować apoptozę lub śmierć komórkową, komórki traktowano BH3I-1 (500 ng/µL) lub inkubowano przez 5 min w temperaturze 95 °C (szok termiczny). Do oznaczenia komórek apoptotycznych (Annexin V) oraz martwych (7-AAD) zastosowano barwienie Annexin V/7-AAD. Oznaczanie in vitro generowane pierwotne komórki Th1 przez 0,5 h za pomocą 500 µM 4sU (stężenie końcowe) lub 1 h z 200 µM 4sU nie indukuje ani oznak stresu komórkowego, ani apoptozy (Rysunek 1) lecz prowadzą do wystarczającej inkorporacji 4sU.
Czas znakowania RNA można również skrócić (≤5 min), co prowadzi do zwiększenia liczby krótkotrwałych sekwencji intronowych w porównaniu do dłuższego czasu znakowania. Aby zwizualizować tempo splicingu kokotranskrypcyjnego, czas znakowania 4sU nie powinien przekraczać 30 min. Dalsze szczegóły dotyczące znakowania 4sU znajdują się w pracy Rädle et al.19
Kontrola jakości: Integralność RNA ma kluczowe znaczenie podczas przetwarzania RNA. Najwygodniej jest sprawdzić jakość RNA znakowanego 4sU po biotinylacji za pomocą analizy elektroforetycznej (patrz Tabela materiałów). Należy rozważyć weryfikację RNA wyizolowanego w kroku 2.2.2, szczególnie w przypadku jego wykorzystania do sekwencjonowania całkowitego RNA. Wartość wskaźnika integralności RNA (RIN) powinna wynosić ≥8, aby zapewnić integralność RNA do dalszego przetwarzania (Rysunek 3).
Analiza elektroforetyczna może być również wykorzystana do weryfikacji nowo transkrybowanego RNA. Należy pamiętać, że nowo transkrybowane RNA zawiera znacznie mniej dojrzałych rRNA w porównaniu z całkowitym RNA, a typowe prążki rRNA są znacznie mniej wyraźne.
Profilowanie rybosomów: amplifikacja PCR biblioteki cDNA: amplifikacja cDNA (krok 4.9.1) jest krytycznym etapem zapewniającym dobre wyniki sekwencjonowania. Przeanalizuj amplifikowane biblioteki za pomocą analizy elektroforetycznej. Dobra próbka amplifikowanych bibliotek wykazuje peak w zakresie 140 - 160 bp (Rysunek 4A). Należy unikać nadmiernej ilości dimerów adapterów (Rysunek 4B), a takie próbki powinny zostać dodatkowo oczyszczone za pomocą procedury oczyszczania w żelu PAGE zgodnie z protokołem producenta (oczyszczanie produktów PCR w żelu PAGE). Zbyt duża ilość matrycy lub zbyt wiele cykli PCR może prowadzić do nadmiernej amplifikacji, która objawia się pojawieniem prążków o masie cząsteczkowej wyższej niż oczekiwana, rozmazanymi produktami PCR oraz produktami w postaci dimerów adapterów (Rysunek 4C). W przypadku większości próbek użycie 1 - 5 µL zcyrkularyzowanego cDNA oraz 9 cykli PCR podczas amplifikacji zazwyczaj pozwala uzyskać wystarczającą ilość właściwego produktu PCR.
ChIP: Fragmentacja chromatyny: Optymalne warunki fragmentacji muszą zostać dostosowane do każdego rodzaju komórek. Należy wcześniej określić warunki fragmentacji (np. liczbę cykli, wysoką lub niską moc). Do celów testowych należy używać tej samej liczby komórek i tej samej objętości, ponieważ niższa gęstość komórek zwiększa wydajność fragmentacji. Należy starać się unikać nadmiernej lub niewystarczającej fragmentacji chromatyny. Duże fragmenty chromatyny mogą drastycznie wpłynąć na wyniki ChIP poprzez zapychanie, natomiast nadmierna fragmentacja może zniszczyć epitopy na badanym białku, co prowadzi do niższej wydajności wiązania przeciwciała. W tym eksperymencie najlepsze wyniki uzyskano, gdy główna frakcja pofragmentowanej chromatyny wynosiła około 1,000 bp lub nieco mniej (Rysunek 5A).
