Wysokowydajna platforma mikromacierzy komórkowych do korelacyjnej analizy różnicowania komórek i sił trakcyjnych
1 marca 2017
Różnicowanie komórek jest regulowane przez wiele czynników mikrośrodowiskowych, w tym zarówno skład matrycy, jak i właściwości materiału substratu. Opisujemy tutaj technikę wykorzystującą mikromacierze komórkowe w połączeniu z mikroskopią sił trakcyjnych do oceny zarówno różnicowania komórek, jak i biomechanicznych interakcji komórka-substrat w funkcji kontekstu mikrośrodowiskowego.
Ogólnym celem tej platformy mikromacierzy komórkowych jest skorelowanie pomiarów zarówno różnicowania komórek, jak i sił trakcyjnych w funkcji kontekstu mikrośrodowiskowego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu inżynierii tkankowej, umożliwiając zarówno podstawowe badania biologii komórek macierzystych, jak i optymalizację protokołów różnicowania. Główne zalety tej techniki to jej przepustowość, zdolność do różnicowania sygnałów biochemicznych i biofizycznych oraz odczyty punktów końcowych zarówno za pomocą immunofluorescencji, jak i mikroskopii sił trakcyjnych (TFM).
Chociaż korzystali z tych metod, osoby rozumiejące różnicowanie progenitorów wątroby mogą być łatwo stosowane do innych typów komórek tętniczych i kontekstów tkankowych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ sukces eksperymentalny zależy od integracji protokołu macierzenia zarówno z wysokiej jakości substratami hydrożelowymi, jak i mikroskopią sił trakcyjnych. Aby wytworzyć kulkę fluorescencyjną zawierającą hydrożele poliakryloamidowe na silanizowanej szalce Petriego o średnicy 35 mm ze szklanym dnem w celu oceny na żywo interakcji substratów komórkowych za pomocą TFM, najpierw przygotuj szklane podłoża w roztworach zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Umieść silanizowane szalki Petriego ze szklanym dnem o średnicy 35 mm w szklanej tacce do suszenia i odpipetuj 20 mikrolitrów kulki prepolimerowej 9 do 1 do roztworu fotoinicjatora na środku każdej naczynia. Delikatnie przykryj każde naczynie okrągłym szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 12 mm, unikając tworzenia się pęcherzyków. W celu rozprowadzenia kulek fluorescencyjnych na powierzchni hydrożelu należy odwrócić naczynia i pozostawić je w temperaturze pokojowej na 20 minut.
Wciąż odwrócona naczynie wystawiaj naczynie na działanie promieniowania UVA o długości 365 nanometrów przez 10 minut. W razie potrzeby zoptymalizuj czas polimeryzacji. Następnie zanurz hydrożele w 1 molowym buforze HEPES i pozostaw je na noc w temperaturze pokojowej w ciemności.
Ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe maszynką do golenia, uważając, aby nie uszkodzić spolimeryzowanych hydrożeli. Odwodnić hydrożele w temperaturze 50 stopni Celsjusza na gorącej płycie, aż wyschną. Hydrożele można przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności przez trzy miesiące.
Przygotuj do wydrukowania biomolekuł i dla płytki źródłowej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po załadowaniu czystych pinów zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy przygotować mikromacierz i zaprogramować ją za pomocą oprogramowania producenta. Następnie włącz nawilżacz.
Dostosuj nastawę na 65% wilgotności względnej i poczekaj, aż reometr dopasuje się do wartości zadanej. Umieść płytę źródłową w odpowiednim adapterze. Następnie umieść odwodnione podłoża hydrożelowe w odpowiednim adapterze.
Dostosuj parametry programu, aby dokładnie odzwierciedlić układ płyty źródłowej, projekt tablicy i żądany format. Rozpocznij produkcję tablicy. Sprawdzaj nie rzadziej niż raz na godzinę, czy wilgotność nie spadła poniżej 65% wilgotności względnej i czy kołki nie są zatkane.
Jeśli wilgotność nieoczekiwanie spadła, przerwij ustawianie w układzie w celu napełnienia nawilżacza i usunięcia powiązanych rurek kondensacji. Jeśli kołki są zatkane, przerwij ustawianie w szyku, aby wyczyścić kołki lub w inny sposób wymień je na wstępnie oczyszczone kołki. Po zakończeniu programu umieść wyprodukowane tablice w pudełku na slajdy lub mikropłytce pokrytej folią aluminiową.
