Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa typu block-face (SBEM) do badania kolców dendrytycznych

Każdy neuron w mózgu jest połączony z innymi komórkami neuronalnymi za pomocą około 7 000 synaps. Z wyjątkiem tego, że te synapsy w mózgu ssaków znajdują się głównie na małych wypukłościach błony zwanych kolcami dendrytycznymi. Plastyczność synaps i kolców dendrytycznych i tym podobne, tak ważne funkcje mózgu, jak procesy uczenia się i pamięci.

Należy zauważyć, że tylko mikroskopia elektronowa daje pełny wgląd w to, czy kolce dendrytyczne mają wejście postsynaptyczne. Dostępne są różne techniki obrazowania kolców dendrytycznych. Jednak seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa daje unikalną możliwość obrazowania dużej objętości tkanki z wysoką rozdzielczością.

Technika skaningowej mikroskopii elektronowej opartej na blokach szeregowych wymaga specjalnego protokołu przygotowania próbki, który polega na silnym kontraście z metalami ciężkimi. Moja pierwotna fiksacja podczas perfuzji pozwoliła nam użyć tych samych mózgów do mikroskopii elektronowej w świetle reflektorów. Myszy zostały uśmiercone i poddane perfuzji łagodnym pierwotnym utrwalaczem.

Mózg przecięto na połowy, a jedną półkulę utrwalono za pomocą dedykowanego do immunofluorescencji utrwalacza, krioprotektoru, pokrojono za pomocą kriostatu i przetworzono do badań immunofluorescencyjnych. Gdzie druga półkula została utrwalona za pomocą utrwalacza mikroskopii elektronowej, pokrojona wibratomem i przygotowana do badań mikroskopem elektronowym. Wycinki mózgu do badań skaningowej mikroskopii elektronowej opartej na blokach szeregowych zostały skontrastowane, płasko osadzone w żywicy, a następnie region CA1 hipokampa został zamontowany na szpilce i zobrazowany za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego opartego na bloku szeregowym.

Część protokołu zaznaczona w żółtym polu została przedstawiona w filmie. Weź tkankę, która została utrwalona i pokrojona na 100 plasterków mikrobiotycznych i przemyj ją zimnym buforem fosforanowym pięć razy przez trzy minuty każdy. Przygotuj mieszaninę jeden do jednego składającą się z 4% tetratlenku osmu i 3% żelazocyjanku potasu.

Produkt końcowy zmieni kolor na brązowy. Zanurzyć próbki w tej mieszaninie. Następnie umieść próbki na lodzie.

I od tego etapu ważne jest, aby chronić je przed światłem. Inkubuj je, delikatnie potrząsając przez godzinę. W międzyczasie przygotuj roztwór TCH.

Wymieszaj 10 mililitrów podwójnie destylowanej wody i 0,1 grama TCH. Wstaw go do piekarnika nastawionego na 60 stopni Celsjusza na godzinę. Ważne jest, aby od czasu do czasu rozlewać roztwór.

Gdy będzie gotowy, ostudź go do temperatury pokojowej. Następnie przemyć próbki podwójnie destylowaną wodą pięć razy przez trzy minuty każda, a następnie zanurzyć je w przefiltrowanym roztworze TCH. Plastry zmienią kolor na.

Inkubuj je przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć próbki podwójnie destylowaną wodą pięć razy przez trzy minuty każda i inkubować je z 2% tetratlenkiem osmu przez 30 minut, tym razem w temperaturze pokojowej. Ponownie przemyj próbki podwójnie destylowaną wodą pięć razy przez trzy minuty i umieść je w przefiltrowanym 1% octanie amylu.

Inkubuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia zacznij od przygotowania D-asparaginianu. Wymieszaj azotan ołowiu z roztworem kwasu asparaginowego podgrzanym do 60 stopni Celsjusza.

Umieść mieszaninę w łaźni wodnej o temperaturze 60 stopni Celsjusza i dostosuj pH do 5,5 za pomocą jednego molowego wodorotlenku sodu. Zamknąć fiolkę z asparaginianem ołowiu i pozostawić w temperaturze 60 stopni Celsjusza na 30 minut. Rozwiązanie powinno być jasne.