Weryfikacja ChIP za pomocą qPCR: Przed rozpoczęciem procedury ChIP zaleca się sprawdzenie za pomocą ChIP-qPCR, czy stosowane przeciwciało nadaje się do tej metody (jeśli to możliwe, należy używać przeciwciał klasy ChIP). Przed przystąpieniem do przygotowania biblioteki należy zweryfikować ChIP do sekwencjonowania za pomocą qPCR (patrz krok 5.6.5). Należy zaprojektować startery wiążące się ze znanym miejscem docelowym badanego białka. Jeśli dokładne miejsce docelowe w obrębie genu jest nieznane, można użyć kilku par starterów w celu przeskanowania genu i powiązanych z nim elementów regulatorowych. Dla ChIP RNAPII w komórkach Th1 Ifng, który wykazuje zwiększoną ekspresję transkrypcyjną po stymulacji, a aktyna Startery mogą służyć jako kontrola pozytywna. Sox9 i insulina służyć jako kontrola negatywna, ponieważ geny te nie są ekspresjonowane w komórkach Th1 (Rysunek 5B). Należy pamiętać, aby nie stosować starterów rozdzielonych intronami (exon-spanning primers), które są zazwyczaj wykorzystywane do qPCR mRNA. W celu potwierdzenia swoistości użytego przeciwciała można zastosować kontrolę IgG. Ilość immunoprecypitowanego DNA można zmierzyć za pomocą odpowiedniego fluorometru (patrz Tabela materiałów). Ilości niespecyficznie związanego DNA w kontroli IgG powinny być znacznie niższe w porównaniu do ilości DNA związanego przez badane przeciwciało.
Powtórzenia: dowód istotności biologicznej: Zaleca się, aby eksperyment kinetyczny dla wszystkich metod przeprowadzać z tej samej puli komórek, aby zapewnić identyczność komórek we wszystkich próbkach niepoddanych i poddanych działaniu czynnika (Rysunek 2). Niemniej jednak zaleca się pobieranie niewielkich alikwotów w głównych punktach czasowych dla każdej metody, aby porównać próbki z powtórzeniem biologicznym (np. za pomocą qPCR, analizy FACS). Pozwala to na wstępną ocenę, czy opracowanie obu powtórzeń było powtarzalne, co umożliwia przejście do sekwencjonowania. Walidacja powtórzeń powinna zostać przeprowadzona za pomocą analizy bioinformatycznej. Powtarzalność wyników można ocenić na podstawie korelacji wartości FPKM pomiędzy powtórzeniami i zwizualizować za pomocą wykresów rozrzutu (Rysunek 6).
<img alt="Wyniki cytometrii przepływowej i analiza Western blot w badaniu apoptozy komórek i ekspresji białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Weryfikacja optymalnych warunków znakowania 4sU bez zaburzania fizjologii komórek (Rysunek z Davari et al.11) 
(A) Wykrywanie apoptozy komórek za pomocą analizy FACS: generowane in vitro komórki Th0 traktowano różnymi stężeniami 4sU (podanymi w nawiasach) odpowiednio przez 0,5 h, 1 h i 2 h. Do indukowania apoptozy wykrywanej za pomocą Annexiny V zastosowano traktowanie BH3I-1, natomiast do indukowania śmierci komórkowej wykrywanej za pomocą 7-AAD zastosowano szok termiczny (5 min w 95 °C). (B) Analiza Western blot białka p53 w aktywowanych limfocytach T traktowanych 4sU: próbki znakowano 200 µM 4sU przez wskazany czas aktywacji, z wyjątkiem punktu czasowego 0,5 h, który znakowano 500 µM 4sU. (C) Analiza Western blot fosfo-EIF2a i całkowitego EIF2a w aktywowanych komórkach Th1 przy tych samych warunkach znakowania co w (B). Jako kontrolę pozytywną zastosowano tapsygarginę. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat traktowania komórek z metodami sekwencjonowania: 4sU-seq, profilowanie rybosomów, punkty czasowe ChIP-seq." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schematyczny przegląd układu kinetycznego służącego do śledzenia zmian w całym genomie 
Niniejszy schemat ilustruje układ łączący 4sU-seq, całkowite RNA-seq, profilowanie rybosomów oraz ChIP-seq w celu zbadania zmian w całym genomie po potraktowaniu komórek. Połączyć komórki i odłożyć wymaganą liczbę komórek do kontroli niepoddanej działaniu czynnika. Pozostałe komórki poddać działaniu czynnika i podzielić na grupy dla każdej metody i punktu czasowego. Komórki niepoddane i poddane działaniu czynnika do analizy 4sU-seq oznakować 4sU zgodnie z opisem. Punkty czasowe i próbki dla każdej metody zależą od konkretnego pytania biologicznego będącego przedmiotem badania. Pobrać próbki dla każdego punktu czasowego i metody, a następnie postępować zgodnie z odpowiednią częścią protokołu. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig2large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Schemat żelu do elektroforezy RNA; całkowite RNA, biotynilacja, analiza prążków 28S i 18S rRNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Kontrola jakości RNA znakowanego 4sU 
