Wysokowydajna platforma mikromacierzy komórkowych do korelacyjnej analizy różnicowania komórek i sił trakcyjnych

Ogólnym celem tej platformy mikrotablic komórkowych jest skorelowanie pomiarów różnicowania komórek oraz sił trakcyjnych w zależności od kontekstu mikrośrodowiskowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii tkankowej, umożliwiając zarówno podstawowe badania biologii komórek macierzystych, jak i optymalizację protokołów różnicowania. Do głównych zalet tej techniki należą jej wydajność, możliwość zmiany sygnałów biochemicznych i biofizycznych oraz odczyty końcowe uzyskiwane za pomocą immunofluorescencji i mikroskopii sił trakcyjnych (TFM).

Mimo zastosowania tych metod do badania różnicowania progenitorów wątroby, można je z łatwością przenieść na inne typy komórek tętniczych i konteksty tkankowe. Demonstracja wizualna tej metody jest kluczowa, ponieważ sukces eksperymentu zależy od integracji protokołu rozmieszczania z wysokiej jakości podłożami hydrożelowymi oraz mikroskopią sił trakcyjnych (TFM). Aby wytworzyć hydrożele poliakrylamidowe zawierające fluorescencyjne kuleczki na silanizowanej szalce Petriego o średnicy 35 mm z szklanym dnem do oceny interakcji komórka-podłoże na żywo przy użyciu TFM, należy najpierw przygotować podłoża szklane w roztworach zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Umieść zylanizowane szalki Petriego z szklanym dnem o średnicy 35 mm w szklanej tacy do suszenia i nanieś pipetą 20 µL roztworu kulek prepolimeru i fotoinicjatora w stosunku 9:1 na środek każdej szalki. Delikatnie przykryj każdą szalkę okrągłym szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 12 mm, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Aby rozłożyć fluorescencyjne kulki na powierzchni hydrożelu, odwróć szalki dnem do góry i pozostaw je w temperaturze pokojowej na 20 minut.

Pozostawiając naczynie w pozycji odwróconej, naświetlaj je promieniowaniem UVA o długości fali 365 nanometrów przez 10 minut. W razie potrzeby zoptymalizuj czas polimeryzacji. Następnie zanurz hydrożele w 1 molarnym buforze HEPES i pozostaw je w ciemności w temperaturze pokojowej przez noc.

Ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe za pomocą żyletki, uważając, aby nie uszkodzić spolimeryzowanych hydrożeli. Odwodnij hydrożele na płycie grzewczej w temperaturze 50 °C aż do całkowitego wyschnięcia. Hydrożele można przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności przez trzy miesiące.

Przygotować bufory do drukowania biomolekuł oraz do płytki źródłowej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po załadowaniu czystych pinów zgodnie z opisem w protokole tekstowym, przygotować urządzenie do mikroarrayerów i zaprogramować je przy użyciu oprogramowania producenta. Następnie włączyć nawilżacz.

Ustaw wartość zadaną na 65% wilgotności względnej i poczekaj, aż reometer osiągnie tę wartość. Umieść płytkę źródłową w odpowiednim adapterze. Następnie umieść odwodnione podłoża hydrożelowe w odpowiednim adapterze.

Dostosuj parametry programu tak, aby dokładnie odzwierciedlały układ płytki źródłowej, projekt macierzy oraz pożądany format. Rozpocznij wytwarzanie macierzy. Przynajmniej raz na godzinę sprawdzaj, czy wilgotność nie spadła poniżej 65% wilgotności względnej oraz czy piny nie są zapchane.

Jeśli wilgotność nieoczekiwanie spadła, należy przerwać proces tworzenia macierzy, aby napełnić nawilżacz i usunąć kondensację z powiązanych rurek. W przypadku zapchania pinów należy przerwać tworzenie macierzy, aby wyczyścić piny lub zastąpić je pinami wcześniej oczyszczonymi. Po zakończeniu programu przygotowane macierze należy umieścić w kasecie na szkiełka lub w mikropłytce przykrytej folią aluminiową.

Pozostaw macierze w temperaturze pokojowej przy wilgotności względnej 65% przez noc. Z naszego doświadczenia wynika, że najczęstsze trudności wiążą się z wykonaniem macierzy. Zalecamy potwierdzenie jakości technicznej i stabilności wykonanych macierzy przy użyciu cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie, ogólnych barwień białek oraz immunofluorescencji.

Dzień po przygotowaniu, zanurz szalki Petriego o średnicy 35 mm z matrycą w 3 mL 1% obj. obj. penicyliny-streptomycyny w PVS. Naświetlaj podłoża z matrycą promieniowaniem UVC przez 30 minut. Następnie wymień roztwór penicyliny-streptomycyny na pożywkę do hodowli komórek.

Po zebraniu i policzeniu komórek, zasiać je na matrycach w objętości 3 mL na płytkę Petriego 35 mm. Inkubować hodowle na matrycach w temperaturze 37°C i 5%CO2 przez okres od 2 do 24 godzin lub do czasu utworzenia gęsto zasiedlonych wysepek komórkowych. Gęstość siewu oraz czas inkubacji można dostosować w zależności od rodzaju komórek i konkretnego zastosowania.

