Wysokowydajna platforma mikromacierzy komórkowych do korelacyjnej analizy różnicowania komórek i sił trakcyjnych
March 1st, 2017
Różnicowanie komórek jest regulowane przez wiele czynników mikrośrodowiskowych, w tym zarówno skład matrycy, jak i właściwości materiału substratu. Opisujemy tutaj technikę wykorzystującą mikromacierze komórkowe w połączeniu z mikroskopią sił trakcyjnych do oceny zarówno różnicowania komórek, jak i biomechanicznych interakcji komórka-substrat w funkcji kontekstu mikrośrodowiskowego.
Ogólnym celem tej platformy mikromacierzy komórkowych jest skorelowanie pomiarów zarówno różnicowania komórek, jak i sił trakcyjnych w funkcji kontekstu mikrośrodowiskowego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu inżynierii tkankowej, umożliwiając zarówno podstawowe badania biologii komórek macierzystych, jak i optymalizację protokołów różnicowania. Główne zalety tej techniki to jej przepustowość, zdolność do różnicowania sygnałów biochemicznych i biofizycznych oraz odczyty punktów końcowych zarówno za pomocą immunofluorescencji, jak i mikroskopii sił trakcyjnych (TFM).
Chociaż korzystali z tych metod, osoby rozumiejące różnicowanie progenitorów wątroby mogą być łatwo stosowane do innych typów komórek tętniczych i kontekstów tkankowych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ sukces eksperymentalny zależy od integracji protokołu macierzenia zarówno z wysokiej jakości substratami hydrożelowymi, jak i mikroskopią sił trakcyjnych. Aby wytworzyć kulkę fluorescencyjną zawierającą hydrożele poliakryloamidowe na silanizowanej szalce Petriego o średnicy 35 mm ze szklanym dnem w celu oceny na żywo interakcji substratów komórkowych za pomocą TFM, najpierw przygotuj szklane podłoża w roztworach zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Umieść silanizowane szalki Petriego ze szklanym dnem o średnicy 35 mm w szklanej tacce do suszenia i odpipetuj 20 mikrolitrów kulki prepolimerowej 9 do 1 do roztworu fotoinicjatora na środku każdej naczynia. Delikatnie przykryj każde naczynie okrągłym szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 12 mm, unikając tworzenia się pęcherzyków. W celu rozprowadzenia kulek fluorescencyjnych na powierzchni hydrożelu należy odwrócić naczynia i pozostawić je w temperaturze pokojowej na 20 minut.
Wciąż odwrócona naczynie wystawiaj naczynie na działanie promieniowania UVA o długości 365 nanometrów przez 10 minut. W razie potrzeby zoptymalizuj czas polimeryzacji. Następnie zanurz hydrożele w 1 molowym buforze HEPES i pozostaw je na noc w temperaturze pokojowej w ciemności.
Ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe maszynką do golenia, uważając, aby nie uszkodzić spolimeryzowanych hydrożeli. Odwodnić hydrożele w temperaturze 50 stopni Celsjusza na gorącej płycie, aż wyschną. Hydrożele można przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności przez trzy miesiące.
Przygotuj do wydrukowania biomolekuł i dla płytki źródłowej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po załadowaniu czystych pinów zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy przygotować mikromacierz i zaprogramować ją za pomocą oprogramowania producenta. Następnie włącz nawilżacz.
Dostosuj nastawę na 65% wilgotności względnej i poczekaj, aż reometr dopasuje się do wartości zadanej. Umieść płytę źródłową w odpowiednim adapterze. Następnie umieść odwodnione podłoża hydrożelowe w odpowiednim adapterze.
Dostosuj parametry programu, aby dokładnie odzwierciedlić układ płyty źródłowej, projekt tablicy i żądany format. Rozpocznij produkcję tablicy. Sprawdzaj nie rzadziej niż raz na godzinę, czy wilgotność nie spadła poniżej 65% wilgotności względnej i czy kołki nie są zatkane.