Całkowite RNA i RNA biotynilowane uzyskane z aktywowanych komórek Th1 zostały przeanalizowane za pomocą Bioanalyzera. Przedstawiono rRNA 18S i rRNA 28S, a wskaźnik integralności RNA (RIN) został wyznaczony przez urządzenie w celu oceny integralności RNA. Wartość RIN powinna wynosić ≥8, aby zapewnić integralność RNA. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie elektroferogramów; analiza DNA; próbki prawidłowe, z dimerami adapterów, nadmiernie amplifikowane; bp vs FU." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Profile Bioanalizatora bibliotek do profilowania rybosomów 
(A) Prawidłowa biblioteka: Próbka wykazuje pik w oczekiwanym zakresie wielkości (140 - 160 bp) i nie wymaga dalszego oczyszczania. (B) Ta próbka wykazuje nadmierną ilość produktu amplifikacji dimerów adapterów (120 bp) w stosunku do pożądanego produktu (140 - 160 bp). Biblioteka ta wymaga dalszego oczyszczania. (C) Próbka nadmiernie amplifikowana: Widoczne są piki o masie cząsteczkowej wyższej niż oczekiwano oraz rozmyte amplikony PCR (wskazane strzałkami). <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Elektroforeza żelowa i wykres słupkowy; eksperyment aktywacji DNA, analiza ekspresji białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Optymalna wielkość chromatyny po fragmentacji i weryfikacja ChIP metodą qPCR 
(A) Zdjęcie żelu agarozowego przedstawia optymalną wielkość fragmentów pociętej chromatyny z trzech próbek, które poddano sonikacji przez 25 cykli i oczyszczono zgodnie z wcześniejszym opisem w protokole. (B) Wyniki qPCR całkowitego ChIP RNAPII (anty-RNA Pol II, 8WG16, ab817) przedstawione jako procent wartości wejściowej (input). Primery do Ifng i actin posłużyły jako kontrole pozytywne, natomiast Sox9 i Insulin jako kontrole negatywne (oba geny nie wykazują ekspresji w aktywowanych komórkach Th1). <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres rozrzutu przedstawiający analizę korelacji RNA z wartościami FPKM, cor=0,94, liniowa linia trendu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Porównanie powtórzeń biologicznych (Rycina z Davari et al. 11) 
Reprezentatywny wykres rozrzutu porównujący wartości ekspresji (FPKM) pomiędzy powtórzeniami nowo transkrybowanego (4sU) RNA 4 h po stymulacji aktywowanych komórek Th1. Zielona linia wskazuje równe wartości FPKM, a korelacja rangowa jest podana na każdym wykresie.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Czas trwania znakowania (min)</td>
			<td>Zalecane stężenie 4sU (µM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120</td>
			<td>100 - 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60</td>
			<td>200 - 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 - 30</td>
			<td>500 - 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&lt;10</td>
			<td>500 - 2000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Zalecane stężenia 4sU (według Rädle, et al.19) 
Zakres zalecanych stężeń 4sU wskazano dla różnych czasów znakowania.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Metoda</td>
			<td>Liczba komórek</td>
			<td>ilość RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>znakowanie 4sU</td>
			<td>≥2 x 107</td>
			<td>≥60µg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Profilowanie rybosomów</td>
			<td>≥2 x107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP-seq</td>
			<td>≥2 x 107 - 3 x 107</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Wymagana liczba pierwotnych limfocytów T 
Minimalna liczba wymaganych pierwotnych limfocytów T dla każdej metody. Liczba ta może być mniejsza w przypadku zastosowania innych typów komórek.

