Name: Izolacja aktywnego ekstraktu jądrowego Caenorhabditis elegans i rekonstytucja do transkrypcji in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Poznaj izolację aktywnych ekstraktów jądrowych z Caenorhabditis elegans i rekonstytucję transkrypcji in vitro. Ta metoda umożliwia badanie aktywności transkrypcyjnej i regulacji ekspresji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant NIH MIRA (R35GM124678 dla J. S.).

<ol><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+window+into+biology%3A+A+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li>
<li>Blackwell, T. K., Walker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcription mechanisms.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-16 (2006).</li>
<li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">The cuticle.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-15 (2007).</li>
<li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+properties+of+the+Caenorhabditis+elegans+TATA-box-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).</li>
<li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+activation+of+transcription+by+UNC-86+and+MEC-3+in+Caenorhabditis+elegans+embryo+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts.</a> EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).</li>
<li>Shan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope-labeled+immunoassays+without+radiation+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isotope-labeled immunoassays without radiation waste.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).</li>
<li>Voss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+non-radioactive+eukaryotic+in+vitro+transcription+assay+for+sensitive+quantification+of+RNA+polymerase+II+activity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity.</a> BMC Molecular Biology. 15, 7(2014).</li>
<li>Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+Caenorhabditis+elegans+transcription+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87(2020).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-11 (2006).</li>
<li>Zbacnik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+buffers+in+protein+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of buffers in protein formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.

C. elegans jest atrakcyjnym organizmem modelowym do badania eukariotycznego systemu transkrypcji ze względu na jego niskie koszty utrzymania i łatwość manipulacji genetycznej. W tym miejscu opisano protokół konsekwentnej izolacji funkcjonalnie aktywnego ekstraktu jądrowego z L4 C. elegans . Chociaż protokół ten koncentrował się na wizualizacji aktywności transkrypcyjnej, cDNA wytwarzane po transkrypcji można określić ilościowo za pomocą RT-qPCR w celu uzyskania bardziej precyzyjnego pomiaru aktywności t...

