Name: Wysokowydajna platforma mikromacierzy komórkowych do korelacyjnej analizy różnicowania komórek i sił trakcyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Poznaj wysokowydajną platformę mikromacierzy komórkowych do korelacyjnej analizy różnicowania komórek i sił trakcyjnych. Ta metoda umożliwia badanie biologii komórek macierzystych oraz optymalizację protokołów różnicowania w inżynierii tkankowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Austinowi Cyphersmithowi i Mayandi Sivaguru (Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana–Champaign) za pomoc w mikroskopii i hojne wykorzystanie ekranu i wideo w rdzeniu mikroskopii.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W naszych eksperymentach odkryliśmy, że najczęstsze awarie są związane z jakością sfabrykowanych macierzy i słabo scharakteryzowaną odpowiedzią w systemie biologicznym będącym przedmiotem zainteresowania. Odsyłamy czytelnika do Tabeli 1, aby zapoznać się z typowymi trybami awarii w eksperymentach z mikromacierzami komórkowymi i powiązanymi krokami rozwiązywania problemów. W szczególności jeśli chodzi o jakość tablic, zalecamy następujące elementy. Potwierdź techniczną jakość i solidność programów, parametrów i macierzujących przy użyciu cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie, takich jak dekstran sprzężony z rodaminą. Dokładnie wyczyść kołki przed lub po ułożeniu zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie sprawdź wzrokowo, czy kanały sworzniowe są wolne od zanieczyszczeń za pomocą mikroskopu świetlnego. Potwierdź retencję biomolekuły w szyku za pomocą ogólnych barwień białek lub znakowania immunologicznego. Należy zauważyć, że biomolekuły o masie cząsteczkowej poniżej 70 kDa często nie są zatrzymywane w hydrożelu23,31. Walidacja funkcjonalności komórek biomolekuł w szyku przy użyciu wielu typów komórek. Należy pamiętać, że tylko przylegające komórki są zgodne z tablicami; dodatkowo adhezja do macierzy jest zależna zarówno od właściwości specyficznych dla komórki (np. profilu ekspresji integryny), jak i wybranych białek ECM.
Ze względu na ograniczoną ilość miejsca, nie przedstawiliśmy tutaj obszernego omówienia projektu, układu i produkcji tablicy i odsyłamy czytelnika do poprzednich prac 23,25. Zazwyczaj używamy 100 podtablic plamek (średnica plamki 150 μm, odległość 450 μm od środka do środka) składających się z 10–20 unikalnych warunków biomolekuł (tj. 5–10 plamek/warunek). Liczba podmatryc w jednej matrycy różni się w zależności od liczby interesujących warunków biomolekuł, które można wygodnie skalować do 1,280 na jednym szkiełku mikroskopowym 25 × 75 mm (~ 6,400 plamek w 64 podukładach)25,31. Powyższe parametry będą się dalej różnić w zależności od wielkości interesującego Cię wzoru; Piny zdolne do generowania wzorów od 75 do 450 μm są łatwo dostępne.
Eksperymenty macierzowe najlepiej uzupełnia walidacja wysoko punktowanych warunków w układzie macierzowym przy użyciu innych formatów hodowli, odczytów testów i systemów modeli biologicznych. W szczególności zalecamy dalszą walidację efektów wybranych warunków macierzowych przy użyciu kultur masowych w połączeniu ze standardowymi technikami biologii molekularnej (np. qRT-PCR, immunoblotting) lub standardowym TFM. Manipulacja genetyczna (np. knockdown lub nadekspresja) czynnika będącego przedmiotem zainteresowania w odpowiednim systemie modelu biologicznego może również służyć do potwierdzenia efektów zaobserwowanych w tablicach. Modele zwierzęce in vivo stanowią kolejny sposób walidacji i zostały ostatnio wykorzystane, na przykład, do potwierdzenia centralnej roli galektyny-3 i galektyny-8 w niszy przerzutowej raka płuc, jak początkowo zidentyfikowano za pomocą mikromacierzy komórkowej31,49.
Do zbadania mikrośrodowiskowej regulacji funkcji komórkowych wykorzystano szereg innych metod, w tym różnorodne dwuwymiarowe systemy mikrofabrykowane 18,50,51,52,53,54,55 i trójwymiarowe systemy biomateriałowe 56,57,58,59. Lokal mieszkalny 60,61. W porównaniu z innymi metodami, szczególne zalety opisanej tutaj platformy mikromacierzy komórkowych obejmują: (1) przepustowość do setek lub tysięcy różnych kombinacji czynników, umożliwiającą analizę efektów interakcji; 2) dostępne, zautomatyzowane obrazowanie i analiza; (3) integracja odczytów zarówno biochemicznych, jak i biofizycznych z kontrolowaną prezentacją czynników w układzie mięśni; (4) możliwość różnicowania właściwości materiału podłoża; oraz (5) analiza losu i funkcji komórek o wysokiej zawartości.
Podsumowując, połączenie mikromacierzy komórkowych z TFM na podłożach o regulowanej sztywności substratu umożliwia dokładne scharakteryzowanie zarówno sygnałów biochemicznych, jak i biofizycznych. Jak przedstawiono tutaj, platforma ta jest uogólniona i może być łatwo stosowana do różnych przylegających typów komórek i kontekstów tkankowych w celu lepszego zrozumienia kombinatorycznej regulacji mikrośrodowiskowej różnicowania komórek i mechanotransdukcji.