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wyznaczenie głównych warstw regulacji RNA i DNA w celu odkrycia podstawowych mechanizmów molekularnych występujących w odpowiedzi na bodziec lub leczenie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w wielu różnych dziedzinach biologii, takich jak ogólne reakcje immunologiczne, ale także odpowiedzi molekularne na leczenie farmakologiczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona jednoczesne wyświetlanie wielu warstw regulacji genów w czasie.Dlatego ważne jest, aby używać tej samej puli komórek dla każdej metody. Ogólnie rzecz biorąc, te trzy protokoły polegają najpierw na manipulowaniu interesującymi komórkami w różnych punktach czasowych. Po każdej manipulacji komórki są łączone i dzielone na trzy grupy, po jednej dla każdego testu.Ta część filmu opisuje etykietowanie i oczyszczanie ostatnio wytworzonych transkryptów przy użyciu etykietowania 4sU. Każdy protokół ostatecznie wytwarza próbki gotowe do sekwencjonowania. Najpierw sprawdź wymagane stężenie 4sU i czas inkubacji potrzebny dla interesującej nas linii komórkowej.Na przykład 200 mikromolowych 4sU stosuje się na limfocytach T przez jedną godzinę. Oddziel pulę komórek po leczeniu do jednego osobnego naczynia dla każdej metody i punktu czasowego. Następnie całkowicie rozmrozić wymaganą liczbę podwielokrotności 4sU i dodać 4sU bezpośrednio do pożywki komórkowej i inkubować kultury zgodnie z zaleceniami.Następnie zbierz komórki oznaczone 4sU w probówkach polipropylenowych. Następnie odwiruj komórki. Ponownie zawiesić osad w TRIzolu w ilości około trzech milionów komórek na mililitr i inkubować komórki w TRIzolu w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Teraz przygotuj od 30 do 80 mikrogramów RNA lub więcej, korzystając z metody Radle i spółki. Następnie wymieszaj reakcję biotynylacji specyficzną dla tiolu w tej kolejności. Zacznij od wody wolnej od nukleaz, następnie 10-krotnego buforu, następnie RNA, a na końcu biotyny-HPDP.Następnie wymieszać pipetując i inkubować. Kontynuuj etap oczyszczania, aby wyprodukować próbki nowo transkrybowanego biotynylowanego RNA zmieszanego z nieznakowanym, wcześniej istniejącym RNA. Następnie podgrzewaj próbki do 65 stopni Celsjusza przez 10 minut.Następnie natychmiast umieść je na lodzie. Gdy każda próbka ostygnie, dodaj 100 mikrolitrów kulek streptawidyny i inkubuj je w temperaturze pokojowej z rotacją przez 15 minut. Teraz wyizoluj koraliki ozdobione nowo transkrybowanym RNA za pomocą kolumny magnetycznej, a następnie wymyj RNA w 11 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz w celu sekwencji.W tej sekcji opisano, jak wyizolować RNA, które jest aktywnie translowane. Sekwencjonowanie tych transkryptów bada dynamiczny translatosom. W połączeniu z danymi z sekwencjonowania RNA, test ten pozwala na obliczenie rotacji RNA i szybkości translacji.Zacznij od dodania