Name: Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa typu block-face (SBEM) do badania kolców dendrytycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Poznaj metodę SBEM do badania kolców dendrytycznych w hipokampie myszy. Technika ta umożliwia uzyskanie obrazów wysokiej rozdzielczości dużych objętości tkanek nerwowych, co pozwala na szczegółową analizę struktury i łączności synaptycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SBEM obrazowanie, obrazowanie mikroskopem świetlnym i przygotowanie próbek do mikroskopii elektronowej zostały wykonane przy użyciu sprzętu Laboratorium Obrazowania Tkanek i Funkcji, które służy jako główny ośrodek obrazowania w Instytucie Biologii Doświadczalnej Menckiego.
Do przygotowania rysunku 1 użyto obrazu myszy (Souris_02) oraz fiolki z https://smart.servier.com/.
Ta praca została wsparta przez Narodowe Centrum Nauki (Polska) Grant Opus (UMO-2018/31/B/NZ4/01603) przyznany KR.

Badania zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytutu Nenckiego i zgodą Lokalnej Komisji Etycznej. Badania zostały przeprowadzone zgodnie z Dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich z dnia 24 listopada 1986 r. (86/609/EWG), Ustawą o ochronie zwierząt i zatwierdzone przez pierwszą Lokalną Komisję Etyczną w Warszawie. Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować liczbę wykorzystywanych zwierząt i ich cierpienie.
UWAGA: Wszystkie procedury opisane poniżej muszą być wykonywane w laboratoryjnym dygestorium. Ze względu na niebezpieczny charakter stosowanych odczynników. Wymagane są środki bezpieczeństwa osobistego, takie jak rękawice, fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i maska na twarz.
1. Przygotowanie utrwalacza do perfuzji (2% wag/obj. paraformaldehydu (PFA) i 0,5% obj. aldehydu glutarowego (GA) w 0,1 M buforze fosforanowym (PB), pH 7,4)
UWAGA: Przygotuj roztwór utrwalający tego samego dnia, w którym zostanie użyty i nie przechowuj go dłużej niż przez 3 godziny. W przypadku braku czasu należy przygotować 2% PFA w 0,1 M PB dzień wcześniej, przechowywać w temperaturze 4 °C i dodać świeży GA na krótko przed perfuzją.
<ol>
	<li>Weź 400 ml sterylnej wody podwójnie destylowanej (ddH2O) i podgrzej ją do 60 °C za pomocą mieszającej płyty grzejnej. Następnie dodaj 20 g PFA. Dodawać krople 1 M NaOH aż do całkowitego rozpuszczenia PFA i pozostawić mieszaninę do ostygnięcia.</li>
	<li>Dodać 500 ml 0,2 M PB (pH 7,4).</li>
	<li>Przefiltrować roztwór, aby usunąć wszelkie osady i schłodzić go do temperatury 4 °C.</li>
	<li>Tuż przed perfuzją dodać 20 ml 25% GA do roztworu, a następnie uzupełnić objętość ddH2O do 1 L.</li>
</ol>
2. Przygotowanie utrwalacza po perfuzji dla SBEM (2% wag./vol PFA i 2.5% vol/vol GA w 0.1 M PB, pH 7.4)
<ol>
	<li>Weź 50 ml utrwalacza do perfuzji (2% PFA i 0,5% GA w 0,1 M PB).</li>
	<li>Dodaj 5 ml 25% GA.</li>
</ol>
3. Przygotowanie utrwalacza po perfuzji do barwienia IF (4% PFA w buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS))
<ol>
	<li>Rozpuść tabletkę 1x PBS (pH 7,4) w oczyszczonej i dejonizowanej wodzie (H2O) zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Za pomocą mieszającej płyty grzejnej podgrzej roztwór do 60 °C i dodaj 40 g PFA.</li>
	<li>Dodawać krople 1 M NaOH, aż PFA całkowicie się rozpuści i pozostawić mieszaninę do ostygnięcia.</li>
	<li>Doprowadzić pH roztworu do 7,5 za pomocą 1 M HCl, a następnie uzupełnić objętość za pomocąH2Odo 1 L.</li>
	<li>Przefiltruj roztwór, aby usunąć wszelkie osady.</li>
</ol>
4. Perfuzja przezsercowa zwierząt
UWAGA: Wszystkie odpady PFA i GA muszą być zbierane i przechowywane do utylizacji zgodnie z lokalnymi przepisami. Znieczulenie i perfuzja powinny być zgodne z lokalnymi przepisami. W opisanym protokole wykorzystano dorosłe 3-miesięczne i 20±1-miesięczne samice myszy Thy1-GFP(M) (Thy1-GFP +/-)12 eksprymujące białko zielonej fluorescencji (GFP) w słabo rozmieszczonej populacji neuronów glutaminergicznym, ale można również użyć dowolnego innego. Zwierzęta były hodowane jako heterozygoty o pochodzeniu C57BL/6J w Zwierzętarniach Instytutu Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego.
<ol>
	<li>Przed perfuzją znieczulić mysz przez podanie mieszaniny ketaminy / ksylazyny (do 90 mg / kg masy ciała ketaminy i 10 mg / kg masy ciała ksylazyny) przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (igła o rozmiarze 27).
	<ol>
		<li>Oceń, czy głębokość znieczulenia jest wystarczająca, sprawdzając odruch na bodźce bólowe (szczypanie) i odruch rogówkowy (mrużenie oczu).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 20 minutach wykonać iniekcję dootrzewnową (igła o rozmiarze 27) pentobarbitalu sodu (50 mg/kg masy ciała).</li>
	<li>Wykonaj perfuzję myszy zgodnie z protokołem chirurgii perfuzyjnej opisanym przez Gage et al.13 (patrz punkt 4; Rysunek 5-6). Za pomocą pompy perfuzyjnej zacznij od 0,1 M buforu fosforanowego o pH 7,4 (30 ml) przez 3 minuty i kontynuuj z 2% PFA i 0,5% GA w 0,1 M PB, pH 7,4 przez 6 minut (80 ml).
	<ol>
		<li>Delikatnie wypreparuj mózg z czaszki i podziel go na pół (patrz Rysunek 9-10 w Gage et al., 201213). Umieścić jedną część w fiolce zawierającej utrwalacz SBEM, a drugą w fiolce z 4% PFA/PBS do barwienia IF.</li>
		<li>Utrzymuj półkule w utrwalaczu w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przygotowanie wycinków mózgu do mikroskopii elektronowej
<ol>
	<li>Wybierz ustawienia wibracji (prędkość przesuwu ostrza: 0,075 mm/s, częstotliwość cięcia: 80 Hz).</li>
	<li>Umieść komorę na plastry w uchwycie, przymocuj ją do wibratomu i otocz lodem. Następnie umieść żyletkę w uchwycie ostrza wibratomowego.</li>
	<li>Użyj łyżki lub podobnego przedmiotu i umieść schłodzony mózg (powierzchnią grzbietową do góry) na twardej powierzchni tnącej (np. szklanej pokrywce szalki Petriego). Aby przygotować wycinek koronalny hipokampa, wykonaj prostopadłe cięcie między półkulą mózgową a móżdżkiem za pomocą żyletki lub skalpela, usuwając w ten sposób móżdżek. Opuszkę węchową można również usunąć.</li>
	<li>Nałóż klej cyjanoakrylowy na suchą platformę wibratomu.</li>
	<li>Podnieś mózg kleszczami i ostrożnie osusz go na bibule filtracyjnej.</li>
	<li>Przyklej półkulę do platformy w pobliżu ostrza tnącego końcówką rostralną do góry. Przymocuj platformę do uchwytu i natychmiast napełnij ją lodowatym 0,1 m PB, pH 7,4. Jeśli prostopadłe cięcie zostanie wykonane prawidłowo, półkula stanie prosto do góry, zapewniając kąt 90° wymagany do wykonania symetrycznego cięcia koronalnego zawierającego hipokamp. Upewnij się, że mózg jest pokryty PB.</li>
	<li>Umieść ostrze wibratomu przed półkulą i opuść je na koronalną stronę półkuli. Obniż ostrze do 400 μm dalej w kierunku ogonowym i rozpocznij krojenie. Kontynuuj krojenie, aż pierwsze dwa plasterki zostaną całkowicie oddzielone od bloku tkanki.</li>
	<li>Schowaj ostrze i opuść o kolejne 100 μm, a następnie ponownie pokrój.</li>
	<li>Kiedy hipokamp staje się widoczny (użyj atlasu mózgu myszy Paxinos i Franklin, 200414), zbierz plastry małym pędzlem lub poszerzoną plastikową pipetą Pasteura.</li>
	<li>Przenieś plastry do 12-dołkowej płytki wypełnionej zimnym 0,1 M PB o pH 7,4.</li>
	<li>Wypreparuj hipokamp na szklanej szalce Petriego wypełnionej 0,1 M PB, pH 7,4 za pomocą żyletki lub skalpela i umieść go w szklanych fiolkach z tym samym buforem fosforanowym. 
	UWAGA: W przypadku długotrwałego przechowywania plastrów uzupełnić 0,1 M PB 0,05% azydkiem sodu (NaN3).</li>
</ol>
6. Przygotowanie próbki mózgu do barwienia immunologicznego
<ol>
	<li>Po utrwaleniu przez noc w 4% roztworze PFA/PBS w dygestorium, tkankę mózgową należy umieścić w roztworze do kriokonserwacji (30% sacharozy w PBS z 0,05% NaN3) i przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2 dni (do momentu zatonięcia).</li>
	<li>Przygotować roztwór przeciw zamarzaniu (15% sacharozy/30% glikolu etylenowego/0,05% NaN3/PBS).</li>
	<li>Ustaw temperaturę w komorze kriostatu na -19 °C i upewnij się, że temperatura została osiągnięta, zanim przejdziesz dalej. Podczas cięcia należy upewnić się, że temperatura szafy utrzymuje się w zakresie od -18 °C do -20 °C.</li>
	<li>Użyj łyżki lub podobnego przedmiotu i umieść schłodzony mózg (powierzchnią grzbietową do góry) na twardej powierzchni tnącej (np. szklanej pokrywce szalki Petriego). Aby przygotować wycinek koronalny hipokampa, wykonaj prostopadłe cięcie między półkulą mózgową a móżdżkiem za pomocą żyletki lub skalpela, usuwając w ten sposób móżdżek.</li>
	<li>Wybierz wstępnie schłodzony krążek próbki, przykryj go podłożem do zamrażania na wolnej półce i za pomocą kleszczy przymocuj półkulę do dysku końcówką rostralną do góry i poczekaj, aż próbka zostanie całkowicie zamrożona. Włóż krążek z próbką do głowicy próbki.</li>
	<li>Zamontuj ostrze w uchwycie ostrza wewnątrz komory kriogenicznej i pokrój plastry o grubości 40 μm.</li>
	<li>Przenieś plastry małym pędzlem na 96-dołkową płytkę wypełnioną zimnym roztworem przeciw zamarzaniu i delikatnie rozwiń kawałki (zbierz plasterek po każdej rundzie krojenia, aby zapobiec ich zgubieniu się w komorze krojenia). 
	UWAGA: Mózgi lub skrawki można przechowywać w roztworze niezamarzającym w temperaturze -20 °C przez długi czas.</li>
</ol>
7. Barwienie immunologiczne wycinków mózgu