Interakcje między komórkami a otaczającymi je czynnikami mikrośrodowiskowymi pośredniczą w wielu różnych procesach biologicznych podczas rozwoju, homeostazy i patogenezy chorób1,2,3,4. Te interakcje mikrośrodowiskowe obejmują dostarczanie rozpuszczalnych czynników do komórek, wiązanie komórka-macierz oraz interakcje komórka-komórka poprzez wiązanie ligand-receptor. Oprócz powyższych rozważań biochemicznych, parametry biofizyczne, takie jak właściwości mechaniczne substratu (np. moduł Younga, porowatość) i kształt komórki oraz związana z tym mechanotransdukcja w dalszej części łańcucha dostaw, coraz częściej zyskują uznanie jako kluczowe mediatory różnicowania komórek5,6,7,8,9,10. Sygnały wynikające z tych interakcji mikrośrodowiskowych służą jako dane wejściowe do sieci genów i szlaków sygnałowych. Co więcej, te wewnętrzne komponenty komórki dostarczają również informacje zwrotne do mikrośrodowiska za pośrednictwem wydzielanych czynników i enzymów rozkładających matrycę, kończąc złożoną pętlę koregulacyjną między programami genetycznymi wewnętrznymi komórki a zewnętrznymi czynnikami mikrośrodowiskowymi komórki5,11,12.
Wykorzystanie systemów inżynieryjnych do kontrolowanej prezentacji czynników mikrośrodowiskowych okazało się przydatne w wielu różnych kontekstach13,14,15. W szczególności systemy mikrofabrykowane ułatwiły precyzyjne przestrzenne wzorcowanie białek i komórek, a także wysoce równoległą analizę poprzez miniaturyzację13,16,17,18,19,20,21,22. Mikromacierze komórkowe reprezentują jeden z takich mikrofabrykowanych systemów, w którym kombinacje biomolekuł są drukowane kontaktowo na elastycznym podłożu z hydrożelu poliakrylamidowego23,24,25. Włączenie składników adhezyjnych komórek (a mianowicie białek macierzy) umożliwia trwałą adhezję komórek i hodowlę na mikromacierzach, po której często następuje dalsza analiza za pomocą immunocytochemii i reporterów fluorescencyjnych. Mikromacierze komórkowe zostały produktywnie ukierunkowane na lepsze zrozumienie fenotypu komórek wątroby23,26, różnicowanie prekursorów neuronalnych27, decyzje o losie przodka sutka28, utrzymanie/różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych23,29,30, przerzuty raka płuc31, oraz odpowiedź terapeutyczna w czerniaku32. Niedawno zademonstrowaliśmy zastosowanie mikromacierzy komórkowych do definiowania roli składu białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w specyfikacji endodermy33, różnicowaniu progenitorów wątroby34,35 i odpowiedzi na lek na komórki nowotworu płuc36. W tych pracach skupiliśmy się na rozszerzeniu możliwości kombinatorycznych platformy macierzy i zbadaniu przecięć sygnalizacji wewnętrznej komórki ze składem macierzy zewnątrzkomórkowej i biomechaniką. Ponadto zaimplementowaliśmy odczyty biofizyczne w tej platformie tablicowej, aby zapewnić możliwość ilościowego scharakteryzowania roli kurczliwości komórek w procesach różnicowania35. W tym celu zintegrowaliśmy mikroskopię sił trakcyjnych (TFM) z mikromacierzami komórek, aby umożliwić wysokoprzepustową ocenę trakcji generowanej przez komórki. TFM jest szeroko stosowaną metodą pomiaru sił trakcyjnych generowanych przez komórki i dostarczyła istotnych informacji na temat koordynacji funkcji na poziomie pojedynczej komórki i tkanki ze składem i biomechaniką lokalnego mikrośrodowiska37,38,39,40. W ten sposób połączenie TFM z mikromacierzami komórkowymi zapewnia wysokowydajny system do pomiaru kluczowych, fizjologicznie istotnych parametrów biofizycznych.
Opisana tutaj platforma mikromacierzy komórkowych składa się z czterech sekcji: produkcja substratów poliakrylamidowych, produkcja tablic, hodowla komórkowa i odczyt testów oraz analiza danych. Rysunek 1 przedstawia schematyczne podsumowanie pierwszych trzech sekcji eksperymentalnych; patrz rysunek 2 w celu schematycznego podsumowania ostatniej sekcji, z naciskiem na analizę danych immunofluorescencyjnych. W celu dostosowania platformy mikromacierzy komórkowej do badań biomechanicznych interakcji komórka-substrat, użyliśmy substratów poliakrylamidowych o przestrajalnym module Younga, ale podobnej porowatości, według Wen i wsp.41. Aby umożliwić TFM pomiary sił wywieranych przez komórki na ich podłoże, zaimplementowaliśmy format szklanej płytki Petriego, oprócz grubych szkiełek mikroskopowych często używanych przez inne grupy. W ten sposób ta platforma mikromacierzy komórkowej jest zdolna do równoległych pomiarów różnicowania komórek za pomocą immunofluorescencji na szkiełkach mikroskopowych i sił generowanych przez komórki za pomocą TFM na oddzielnych naczyniach ze szklanym dnem. Zastosowaliśmy również kilka ulepszeń w podejściu analitycznym powszechnie stosowanym w przypadku mikromacierzy komórkowych. W szczególności, zamiast parametrycznej punktacji Z ogólnej intensywności wyspy, mierzymy intensywność pojedynczej komórki i stosujemy normalizację kwantylową w celu uwzględnienia rozkładów nienormalnych i dokładniejszego opisania zachowania komórek. Uważamy, że te ulepszenia są szczególnie użyteczne w badaniach procesów biologicznych, w których zarówno sygnały biochemiczne, jak i biofizyczne odgrywają znaczące, przecinające się role. Co więcej, nasze ulepszenia analityczne umożliwiają zastosowanie mikromacierzy komórkowych do badań nad szeregiem funkcji komórkowych, w przypadku których zachowania na poziomie pojedynczej komórki i populacji są rozbieżne.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mikro; m filtr strzykawkowy</td><td>Pall Corporation</td><td>4433</td><td>Pasuje do plastikowych strzykawek Luer lock o odpowiedniej wielkości.