Izolacja aktywnego ekstraktu jądrowego Caenorhabditis elegans i rekonstytucja do transkrypcji in vitro
11 sierpnia 2021
Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji aktywnego ekstraktu jądrowego z larwalnego stadium 4 C. elegans i wizualizacji aktywności transkrypcyjnej w systemie in vitro.
Protokół ten wypełnia lukę techniczną w badaniach biochemicznych C. elegans i rozszerza ich użyteczność jako organizmu modelowego. Technika ta jest zarówno prosta, jak i solidna, co pozwala na konsekwentną izolację funkcjonalnie aktywnego ekstraktu jądrowego C.elegans. Zacznij od umieszczenia zsynchronizowanych zwierząt L1 na 10 150-milimetrowych płytkach zawierających pożywkę do wzrostu nicieni obsianych Escherichia coli OP50 i pozwól zwierzętom rosnąć przez 48 godzin w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż osiągną etap L4.
Po przygotowaniu hipotonicznych i hipertonicznych należy oczyścić homogenizator Balch, zalewając komorę mielenia 70% etanolem. Następnie przepłucz komorę wodą dejonizowaną, aby usunąć nadmiar etanolu. Włóż kulkę z węglika wolframu do komory mielenia.
Zakręć końce cylindra homogenizatora Balch i zabezpiecz nakrętki dostarczonymi skrzydełkowymi. Następnie należy przygotować pięć mililitrów kompletnych hipotonicznych i hipertonicznych na próbkę, zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstu. Następnie napełnij sterylną, dwumililitrową strzykawkę jednym mililitrem kompletnego buforu hipotonicznego i delikatnie przepłucz komorę mielenia homogenizatora Balch, pozostawiając w komorze około 500 mikrolitrów kompletnego buforu hipotonicznego.
Przepłukany homogenizator należy przechowywać na lodzie i pozostawić do ostygnięcia na 30 minut. Zebrać dobrze odżywione zwierzęta L4 z buforem M9 w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów i odwirować zwierzęta pod ciśnieniem 1000 g przez trzy minuty. Usunąć supernatant i kontynuować mycie osadu zwierzęcego, aż stanie się klarowny.
Następnie umyj zwierzęta trzema mililitrami zimnego buforu hipotonicznego i ponownie odwiruj, jak pokazano. Po usunięciu supernatantu buforu hipotonicznego dodać jeden mililitr kompletnego buforu hipotonicznego do osadu zwierzęcego i przenieść zawiesinę zwierzęcą do nowej sterylnej strzykawki o pojemności dwóch mililitrów. W celu homogenizacji zwierząt trzymanych na lodzie należy delikatnie przepchnąć zwierzęta przez komorę mielenia homogenizatora Balch załadowanego kulką wolframową.
Następnie zbierz zwierzęta z powrotem do strzykawki i powtórz tę procedurę 30 razy. Po 30 cyklach homogenizacji zbierz maksymalną zawiesinę zwierzęcą z homogenizatora Balch i przechowuj strzykawkę końcówką skierowaną w dół w mikroprobówce o pojemności 1,7 mililitra. Wyjmij kulkę wolframową i wyczyść komorę mielenia wodą dejonizowaną.
Wysuszyć i włożyć piłkę z powrotem do odpowiedniej oznaczonej tuby. Następnie włóż kulkę wolframową o średnicy 7,9880 milimetra i odstępie 12 mikrometrów do komory mielenia i ponownie zamknij homogenizator. Ponownie przepłukać komorę mielenia jednym mililitrem lodowatego kompletnego buforu hipotonicznego.
Zmiel zawieszenie 25 razy, jak pokazano. Przenieś zawiesinę zwierzęcą do czystej, mikroprobówki o pojemności 1,7 mililitra i przechowuj zawiesinę na lodzie. Ciała zwierząt i szczątki rozdrobnić przez odwirowanie.
Odpipetować 40 mikrolitrów supernatantu do probówki oznaczonej jako frakcja wejściowa i przechowywać frakcję na lodzie. Przenieś pozostały supernatant do nowej probówki o pojemności 1,7 mililitra bez naruszania osadu i odwiruj w celu osadzania jąder. Następnie przenieś supernatant bez naruszania granulowanych jąder do nowej 1,7-mililitrowej probówki oznaczonej jako frakcja cytozolowa.
Aby umyć osad jądrowy, dodaj 500 mikrolitrów całkowitego buforu hipotonicznego do osadu, zawiesić osad i odwirować przy 4 000 razy g w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Pod koniec wirowania ponownie zawiesić osad jądrowy w 500 mikrolitrach świeżego kompletnego buforu hipotonicznego i ponownie odwirować próbkę, jak pokazano. Następnie rozpuść osad w 40 mikrolitrach pełnego buforu hipertonicznego.