UWAGA: Wszystkie etapy barwienia zostały wykonane na 24-dołkowej płytce na platformie wytrząsarkowej.
<ol>
	<li>Umyj plastry PBS trzy razy, za każdym razem przez 6 minut.</li>
	<li>Inkubować plastry w 300 μl roztworu blokującego (5% normalnej surowicy osła (NDS)/0,3% Triton X-100) przez 1 godzinę, delikatnie potrząsając rotatorem.</li>
	<li>Inkubować plastry z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko PSD-95 rozcieńczonym w stosunku 1:500 w 5% NDS/0,3% Triton X-100/PBS (300 μL na studzienkę) przez noc w temperaturze 4 °C. Końcowe stężenie przeciwciała pierwszorzędowego wynosi 2 μg/ml.</li>
	<li>Umyj plastry 0,3% Triton X-100/PBS w temperaturze pokojowej (RT) trzy razy, za każdym razem przez 6 minut.</li>
	<li>Inkubować plastry z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w stosunku 1:500 w 300 μl 0,3% Triton X-100/PBS przez 90 minut. Końcowe stężenie przeciwciała drugorzędowego wynosi 4 μg /ml.</li>
	<li>Umyj plastry PBS trzy razy, za każdym razem przez 6 minut.</li>
	<li>Zamontuj plastry na szkiełkach za pomocą podłoża montażowego, a następnie zamknij je szkiełkiem zakrywającym.</li>
	<li>Zbadaj próbki za pomocą mikroskopu konfokalnego (obiektyw olejowy 63 ×, NA 1,4, rozmiar piksela 0,13 μm × 0,13 μm). 
	UWAGA: W przypadku długotrwałego przechowywania: próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić je przed światłem.</li>
</ol>
8. Przygotowanie próbki SBEM
UWAGA: Ze względu na niebezpieczny charakter używanych odczynników, wszystkie opisane poniżej procedury muszą być przeprowadzone w laboratoryjnym dygestorium. Przed użyciem tych chemikaliów należy uważnie zapoznać się z kartami charakterystyki substancji niebezpiecznych dostarczonymi przez producentów i zapytać specjalistę ds. bezpieczeństwa o lokalne przepisy zapewniające bezpieczne obchodzenie się z odpadami i ich utylizację.
<ol>
	<li>Próbka kontrastująca 
	UWAGA: Mycie plastrów i inkubację w temperaturze pokojowej należy przeprowadzać z łagodnym wstrząsaniem (np. na wytrząsarce platformowej). Użyto wody odgazowanej w autoklawie.
	<ol>
		<li>Plastry umyć zimnym 0,1 M PB, pH 7,4 pięć razy, za każdym razem przez 3 minuty.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę 1:1 4% wodnego tetratlenku osmu i 3% żelazocyjanku potasu (1:1 obj.). Produkt końcowy zmieni kolor na brązowy. Zanurz próbki w tej mieszaninie, umieść je na lodzie i od tego etapu ważne jest, aby chronić je przed światłem. Inkubuj je, delikatnie potrząsając przez 1 godzinę.</li>
		<li>W międzyczasie przygotuj roztwór tiokarbohydrazydu (TCH). Wymieszać 10 ml podwójnie destylowanegoH2O(ddH2O) i 0,1 g TCH i umieścić w piekarniku nastawionym na 60 °C na 1 godzinę. Ważne jest, aby od czasu do czasu mieszać roztwór (np. co 10 minut). Gdy będzie gotowy, schłodzić do temperatury pokojowej.</li>
		<li>Umyj plastry ddH2O pięć razy, za każdym razem przez 3 minuty.</li>
		<li>Przefiltrować roztwór TCH za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm i zanurzyć próbkę w przefiltrowanym roztworze. Plastry zmienią kolor na. Inkubuj je przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przemyć próbki ddH2O pięć razy, za każdym razem przez 3 minuty.</li>
		<li>Próbki inkubować w 2% wodnym roztworze OsO4 przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przemyć próbki ddH2O pięć razy, za każdym razem przez 3 minuty.</li>
		<li>Umieścić próbki w przefiltrowanym 1% wodnym octanie uranylu i inkubować je w temperaturze 4 °C przez noc. Do filtracji należy użyć filtra strzykawkowego 0,22 μm.</li>
		<li>Przygotuj roztwór kwasu L-asparaginowego, mieszając 0,4 g kwasu L-asparaginowego i 80 ml ddH2O, dostosuj pH do 3,8 dla łatwiejszego rozpuszczenia, a następnie uzupełnij wodą do 100 ml.</li>
		<li>Następnego dnia zacznij od przygotowania Waltona z ołowiu asparaginian15. Zmieszać 0,066 g azotanu ołowiu z 10 ml roztworu kwasu L-asparaginowego (pkt 8.1.10) podgrzanego do temperatury 60 °C i dostosować pH do 5,5 (mierzone w temperaturze 60 °C) z 1 M NaOH. Zamknąć fiolkę z asparaginianem ołowiu i pozostawić w temperaturze 60 °C na 30 minut w łaźni wodnej. Rozwiązanie powinno być jasne. Jeśli stanie się mętny, należy go wyrzucić i przygotować nowy.</li>
		<li>W międzyczasie przemyć próbki odgazowanym ddH2O pięć razy, za każdym razem przez 3 minuty. Następnie przechowuj je w piekarniku nastawionym na 60 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Zanurzyć próbki w świeżo przygotowanym roztworze asparaginianu ołowiu i inkubować je w piecu nastawionym na 60 °C przez 20 minut.</li>
		<li>Przemyć próbki odgazowanym ddH2O pięć razy, za każdym razem przez 3 minuty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwodnienie i zatapianie żywicy
	<ol>
		<li>Przygotuj żywicę epoksydową. Zważyć składniki (33,3 g składnika A/M, 33,3 g składnika B i 1 g składnika D) i dobrze wymieszać żywicę (np. wstrząsnąć nią na wytrząsarce obrotowej w probówce o pojemności 15 ml) przez co najmniej 30 minut przed dodaniem 16 kropli przyspieszacza DMP 30. Mieszaj ponownie przez kolejne 10 minut. 
		UWAGA: Zważyć składniki pod wyciągiem. Taka ilość składników daje około 60 ml żywicy, co wystarcza na 15 fiolek z próbkami. Możesz przygotować mniej żywicy lub przechowywać resztę żywicy w strzykawce w temperaturze 4 °C i zużyć ją następnego dnia. Należy pamiętać o uszczelnieniu końcówki strzykawki.</li>
		<li>Przygotować fiolki ze stopniowanymi rozcieńczeniami etanolu (30%, 50%, 70%, 90%, 100%, 100% etanolu w wodzie i 100% wysuszonego na sicie molekularnym).</li>
		<li>Wymieszaj żywicę ze 100% etanolem w proporcji 1:1, aby uzyskać 50% żywicy. Dobrze wymieszaj.</li>
		<li>Odwadniać próbki przez 5 minut w każdym rozcieńczeniu etanolu, zaczynając od 30%, a kończąc na 100% bezwodnym etanolu suszonym na sicie molekularnym. Należy pamiętać, że próbki nigdy nie mogą całkowicie wyschnąć.</li>
		<li>Infiltruj próbki najpierw w 50% żywicy przez 30 minut, następnie w 100% żywicy przez godzinę, a następnie ponownie w 100% żywicy przez noc. Wykonuj wszystkie etapy infiltracji ze stałym, powolnym potrząsaniem.</li>
		<li>Następnego dnia umieść próbki w świeżej 100% żywicy na godzinę, a następnie zanurz je między arkuszami do zatapiania fluoropolimeru. Odtłuścić kawałki arkusza do zatapiania etanolem i płasko zatopić próbki między dwiema jego warstwami, używając dwóch szkiełek jako podpory. Staraj się unikać pęcherzyków powietrza w żywicy na próbce lub w jej pobliżu.</li>
		<li>Próbki utwardzać w piecu w temperaturze 70 °C przez co najmniej 48 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przycinanie i montaż
	<ol>
		<li>Oddziel arkusze do zatapiania i odetnij kawałek osadzonej próbki (około 1 mm x 1 mm) za pomocą żyletki. Przenieś go do parafilmu. Zminimalizuje to niebezpieczeństwo utraty próbki z powodu elektrostatyki.</li>
		<li>Weź aluminiową szpilkę, która została odtłuszczona etanolem. Dobrze wymieszaj przewodzącą żywicę epoksydową i użyj jej niewielkiej ilości do zamontowania próbki na szpilce. Utwardzać przewodzącą żywicę epoksydową w temperaturze 70 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Przytnij każdą stronę bloku próbki nożem diamentowym, a następnie wypoleruj powierzchnię bloku, aż tkanka zostanie odsłonięta. 
		UWAGA: Na tym etapie potwierdź obecność interesującego Cię obszaru, zbierając kilka skrawków i wykonując barwienie na niebiesko toluidyną16 lub sprawdzając pod mikroskopem elektronowym.</li>
		<li>Zmniejsz rozmiar próbki tak bardzo, jak to możliwe. Następnie zmielić próbkę na szpilce farbą przewodzącą i utwardzić (przez 24 godziny w temperaturze pokojowej lub w piecu w temperaturze 65 °C przez 40 minut).</li>
		<li>Aby zminimalizować artefakty ładowania, napylaj próbki cienką warstwą złota lub złota/palladu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. Obrazowanie SBEM
<ol>
	<li>Umieść szpilkę z próbką w komorze seryjnego skaningowego mikroskopu elektronowego z powierzchnią czołową. Wyrównaj próbkę z nożem. Zamknij komorę i ustaw parametry.</li>
	<li>Zbierz stos obrazów o żądanym powiększeniu, rozmiarze piksela, grubości warstwy, przyspieszonym napięciu (EHT), przysłonie, ciśnieniu itp. 
	UWAGA: Parametry zależą od próbki i celu eksperymentu. Przykładowe początkowe ustawienia obrazowania znajdują się w tabeli materiałów.</li>
</ol>
10. 3D rekonstrukcje
UWAGA: Do poniższych kroków używamy oprogramowania o otwartym dostępie, np. FijiJ17 (ImageJ version 1.49b), Microscopy Image Browser (MIB)18 i Reconstruct19, ale można zastosować różne inne programy.
<ol>
	<li>Konwertuj pliki mikrografów cyfrowych (dm) na format TIFF. Najpierw zaimportuj sekwencję obrazów (w FidżiJ: Plik > Importuj > Sekwencja obrazów > Wybierz format 8-bitowy), a następnie zapisz jako TIFF (w FidżiJ: Plik > Zapisz jako sekwencję obrazów > > Wybierz Tiff).</li>
	<li>Dostosuj jasność i kontrast stosu obrazów (w FijiJ: Image > Dostosuj > Jasność/Kontrast) i, jeśli to konieczne, odszum go (użyj wtyczki DenoisEM dla FijJ20 : Plugins > DenoiseEM > Denoise).</li>
	<li>Wyrównaj stos (w FijiJ: Plugins > StagReg lub MIB: Dataset > Alignment Tools).</li>
	<li>Segmentowanie kolców dendrytycznych i synaps (w oprogramowaniu MIB lub Reconstruct dostępne są obszerne samouczki (szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli materiałów).</li>
</ol>