</td></tr><tr><td>100 & razy; penicylina&ndash; roztwór streptomycyny</td><td>Fisher Scientific SV30010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 i 60 mm okulary nakrywkowe</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>63765</td><td></td></tr><tr><td>3-(trimetysililo)metakrylan propylu (3-TPM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159</td><td>Przechowywać w atmosferze gazu obojętnego zgodnie z instrukcjami producenta. Wystawienie 3-TPM na działanie powietrza może zagrozić silanizacji podłoży szklanych. UWAGA: 3-TPM jest cieczą palną. Przechowywać z dala od źródeł ciepła, iskier, otwartego ognia i gorących powierzchni i używać wyłącznie w dygestoriach chemicznych.</td></tr><tr><td>Hydrat 3-[(3-cholamidopropylo)dimetyloamonio]-1-propanosulfonianu (CHAPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3023</td><td></td></tr><tr><td>35 mm szalki Petriego ze szklanym dnem</td><td>Komórka E& G</td><td>GBD00002-200</td><td>13 mm dobrze składający się ze szkła nakrywkowego #1,5. Umożliwia TFM i obrazowanie żywych komórek.</td></tr><tr><td>384-dołkowa polipropylenowa mikropłytka z dnem w kształcie litery V, niesterylna</td><td>USA Scientific</td><td>1823-8400</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe mikropłytki polistyrenowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>35-milimetrowe szalki Petriego ze szklanym dnem pasują do studzienek mikropłytki, ułatwiając wytwarzanie matrycy.</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179973</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td>UWAGA: Narażenie na akrylamid może powodować ostrą toksyczność i podrażnienie. Nosić rękawice ochronne, odzież i okulary ochronne.</td></tr><tr><td>Kolagen I, ogon szczura</td><td>EMD Millipore</td><td>08-115MI</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen III, ludzki</td><td>EMD Millipore</td><td>CC054</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen IV, ludzki</td><td>EMD Millipore</td><td>CC076</td><td></td></tr><tr><td>Środek sieciujący, 365 nm</td><td>UVP</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran, rodamina B-sprzężona, 70 kDa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1841</td><td>Używany jako marker do lokalizacji tablicy.</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (PBS)</td><td>Fisher Scientific (HyClone)</td><td>SH3001302</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Fc-rekombinowany DLL1, mysz</td><td>R& D Systems</td><td>5026-DL-050</td><td></td></tr><tr><td>Fc-rekombinant DLL4, mysz</td><td>AdipoGen</td><td>AG-40A-0145-C050</td><td></td></tr><tr><td>Fc-rekombinowany JAG1, szczur</td><td>R& D Systems</td><td>599-JG-100</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna, ludzki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny, odwrócony</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td>Upewnij się, że mikroskop jest wyposażony w stolik robotyczny zarówno do automatycznego obrazowania fluorescencyjnego, jak i TFM. Kontrola środowiska (i., 37 &deg; C i 5% CO2) są wysoce wskazane dla TFM.</td></tr><tr><td>Fluoromount G z DAPI</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td>UWAGA: Kwas octowy jest łatwopalny i. Nosić rękawice ochronne, odzież i okulary ochronne.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>BASF Corporation</td><td>55047962</td><td></td></tr><tr><td>Laminin, mysz</td><td>EMD Millipore</td><td>CC095</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179957</td><td></td></tr><tr><td>Skaner mikromacierzy</td><td>GenePix</td><td>4000B</td><td>Fluorofory muszą być kompatybilne z Cy3 lub Cy5.</td></tr><tr><td>Mikromacierz</td><td>Digilab</td><td>OmniGrid Micro</td><td>Inne mikromacierze o podobnych lub większych możliwościach mogą być łatwo zastąpione.</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe, 25 i razy; 75 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS294775X25</td> <td>~ 0,9 & ndash; 1,1 mm grubości.</td></tr><tr><td>N,N&prime; -Metylenobisakryloamid (bisakrylamid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7279</td><td>UWAGA: Narażenie na akrylamid może powodować ostrą toksyczność i podrażnienie. Nosić rękawice ochronne, odzież i okulary ochronne.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA), 16% v/v</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>RT15710</td><td>Przygotuj PFA świeży (nie przechowywać) w celu optymalnego utrwalenia. UWAGA: Narażenie na PFA może powodować ostrą toksyczność, a także może podrażniać lub korodować skórę w kontakcie. Nosić rękawice ochronne, odzież i okulary ochronne i używać tylko w okapie oparów chemicznych.</td></tr><tr><td>Białko A/G, rekombinowana</td> taca do suszenia <td>ThermoFisher Scientific</td><td>21186</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex, 2 000&nbsp; mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-242B</td><td></td></tr><tr><td>Prostokątne 4-komorowe naczynie hodowlane</td><td>Fisher Scientific (Nunc)</td><td>12-565-495</td><td>Do hodowli komórkowych na szkiełkach mikroskopowych.</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td>UWAGA: NaOH jest silnie i może powodować poważne oparzenia skóry i uszkodzenie oczu. Nosić rękawice ochronne, odzież i okulary ochronne.</td></tr><tr><td>Pin stealth do układania</td> pinów <td>ArrayIt</td><td>SMP3</td><td>Clean po każdym uruchomieniu macierzy zgodnie z instrukcjami producenta. Wytwarza domeny o wielkości 150 mikronów; Kup inne rozmiary pinów (75&ndash; 450 mikronów) zgodnie z konkretnym zastosowaniem.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokowydajna platforma mikromacierzy komórkowych do korelacyjnej analizy różnicowania komórek i sił trakcyjnych