Pozostaw matryce w temperaturze pokojowej przy wilgotności względnej 65% na noc. Z naszego doświadczenia wynika, że najczęstsze trudności są związane z produkcją tablic. Zalecamy potwierdzenie technicznej jakości i solidności wytworzonych macierzy przy użyciu cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie, ogólnych barwników białkowych i immunofluorescencyjnych.
Dzień po wytworzeniu zanurzyć matrycę 35 mm szalek Petriego w 3 ml 1% objętości na objętość penicyliny-streptomycyny w PVS. Wystawić ułożone podłoża na działanie promieni UVC przez 30 minut. Następnie zamień roztwór penicyliny i streptomycyny na pożywkę do hodowli komórkowych.
Po zebraniu i zliczeniu komórek, umieść komórki w tablicach po 3 ml na szalkę Petriego o średnicy 35 mm. Inkubuj kultury macierzy w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez dwie do 24 godzin lub do momentu powstania dobrze zaludnionych wysp komórkowych. Gęstość i czas siewu można dostosować w zależności od komórek i konkretnego zastosowania.
Po umożliwieniu tworzenia się wysp komórkowych, należy dwukrotnie przemyć kultury macierzy 3 ml wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych. W tym momencie do systemu biologicznego można dodać odpowiednie kontrole i zabiegi, które są przedmiotem zainteresowania. Zmieniaj pożywki w matrycach co jeden do dwóch dni, aby utrzymać stężenie wszelkich zabiegów.
W ciągu jednego do pięciu dni od rozpoczęcia hodowli macierzowych należy przeprowadzić ocenę interakcji substratów komórkowych na żywo za pomocą TFM. Przenieść 35-milimetrowe szalki Petriego zawierające kultury matrycowe do inkubowanego odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego ze stolikiem robotycznym do pomiarów TFM. W jednym naczyniu zaznacz pozycje i płaszczyzny ostrości poszczególnych wysp komórkowych za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym.
Przełącz się na mikroskopię fluorescencyjną dalekiej czerwieni, aby uwidocznić koraliki. Następnie wróć do każdej z pozycji zapisanych w poprzednim kroku i skoryguj współrzędną Z płaszczyzny ostrości, tak aby tylko pierwsza warstwa ściegów poniżej wyspy komórek była ostra. Zapisz nowe współrzędne i przejdź do automatycznego obrazowania wszystkich wysp komórkowych, aby uchwycić kontrast fazy przed dysocjacją i obrazy fluorescencyjne dalekiej czerwieni.
Następnie ostrożnie dodaj 150 mikrolitrów roztworu BSA/SDS do naczynia i odczekaj pięć minut, aby umożliwić całkowitą dysocjację komórek od substratu. Monitoruj dysocjację komórek za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Po oddzieleniu wysp komórkowych od podłoża wróć do zaznaczonych pozycji i sprawdź, czy pierwsza warstwa koralików jest nadal ostra.
Jeśli te koraliki są poza płaszczyzną z powodu deformacji wywołanej przez trakcję generowaną przez komórki, skoryguj współrzędną z płaszczyzny skupienia, aby ponownie były ostre. Zapisz skorygowane współrzędne Z i powtórz automatyczne obrazowanie wszystkich wysp, aby uchwycić obrazy fluorescencyjne dalekiej czerwieni po dysocjacji. Powtórz te kroki dla pozostałych potraw.
Sprzężone ligandy karbu A / G postrzępione jeden i delta podobne do jednego wykazały lepszą retencję w hydrożelach. Prezentacja liganda karbowego doprowadziła również do różnicowania komórek progenitorowych wątroby w kierunku losu komórek dróg żółciowych, na co wskazuje obecność markera komórek zielonego przewodu żółciowego. Odpowiedź na ligandy karbowe określono ilościowo dla pięciu białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i wykazano, że odpowiedź komórek progenitorowych wątroby na ligandy zależy od kontekstu ECM.
Mały knockdown RNA spinki do włosów wykorzystano do wygenerowania progenitorów bez ligandów delta, takich jak jeden i postrzępiony. Komórkom następnie przedstawiono ligandy z wycięciem postrzępionymi jeden i delta jak jeden i delta jak jeden, a delta jak cztery. Odpowiedź na ligand z wycięciem w szyku różniła się w zależności od wewnętrznej ekspresji każdego liganda w komórce.