<ol><li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity dendritic spines.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).</li>
<li>Borczyk, M., Radwanska, K., Giese, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+ultrastructural+analysis+of+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">The importance of ultrastructural analysis of memory.</a> Brain Research Bulletin. 173, 28-36 (2021).</li>
<li>Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+microtome-based+serial+block-face+scanning+electron+microscopy+in+neuroscience%3A+challenges+of+SBEM+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience: challenges of SBEM in neuroscience.</a> Journal of Microscopy. 259 (2), 137-142 (2015).</li>
<li>Śliwińska, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+Memory+Upscales+Volume+of+Postsynaptic+Densities+in+the+Process+that+Requires+Autophosphorylation+of+%CE%B1CaMKII%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Long-term Memory Upscales Volume of Postsynaptic Densities in the Process that Requires Autophosphorylation of αCaMKII.</a> Cerebral Cortex. 30 (4), 2573-2585 (2020).</li>
<li>Borczyk, M., Śliwińska, M. A., Caly, A., Bernas, T., Radwanska, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+plasticity+affects+correlation+between+the+size+of+dendritic+spine+and+its+postsynaptic+density%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Neuronal plasticity affects correlation between the size of dendritic spine and its postsynaptic density.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1693(2019).</li>
<li>Leighton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEM+images+of+block+faces%2C+cut+by+a+miniature+microtome+within+the+SEM+-+a+technical+note%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note.</a> Scanning Electron Microscopy. , Pt 2 73-76 (1981).</li>
<li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+Block-Face+Scanning+Electron+Microscopy+to+Reconstruct+Three-Dimensional+Tissue+Nanostructure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), 329(2004).</li>
<li>Smith, D., Starborg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block+face+scanning+electron+microscopy+in+cell+biology%3A+Applications+and+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+and+Cell%22%5BJournal%5D)">Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology.</a> Tissue and Cell. 57, 111-122 (2019).</li>
<li>Titze, B., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+scanning+electron+microscopy+for+imaging+biological+ultrastructure%3A+Volume+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure: Volume scanning electron microscopy.</a> Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).</li>
<li>Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeerinck%2C+TJ+%22NCMIR+methods+for+3D+EM%3A+A+new+protocol+for+preparation+of+biological+specimens+for+serial+block+face+scanning+electron+microscopy%22">NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy</a>. , 6-8 (2010).</li>
<li>Willingham, M. C., Rutherford, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+osmium-thiocarbohydrazide-osmium+%28OTO%29+and+ferrocyanide-reduced+osmium+methods+to+enhance+membrane+contrast+and+preservation+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , Acad. Press. San Diego, Calif. (2004).</li>
<li>Walton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lead+aspartate%2C+an+en+bloc+contrast+stain+particularly+useful+for+ultrastructural+enzymology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).</li>
<li>Mercer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+scheme+for+section+staining+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">a scheme for section staining in electron microscopy.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 81 (3-4), 179-186 (1963).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+Image+Browser%3A+A+Platform+for+Segmentation+and+Analysis+of+Multidimensional+Datasets%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets.</a> PLOS Biology. 14 (1), 1002340(2016).</li>
<li>Fiala, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruct%3A+a+free+editor+for+serial+section+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Reconstruct: a free editor for serial section microscopy.</a> Journal of Microscopy. 218 (1), 52-61 (2005).</li>
<li>Roels, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interactive+ImageJ+plugin+for+semi-automated+image+denoising+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An interactive ImageJ plugin for semi-automated image denoising in electron microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 771(2020).</li>
<li>Radwanska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+for+long-term+memory+formation+when+synaptic+strengthening+is+impaired%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mechanism for long-term memory formation when synaptic strengthening is impaired.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18471-18475 (2011).</li>
<li>Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block+face+scanning+electron+microscopy+and+the+reconstruction+of+plant+cell+membrane+systems%3A+SBFSEM+Methods+for+Plant+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems: SBFSEM Methods for Plant Cells.</a> Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).</li>
<li>Fendrych, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+Cell+Death+Controlled+by+ANAC033%2FSOMBRERO+Determines+Root+Cap+Organ+Size+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Programmed Cell Death Controlled by ANAC033/SOMBRERO Determines Root Cap Organ Size in Arabidopsis.</a> Current Biology. 24 (9), 931-940 (2014).</li>
<li>Russell, M. R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+correlative+light+and+electron+microscopy+of+cultured+cells+using+serial+blockface+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).</li>
<li>Płachno, B. J., Świątek, P., Jobson, R. W., Małota, K., Brutkowski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block+face+SEM+visualization+of+unusual+plant+nuclear+tubular+extensions+in+a+carnivorous+plant+%28Utricularia%2C+Lentibulariaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Serial block face SEM visualization of unusual plant nuclear tubular extensions in a carnivorous plant (Utricularia, Lentibulariaceae).</a> Annals of Botany. 120 (5), 673-680 (2017).</li>
<li>Genoud, C., Titze, B., Graff-Meyer, A., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Homogeneous+En+Bloc+Staining+of+Large+Tissue+Samples+for+Volume+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Fast Homogeneous En Bloc Staining of Large Tissue Samples for Volume Electron Microscopy.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, (2018).</li>
<li>Puhka, M., Joensuu, M., Vihinen, H., Belevich, I., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+sheet-to-tubule+transformation+is+a+general+mechanism+for+endoplasmic+reticulum+partitioning+in+dividing+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Progressive sheet-to-tubule transformation is a general mechanism for endoplasmic reticulum partitioning in dividing mammalian cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2424-2432 (2012).</li>
<li>Gluenz, E., Wheeler, R. J., Hughes, L., Vaughan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+and+three-dimensional+electron+microscopy+methods+for+the+study+of+Trypanosoma+brucei+and+Leishmania+mexicana+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Scanning and three-dimensional electron microscopy methods for the study of Trypanosoma brucei and Leishmania mexicana flagella.</a> Methods in Cell Biology. 127, 509-542 (2015).</li>
<li>Starborg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+transmission+electron+microscopy+and+3View+to+determine+collagen+fibril+size+and+three-dimensional+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using transmission electron microscopy and 3View to determine collagen fibril size and three-dimensional organization.</a> Nature Protocols. 8 (7), 1433-1448 (2013).</li>
<li>Hughes, L., Borrett, S., Towers, K., Starborg, T., Vaughan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+organelle+ontogeny+through+a+cell+cycle+revealed+by+whole-cell+reconstructions+using+3D+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Patterns of organelle ontogeny through a cell cycle revealed by whole-cell reconstructions using 3D electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (3), 637-647 (2017).</li>
<li>Bojko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Autophagic+Flux+in+Escapers+from+Doxorubicin-Induced+Senescence%2FPolyploidy+of+Breast+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Improved Autophagic Flux in Escapers from Doxorubicin-Induced Senescence/Polyploidy of Breast Cancer Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6084(2020).</li>
<li>Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+preparing+GFP-labeled+neurons+previously+imaged+in+vivo+and+in+slice+preparations+for+light+and+electron+microscopic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1145-1156 (2009).</li>
<li>Glauert, A. M., Lewis, P. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGlauert%2C+AM+%22Biological+specimen+preparation+for+transmission+electron+microscopy%22">Biological specimen preparation for transmission electron microscopy</a>. , Princeton University Press. Princeton. (2014).</li>
<li>Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Synapse+Formation+in+the+Adult+Somatosensory+Cortex+of+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Heterozygote+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Altered Synapse Formation in the Adult Somatosensory Cortex of Brain-Derived Neurotrophic Factor Heterozygote Mice.</a> Journal of Neuroscience. 24 (10), 2394-2400 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istnieje wiele odmian podstawowej metody NCMIR opisanej przez Deerincka w 2010 roku10. Podstawowe zasady pozostają takie same, ale w zależności od rodzaju badanego materiału wprowadzane są niewielkie zmiany. Opisano wcześniej, że różne żywice mogą być używane do osadzania próbek SBEM i na przykład w przypadku roślin, żywica Spurra jest preferowana ze względu na jej niską lepkość, która umożliwia lepszą infiltrację przez ściany komórkowe22,23</su...