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Mikrofabrykowane mikromacierze komórkowe, które składają się z drukowanych kontaktowo kombinacji biomolekuł na elastycznej powierzchni hydrożelu, zapewniają ściśle kontrolowany, wysokowydajny system inżynieryjny do pomiaru wpływu złożonych sygnałów biochemicznych na różnicowanie komórek. Niedawne wysiłki z wykorzystaniem mikromacierzy komórkowych wykazały ich przydatność w badaniach kombinatorycznych, w których równolegle prezentowanych jest wiele czynników mikrośrodowiskowych. Wysiłki te koncentrowały się jednak przede wszystkim na badaniu wpływu sygnałów biochemicznych na odpowiedzi komórek. W tym miejscu prezentujemy platformę mikromacierzy komórkowej o regulowanych właściwościach materiału do oceny zarówno różnicowania komórek za pomocą immunofluorescencji, jak i biomechanicznych interakcji komórka-substrat za pomocą mikroskopii sił trakcyjnych. W tym celu opracowaliśmy dwa różne formaty wykorzystujące hydrożele poliakrylamidowe o różnym module Younga, wytwarzane na szkiełkach mikroskopowych lub szalkach Petriego ze szklanym dnem. Zapewniamy najlepsze praktyki i rozwiązywanie problemów związanych z wytwarzaniem mikromacierzy na tych podłożach hydrożelowych, późniejszą hodowlą komórkową na mikromacierzach i pozyskiwaniem danych. Platforma ta doskonale nadaje się do wykorzystania w badaniach procesów biologicznych, w których zarówno sygnały biochemiczne (np. skład macierzy zewnątrzkomórkowej), jak i biofizyczne (np. sztywność substratu) mogą odgrywać znaczące, przecinające się role.