cykloheksymidu do zawiesiny i wymieszania go za pomocą inwersji. Po jednej minucie w temperaturze pokojowej odwirować komórki, usunąć pożywkę i umyć komórki co najmniej 10 mililitrami PBS uzupełnionymi cykloheksymidem. Następnie odessaj pożywkę i zastąp ją 100 mikrolitrami buforu do lizy komórek ssaków na 10 milionów komórek.Rozetrzeć mieszaninę w celu lizy komórek za pomocą igły o rozmiarze od 20 do 25. Następnie przenieś lizat komórkowy do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,50 mililitra i inkubuj lizat na lodzie przez 10 minut z okresowymi inwersjami. Po 10 minutach odwirować lizat i przenieść supernatant do chłodnej, 1,5-mililitrowej probówki.Następnie przygotuj rozcieńczenie lizatu od 1 do 10 w wodzie wolnej od nukleaz i zmierz absorbancję przy 260 nanometrach. Następnie utwórz 200-mikrolitrowe podwielokrotności nierozcieńczonego lizatu i potraktuj każdą z nich 7,5 jednostki nukleazy na każdą jednostkę absorbancji. Pozwól nukleazie reagować przez 45 minut, a następnie zakończ reakcję za pomocą 15 mikrolitrów inhibitora RNazy lub przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Następnie oczyść RNA RPF za pomocą komercyjnego zestawu, a następnie zubożenie rRNA, również za pomocą zestawu. Następnie wykonaj oczyszczanie PAGE na 500 nanogramach wyizolowanego RNA RPF. Po przygotowaniu próbek do załadowania do żelu, należy je zdenaturować, ten ostatni i kontrolę, w pięciominutowej inkubacji w temperaturze 95 stopni Celsjusza.Następnie badaj próbki pod napięciem 180 woltów przez około 75 minut i oceń wyniki. W przypadku kolekcji plasterków żelu przebij otwory na dnie 0,5-mililitrowej tubki za pomocą sterylnej igły o rozmiarze 20. Następnie należy wyciąć plastry żelu akcyzowego odpowiadające regionowi nukleotydów zasadowych od 28 do 30 i przenieść je do przygotowanych probówek o pojemności 0,5 mililitra.Dołączyć próbkę kontrolnego RNA i próbkę kontroli ujemnej w celu sprawdzenia pod kątem zanieczyszczenia. Następnie załaduj małe, zakryte probówki na próbki do większych probówek do mikrowirówek. Następnie odwiruj zespoły, aby rozdrobnić żel i przenieś próbkę do probówki o pojemności 1,5 mililitra.Następnie dodaj wodę, octan amonu i SDS do probówek z próbkami, aby wymyć RNA w nocnej reakcji w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie użyj komercyjnego zestawu, aby utworzyć bibliotekę cDNA z małego RNA i przystąp do sekwencjonowania biblioteki cDNA. ChIP-seq służy do mapowania wiązania czynnika transkrypcyjnego będącego przedmiotem zainteresowania w całym genomie.W połączeniu z danymi z profilowania rybosomów i badania wszystkich nowych transkryptów, ChIP-seq ujawnia rzeczywisty wpływ wiązania czynnika transkrypcyjnego. Na początek usieciuj próbki komórek za pomocą formaldehydu do końcowego stężenia 1%Po 10 minutach w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem zatrzymaj reakcję, podnosząc stężenie glicyny