Większość synaps pobudzających w ośrodkowym układzie nerwowym znajduje się na kolcach dendrytycznych – niewielkich wypustkach błony neuronalnej. Wypustki te tworzą ograniczone przedziały biochemiczne, które kontrolują wewnątrzkomórkową transdukcję sygnałów. Plastyczność strukturalna kolców dendrytycznych i synaps jest ściśle powiązana z funkcjonalnymi zmianami skuteczności synaptycznej, które leżą u podstaw tak istotnych procesów jak uczenie się i pamięć1,2. Należy zauważyć, że mikroskopia elektronowa (EM) jest jedyną techniką pozwalającą określić, czy kolce dendrytyczny posiada wkład presynaptyczny. Rozdzielczość EM jest również niezbędna do badania szczegółów ultrastrukturalnych, takich jak kształt gęstości postsynaptycznej (PSD), stanowiącej część postsynaptyczną synapsy, czy wymiary kolca dendrytycznego, a także rozmiar i kształt pączka aksonalnego. Ponadto dzięki EM możliwe jest obrazowanie synaps oraz ich otoczenia.
Dzięki postępom w technologiach obrazowania i obliczeń możliwe jest rekonstruowanie całych obwodów neuronalnych. Techniki wolumetrycznej mikroskopii elektronowej, takie jak transmisyjna mikroskopia elektronowa z seryjnych przekrojów (ssTEM), skaningowa mikroskopia elektronowa seryjnych powierzchni bloków (SBEM) oraz skaningowa mikroskopia elektronowa z wykorzystaniem skoncentrowanej wiązki jonów (FIB-SEM), są powszechnie stosowane do rekonstrukcji obwodów neuronalnych3.
W naszych badaniach metoda SBEM jest z powodzeniem stosowana do badania plastyczności strukturalnej kolców dendrytycznych oraz PSD w próbkach hipokampa mysiego oraz organotypowych skrawków mózgu 4,5. Metoda SBEM opiera się na zainstalowaniu miniaturowego ultramikrotomu wewnątrz komory skaningowego mikroskopu elektronowego6,7,8,9. Obrazowany jest wierzchołek bloku próbki, a następnie ultramikrotom wykonuje cięcie na określonej głębokości, odsłaniając nową powierzchnię bloku, która jest ponownie obrazowana, a następnie proces jest powtarzany8. W rezultacie pozostaje jedynie obraz powierzchni bloku, natomiast wycięty skrawek zostaje utracony w postaci odpadów. Właśnie dlatego SBEM nazywana jest techniką destrukcyjną, co oznacza, że ponowne obrazowanie tego samego miejsca nie jest możliwe. Zaletą destrukcyjnych metod on-block jest jednak fakt, że nie występują w nich problemy z wypaczaniem oraz utratą sekcji, co może znacząco wpłynąć na jakość danych i ich analizę3. Ponadto SBEM umożliwia obrazowanie stosunkowo dużego pola widzenia (&gt; 0.5 mm × 0.5 mm) przy wysokiej rozdzielczości3.
Aby zastosować SBEM, próbki muszą być przygotowane zgodnie z dedykowanym protokołem zapewniającym wysoki kontrast, ze względu na zastosowanie detektora elektronów wstecznie rozproszonych do obrazowania. Przedstawiamy tutaj sposób przygotowania próbek zgodnie z protokołem opartym na procedurze opracowanej przez Deerinka10 (metoda National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR)), z wykorzystaniem barwień rOTO (zredukowany osm przeplatający się z tiokarbohydrazydem i osmem) opracowanych w latach 80.8,11. Dodatkowo wprowadzamy dwuetapowe podejście do fiksacji, z łagodną perfuzją utrwalającą, która pozwala na wykorzystanie tego samego mózgu zarówno do badań immunofluorescencyjnych w mikroskopii świetlnej, jak i do SBEM.
W protokole mózg myszy jest najpierw utrwalany łagodnym utrwalaczem, a następnie dzielony na połówki; jedna półkula poddawana jest postfiksacji i przygotowywana do immunofluorescencji (IF), natomiast druga do badań EM (Rysunek 1).
<img alt="Schemat analizy mózgu myszy z utrwalaniem, post-utrwalaniem, wibratomem, obrazowaniem SEM i rekonstrukcją 3D." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62712/62712fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1Schematyczny przedstawienie przebiegu prac podczas przygotowania kolców dendrytycznych do analizy metodą SBEM. Myszy uśmiercono i poddano perfuzji łagodnym utrwalaczem pierwotnym. Mózg przecięto na pół; jedną półkulę poddano późniejszemu utrwalaniu utrwalaczem dedykowanym do immunofluorescencji (IF), krioprotekcji, cięciu przy użyciu kriostatu i dalszej obróbce do badań IF, natomiast drugą półkulę utrwalono późniejszym utrwalaczem do EM, przecięto w wibrotomie i przygotowano do badań EM. Przekroje mózgu do badań SBEM poddano kontrastowaniu i płaskiemu zatopieniu w żywicy, następnie obszar CA1 hipokampa zamocowano na pinie i obrazowano za pomocą SBEM (Rysunek 1). Część protokołu wyróżniona żółtym polem została przedstawiona w filmie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62712/62712fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>