Wykorzystując tę platformę, zbadaliśmy rolę sygnałów biochemicznych i biofizycznych w specyfikacji losu progenitorów wątroby34,35. Ligandy Notch sprzężone z białkiem A/G wykazały lepszą retencję i klasteryzację w hydrożelu poliakryloamidowym (Ryc. 3A), a ponadto były zdolne do indukowania różnicowania progenitorów wątroby w kierunku losu komórek przewodów żółciowych (Ryc. 3B). Za pomocą analizy pojedynczych komórek ilościowo określiliśmy odpowiedź na ligandy Notch dla białek ECM: kolagenu I, kolagenu III, kolagenu IV, fibronektyny i lamininy (Ryc. 3C), stwierdzając, że odpowiedź progenitorów wątroby na ligand zależy również od kontekstu ECM. Na koniec wykorzystaliśmy wyciszanie za pomocą shRNA do wygenerowania progenitorów wątroby pozbawionych ligandów Dll1 i Jag1. Odpowiedź na rozmieszczony w matrycy ligand Notch różniła się w zależności od obecności któregoś z ligandów, co potwierdza, że wrażliwość na zewnętrzny ligand komórkowy jest również funkcją ekspresji wewnętrznego ligandu komórkowego (Ryc. 3D). Ponadto zaobserwowaliśmy wyraźną subpopulację komórek podwójnie dodatnich (ALB+/OPN+) w przypadku wyciszenia Dll1 (Ryc. 3D). Razem te reprezentatywne wyniki pokazują: (1) kombinatoryczne możliwości formatu matrycy, czego przykładem jest zestawienie wielu białek ECM i ligandów Notch rozmieszczonych w matrycy z wyciszaniem poszczególnych ligandów; (2) funkcjonalność nie tylko białek ECM, ale także ligandów komórka-komórka rozmieszczonych w matrycy poprzez sprzęganie za pomocą białka A/G; oraz (3) wdrożenie naszej analizy pojedynczych komórek i jej zdolność do rozróżniania unikalnych subpopulacji.
Zaobserwowaliśmy również, że różnicowanie progenitorów wątroby zależy zarówno od sztywności podłoża, jak i składu ECM (Rysunek 4A); konkretnie stwierdzono, że kolagen IV wspomaga różnicowanie zarówno na podłożach miękkich, jak i sztywnych, podczas gdy fibronektyna wspomaga różnicowanie wyłącznie na podłożach sztywnych (Rysunek 4B). Reprezentatywne mapy ciepła pomiarów TFM sugerowały, że utrzymujące się naprężenie trakcyjne przy niskiej sztywności podłoża na kolagenie IV promowało różnicowanie w kierunku komórek przewodów żółciowych (Rysunek 4C), co zostało potwierdzone przez średnie wartości pierwiastka kwadratowego (Rysunek 4D). Wspólnie te reprezentatywne wyniki wykazują: (1) pomyślną integrację TFM z mikromacierzami komórkowymi na podłożach o regulowanej sztywności w celu oceny zarówno fenotypu komórek, jak i naprężenia trakcyjnego; (2) koordynację losu komórek progenitorowych wątroby zarówno ze składem macierzy, jak i sztywnością podłoża; oraz (3) wdrożenie naszej analizy TFM i typowych profili naprężeń trakcyjnych w mikromacierzach komórkowych.
<img alt="Schemat procesu wytwarzania podłoży poliakrylamidowych, tworzenia macierzy i hodowli komórkowej wraz z wynikami analizy." src="/files/ftp_upload/55362/55362fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat ogólny przedstawiający pierwsze trzy sekcje eksperymentalne.W sekcji 1 podłoża szklane są czyszczone i silanizowane, aby ułatwić wytwarzanie hydrożeli poliakrylamidowych. W sekcji 2 w 384-dołkowej mikropłytce źródłowej przygotowuje się interesujące kombinacje biomolekuł. Następnie do robotycznego arrayera ładuje się czyste piny, mikropłytkę źródłową oraz hydrożele poliakrylamidowe, po czym urządzenie jest inicjowane w celu wytworzenia macierzy na hydrożelach. W sekcji 3 komórki są wysiewane na obszary macierzy i pozostawione do adhezji, po czym przeprowadza się właściwy protokół hodowli. W punkcie końcowym komórki są albo utrwalane do immunocytochemii/immunofluorescencji, albo analizowane za pomocą TFM. Paski skali wynoszą 75 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rozdzielanie kanałów RGB, proces cytometrii obrazowej; schematy przedstawiają analizę pojedynczych komórek, normalizację kwantylową." src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przetwarzanie i analiza danych immunofluorescencji z macierzy. (A) Kafelkowe, kompozytowe 32-bitowe obrazy RGB są najpierw grupowane, a następnie rozdzielane na poszczególne 8-bitowe kanały. Wykorzystując kombinację uporządkowanych markerów fluorescencyjnych i wysp komórkowych, identyfikuje się trzy narożniki macierzy, co umożliwia automatyczną orientację i siatkowanie macierzy. (B) Dla każdego kanału wejściowych macierzy generowane są dane dla pojedynczych komórek. Aby uwzględnić dryf eksperymentalny, stosuje się normalizację kwantylową w obrębie powtórzeń biologicznych, co pozwala uzyskać jeden wspólny rozkład dla wszystkich powtórzeń. Dane poddane normalizacji kwantylowej są następnie przedstawiane graficznie i interpretowane poprzez obliczanie pomiarów zbiorczych (np. liczba komórek/wyspa, średnia intensywność, procent komórek wykazujących pozytywną reakcję z markerem) lub bezpośrednią analizę rozkładów pojedynczych komórek. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Immunofluorescencja i analiza intensywności OPN/ALB w różnicowaniu komórek; wyniki eksperymentu." src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Prezentacja ligandów Notch pośredniczy w różnicowaniu progenitorów wątroby. (A) Rekombinowane ligandy Notch z fragmentem Fc, Jagged-1 (JAG1) i Delta-like 1 (DLL1), wykazały lepszą retencję i klastrowanie po unieruchomieniu z białkiem A/G. Pasek skali wynosi 50 µm. (B) Progenitory wątroby różnicowały się w komórki przewodów żółciowych po prezentacji ligandu Notch. 4',6-Diamidino-2-fenyloindol (DAPI) jest markerem jądrowym, albuminy (ALB) są markerami komórek wątrobowych, a osteopontyna (OPN) jest markerem komórek przewodów żółciowych. Pasek skali wynosi 150 µm. (C) Ilościowe oznaczenie procentu komórek wykazujących pozytywną reakcję na OPN dla ligandów Notch JAG1, DLL1 i Delta-like 4 (DLL4) na białkach ECM: kolagenie I, kolagenie III, kolagenie IV, fibronektynie i lamininie. Testy t Studenta przeprowadzono względem kontrolnego IgG dla każdego unieruchomionego ligandu Notch w obrębie każdego białka ECM, z zaznaczonymi wartościami P dla P&lt;0.05 (*). (D) Cytometria obrazowa ALB i OPN dla komórek na kolagenie III z prezentacją ligandów Notch JAG1, DLL1 i DLL4. Progenitory wątroby pozbawione ligandów Notch Dll1 i Jag1 (tj. shDll1 i shJag1) zostały wygenerowane przy użyciu wyciszania shRNA. Dane w części (C) przedstawiono jako średnia ± s.e.m. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Kaylan et al.34. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza naprężeń trakcyjnych komórek i sztywności podłoża; obrazowanie immunofluorescencyjne; porównanie danych wykresowych." src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Skład macierzy i sztywność podłoża koordynują różnicowanie progenitorów wątroby. (A) Różnicowanie progenitorów wątroby w komórki przewodów żółciowych zależy zarówno od składu ECM, jak i od sztywności podłoża. DAPI jest markerem jądrowym, ALB jest markerem komórek wątroby, a OPN markerem komórek przewodów żółciowych. (B) Ilościowe oznaczenie procentu komórek wykazujących pozytywną ekspresję OPN na podłożach o module Younga 30 kPa, 13 kPa i 4 kPa dla kolagenu I (C1), kolagenu IV (C4), fibronektyny (FN) oraz wszystkich dwuskładnikowych kombinacji tych białek ECM. (C) Naprężenie trakcyjne komórek zależy zarówno od sztywności podłoża, jak i od składu ECM. (D) Ilościowe oznaczenie wartości średnio kwadratowych naprężeń trakcyjnych na podłożach o module Younga 30 kPa i 4 kPa dla kolagenu I (C1), kolagenu IV (C4), fibronektyny (FN) oraz wszystkich dwuskładnikowych kombinacji tych białek ECM. Na wykresach (B) i (D) dane przedstawiono jako średnia ± s.e.m, a testy t Studenta przeprowadzono w odniesieniu do wartości 30 kPa dla każdej kombinacji ECM, z zaznaczonymi wartościami P dla P&lt; 0.05 (*), P&lt; 0.01 (**) i P&lt; 0.001 (***). Paski skali wynoszą 50 µm. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Kourouklis et al.35. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td fo:width="1.2in">Sekcja</td>
			<td fo:width="1.5in">Problem</td>
			<td fo:width="1.5in">Potencjalne przyczyny</td>
			<td>Roztwór</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">1. Wykonanie podłoża poliakryloamidowego.</td>
			<td>Kapturek szkiełkowy nie może zostać usunięty z hydrożelu.</td>
			<td>Nadpolimeryzacja.</td>
			<td>Skrócić czas polimeryzacji do &lt;10 minut (4 W/m2). Sprawdzić, czy moc wyjściowa naświetlacza UV mieści się w oczekiwanym zakresie.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niewłaściwa polimeryzacja hydrożelu poliakryloamidowego.</td>
			<td>Niedopolimeryzacja.</td>
			<td>Wydłużyć czas polimeryzacji do &gt;10 minut (4 W/m2). Sprawdzić, czy moc wyjściowa lampy UV do sieciowania mieści się w oczekiwanym zakresie.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrożele poliakrylamidowe ulegają uszkodzeniu po usunięciu szkiełka zakrywającego.</td>
			<td>Miękkie hydrożele poliakryloamidowe są podatne na uszkodzenia. </td>
			<td>Obserwujemy spadek wydajności wytwarzania hydrożeli (~50%) w przypadku najmiększych (t. j., w szczególności hydrożele o niskim module sprężystości (np. G' < 4 kPa). Z hydrożelami należy obchodzić się ostrożnie i zwiększyć liczbę początkową w celu uzyskania pożądanej wydajności.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">2. Wykonanie macierzy.</td>
			<td rowspan="2">Słaba lub niespójna morfologia plamek.</td>
			<td>Niestabilne działanie nawilżacza.</td>
			<td>Należy upewnić się, że nawilżacz i reometr są sprawne podczas każdego procesu drukowania i utrzymują wilgotność względną na poziomie 65%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piny zablokowane w głowicy drukującej lub zapchane.</td>
			<td>Wyczyść głowicę drukującą, aby umożliwić swobodny ruch pinów. Dokładnie czyść piny przed lub po każdym cyklu drukowania, aby usunąć agregaty z kanałów pinów.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">3. Hodowla komórkowa i przeprowadzenie analizy.</td>
			<td rowspan="2">Odrywanie się lub obumieranie komórek na matrycach po początkowym przyleganiu.</td>
			<td>Zbyt gęsty wysiew i nadmierna proliferacja.</td>
			<td>Należy zmniejszyć początkową gęstość wysiewu oraz czas inkubacji. Podczas hodowli w układzie matrycowym należy stosować pożywki „podtrzymujące” (maintenance) lub „różnicujące” (differentiation), aby ograniczyć proliferację komórek.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uwalnianie toksycznego monomeru akrylamidu z hydrożelu.</td>
			<td>Namoczyć hydrożele w dH2O2przez co najmniej 3 dni, aby umożliwić dyfuzję/uwalnianie monomeru akryloamidu i zmniejszyć toksyczność dla komórek.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Komórki nie przylegają do macierzy.</td>
			<td>Podsiew łąkowy.</td>
			<td>Zwiększyć początkową gęstość wysiewu oraz czas inkubacji. Użyć linii komórkowej o silniejszej adhezji.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niewłaściwa depozycja matrycy lub biomolekuły.</td>
			<td>Oczyścić piny z cząsteczek i agregatów, potwierdzić parametry drukowania oraz ocenić naniesienie markerów fluorescencyjnych, np., dekstran sprzężony z rodamyną.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specyficzność oddziaływań komórka–macierz.</td>
			<td>Różne typy komórek przylegają specyficznie do niektórych białek ECM, a do innych nie. Przetestuj wiele różnych białek ECM z użyciem swoich komórek.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nieoptymalne przechowywanie matrycy po wykonaniu.</td>
			<td>Zaleca się przechowywanie wykonanych macierzy przez noc w temperaturze pokojowej i przy wilgotności względnej (RH) wynoszącej 65%, częściowo w celu uniknięcia zmian fazowych podczas zamrażania. Adhezja komórek jest wrażliwa na wilgotność, temperaturę oraz czas przechowywania; należy upewnić się, że parametry te są spójne i zoptymalizowane dla przeprowadzanych eksperymentów.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Oddzielanie się hydrożelu od szklanego podłoża podczas hodowli komórkowej.</td>
			<td>Niewłaściwe oczyszczanie i silanizacja szkiełek.</td>
			<td>Wymień roztwory robocze do czyszczenia i silanizacji szkiełek.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przesuszony hydrożel.</td>
			<td>Nie należy pozostawiać hydrożeli do odwadniania na płycie grzejnej dłużej niż przez 15–30 min.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. Analiza danych.</td>
			<td>Wysoka zmienność między powtórzeniami w obrębie plamek oraz między slajdami.</td>
			<td>Zmienność w wytwarzaniu macierzy.</td>
			<td>Należy sprawdzić, czy piny i głowica drukująca są czyste. Potwierdzić działanie nawilżacza. Zwizualizować i określić ilościowo jakość plamek oraz macierzy przy użyciu markerów fluorescencyjnych. Przechowywać macierze zgodnie z powyższymi zaleceniami. </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Rozwiązywanie problemów.