Po dopuszczeniu do uformowania się wysp komórkowych, przemyć hodowle w matrycy dwukrotnie 3 mL uprzednio ogrzanej pożywki do hodowli komórek. Na tym etapie do układu biologicznego można dodać odpowiednie kontrole oraz interesujące badacza substancje testowe. Wymieniać pożywkę w matrycach co jeden lub dwa dni, aby utrzymać stężenie zastosowanych substancji.

W ciągu jednego do pięciu dni od rozpoczęcia hodowli w układzie macierzowym należy przeprowadzić ocenę interakcji komórek z podłożem na żywo, wykorzystując TFM. Płytki Petri o średnicy 35 mm zawierające hodowle w układzie macierzowym należy przenieść do inkubowanego odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z mechanicznym stołem do pomiarów TFM. W jednej z płytek należy wyznaczyć położenia i płaszczyzny ogniskowania poszczególnych wysp komórkowych przy użyciu mikroskopii w kontraście fazowym.

Przełącz na mikroskopię fluorescencyjną w dalekiej czerwieni, aby zwizualizować kuleczki. Następnie powróć do każdej z pozycji zapisanych w poprzednim kroku i skoryguj współrzędną z płaszczyzny ogniskowania w taki sposób, aby w ostrości znajdowała się tylko pierwsza warstwa kuleczek pod wyspą komórek. Zapisz nowe współrzędne i przystąp do zautomatyzowanego obrazowania wszystkich wysp komórek, aby zarejestrować obrazy w kontraście fazowym oraz fluorescencyjne w dalekiej czerwieni dla fazy przed dysocjacją.

Następnie ostrożnie dodaj 150 µL roztworu BSA/SDS do naczynia i odczekaj pięć minut, aby umożliwić całkowitą dysocjację komórek od podłoża. Monitoruj dysocjację komórek za pomocą mikroskopii kontrastowej. Po oddzieleniu wysp komórkowych od podłoża powróć do zaznaczonych pozycji i sprawdź, czy pierwsza warstwa kulek nadal znajduje się w ogniskowej.

Jeśli kuleczki znajdują się poza płaszczyzną z powodu odkształcenia wywołanego trakcją generowaną przez komórki, skoryguj współrzędną z płaszczyzny ogniskowania, aby ponownie znalazły się w ostrości. Zapisz skorygowane współrzędne z i powtórz automatyczne obrazowanie wszystkich wysepek, aby uzyskać obrazy fluorescencyjne w dalekiej czerwieni po dysocjacji. Powtórz te kroki dla pozostałych szalek.

Ligandy Notch Jagged1 i Delta-like 1 sprzężone z białkiem A/G wykazały poprawioną retencję w hydrożelach. Prezentacja ligandów Notch stymulowała również różnicowanie progenitorów wątroby w kierunku komórek przewodów żółciowych, o czym świadczyła obecność zielonego markera komórek przewodów żółciowych. Odpowiedź na ligandy Notch została ilościowo określona dla pięciu białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), co wykazało, że odpowiedź progenitorów wątroby na ligandy zależy od kontekstu ECM.

Do wygenerowania prekursorów pozbawionych ligandów Delta-like 1 oraz Jagged 1 wykorzystano wyciszenie za pomocą małych rybnich RNA (shRNA). Następnie komórki poddano działaniu ligandów Notch: Jagged 1, Delta-like 1 oraz Delta-like 4. Odpowiedź na zastosowany zestaw ligandów Notch różniła się w zależności od wewnętrznej ekspresji danego ligandu w komórkach.

Obrazy te przedstawiają różnicowanie progenitorów wątroby w zależności od sztywności podłoża oraz składu macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Analiza ilościowa wykazała, że kolagen IV sprzyja różnicowaniu zarówno na podłożach miękkich, jak i sztywnych, podczas gdy fibronektyna wspiera różnicowanie wyłącznie na podłożach sztywnych. Reprezentatywne mapy ciepła sugerują, że utrzymujące się naprężenia trakcyjne przy niskiej sztywności podłoża z kolagenu IV promują różnicowanie w komórki przewodów żółciowych.

Wynik ten potwierdzono poprzez ilościowe oznaczenie średnich wartości skutecznych naprężeń trakcyjnych. Niniejsze wideo oraz towarzyszący mu protokół przedstawiają główne etapy wytwarzania hydrożeli i macierzy do hodowli komórkowej na podłożach macierzowych, a także pomiaru oddziaływań między komórkami a podłożem przy użyciu mikroskopii sił trakcyjnych. Po zapoznaniu się z tymi technikami każdy eksperyment można przeprowadzić w czasie od jednego do dwóch tygodni, pod warunkiem właściwego wykonania procedur.

W uzupełnieniu do tej metody, hodowle komórkowe powinny zostać wykorzystane do walidacji warunków macierzy o wysokich wynikach za pomocą jakościowego PCR, immunoblottingu, standardowych osi mechanobiologicznych lub innych komplementarnych technik biologii molekularnej. Ta wszechstronna platforma może być zastosowana do wysokoprzepustowych badań funkcji komórkowych w szerokim zakresie kontekstów komórkowych i tkankowych, w tym w różnicowaniu komórek macierzystych oraz biologii komórek nowotworowych.