<table><tbody><tr><td>&lt; silny&gt; znieczulający: &lt; / silny&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>mieszanina ketaminy / ksylazyny (Ketamina / Sedazyna)</td> <td>Biowet Puławy, Puławy, Polska</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu (Morbital)</td> <td>Biowet Puławy, Puławy, Polska</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt; silny&gt;Utrwalacze:&lt; / silny&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>aldehyd glutarowy (GA)</td> <td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA</td><td>G5882</td><td>Klasa I, 25% w H2O, specjalnie oczyszczony do stosowania jako utrwalacz do mikroskopii elektronowej</td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl)</td><td>POCH, Gliwice, Polska</td><td>575283115</td><td>czysty rocznie</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td><td>441244</td><td>bryłki, 95%</td></tr> <tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td> Klasa odczynnika <td>S5881</td><td>, <img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png">98%, granulki ( bezwodny)</td></tr> <tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy (NaH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td><silny>Perfuzja: &lt; / silny&gt;</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duży / zakrzywiony nożyczki (~14,5 cm)</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td><td>14519-14</td><td></td></tr><tr><td>Mikroszpatułka (podwójne płaskie końce 2", jedna zaokrąglona, jedna zwężająca się do 1/8")</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td><td>10091-12</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka igły, 15 GA, (igła perfuzyjna)</td><td>KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, Niemcy</td><td>KD-FINE 900413</td><td>1,80 x 40 mm</td></tr><tr><td>Para cienkich (Graefe) pęset</td><td>Fine Science Tools, Foster City, Kalifornia, Stany Zjednoczone</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perfuzyjna</td><td>Płyn ołowiowy</td><td>BQ80S</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki plastikowe</td><td>Profilab, Warszawa, Polska</td><td>534.02</td><td>Fiolki plastikowe z niebieską nakrętką do przechowywania tkanek, 20 ml, 31 x 48 mm</td></tr><tr><td>Nożyczki do prostych tęczówek (~9 cm)</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Przygotowanie plastrów mózgu do EM: strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka</td><td>NEST, Rahway, NJ, Stany Zjednoczone</td><td>712001</td><td></td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy</td><td>Fenedur, Montevideo, Urugwaj</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiolki szklane</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>72632</td><td>20 ml Fiolka scyntylacyjna, opakowanie 100</td></tr><tr><td>pipet Pasteura</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>612-4545</td><td>LDPE, jednorazowe, 7,5 ml</td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Wilkinson Sword, Londyn, Wielka Brytania</td><td></td><td>Klasyczne maszynki do golenia z podwójną krawędzią</td></tr><tr><td>Ostrze skalpela</td><td>Swann-Morton, Sheffield, Wielka Brytania</td><td>Nr 20</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Microsystems, Wiedeń, Austria</td><td>Leica VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Przygotowanie plastrów mózgu do IF:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>NEST, Rahway, NJ, Stany Zjednoczone</td><td>701101</td><td></td></tr><tr><td>Criostat</td><td>Leica Microsystems, Wiedeń, Austria</td><td>Leica CM 1950</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy</td><td>Bioshop, Burlington, Kanada</td><td>ETH001</td><td></td></tr><tr><td>Niskoprofilowe ostrze jednorazowe 819</td><td>Leica Biosystems Inc., Stany 14035838925</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpela</td><td>Swann-Morton, Sheffield, Wielka Brytania</td><td>Nr 20</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu (NaN3)</td><td>POCH, Gliwice, Polska</td><td>792770426</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>POCH, Gliwice, Polska</td><td>772090110</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka tkanek do kriosekcji, OCT</td><td>Leica Biosystems, Szwajcaria</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>Immunostaining:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-well plate</td><td>NEST, Rahway, NJ, USA</td><td>702001</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-post Synaptic Density Protein 95</td><td>Merck-Millipore, Burlington, MA, USA</td><td>MAB1598</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss, Gö ttingen, Niemcy</td><td></td><td>Mikroskop Zeiss Spinning Disc (63 i razy; obiektyw olejowy, NA 1.4, rozmiar piksela 0.13 i mikro; m i razy; 0,13 &amp;mikro; m)</td></tr> <tr><td>Szkiełko osłonowe</td><td>Menzel Glaser, Brunszwik, Niemcy</td><td>B-1231</td><td>24 x 60 mm</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej Przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td><td>A31570</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe Fluoromount-G, z DAPI</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td><td>00-4959-52</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>AGAA00008</td><td>SuperFrost</td></tr><tr><td>Normalna surowica osła (NDS)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>JWElectronic, Warszawa, Polska</td><td>KL-942</td><td></td></tr><tr><td>TritonT X-100 Reagent</td><td>Grade Bioshop, Burlington, Kanada</td><td>TRX506</td><td></td></tr><tr><td>Przygotowanie próbki z mikrosokopy elektronowej</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trójwodzian heksacyjanożelazianu(II) potasu</td><td>POCH, Gliwice, Polska</td><td>746980113</td><td></td></tr><tr><td>Aclar 33C Film</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>50425</td><td>Arkusz do zatapiania folii fluoropolimerowej</td></tr><tr><td>DMP-30, 2,4,6-tris(dimetyloaminometylo)fenol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA</td><td>T58203</td><td>Akcelerator podłoża epoksydowego</td></tr><tr><td>Durcupan ACM jednoskładnikowy A, M</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA</td><td>44611</td><td>Durcupan ACM jednoskładnikowy A, M żywica epoksydowa</td></tr><tr><td>Durcupan ACM jednoskładnikowa B</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA</td><td>44612</td><td>Durcupan ACM jednoskładnikowy B, utwardzacz 964</td></tr><tr><td>Durcupan ACM jednoskładnikowy D</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA</td><td>44614</td><td>Durcupan ACM jednoskładnikowy D, plastyfikator</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy bezwzględny</td><td>POCH, Gliwice, Polska</td><td>64-17-5</td><td>Alkohol etylowy absolutny 99,8 % czystości P.A.-BASIC</td></tr><tr><td>Piec laboratoryjny Genlab</td><td>Wolflabs, York, Wielka Brytania</td><td>Piekarnik Mino/18/SS</td><td>Genlab MINO/18/SS pojemność 18l, bez cyrkulacji wentylatora, bez wyświetlacza cyfrowego, standardowy gradient temperatury, standardowy współczynnik odzysku, bez timera, 250° C maksymalna temperatura, zasilanie elektryczne 240 V</td></tr><tr><td>Kwas L-asparaginowy</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA</td><td>Klasa odczynnika A-9256</td><td>, <img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png">98% (HPLC)</td></tr><tr><td>Azotan ołowiu (II)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA</td><td>467790</td><td><img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png">99.95% metali śladowych podstawa</td></tr><tr><td>Tetratlenek osmu</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA</td><td>75632</td><td>do mikroskopii elektronowej, 4% w pH2O</td></tr><tr><td>pHmetron, Zabrze, Polska</td><td>CP-5-5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>BioSan, Jó zefó w, Polska</td><td>Multi Bio RS-24</td><td>rotator Multi Bio RS-24</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td> Klasa odczynnika <td>S5881</td><td>, <img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png">98%, granulki (bezwodne)</td></tr><tr><td>Mini shaker słonecznikowy</td><td>Grant bio, Shepreth,Wielka Brytania</td> Filtr strzykawkowy <td>PD-3D</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Millipore, Burlington, MA, USA</td><td>SLGP033NB</td><td>0,22 &amp;mikro; m wielkość porów</td></tr><tr><td>Tiokarbohydrazyd</td><td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td><td>88535</td><td>purum p.a., do mikroskopii elektronowej, <img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png">99.0% Octan</td></tr> <tr><td>uranylu</td><td>Serva, Heidelberg, Niemcy</td><td>77870</td><td>Octan uranylu· 2H2O, klasa badawcza</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>WSL, Świętochlowice, Polska</td><td>LWT</td><td></td></tr><tr><td>Mocowanie próbki do płytki hodowlanej SBEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>734-2782</td><td>Płytki 96-dołkowe, okrągłe dno, nieobrobione</td></tr><tr><td>AM Gatan 3Zobacz pęsetę do obsługi króćców</td><td>Micro to Nano, Haarlem, Holandia Holandia</td><td>50-001521</td><td></td></tr><tr><td>Lornetka</td><td>OPTA-TECH, Warszawa, Polska</td><td>X2000</td><td></td></tr><tr><td>Klej przewodzący</td><td>Chemtronics, Gruzja, USA</td><td>CW2400</td><td>przewodzący eopxy</td></tr><tr><td>Gatan 3Zobacz przykładowe odcinki pinów</td><td>Micro to Nano, Haarlem, Holandia Holandia</td><td>10-006003</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA</td><td>P7793</td><td>Rozmiar rolki 20  w. &amp;czasy; 50  ft</td></tr><tr><td>Pelco przewodząca srebrna farba</td><td>Ted Pella, Redding, CA, USA</td><td>16062-15</td><td>PELCO®   Przewodząca srebrna farba, 15g</td></tr><tr><td>Żyletki z podwójną krawędzią</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences, Hatfield, PA, USA</td> Powlekane stalą nierdzewną <td>72000</td><td>"PTFE". Marka PERSONNA .004" gruby, pakowany pojedynczo, 250 ostrzy w pudełku.</td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy</td><td>Zeiss, Oberkochen, Niemcy</td><td></td><td>Sigma VP z komorą Gatan 3View2, napięcie przyspieszenia 2,5 kV, zmienne ciśnienie 5 Pa, apertura 20 µ m, czas przebywania 6 i mikro; s, grubość warstwy 60 nm, powiększenie 15 000 x, rozdzielczość obrazu 2048 x 2048 pikseli, rozmiar piksela 7,3 nm</td></tr><tr><td>wykończenie 90° nóż diamentowy</td><td>Diatome Ltd., Nidau, Szwajcaria</td><td>DTB90</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica Microsystems, Wiedeń, Austria</td> Samouczki na stronie <td></td> internetowej oprogramowania Leica ultracutR <td></td></tr><tr><td>Fidżij</td><td>https://fiji.sc/</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeglądarka obrazów mikroskopowych</td><td>http://mib.helsinki.fi/</td><td></td> <td>http://mib.helsinki.fi/tutorials.html</td></tr><tr><td>Rekonstruuj</td><td>https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0</td><td></td><td>https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0)</td></tr><tr><td>Zwierzęta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Myszy Dorosłe 3-miesięczne i  20± 1  miesiąc  Kobieta  Myszy Thy1-GFP(M) (Thy1-GFP +/-) (Feng i wsp., 2000), które wyrażają GFP w słabo rozmieszczonej populacji neuronów glutaminergicznym. Zwierzęta były hodowane jako heterozygoty o pochodzeniu C57BL/6J w Zwierzętarniach Instytutu Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa typu block-face (sbem) do badania kolców dendrytycznych