Obrazy te pokazują różnicowanie komórek progenitorowych wątroby w zależności zarówno od sztywności substratu, jak i składu ECM. Analiza ilościowa wykazała, że kolagen 4 wspomaga różnicowanie zarówno na miękkich, jak i sztywnych podłożach, podczas gdy fibronektyna wspiera różnicowanie tylko na sztywnych podłożach. Reprezentatywne mapy cieplne sugerują, że utrzymujące się naprężenie trakcyjne przy niskiej sztywności podłoża na kolagenie 4 sprzyja różnicowaniu się w komórki dróg żółciowych.
Stwierdzenie to zostało potwierdzone przez kwantyfikację średnich wartości średnich kwadratów naprężeń trakcyjnych. Ten film i towarzyszący mu protokół przedstawiły główne etapy wytwarzania hydrożeli i matryc do przeprowadzania hodowli komórkowych na ugrupowanych substratach oraz do pomiaru interakcji substratów komórkowych za pomocą mikroskopii sił trakcyjnych. Po zapoznaniu się z technikami, każdy eksperyment można zakończyć w ciągu zaledwie jednego do dwóch tygodni, jeśli zostanie wykonany prawidłowo.
W zgodzie z tą metodą, hodowle komórkowe powinny być używane do walidacji warunków matrycowych o wysokiej punktacji przy użyciu jakościowego PCR, immuno blottingu, standardowych osi mechanobiologicznych lub innych uzupełniających technik biologii molekularnej. Ta wszechstronna platforma może być stosowana do wysokoprzepustowych badań funkcji komórek w wielu kontekstach komórkowych i tkankowych, w tym różnicowania komórek macierzystych i biologii komórek nowotworowych.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia platformę mikrotablic komórkowych zaprojektowaną w celu skorelowania różnicowania komórek i sił trakcyjnych w różnych kontekstach mikrośrodowiskowych. Metoda ta pogłębia zrozumienie biologii komórek macierzystych oraz zastosowań w inżynierii tkankowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Inżynieria tkankowa
- Biomechanika
Wprowadzenie
- Różnicowanie komórek jest uwarunkowane czynnikami mikrośrodowiskowymi.
- Mikroskopia sił trakcyjnych (TFM) jest wykorzystywana do oceny oddziaływań między komórką a podłożem.
- Techniki wysokoprzepustowe są niezbędne dla rozwoju badań nad komórkami macierzystymi.
- Integracja sygnałów biochemicznych i biofizycznych jest kluczowa dla sukcesu eksperymentalnego.
Cel badania
- Ocena różnicowania komórek i oddziaływań biomechanicznych.
- Optymalizacja protokołów różnicowania dla różnych typów komórek.
- Przedstawienie wizualnej demonstracji techniki mikroarray.
Zastosowane metody
- Wytwarzanie hydrożeli poliakrylamidowych z fluorescencyjnymi kuleczkami.
- Druk mikroarray biomolekuł.
- Hodowla komórkowa i wysiew na wytworzonych macierzach.
- Ocena na żywo oddziaływań komórka-podłoże z wykorzystaniem TFM.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia monitorowanie zachowania komórek w czasie rzeczywistym.
- Wykazano skuteczną różnicowanie komórek progenitorowych wątroby.
- Możliwe jest wytwarzanie wysokiej jakości matryc z powtarzalnymi wynikami.
- TFM dostarcza informacji na temat właściwości mechanicznych oddziaływań komórkowych.
Wnioski
- Platforma mikroarrayów komórkowych jest cennym narzędziem w badaniach nad komórkami macierzystymi.
- Umożliwia ona badanie różnych typów komórek oraz ich różnicowania.