Jeśli wilgotność nieoczekiwanie spadła, przerwij ustawianie w układzie w celu napełnienia nawilżacza i usunięcia powiązanych rurek kondensacji. Jeśli kołki są zatkane, przerwij ustawianie w szyku, aby wyczyścić kołki lub w inny sposób wymień je na wstępnie oczyszczone kołki. Po zakończeniu programu umieść wyprodukowane tablice w pudełku na slajdy lub mikropłytce pokrytej folią aluminiową.
Pozostaw matryce w temperaturze pokojowej przy wilgotności względnej 65% na noc. Z naszego doświadczenia wynika, że najczęstsze trudności są związane z produkcją tablic. Zalecamy potwierdzenie technicznej jakości i solidności wytworzonych macierzy przy użyciu cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie, ogólnych barwników białkowych i immunofluorescencyjnych.
Dzień po wytworzeniu zanurzyć matrycę 35 mm szalek Petriego w 3 ml 1% objętości na objętość penicyliny-streptomycyny w PVS. Wystawić ułożone podłoża na działanie promieni UVC przez 30 minut. Następnie zamień roztwór penicyliny i streptomycyny na pożywkę do hodowli komórkowych.
Po zebraniu i zliczeniu komórek, umieść komórki w tablicach po 3 ml na szalkę Petriego o średnicy 35 mm. Inkubuj kultury macierzy w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez dwie do 24 godzin lub do momentu powstania dobrze zaludnionych wysp komórkowych. Gęstość i czas siewu można dostosować w zależności od komórek i konkretnego zastosowania.
Po umożliwieniu tworzenia się wysp komórkowych, należy dwukrotnie przemyć kultury macierzy 3 ml wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych. W tym momencie do systemu biologicznego można dodać odpowiednie kontrole i zabiegi, które są przedmiotem zainteresowania. Zmieniaj pożywki w matrycach co jeden do dwóch dni, aby utrzymać stężenie wszelkich zabiegów.
W ciągu jednego do pięciu dni od rozpoczęcia hodowli macierzowych należy przeprowadzić ocenę interakcji substratów komórkowych na żywo za pomocą TFM. Przenieść 35-milimetrowe szalki Petriego zawierające kultury matrycowe do inkubowanego odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego ze stolikiem robotycznym do pomiarów TFM. W jednym naczyniu zaznacz pozycje i płaszczyzny ostrości poszczególnych wysp komórkowych za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym.
Przełącz się na mikroskopię fluorescencyjną dalekiej czerwieni, aby uwidocznić koraliki. Następnie wróć do każdej z pozycji zapisanych w poprzednim kroku i skoryguj współrzędną Z płaszczyzny ostrości, tak aby tylko pierwsza warstwa ściegów poniżej wyspy komórek była ostra. Zapisz nowe współrzędne i przejdź do automatycznego obrazowania wszystkich wysp komórkowych, aby uchwycić kontrast fazy przed dysocjacją i obrazy fluorescencyjne dalekiej czerwieni.
Następnie ostrożnie dodaj 150 mikrolitrów roztworu BSA/SDS do naczynia i odczekaj pięć minut, aby umożliwić całkowitą dysocjację komórek od substratu. Monitoruj dysocjację komórek za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Po oddzieleniu wysp komórkowych od podłoża wróć do zaznaczonych pozycji i sprawdź, czy pierwsza warstwa koralików jest nadal ostra.
Jeśli te koraliki są poza płaszczyzną z powodu deformacji wywołanej przez trakcję generowaną przez komórki, skoryguj współrzędną z płaszczyzny skupienia, aby ponownie były ostre. Zapisz skorygowane współrzędne Z i powtórz automatyczne obrazowanie wszystkich wysp, aby uchwycić obrazy fluorescencyjne dalekiej czerwieni po dysocjacji. Powtórz te kroki dla pozostałych potraw.