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Trójwymiarowa mikroskopia elektronowa (3D EM) daje możliwość analizy parametrów morfologicznych kolców dendrytycznych z rozdzielczością nanoskali. Ponadto niektóre cechy kolców dendrytycznych, takie jak objętość kręgosłupa i gęstość postsynaptyczna (PSD) (reprezentująca postsynaptyczną część synapsy), obecność zakończenia presynaptycznego i gładkiej retikulum endoplazmatycznego lub nietypową postać PSD (np. kolce wielounerwione), można zaobserwować tylko za pomocą 3D EM. Dzięki zastosowaniu seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej (SBEM) możliwe jest uzyskanie danych 3D EM w łatwiejszy i bardziej powtarzalny sposób niż w przypadku wykonywania tradycyjnego cięcia seryjnego. Tutaj pokazujemy, jak przygotować próbki hipokampa myszy do analizy SBEM i jak ten protokół można połączyć z badaniem immunofluorescencyjnym kolców dendrytycznych. Łagodna perfuzja fiksacji pozwala nam na wykonanie badań immunofluorescencyjnych z mikroskopią świetlną na jednej połowie mózgu, podczas gdy druga połowa została przygotowana do SBEM. Takie podejście zmniejsza liczbę zwierząt, które mają być wykorzystane do badania.