do 0,125 mola. Następnie zbierz komórki i umyj je trzykrotnie lodowatym PBS i zamroź osad komórek w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Później ponownie zawieś osad komórkowy w jednym mililitrze lodowatego buforu do lizy komórek ze świeżo dodanymi inhibitorami proteazy i inkubuj komórki na lodzie przez 10 minut. Po 10 minutach odwirować komórki, odessać supernatant i powtórzyć dodawanie buforu do lizy i inkubację. Następnie użyj sonikacji, aby wygenerować ściętą chromatynę między 200 a 1 000 par zasad.Następnie sprzęgnij chromatynę z kulkami magnetycznymi pokrytymi przeciwciałami i eluuj kompleksy białko-DNA w 50 mikrolitrach buforu elucyjnego. Następnie dodaj pięć mikrolitrów 40% RNazy i buforu elucyjnego i inkubuj próbkę przez 30 minut. Następnie dodaj jedną jednostkę proteinazy K i 20 mikrogramów glikogenu do próbki i inkubuj ją przez dwie godziny.Następnie przenieś próbkę do 65 stopni Celsjusza na noc, aby ją odwrócić sieciowanie. Następnego dnia umieść próbkę na magnesie na co najmniej 30 sekund, a następnie zbierz supernatant, który zawiera interesujące nas DNA. Następnie oczyść DNA, użyj ilościowego PCR do weryfikacji i zsekwencjonuj DNA.Znakowanie 4sU może stresować komórki i prowadzić do apoptozy. Barwienie aneksyną V i 7-AAD zastosowano do identyfikacji komórek apoptotycznych i martwych. Po znakowaniu komórek Th1 za pomocą 4sU przy użyciu 30 lub 60-minutowych zabiegów, komórki nie umierały ani nie ulegały apoptozie.Integralność RNA była zawsze sprawdzana przed sekwencjonowaniem przy użyciu standardowego testu, ponieważ ma to ogromne znaczenie podczas przetwarzania RNA. Amplifikowane biblioteki miały zdrowy zakres nukleotydów. Nadmiar dimerów adapterowych wymagał dalszego oczyszczenia przez PAGE.Zbyt duża matryca lub zbyt wiele cykli skutkuje ciężkimi nukleotydami, rozmazanymi produktami i produktami dimerów adapterowych Stwierdzono, że ścinanie chromatyny działa najlepiej, gdy główna frakcja ściętej chromatyny wynosi około 1,000 par zasad lub nieco mniej. Ilościowy PCR zastosowano do zbadania możliwości zastosowania przeciwciała do sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny. Startery kontroli ujemnej są przeznaczone dla genów, które nie ulegają ekspresji w komórkach będących przedmiotem zainteresowania.Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby pamiętać o sporządzeniu szczegółowego planu konfiguracji eksperymentalnej, w tym harmonogramu czasu, kiedy dodać 4sU i kiedy zebrać komórki dla każdej metody. Zawsze sprawdzaj optymalne warunki znakowania 4sU, testując z wyprzedzeniem wpływ 4sU na żywotność komórek i reakcję na stres. Podsumowując, takie podejście pozwala nam zobrazować wszystkie zdarzenia regulacji genów, które mogą wystąpić podczas procesu aktywacji komórkowej.Metoda ta może być również stosowana w przypadku pierwotnych komórek odpornościowych i ich odpowiedzi na bodźce lub leki.