Sprzężone ligandy karbu A / G postrzępione jeden i delta podobne do jednego wykazały lepszą retencję w hydrożelach. Prezentacja liganda karbowego doprowadziła również do różnicowania komórek progenitorowych wątroby w kierunku losu komórek dróg żółciowych, na co wskazuje obecność markera komórek zielonego przewodu żółciowego. Odpowiedź na ligandy karbowe określono ilościowo dla pięciu białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i wykazano, że odpowiedź komórek progenitorowych wątroby na ligandy zależy od kontekstu ECM.
Mały knockdown RNA spinki do włosów wykorzystano do wygenerowania progenitorów bez ligandów delta, takich jak jeden i postrzępiony. Komórkom następnie przedstawiono ligandy z wycięciem postrzępionymi jeden i delta jak jeden i delta jak jeden, a delta jak cztery. Odpowiedź na ligand z wycięciem w szyku różniła się w zależności od wewnętrznej ekspresji każdego liganda w komórce.
Obrazy te pokazują różnicowanie komórek progenitorowych wątroby w zależności zarówno od sztywności substratu, jak i składu ECM. Analiza ilościowa wykazała, że kolagen 4 wspomaga różnicowanie zarówno na miękkich, jak i sztywnych podłożach, podczas gdy fibronektyna wspiera różnicowanie tylko na sztywnych podłożach. Reprezentatywne mapy cieplne sugerują, że utrzymujące się naprężenie trakcyjne przy niskiej sztywności podłoża na kolagenie 4 sprzyja różnicowaniu się w komórki dróg żółciowych.
Stwierdzenie to zostało potwierdzone przez kwantyfikację średnich wartości średnich kwadratów naprężeń trakcyjnych. Ten film i towarzyszący mu protokół przedstawiły główne etapy wytwarzania hydrożeli i matryc do przeprowadzania hodowli komórkowych na ugrupowanych substratach oraz do pomiaru interakcji substratów komórkowych za pomocą mikroskopii sił trakcyjnych. Po zapoznaniu się z technikami, każdy eksperyment można zakończyć w ciągu zaledwie jednego do dwóch tygodni, jeśli zostanie wykonany prawidłowo.
W zgodzie z tą metodą, hodowle komórkowe powinny być używane do walidacji warunków matrycowych o wysokiej punktacji przy użyciu jakościowego PCR, immuno blottingu, standardowych osi mechanobiologicznych lub innych uzupełniających technik biologii molekularnej. Ta wszechstronna platforma może być stosowana do wysokoprzepustowych badań funkcji komórek w wielu kontekstach komórkowych i tkankowych, w tym różnicowania komórek macierzystych i biologii komórek nowotworowych.
Przegląd
Niniejsze badanie prezentuje platformę mikroarrayu komórkowego zaprojektowaną w celu korelacji różnicowania komórek i sił traccyjnych w różnych kontekstach mikrośrodowiska. Metoda poprawia rozumienie biologii komórek macierzystych i zastosowań inżynierii tkankowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Inżynieria tkankowa
- Biomechanika
Tło
- Różnicowanie komórek jest wpływane przez czynniki mikrośrodowiskowe.
- Mikroskopia sił traccyjnych (TFM) jest używana do oceny interakcji komórka-podstawa.
- Techniki wysoko przepustowe są niezbędne dla rozwoju badań nad komórkami macierzystymi.
- Integracja wskazówek biochemicznych i biofizycznych jest krytyczna dla sukcesu eksperymentu.
Cel badania
- Ocenić różnicowanie komórek i interakcje biomechaniczne.
- Optymalizować protokoły różnicowania dla różnych typów komórek.
- Dostarczyć wizualnej demonstracji techniki mikroarrayu.
Stosowane metody
- Wytwarzanie żeli poliakrylowych z fluorescencyjnymi kulkami.
- Drukowanie mikroarrayu biomolekuł.