Stosując opisaną powyżej metodę, można uzyskać obrazy tkanki mózgu myszy o wysokim kontraście i dobrej rozdzielczości. Szerokie pole widzenia zapewniane przez technikę SBEM ułatwia precyzyjny wybór obszaru zainteresowania. Wykonano szeroki obraz obszaru CA1 hipokampa, aby zmierzyć długość stratum radiatum (SR) (Rycina 2A) oraz precyzyjnie ustawić obrazowanie w centrum (Rycina 2B). Następnie pozyskano stos obrazów i przeprowadzono segmentację obiektów za...

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa (SBEM) jest stosowana do obrazowania i analizy kolców dendrytycznych w mysim hipokampie.

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa typu block-face (SBEM) do badania kolców dendrytycznych

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...

Każdy neuron w mózgu jest połączony z innymi komórkami neuronalnymi za pomocą około 7 000 synaps. Z wyjątkiem tego, że te synapsy w mózgu ssaków znajdują się głównie na małych wypukłościach błony zwanych kolcami dendrytycznymi. Plastyczność synaps i kolców dendrytycznych i tym podobne, tak ważne funkcje mózgu, jak procesy uczenia się i pamięci.Należy zauważyć, że tylko mikroskopia elektronowa daje pełny wgląd w to, czy kolce dendrytyczne mają wejście postsynaptyczne. Dostępne są różne techniki obrazowania kolców dendrytycznych. Jednak seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa daje unikalną możliwość obrazowania dużej objętości tkanki z wysoką rozdzielczością.Technika skaningowej mikroskopii elektronowej opartej na blokach szeregowych wymaga specjalnego protokołu przygotowania próbki, który polega na silnym kontraście z metalami ciężkimi. Moja pierwotna fiksacja podczas perfuzji pozwoliła nam użyć tych samych mózgów do mikroskopii elektronowej w świetle reflektorów. Myszy zostały uśmiercone i poddane perfuzji łagodnym pierwotnym utrwalaczem.Mózg przecięto na połowy, a jedną półkulę utrwalono za pomocą dedykowanego do immunofluorescencji utrwalacza, krioprotektoru, pokrojono za pomocą kriostatu i przetworzono do badań immunofluorescencyjnych. Gdzie druga półkula została utrwalona za pomocą utrwalacza mikroskopii elektronowej, pokrojona wibratomem i przygotowana do badań mikroskopem elektronowym. Wycinki mózgu do badań skaningowej mikroskopii elektronowej opartej na blokach szeregowych zostały skontrastowane, płasko osadzone w żywicy, a następnie region CA1 hipokampa został zamontowany na szpilce i zobrazowany za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego opartego na bloku szeregowym.Część protokołu zaznaczona w żółtym polu została przedstawiona w filmie. Weź tkankę, która została utrwalona i pokrojona na 100 plasterków mikrobiotycznych i przemyj ją zimnym buforem fosforanowym pięć razy przez trzy minuty każdy. Przygotuj mieszaninę jeden do jednego składającą się z 4% tetratlenku osmu i 3% żelazocyjanku potasu.Produkt końcowy zmieni kolor na brązowy. Zanurzyć próbki w tej mieszaninie. Następnie umieść próbki na lodzie.I od tego etapu ważne jest, aby chronić je przed światłem. Inkubuj je, delikatnie potrząsając przez godzinę. W międzyczasie przygotuj roztwór TCH.Wymieszaj 10 mililitrów podwójnie destylowanej wody i 0,1 grama TCH. Wstaw go do piekarnika nastawionego na 60 stopni Celsjusza na godzinę. Ważne jest, aby od czasu do czasu rozlewać roztwór.Gdy będzie gotowy, ostudź go do temperatury pokojowej. Następnie przemyć próbki podwójnie destylowaną wodą pięć razy przez trzy minuty każda, a następnie zanurzyć je w przefiltrowanym roztworze TCH. Plastry zmienią kolor na.Inkubuj je przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć próbki podwójnie destylowaną wodą pięć razy przez trzy minuty każda i inkubować je z 2% tetratlenkiem osmu przez 30 minut, tym razem w temperaturze pokojowej. Ponownie przemyj próbki podwójnie destylowaną wodą pięć razy przez trzy minuty i umieść je w przefiltrowanym 1% octanie amylu.Inkubuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia zacznij od przygotowania D-asparaginianu. Wymieszaj azotan ołowiu z roztworem kwasu asparaginowego podgrzanym do 60 stopni Celsjusza.Umieść mieszaninę w łaźni wodnej o temperaturze 60 stopni Celsjusza i dostosuj pH do 5,5 za pomocą jednego molowego wodorotlenku sodu. Zamknąć fiolkę z asparaginianem ołowiu i pozostawić w temperaturze 60 stopni Celsjusza na 30 minut. Rozwiązanie powinno być jasne.Jeśli stanie się mętny, należy go wyrzucić i przygotować nowy. W międzyczasie umyj próbki wodą podwójnie destylowaną gazem pięć razy przez trzy minuty każda i trzymaj je w piecu w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 30 minut. Zanurzyć próbki w świeżo przygotowanym roztworze asparaginianu ołowiu i inkubować je w piecu nastawionym na 60 stopni Celsjusza przez 20 minut.Przygotuj żywicę epoksydową. Zważ składniki i dobrze wymieszaj żywicę przez co najmniej 30 minut przed dodaniem akceleratora DMP 30. Przygotować wirusa ze stopniowanym rozcieńczeniem etanolu.Następnie wyjmij próbki z pieca i umyj je ponownie podwójnie destylowaną wodą pięć razy przez trzy minuty każda. W międzyczasie wymieszaj żywicę ze 100% etanolem w proporcji jeden do jednego, aby uzyskać 50% żywicy. Dobrze wymieszaj.Następnie należy odwodnić próbki w każdym rozcieńczeniu etanolu przez pięć minut. Należy pamiętać, że próbki nigdy nie mogą całkowicie wyschnąć. Infiltruj próbki najpierw w 50% żywicy przez 30 minut, następnie w 100% żywicy przez godzinę, a następnie ponownie w świeżej 100% żywicy przez noc.Następnego dnia umieść próbki w świeżej 100% żywicy na godzinę, a następnie zanurz je między arkuszami do zatapiania fluoropolimeru. Przygotuj kawałki arkusza do zatapiania, które zostały odtłuszczone etanolem i odłóż na bok szkiełka, które posłużą jako podpora. Umieść kawałek arkusza do zatapiania na szkiełku podstawowym, nałóż na niego kroplę żywicy, a następnie ostrożnie przenieś próbkę za pomocą drewnianego patyczka.Przykryj go drugim kawałkiem. Staraj się unikać pęcherzyków powietrza. Bądź delikatny, ponieważ tkanka jest bardzo delikatna.Ostrożnie umieść kolejne szkiełko na kawałku arkusza do zatapiania i utwardź próbkę w piecu w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez co najmniej 48 godzin. Oddziel warstwy i odetnij kawałek osadzonej próbki żyletką. Przenieś go do parafiny.Zminimalizuje to niebezpieczeństwo utraty próbki z powodu elektrostatyki. Weź aluminiową szpilkę, która została odtłuszczona etanolem. Dobrze wymieszaj przewodzącą żywicę epoksydową i użyj jej niewielkiej ilości do zamontowania próbki na szpilce.Utwardź przewodzącą żywicę epoksydową w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut. Przytnij każdą stronę bloku próbki nożem diamentowym, a następnie wypoleruj powierzchnię bloku, aż tkanka zostanie odsłonięta. Zmielić próbkę do szpilki za pomocą farby przewodzącej i utwardzić ją.Aby zminimalizować ładowanie, próbki powinny być również pokryte cienką warstwą złota lub złotego palladu. Umieść szpilkę z próbką w komorze seryjnego skaningowego mikroskopu elektronowego opartego na bloku. Wyrównaj próbkę do noża, a następnie zamknij komorę i ustaw parametry.Zbierz stos obrazów. Za pomocą opisanej metody uzyskano obrazy tkanki mózgowej myszy. Wykonano duże zdjęcie hipokampa w jednym regionie, a obrazowanie umieszczono w środku warstwy promienistej.Uzyskano stos obrazów, a obiekty zainteresowania, takie jak kolce dendrytyczne i synapsy, zostały podzielone na segmenty. Uzyskano dobrej jakości morfologię tkanek z wyraźnie widocznymi błonami i pęcherzykami synaptycznymi oraz dobrze zachowanymi mitochondriami. Badania immunofluorescencyjne przeciwciała PSD 95 potwierdziły, że łagodne wiązanie pierwotne i tradycyjne wiązanie z 4%PFA dają porównywalne wyniki.Prezentowany protokół umożliwia pozyskiwanie obrazów tkanki mózgowej za pomocą seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej opartej na blokach, wysokiej jakości morfologia tkanek oraz 12 widocznych błon ułatwiają 10 prawych segmentacji i rekonstrukcji. Moja pierwotna fiksacja umożliwiła mi użycie tych samych mózgów do analizy immunofluorescencji PSD 95 i mikroskopii elektronowej obrazującej kolce dendrytyczne. Tutaj używamy pączkowania PSE 9, 500.Jednak drugi może być również używany.