Przenieś zawiesinę jądrową do nowej 1,7-mililitrowej probówki oznaczonej frakcją jądrową i przechowuj ją na lodzie. Określić stężenie białka w trzech frakcjach za pomocą fluorescencyjnego zestawu do oznaczania ilościowego. Porcjować frakcje jądrowe do jednorazowych probówek zawierających sześć mikrogramów białka jądrowego i zamrażać błyskawicznie w suchym lodzie i kąpieli etanolowej.
Próbki należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia. Reprezentatywny obraz żelu przedstawia produkty transkrypcji ekstraktu jądrowego L4 larw Caenorhabditis elegans przy użyciu matrycy DNA promotora CMV. Udana izolacja aktywnych białek jądrowych spowodowała powstanie prążka 132 par zasad po transkrypcji in vitro, a nieudana izolacja spowodowała słabą prążek lub brak prążka.
Pamiętaj, aby wyraźnie oznaczyć kompletne. Niewłaściwe mogą zaszkodzić funkcjonalności białek jądrowych. Utrzymuj homogenizator w lodowatej temperaturze, aby zapobiec denaturacji białek.
Opracowanie tej techniki pozwoliło naukowcom zmierzyć tempo transkrypcji RNA C. elegans w warunkach stresowych, pokazując, że tempo transkrypcji zwierzęcia może się zmieniać w zależności od warunków środowiskowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół wypełnia lukę techniczną w biochemicznym badaniu C. elegans i rozszerza ich przydatność jako organizmu modelowego. Umożliwia spójne izolację funkcjonalnie aktywnego ekstraktu jądrowego C. elegans i wizualizację aktywności transkrypcji w układzie in vitro.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Neuronauki
- Organizmy modelowe
Tło
- C. elegans jest szeroko stosowanym organizmem modelowym w badaniach biologicznych.
- Rozumienie aktywności transkrypcji jest kluczowe dla badań ekspresji genów.
- Izolowanie ekstraktów jądrowych jest niezbędne dla różnych analiz biochemicznych.
- Ten protokół zapewnia niezawodną metodę uzyskania aktywnych ekstraktów jądrowych.
Cel badania
- Opracowanie protokołu izolacji aktywnych ekstraktów jądrowych z C. elegans.
- Wizualizacja aktywności transkrypcji in vitro.
- Zwiększenie przydatności C. elegans w badaniach biochemicznych.
Stosowane metody
- Synchronizowane L1 C. elegans są hodowane na pożywce do hodowli nicieni.
- Zwierzęta są dopuszczane do rozwoju do stadium L4 w temperaturze 20 stopni Celsjusza.
- Przygotowywane są bufory do procesu ekstrakcji.
- Do izolacji ekstraktów jądrowych stosowany jest homogenizator Balch.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja funkcjonalnie aktywnych ekstraktów jądrowych.
- Wizualizacja aktywności transkrypcji w układzie in vitro.
- Demonstracja wytrzymałości techniki.
- Potencjalne zastosowania w badaniach regulacji genów.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodną metodę izolacji ekstraktów jądrowych.
- Ta technika poprawia biochemiczne badania C. elegans.
- Otwiera nowe szlaki badań w zakresie ekspresji i regulacji genów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a critical technical gap in leveraging C. elegans for biochemical assays, enabling consistent isolation of functionally active nuclear extracts. By overcoming cuticle disruption challenges without compromising protein activity, it expands the utility of C. elegans in target validation and mechanistic studies. The method supports predictive confidence in gene regulation research through reliable in vitro transcription readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional regulation pathways in a genetically tractable model.
- Operational Value: Provides reproducible nuclear extract preparation for target de-risking.
- Strategic Value: Supports hypothesis testing of gene function prior to mammalian model investment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Yields quantitatively measurable transcription activity using defined DNA templates.
- Operational Value: Standardized fractionation workflow ensures batch-to-batch consistency.
- Strategic Value: Enables scalable assay development for compound effect screening on transcription.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking of targets via direct measurement of transcriptional output.
- Operational Value: Connects genetic perturbations to biochemical phenotypes in a whole-organism context.
- Strategic Value: Informs target selection by validating pathway relevance in a disease-relevant system.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, providing biochemically validated nuclear extracts that bridge genetic findings to functional assays.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation through direct transcription measurement.
- Screening: Enables assay readiness for evaluating modulator effects on gene expression.
- Analytics: Generates quantitative band intensity data for comparative condition analysis.
- Translational Research: Aligns with biomarker discovery by linking nuclear extract activity to regulatory mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for nuclear extract preparation across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Delivers standardization and reproducibility in nuclear extract isolation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions through reliable biochemical readouts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional transcriptional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans culture and biochemical fractionation techniques.
- Dependent on access to a Balch homogenizer and temperature-controlled centrifugation.
- Necessitates standardized buffer preparation and protein quantification protocols.
- Involves adaptation considerations for different developmental stages or mutant strains.
- Limited by the need for careful homogenizer maintenance to prevent cross-contamination.