- Przyszłe zastosowania mogą objąć inne konteksty tkankowe.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Platforma ta umożliwia wysokoprzepustową korelację sygnałów biochemicznych i biofizycznych w procesie różnicowania się komórek macierzystych, odpowiadając na kluczowe wyzwanie w inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej. Dzięki integracji immunofluorescencji i mikroskopii sił trakcyjnych dostarcza ona ilościowe, multiparametryczne odczyty, które zwiększają pewność prognostyczną we wczesnej walidacji celów oraz w ograniczaniu ryzyka mechanistycznego. System wspiera skalowalny screening czynników mikrośrodowiskowych, dostarczając informacji niezbędnych do podejmowania decyzji typu go/no-go w rozwoju przedklinicznych etapów badań.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez korelację wyników różnicowania z subkomórkowymi siłami trakcji w określonych warunkach mikrośrodowiska.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez wysokoprzepustowy screening białek ECM oraz kombinacji ligandów w kontrolowanym, powtarzalnym formacie.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez identyfikację wpływu sztywności podłoża i sygnałów biochemicznych na decyzje dotyczące losów komórki, co zmniejsza niejednoznaczność w zakresie mechanizmu działania celu.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie ustandaryzowanych, ilościowych zbiorów danych dotyczących różnicowania komórek i sił trakcyjnych, co umożliwia wiarygodną ocenę związków lub ligandów w wielu warunkach rozmieszczonych w układzie macierzowym.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność analizy dzięki standaryzacji procesu wytwarzania hydrożeli, kontrolowanej wilgotności podczas drukowania oraz zwalidowanym odczytom TFM opartym na koralikach.
- Wartość skalowalności: Jest kompatybilna z procesami drukowania mikrotablic, co pozwala na równoległe testowanie dziesiątek kombinacji mikrośrodowisk na jednym szkiełku w celu efektywnej identyfikacji potencjalnych kandydatów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Wykazuje zastosowanie w kontekście chorobowym w różnicowaniu progenitorów wątroby, z bezpośrednim odczytem losu komórek przewodów żółciowych za pomocą immunofluorescencji i wskaźników biomechanicznych.
- Ciągłość przedkliniczna: Łączy mechanistyczne spostrzeżenia w skali odkryć z walidacją przedkliniczną, dostarczając wieloparametrycznych danych na temat skuteczności różnicowania i odpowiedzi mechanobiologicznych.
- Podejmowanie decyzji z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia priorytetyzację warunków wykazujących trwałe naprężenie trakcyjne i różnicowanie na matrycach dopuszczalnych, co wspiera postęp oparty na danych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych po identyfikację związków wiodących, szczególnie w przypadku celów, w których mechanotransdukcja wpływa na skuteczność lub toksyczność.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez izolację wpływu zestawionych zmiennych biochemicznych i biofizycznych na różnicowanie komórek i generowanie siły.
- Przesiewanie: Dostarcza ustandaryzowanych wyników gotowych do analizy za pomocą immunofluorescencji i TFM, umożliwiając ilościowe porównanie warunków mikrośrodowiskowych.
- Analityka: Zapewnia wieloparametryczne odczyty (intensywność fluorescencji, RMS naprężenia trakcyjnego), które pozwalają zespołom szeregować warunki pod kątem skuteczności różnicowania i fenotypu mechanicznego.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez zwalidowane, istotne dla choroby modele komórkowe oraz mierzalne punkty końcowe biomechaniczne, które pozwalają przewidzieć zachowanie na poziomie tkanki.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Wytworzone podłoża hydrożelowe można przechowywać i ponownie wykorzystywać w różnych projektach, co pozycjonuje platformę jako skalowalną, interdyscyplinarną funkcjonalność.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do mechanizmów docelowych poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki skorelowanemu profilowaniu biochemicznemu i biomechanicznemu.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację dzięki kontrolowanemu wytwarzaniu hydrożeli, monitorowaniu środowiska podczas tworzenia macierzy oraz zwalidowanym procesom dysocjacji i ponownego obrazowania w TFM.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając szybką selekcję warunków mikrośrodowiskowych, co ogranicza zależność od niskoprzepustowej, sekwencyjnej walidacji.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka poprzez identyfikację warunków z zgodnymi odpowiedziami biomechanicznymi i różnicowaniem, co dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o dalszym rozwoju.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie chemii hydrożeli, drukowania mikrotablic oraz konfiguracji i kalibracji mikroskopii sił trakcyjnych.
- Zależne od dostępu do systemów naświetlania UVA/UVC, nawilżanych platform do tworzenia tablic oraz odwróconych mikroskopów fluorescencyjnych z mechanicznymi stolikami.
- Wymaga standaryzacji protokołów wytwarzania tablic pomiędzy zespołami, w tym kontroli wilgotności, konserwacji pinów oraz warunków przechowywania podłoża.
- Adaptacja do alternatywnych typów komórek może wymagać optymalizacji gęstości siewu, czasu hodowli oraz warunków dysocjacji.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność starannego unikania pęcherzyków powietrza podczas polimeryzacji hydrożelu oraz walidację jakości tablic poprzez znakowanie fluorescencyjne przed hodowlą komórek.