serial-block-face-scanning-electron-microscopy-sbem-for-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Weź stały odcinek tkanki korowej mózgu myszy z aksonami neuronalnymi i dendrytami. Dendryty posiadają wypukłości, znane jako kolce dendrytyczne, które tworzą synapsy z aksonami. Inkubuj tkankę z żelazocyjankiem osmu, który wiąże się z lipidami, a następnie ponownie zastosuj osm, który zwiększa kontrast strukturalny do obrazowania. Barwnik ze związkiem metalu ciężkiego, który wiąże się z makrocząsteczkami i zwiększa kontrast. Odwodnić za pomocą zwiększających się stężeń alkoholu do zatapiania...

Skaningowa mikroskopia elektronowa ze skupioną wiązką jonów do rekonstrukcji 3D neuronów połączonych synaptycznie

Źródło: Pekarek, B. T., et. al., Obrazowanie i kwantyfikacja nienaruszonych dendrytów neuronalnych za pomocą oczyszczania tkanek CLARITY. J. Vis. Exp. (2021)W tym filmie pokazujemy przygotowanie, obrazowanie i analizę oczyszczonego mózgu myszy w celu zbadania dendrytycznych altan dendrytycznych, morfologii kręgosłupa i rozmieszczenia neuronów przy użyciu mikroskopii konfokalnej i technik rekonstrukcji 3D.

Obrazowanie mikroskopem konfokalnym nienaruszonych altan dendrytycznych i morfologii kręgosłupa w oczyszczonym mózgu myszy

Źródło: Mukherjee, K., et. al. Analiza mitochondriów mózgu za pomocą seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej. J. Vis. exp. (2016)Ten film pokazuje przygotowanie,  obrazowanie i analiza tkanki mózgowej myszy przy użyciu seryjnego skaningowego mikroskopu elektronowego z blokową powierzchnią czołową (SBFSEM) w celu wizualizacji ultrastruktury mitochondriów, umożliwiając precyzyjne mapowanie ich morfologii i rozmieszczenia przestrzennego w aksonalnych i dendrytycznych przedziałach...

 Obrazowanie mitochondriów neuronalnych za pomocą seryjnego skaningowego mikroskopu elektronowego typu block-face

Ten artykuł opisuje działający protokół obrazowania kolców dendrytycznych z neuronów hipokampa in vitro za pomocą Mikroskopii Iluminacji Strukturalnej (SIM). Mikroskopia superrozdzielcza wykorzystująca SIM zapewnia rozdzielczość obrazu znacznie wykraczającą poza granicę dyfrakcji światła we wszystkich trzech wymiarach przestrzennych, umożliwiając obrazowanie pojedynczych kolców dendrytycznych z większą szczegółowością.

Obrazowanie kolców dendrytycznych pierwotnych neuronów hipokampa szczura za pomocą mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Wielkoskalowa mikroskopia elektronowa 2D (EM), czyli nanotomia, to ogólnotkankowe zastosowanie nanoskalowej rozdzielczości EM. W tym miejscu opisujemy uniwersalną metodę nanotomii stosowaną do badania mózgu larw danio pręgowanego w zdrowiu i po nieinwazyjnym uszkodzeniu mózgu.

Wielkoskalowa skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa (nanotomia) mózgu zdrowego i uszkodzonego danio pręgowanego

Wizualizacja i analiza mitochondriów z tkanki mózgowej ssaków to trudne zadanie. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób trójwymiarowa (3D) analiza rekonstrukcji z seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej (SBFSEM) może być wykorzystana do uzyskania wglądu w morfologiczną i wolumetryczną analizę tego krytycznego organcelli generującej energię.

Analiza mitochondriów mózgowych z wykorzystaniem seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej z obrazowaniem powierzchni bloku (SBF-SEM)

Tutaj prezentujemy protokół efektywnego łączenia mikroskopii elektronowej ze skaningową wiązką bloków szeregowych i skupionej wiązki jonów, aby dotrzeć do interesującego obszaru. Pozwala to na sprawne wyszukiwanie, w trzech wymiarach i lokalizowanie rzadkich zdarzeń w dużym polu widzenia.

Ukierunkowane badania z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej z blokiem szeregowym i mikroskopią elektronową ze zogniskowaną wiązką jonów

Ten protokół przedstawia rutynową metodę korzystania z seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej (SBF-SEM), potężnej techniki obrazowania 3D. Skuteczne zastosowanie SBF-SEM zależy od prawidłowych technik utrwalania i barwienia tkanek, a także od starannego rozważenia ustawień obrazowania. Protokół ten zawiera praktyczne rozważania dotyczące całego tego procesu.

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa ze skaningiem blokowym (SBF-SEM) próbek tkanek biologicznych

Kolce dendrytyczne są postsynaptycznymi przedziałami większości synaps pobudzających. Zmiany w morfologii kolców dendrytycznych występują podczas rozwoju neurologicznego, starzenia się, uczenia się oraz wielu zaburzeń neurologicznych i psychiatrycznych, co podkreśla znaczenie wiarygodnej analizy kręgosłupa dendrytycznego. Protokół ten opisuje ilościowe określanie morfologii kolców dendrytycznych w sposób dokładny i powtarzalny przy użyciu oprogramowania do automatycznej trójwymiarowej...

Kwantyfikacja dendrytycznego kręgosłupa za pomocą automatycznego oprogramowania do trójwymiarowej rekonstrukcji neuronów

Prezentowany protokół opisuje zastosowanie transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) do ilościowego określania zmian okołodobowych w korze myszy, koncentrując się głównie na liczbie synaps i morfologii kolców dendrytycznych.

Transmisyjna mikroskopia elektronowa jako technika wizualizacji do analizy okołodobowej plastyczności synaptycznej w korze mięśniowej myszy

Poznaj metodę SBEM do badania kolców dendrytycznych w hipokampie myszy. Technika ta umożliwia uzyskanie obrazów wysokiej rozdzielczości dużych objętości tkanek nerwowych, co pozwala na szczegółową analizę struktury i łączności synaptycznej.

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa typu block-face (SBEM) do badania kolców dendrytycznych

Przeglądaj więcej filmów