- Hodowla komórek i ich siew na wytworzonych mikroarrayach.
- Ocena na żywo interakcji komórka-podstawa za pomocą TFM.
Główne wyniki
- Metoda pozwala na monitorowanie zachowania komórek w czasie rzeczywistym.
- Pomyślne różnicowanie komórek progenitorów wątroby zostało zademonstrowane.
- Można wytworzyć wysokiej jakości mikroarraye z konsystencją wyników.
- TFM dostarcza wglądu w mechaniczne właściwości interakcji komórek.
Wnioski
- Platforma mikroarrayu komórkowego jest cennym narzędziem dla badań nad komórkami macierzystymi.
- Umożliwia badanie różnych typów komórek i ich różnicowania.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować inne konteksty tkankowe.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This platform enables high-throughput correlation of biochemical and biophysical cues in stem cell differentiation, addressing a key challenge in tissue engineering and regenerative medicine. By integrating immunofluorescence and traction force microscopy, it provides quantitative, multiparametric readouts that enhance predictive confidence in early target validation and mechanistic de-risking. The system supports scalable screening of microenvironmental factors, informing go/no-go decisions in preclinical pipeline advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating differentiation outcomes with subcellular traction forces under defined microenvironmental conditions.
- Operational Value: Supports functional target validation through high-throughput screening of ECM proteins and ligand combinations in a controlled, reproducible format.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by identifying how substrate stiffness and biochemical cues jointly influence cell fate decisions, reducing ambiguity in target mechanism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative datasets on cell differentiation and traction forces, enabling reliable compound or ligand evaluation across arrayed conditions.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through standardized hydrogel fabrication, controlled humidity during printing, and validated bead-based TFM readouts.
- Scalability Value: Compatible with microarray printing workflows, allowing parallel testing of dozens of microenvironmental combinations per slide for efficient lead identification.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Demonstrates disease-relevant applicability in liver progenitor differentiation, with direct readouts of bile duct cell fate via immunofluorescence and biomechanical metrics.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery-scale mechanistic insights with preclinical validation by providing multiparametric data on differentiation efficacy and mechanobiological responses.
- Risk-Adjusted Decision-Making: Enables prioritization of conditions that show sustained traction stress and differentiation on permissive matrices, supporting data-driven advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, particularly for targets where mechanotransduction influences efficacy or toxicity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating the effects of arrayed biochemical and biophysical variables on cell differentiation and force generation.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized outputs via immunofluorescence and TFM, enabling quantitative comparison of microenvironmental conditions.
- Analytics: Provides multiparametric readouts (fluorescence intensity, traction stress RMS) that allow teams to rank conditions by differentiation efficacy and mechanical phenotype.
- Translational Research: Connects to preclinical work through validated, disease-relevant cell models and measurable biomechanical endpoints predictive of tissue-level behavior.
- Enterprise Reuse: Fabricated hydrogel substrates are storable and reusable across projects, positioning the platform as a scalable, cross-disciplinary capability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target mechanisms by reducing mechanistic ambiguity through correlated biochemical and biomechanical profiling.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via controlled hydrogel fabrication, environmental monitoring during arraying, and validated dissociation/re-imaging workflows for TFM.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid triage of microenvironmental conditions, reducing reliance on low-throughput, sequential validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying conditions with concordant differentiation and biomechanical responses, informing advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hydrogel chemistry, microarray printing, and traction force microscopy setup and calibration.
- Dependent on access to UVA/UVC exposure systems, humidified arraying platforms, and inverted fluorescent microscopes with robotic stages.
- Necessitates cross-team standardization of array fabrication protocols, including humidity control, pin maintenance, and substrate storage conditions.
- Adaptation to alternative cell types may require optimization of seeding density, culture duration, and dissociation conditions.
- Practical limitations include the need for careful bubble avoidance during hydrogel polymerization and validation of array quality via fluorescent labeling prior to cell culture.