real-time-analysis-transcription-factor-binding-transcription

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Niniejszy protokół opisuje sposób wykorzystania immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do badania dynamicznych zmian w matrycy chromatyny, które regulują transkrypcję indukowaną przez szlak przekazywania sygnału.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) w celu badania dynamicznych modyfikacji histonów w aktywownej ekspresji genów w komórkach ludzkich

Kinetykę transkrypcyjną polimerazy RNA II mierzy się na wybranych genach w żywych komórkach. mRNA transkrybowane z badanego genu są znakowane fluorescencyjnie, a za pomocą metody FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) wyznacza się kinetykę elongacji transkrypcji in vivo.

Pomiar kinetyki transkrypcji mRNA w pojedynczych żywych komórkach

Opisujemy metodę mikroskopii fluorescencyjnej, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), do obrazowania produkcji cząsteczek białka w żywych komórkach z precyzją pojedynczej cząsteczki bez zakłócania funkcjonalności białka. Metoda ta została wykorzystana do śledzenia stochastycznej dynamiki ekspresji czynnika transkrypcyjnego, represora λ CI 1.

Obrazowanie pojedynczej cząsteczki regulacji genów in vivo przy użyciu aktywacji kotranslacyjnej przez rozszczepienie (CoTrAC)

Rybosomy odgrywają kluczową rolę w syntezie białek. Frakcjonowanie polirybosomów (polisomów) za pomocą wirowania w gradiencie gęstości sacharozy umożliwia bezpośrednie określenie wydajności translacji poszczególnych mRNA w skali całego genomu. Ponadto metoda ta może być stosowana do analizy biochemicznej czynników związanych z rybosomami i polisomami, takich jak białka opiekuńcze i cząsteczki sygnałowe.

Frakcjonowanie polisomów i analiza translatomiów ssaków w skali całego genomu

Tutaj proponujemy strategię badania wpływu interesującego czynnika transkrypcyjnego na transkryptom mikroRNA, korzystając z publicznie dostępnych danych, zasobów obliczeniowych i danych o wysokiej przepustowości z macierzy mikroRNA po transfekcji komórek z małą spinką do włosów (sh)RNA ukierunkowaną na interesujący czynnik transkrypcyjny.

Opisywanie zależnej od czynnika transkrypcyjnego regulacji transkryptomu mikroRNA

Tutaj prezentujemy ulepszony protokół badań przesiewowych drożdży z jedną hybrydą, aby zidentyfikować czynniki transkrypcyjne (TF), które mogą wiązać się z interesującym nas regionem ludzkiego DNA. Ta metoda wykorzystuje potok przesiewowy o wysokiej przepływności, który może badać wiązanie &gt;1 000 TF w jednym eksperymencie.

Ulepszone badania przesiewowe hybryd drożdży w celu identyfikacji powiązania czynnika transkrypcyjnego z sekwencjami ludzkiego DNA

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest potężnym narzędziem do zrozumienia molekularnych mechanizmów regulacji genów. Metoda ta wiąże się jednak z trudnościami w uzyskaniu powtarzalnej fragmentacji chromatyny przez mechaniczne ścinanie. W tym miejscu przedstawiamy ulepszony protokół testu ChIP z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego.

Test immunoprecypitacji chromatyny z wykorzystaniem nukleaz mikrokokowych w komórkach ssaków

Domeny wewnętrznie nieuporządkowane są ważne dla funkcji czynnika transkrypcyjnego fuzji onkogennej. Aby terapeutycznie ukierunkować te białka, konieczne jest bardziej szczegółowe zrozumienie mechanizmów regulacyjnych stosowanych przez te domeny. Tutaj używamy transkryptomiki do mapowania ważnych cech strukturalnych wewnętrznie nieuporządkowanej domeny EWS w mięsaku Ewinga.

Mapowanie zależności struktura-funkcja zaburzonych onkogennych czynników transkrypcyjnych za pomocą analizy transkryptomicznej

Ten protokół przedstawia nowy system genów reporterowych i eksperymentalne ustawienie do wykrywania transkrypcji przy pęknięciach dwuniciowych DNA z czułością pojedynczej cząsteczki.

Obrazowanie aktywności transkrypcyjnej żywych komórek przy pęknięciach dwuniciowych DNA

Wykazano, że wiele wewnętrznie nieuporządkowanych białek uczestniczy w tworzeniu wysoce dynamicznych kondensatów biomolekularnych, co jest ważne dla wielu procesów komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy opartą na obrazowaniu pojedynczych cząsteczek metodę ilościowego określania dynamiki, za pomocą której białka oddziałują ze sobą w kondensatach biomolekularnych w żywych komórkach.

Jednocząsteczkowy pomiar dynamiki oddziaływań białek w kondensatach biomolekularnych

Poznaj metodę analizy w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji i translacji w komórkach aktywowanych. Technika łączy ChIP-seq, 4sU-seq i ribosome profiling dla kompleksowego obrazu regulacji genów.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej (Wideo) | JoVE Journal

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Przeglądaj więcej filmów