Różnicowanie komórek jest regulowane przez wiele czynników mikrośrodowiskowych, w tym zarówno skład matrycy, jak i właściwości materiału substratu. Opisujemy tutaj technikę wykorzystującą mikromacierze komórkowe w połączeniu z mikroskopią sił trakcyjnych do oceny zarówno różnicowania komórek, jak i biomechanicznych interakcji komórka-substrat w funkcji kontekstu mikrośrodowiskowego.

Wysokowydajna platforma mikromacierzy komórkowych do korelacyjnej analizy różnicowania komórek i sił trakcyjnych

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Ogólnym celem tej platformy mikrotablic komórkowych jest skorelowanie pomiarów różnicowania komórek oraz sił trakcyjnych w zależności od kontekstu mikrośrodowiskowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii tkankowej, umożliwiając zarówno podstawowe badania biologii komórek macierzystych, jak i optymalizację protokołów różnicowania. Do głównych zalet tej techniki należą jej wydajność, możliwość zmiany sygnałów biochemicznych i biofizycznych oraz odczyty końcowe uzyskiwane za pomocą immunofluorescencji i mikroskopii sił trakcyjnych (TFM).Mimo zastosowania tych metod do badania różnicowania progenitorów wątroby, można je z łatwością przenieść na inne typy komórek tętniczych i konteksty tkankowe. Demonstracja wizualna tej metody jest kluczowa, ponieważ sukces eksperymentu zależy od integracji protokołu rozmieszczania z wysokiej jakości podłożami hydrożelowymi oraz mikroskopią sił trakcyjnych (TFM). Aby wytworzyć hydrożele poliakrylamidowe zawierające fluorescencyjne kuleczki na silanizowanej szalce Petriego o średnicy 35 mm z szklanym dnem do oceny interakcji komórka-podłoże na żywo przy użyciu TFM, należy najpierw przygotować podłoża szklane w roztworach zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Umieść zylanizowane szalki Petriego z szklanym dnem o średnicy 35 mm w szklanej tacy do suszenia i nanieś pipetą 20 µL roztworu kulek prepolimeru i fotoinicjatora w stosunku 9:1 na środek każdej szalki. Delikatnie przykryj każdą szalkę okrągłym szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 12 mm, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Aby rozłożyć fluorescencyjne kulki na powierzchni hydrożelu, odwróć szalki dnem do góry i pozostaw je w temperaturze pokojowej na 20 minut.Pozostawiając naczynie w pozycji odwróconej, naświetlaj je promieniowaniem UVA o długości fali 365 nanometrów przez 10 minut. W razie potrzeby zoptymalizuj czas polimeryzacji. Następnie zanurz hydrożele w 1 molarnym buforze HEPES i pozostaw je w ciemności w temperaturze pokojowej przez noc.Ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe za pomocą żyletki, uważając, aby nie uszkodzić spolimeryzowanych hydrożeli. Odwodnij hydrożele na płycie grzewczej w temperaturze 50 °C aż do całkowitego wyschnięcia. Hydrożele można przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności przez trzy miesiące.Przygotować bufory do drukowania biomolekuł oraz do płytki źródłowej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po załadowaniu czystych pinów zgodnie z opisem w protokole tekstowym, przygotować urządzenie do mikroarrayerów i zaprogramować je przy użyciu oprogramowania producenta. Następnie włączyć nawilżacz.Ustaw wartość zadaną na 65% wilgotności względnej i poczekaj, aż reometer osiągnie tę wartość. Umieść płytkę źródłową w odpowiednim adapterze. Następnie umieść odwodnione podłoża hydrożelowe w odpowiednim adapterze.Dostosuj parametry programu tak, aby dokładnie odzwierciedlały układ płytki źródłowej, projekt macierzy oraz pożądany format. Rozpocznij wytwarzanie macierzy. Przynajmniej raz na godzinę sprawdzaj, czy wilgotność nie spadła poniżej 65% wilgotności względnej oraz czy piny nie są zapchane.Jeśli wilgotność nieoczekiwanie spadła, należy przerwać proces tworzenia macierzy, aby napełnić nawilżacz i usunąć kondensację z powiązanych rurek. W przypadku zapchania pinów należy przerwać tworzenie macierzy, aby wyczyścić piny lub zastąpić je pinami wcześniej oczyszczonymi. Po zakończeniu programu przygotowane macierze należy umieścić w kasecie na szkiełka lub w mikropłytce przykrytej folią aluminiową.Pozostaw macierze w temperaturze pokojowej przy wilgotności względnej 65% przez noc. Z naszego doświadczenia wynika, że najczęstsze trudności wiążą się z wykonaniem macierzy. Zalecamy potwierdzenie jakości technicznej i stabilności wykonanych macierzy przy użyciu cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie, ogólnych barwień białek oraz immunofluorescencji.Dzień po przygotowaniu, zanurz szalki Petriego o średnicy 35 mm z matrycą w 3 mL 1% obj. obj. penicyliny-streptomycyny w PVS. Naświetlaj podłoża z matrycą promieniowaniem UVC przez 30 minut. Następnie wymień roztwór penicyliny-streptomycyny na pożywkę do hodowli komórek.Po zebraniu i policzeniu komórek, zasiać je na matrycach w objętości 3 mL na płytkę Petriego 35 mm. Inkubować hodowle na matrycach w temperaturze 37°C i 5%CO2 przez okres od 2 do 24 godzin lub do czasu utworzenia gęsto zasiedlonych wysepek komórkowych. Gęstość siewu oraz czas inkubacji można dostosować w zależności od rodzaju komórek i konkretnego zastosowania.Po dopuszczeniu do uformowania się wysp komórkowych, przemyć hodowle w matrycy dwukrotnie 3 mL uprzednio ogrzanej pożywki do hodowli komórek. Na tym etapie do układu biologicznego można dodać odpowiednie kontrole oraz interesujące badacza substancje testowe. Wymieniać pożywkę w matrycach co jeden lub dwa dni, aby utrzymać stężenie zastosowanych substancji.W ciągu jednego do pięciu dni od rozpoczęcia hodowli w układzie macierzowym należy przeprowadzić ocenę interakcji komórek z podłożem na żywo, wykorzystując TFM. Płytki Petri o średnicy 35 mm zawierające hodowle w układzie macierzowym należy przenieść do inkubowanego odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z mechanicznym stołem do pomiarów TFM. W jednej z płytek należy wyznaczyć położenia i płaszczyzny ogniskowania poszczególnych wysp komórkowych przy użyciu mikroskopii w kontraście fazowym.Przełącz na mikroskopię fluorescencyjną w dalekiej czerwieni, aby zwizualizować kuleczki. Następnie powróć do każdej z pozycji zapisanych w poprzednim kroku i skoryguj współrzędną z płaszczyzny ogniskowania w taki sposób, aby w ostrości znajdowała się tylko pierwsza warstwa kuleczek pod wyspą komórek. Zapisz nowe współrzędne i przystąp do zautomatyzowanego obrazowania wszystkich wysp komórek, aby zarejestrować obrazy w kontraście fazowym oraz fluorescencyjne w dalekiej czerwieni dla fazy przed dysocjacją.Następnie ostrożnie dodaj 150 µL roztworu BSA/SDS do naczynia i odczekaj pięć minut, aby umożliwić całkowitą dysocjację komórek od podłoża. Monitoruj dysocjację komórek za pomocą mikroskopii kontrastowej. Po oddzieleniu wysp komórkowych od podłoża powróć do zaznaczonych pozycji i sprawdź, czy pierwsza warstwa kulek nadal znajduje się w ogniskowej.Jeśli kuleczki znajdują się poza płaszczyzną z powodu odkształcenia wywołanego trakcją generowaną przez komórki, skoryguj współrzędną z płaszczyzny ogniskowania, aby ponownie znalazły się w ostrości. Zapisz skorygowane współrzędne z i powtórz automatyczne obrazowanie wszystkich wysepek, aby uzyskać obrazy fluorescencyjne w dalekiej czerwieni po dysocjacji. Powtórz te kroki dla pozostałych szalek.Ligandy Notch Jagged1 i Delta-like 1 sprzężone z białkiem A/G wykazały poprawioną retencję w hydrożelach. Prezentacja ligandów Notch stymulowała również różnicowanie progenitorów wątroby w kierunku komórek przewodów żółciowych, o czym świadczyła obecność zielonego markera komórek przewodów żółciowych. Odpowiedź na ligandy Notch została ilościowo określona dla pięciu białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), co wykazało, że odpowiedź progenitorów wątroby na ligandy zależy od kontekstu ECM.Do wygenerowania prekursorów pozbawionych ligandów Delta-like 1 oraz Jagged 1 wykorzystano wyciszenie za pomocą małych rybnich RNA (shRNA). Następnie komórki poddano działaniu ligandów Notch: Jagged 1, Delta-like 1 oraz Delta-like 4. Odpowiedź na zastosowany zestaw ligandów Notch różniła się w zależności od wewnętrznej ekspresji danego ligandu w komórkach.Obrazy te przedstawiają różnicowanie progenitorów wątroby w zależności od sztywności podłoża oraz składu macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Analiza ilościowa wykazała, że kolagen IV sprzyja różnicowaniu zarówno na podłożach miękkich, jak i sztywnych, podczas gdy fibronektyna wspiera różnicowanie wyłącznie na podłożach sztywnych. Reprezentatywne mapy ciepła sugerują, że utrzymujące się naprężenia trakcyjne przy niskiej sztywności podłoża z kolagenu IV promują różnicowanie w komórki przewodów żółciowych.Wynik ten potwierdzono poprzez ilościowe oznaczenie średnich wartości skutecznych naprężeń trakcyjnych. Niniejsze wideo oraz towarzyszący mu protokół przedstawiają główne etapy wytwarzania hydrożeli i macierzy do hodowli komórkowej na podłożach macierzowych, a także pomiaru oddziaływań między komórkami a podłożem przy użyciu mikroskopii sił trakcyjnych. Po zapoznaniu się z tymi technikami każdy eksperyment można przeprowadzić w czasie od jednego do dwóch tygodni, pod warunkiem właściwego wykonania procedur.W uzupełnieniu do tej metody, hodowle komórkowe powinny zostać wykorzystane do walidacji warunków macierzy o wysokich wynikach za pomocą jakościowego PCR, immunoblottingu, standardowych osi mechanobiologicznych lub innych komplementarnych technik biologii molekularnej. Ta wszechstronna platforma może być zastosowana do wysokoprzepustowych badań funkcji komórkowych w szerokim zakresie kontekstów komórkowych i tkankowych, w tym w różnicowaniu komórek macierzystych oraz biologii komórek nowotworowych.

a-high-throughput-cell-microarray-platform-for-correlative-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym protokole prezentujemy proces wytwarzania macierzy mikroaktuatorów z pionowo przesuniętymi słupkami, na której opiera się ta technologia, oraz sposób, w jaki technologia bazowa ta może zostać zmodyfikowana w celu prowadzenia wysokoprzepustowych dynamicznych mechanicznie hodweli komórkowych w dwu- i trójwymiarowych paradygmatach hodowli.

Mikrofabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórek

Ten film opisuje test mikroskopii siły pociągowej. Test określa trakcję komórkową ludzkich komórek raka jelita grubego na macierzy zewnątrzkomórkowej obecnej na miękkim elastycznym hydrożelu z osadzonymi kulkami fluorescencyjnymi. Wynikowe przemieszczenie kulek fluorescencyjnych mierzy się za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

Test cytometrii trakcyjnej: metoda ilościowego określania siły trakcyjnej wywieranej przez komórki rakowe na ECM

Opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę do hodowli komórek i przesłuchań do eksperymentów stymulacji komórek na mikroskalę.  Platforma oferuje prostą, wszechstronną i precyzyjną kontrolę w hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwaniu lizatów do analiz molekularnych.  Platforma doskonale nadaje się do badań, w których wykorzystuje się cenne komórki i/lub odczynniki.

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

To badanie opisuje eksperymentalną platformę do szybkiego charakteryzowania zmodyfikowanych komórek macierzystych i ich zachowań przed ich zastosowaniem w długoterminowych badaniach nad przeszczepami in vivo w celu ratowania i naprawy układu nerwowego.

Wysokoprzepustowa charakterystyka dorosłych komórek macierzystych zmodyfikowanych pod kątem dostarczania czynników terapeutycznych w strategiach neuroprotekcyjnych

Opisane są protokoły ilościowego określania interakcji mechanicznych między przylegającymi komórkami a mikrostrukturalnymi substratami. Interakcje te są ściśle związane z podstawowymi zachowaniami komórek, w tym migracją, proliferacją, różnicowaniem i apoptozą. Protokoły prezentują oprogramowanie do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym o nazwie MechProfiler, które umożliwia określenie zaangażowanych sił dla każdego mikrosłupka.

Łatwe i dokładne profilowanie mechaniczne na matrycach Micropost

Prezentujemy test siły pociągowej o wysokiej przepustowości wykonany z gumy silikonowej (PDMS). Ten nowatorski test nadaje się do badania fizycznych zmian kurczliwości komórek podczas różnych procesów i chorób biologicznych i biomedycznych. Wykazujemy użyteczność tej metody, mierząc zależny od TGF-β wzrost kurczliwości podczas przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego.

Wysokoprzepustowa mikroskopia sił trakcyjnych z wykorzystaniem PDMS ujawnia zależne od dawki efekty transformacji czynnika wzrostu β na przejście z nabłonka do mezenchymów

Siły mechaniczne są ważne dla kontrolowania migracji komórek. Protokół ten demonstruje użycie elastycznych hydrożeli, które można odkształcić za pomocą szklanej mikropipety i mikromanipulatora w celu stymulacji komórek za pomocą lokalnego gradientu sztywności w celu wywołania zmian w strukturze komórki i migracji.

Test durotaksji pojedynczej komórki do oceny mechanicznej kontroli ruchu komórkowego i powiązanych zdarzeń sygnalizacyjnych

Ten protokół zawiera instrukcje dotyczące implementacji litografii wielofotonowej do wytwarzania trójwymiarowych matryc fluorescencyjnych znaczników referencyjnych osadzonych w hydrożelach na bazie poli(glikolu etylenowego) do wykorzystania jako platformy mikroskopii siły pociągowej bez odniesień. Korzystając z tych instrukcji, pomiar odkształcenia materiału 3D i obliczanie trakcji komórkowych jest uproszczone, aby ułatwić pomiary siły pociągowej o wysokiej przepustowości.

Wykonanie i wdrożenie bezreferencyjnej platformy mikroskopii sił trakcyjnych

Zbiorowa migracja komórek w procesie rozwoju, gojenia ran i przerzutów nowotworowych jest często kierowana przez gradienty czynników wzrostu lub cząsteczek sygnałowych. Opisano tutaj eksperymentalny system łączący mikroskopię trakcyjną z układem mikroprzepływowym oraz demonstrację sposobu ilościowego określania mechaniki migracji zbiorowej w warunkach gradientu biochemicznego.

Mikroskopia trakcyjna zintegrowana z mikrofluidyką do chemotaktycznej migracji zbiorowej

Platforma iTACS (Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals) automatyzuje proces jednoczesnego pomiaru szerokiej gamy sygnałów chemicznych i mechanicznych w przylegających komórkach. iTACS został zaprojektowany, aby ułatwić rozwój kierowany przez społeczność i umożliwić naukowcom korzystanie ze wszystkich funkcji platformy, niezależnie od ich wykształcenia.

Zintegrowany zestaw narzędzi do analizy sygnałów komórkowych: sił, ruchu, morfologii i fluorescencji

Ta praca przedstawia elastyczny protokół wykorzystania technologii fluorescencyjnie znakowanych elastomerowych powierzchni skurczowych (FLECS) w formacie mikrostudzienki do uproszczonej, bezobsługowej kwantyfikacji sił skurczu pojedynczej komórki na podstawie wizualizacji przemieszczeń mikrowzorów białek fluorescencyjnych.

Uproszczona, wysokoprzepustowa analiza kurczliwości pojedynczych komórek przy użyciu elastomerów mikrowzorzystych

Poznaj wysokowydajną platformę mikromacierzy komórkowych do korelacyjnej analizy różnicowania komórek i sił trakcyjnych. Ta metoda umożliwia badanie biologii komórek macierzystych oraz optymalizację protokołów różnicowania w inżynierii tkankowej.

Wysokowydajna platforma mikromacierzy komórkowych do korelacyjnej analizy różnicowania komórek i sił trakcyjnych

Przeglądaj więcej filmów