Jeśli stanie się mętny, należy go wyrzucić i przygotować nowy. W międzyczasie umyj próbki wodą podwójnie destylowaną gazem pięć razy przez trzy minuty każda i trzymaj je w piecu w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 30 minut. Zanurzyć próbki w świeżo przygotowanym roztworze asparaginianu ołowiu i inkubować je w piecu nastawionym na 60 stopni Celsjusza przez 20 minut.

Przygotuj żywicę epoksydową. Zważ składniki i dobrze wymieszaj żywicę przez co najmniej 30 minut przed dodaniem akceleratora DMP 30. Przygotować wirusa ze stopniowanym rozcieńczeniem etanolu.

Następnie wyjmij próbki z pieca i umyj je ponownie podwójnie destylowaną wodą pięć razy przez trzy minuty każda. W międzyczasie wymieszaj żywicę ze 100% etanolem w proporcji jeden do jednego, aby uzyskać 50% żywicy. Dobrze wymieszaj.

Następnie należy odwodnić próbki w każdym rozcieńczeniu etanolu przez pięć minut. Należy pamiętać, że próbki nigdy nie mogą całkowicie wyschnąć. Infiltruj próbki najpierw w 50% żywicy przez 30 minut, następnie w 100% żywicy przez godzinę, a następnie ponownie w świeżej 100% żywicy przez noc.

Następnego dnia umieść próbki w świeżej 100% żywicy na godzinę, a następnie zanurz je między arkuszami do zatapiania fluoropolimeru. Przygotuj kawałki arkusza do zatapiania, które zostały odtłuszczone etanolem i odłóż na bok szkiełka, które posłużą jako podpora. Umieść kawałek arkusza do zatapiania na szkiełku podstawowym, nałóż na niego kroplę żywicy, a następnie ostrożnie przenieś próbkę za pomocą drewnianego patyczka.

Przykryj go drugim kawałkiem. Staraj się unikać pęcherzyków powietrza. Bądź delikatny, ponieważ tkanka jest bardzo delikatna.

Ostrożnie umieść kolejne szkiełko na kawałku arkusza do zatapiania i utwardź próbkę w piecu w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez co najmniej 48 godzin. Oddziel warstwy i odetnij kawałek osadzonej próbki żyletką. Przenieś go do parafiny.

Zminimalizuje to niebezpieczeństwo utraty próbki z powodu elektrostatyki. Weź aluminiową szpilkę, która została odtłuszczona etanolem. Dobrze wymieszaj przewodzącą żywicę epoksydową i użyj jej niewielkiej ilości do zamontowania próbki na szpilce.

Utwardź przewodzącą żywicę epoksydową w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut. Przytnij każdą stronę bloku próbki nożem diamentowym, a następnie wypoleruj powierzchnię bloku, aż tkanka zostanie odsłonięta. Zmielić próbkę do szpilki za pomocą farby przewodzącej i utwardzić ją.

Aby zminimalizować ładowanie, próbki powinny być również pokryte cienką warstwą złota lub złotego palladu. Umieść szpilkę z próbką w komorze seryjnego skaningowego mikroskopu elektronowego opartego na bloku. Wyrównaj próbkę do noża, a następnie zamknij komorę i ustaw parametry.

Zbierz stos obrazów. Za pomocą opisanej metody uzyskano obrazy tkanki mózgowej myszy. Wykonano duże zdjęcie hipokampa w jednym regionie, a obrazowanie umieszczono w środku warstwy promienistej.

Uzyskano stos obrazów, a obiekty zainteresowania, takie jak kolce dendrytyczne i synapsy, zostały podzielone na segmenty. Uzyskano dobrej jakości morfologię tkanek z wyraźnie widocznymi błonami i pęcherzykami synaptycznymi oraz dobrze zachowanymi mitochondriami. Badania immunofluorescencyjne przeciwciała PSD 95 potwierdziły, że łagodne wiązanie pierwotne i tradycyjne wiązanie z 4%PFA dają porównywalne wyniki.

Prezentowany protokół umożliwia pozyskiwanie obrazów tkanki mózgowej za pomocą seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej opartej na blokach, wysokiej jakości morfologia tkanek oraz 12 widocznych błon ułatwiają 10 prawych segmentacji i rekonstrukcji. Moja pierwotna fiksacja umożliwiła mi użycie tych samych mózgów do analizy immunofluorescencji PSD 95 i mikroskopii elektronowej obrazującej kolce dendrytyczne. Tutaj używamy pączkowania PSE 9, 500.

Jednak drugi może być również używany.