Mały, wolno żyjący nicień Caenorhabditis elegans jest prostym, ale potężnym organizmem modelowym do rozwiązywania szerokiego zakresu zagadnień biologicznych. Od czasu wprowadzenia na rynek w 1963 roku, nicienie były nieocenione w odpowiadaniu na pytania z zakresu neurobiologii, metabolizmu, starzenia się, rozwoju, odporności i genetyki1. Niektóre z wielu cech zwierzęcia, które czynią je idealnym organizmem modelowym, obejmują krótki czas generacji, skuteczność interferencji RNA, przezroczyste ciało oraz ukończone mapy zarówno jego linii komórkowej, jak i układu nerwowego.
Chociaż wkład nicieni w naukę jest ogromny, nie został on wykorzystany do wyjaśnienia systemu transkrypcji eukariotycznej, a większość naszej wiedzy na temat tych mechanizmów pochodzi z badań z wykorzystaniem ekstraktu jądrowego z drożdży, muszki owocowej i hodowli komórek ssaków2. Największą przeszkodą, która zniechęca naukowców do ekstrakcji funkcjonalnego ekstraktu jądrowego, jest twardy zewnętrzny naskórek nicienia. Ten egzoszkielet składa się z usieciowanych kolagenów, kutykin, glikoprotein i lipidów, dzięki czemu C. elegans od stadium larwalnego do dorosłości jest odporny na ekstrakcję białek za pomocą sił chemicznych lub mechanicznych3. System transkrypcji in vitro wykorzystujący ekstrakt jądrowy C. elegans został kiedyś opracowany, ale nie został powszechnie przyjęty ze względu na ograniczony zakres systemu, a użycie homogenizatora Dounce do przygotowania ekstraktu może prowadzić do niestabilności białka4,5.
W przeciwieństwie do poprzedniego protokołu izolacji ekstraktu jądrowego, który wykorzystywał homogenizator Dounce do rozbijania C. elegans, ten protokół wykorzystuje homogenizator Balch. Homogenizator Balch składa się z dwóch głównych elementów: kulki z węglika wolframu i bloku ze stali nierdzewnej z kanałem przewierconym z jednego końca na drugi. Homogenizator Balch jest załadowany kulką z węglika wolframu i zaślepiony po obu stronach w celu uszczelnienia komory mielenia. Strzykawki można ładować na dwa pionowe porty prowadzące do komory mielenia. Gdy materiał jest przenoszony z jednej strzykawki do drugiej przez komorę mielenia, ciśnienie ze strzykawek przepycha materiał przez wąską szczelinę między kulką a ścianką komory. Ten powolny i stały nacisk rozbija materiał, aż osiągnie stały rozmiar, który jest w stanie łatwo przejść przez wąską szczelinę. Przepychanie C. elegans przez wąską szczelinę poprzez stały, ale delikatny nacisk rozbija zwierzęta, uwalniając ich zawartość do otaczającego bufora. Zmiana rozmiarów kulek jeszcze bardziej zacieśnia szczelinę, rozbijając nowo uwolnione komórki i uwalniając jądra do bufora. Wielokrotne wirowanie oddziela jądra od reszty szczątków komórkowych, co pozwala na zebranie czystego ekstraktu jądrowego. Homogenizator Balch jest preferowany w stosunku do homogenizatora Dounce z kilku powodów: system może obsłużyć dużą liczbę zwierząt, dzięki czemu możliwe jest wyekstrahowanie dużej ilości aktywnych białek za jednym razem; Precyzyjna obróbka kulek i bloku stalowego pozwala na równomierne mielenie między wieloma próbkami; Ciężki stalowy blok działa jak radiator, równomiernie odprowadzając ciepło z komory mielenia, zapobiegając denaturacji.
Po izolacji, aktywność transkrypcyjna ekstraktu jądrowego musi zostać zweryfikowana przed użyciem w jakichkolwiek eksperymentach biochemicznych. Tradycyjnie, aktywność transkrypcyjną mierzono za pomocą znakowanych radioaktywnie nukleotydów do śledzenia i wizualizacji nowo zsyntetyzowanego RNA. Jednak etykietowanie radioaktywne może być uciążliwe, ponieważ wymaga ostrożności podczas użytkowania i usuwania6. Postęp technologiczny pozwala dziś naukowcom na stosowanie znacznie mniej szkodliwych lub kłopotliwych metod pomiaru nawet małych ilości RNA przy użyciu technik takich jak ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)7. W tym przypadku protokół opisuje metodę izolowania aktywnego ekstraktu jądrowego z larwalnego stadium 4 (L4) C. elegans i wizualizacji aktywności transkrypcyjnej w systemie in vitro.

<table><tbody><tr><td>Materiały eksploatacyjne i odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 ml 8-paskowe probówki i odczynniki Nakrętki z płaskim paskiem, przezroczyste</td><td>Genesee Scientific</td><td>&nbsp; 24-706</td><td></td></tr><tr><td>0,2 ml Indywidualne probówki do PCR</td><td>Genesee Scientific</td><td>&nbsp; 24-153G</td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml sterylne mikroprobówki</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-282S</td><td></td></tr><tr><td>100% absolutny etanol klasy molekularnej</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; BP2818</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol, Koptec</td><td>Decon Labs</td><td>&nbsp; Pipeta serologiczna V1001</td><td></td></tr><tr><td>10 ml</td><td>VWR international</td><td>&nbsp; 89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Płytki Petriego 150 mm</td><td>Tritech Research</td><td>&nbsp; T3325</td><td></td></tr><tr><td>15 ml stożkowe probówki wirówkowe</td><td>Genesee Scientific</td><td>&nbsp; 28-103</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe strzykawki 20 ml</td><td>Fisher Scientific 14955460</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki 2 ml Norm-Ject</td><td>Henke-Sass Wolf GmbH</td><td>4020</td><td></td></tr><tr><td>500 ml próżniowy kubek filtracyjny 0,22 i mikro; m PES, Stericup Millipore Express Plus</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCGPU10RE</td><td></td></tr><tr><td>50 ml stożkowe probówki wirówkowe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>50 ml pipeta serologiczna</td><td>VWR international</td><td>&nbsp; 89130-902</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 5 ml</td><td>VWR international</td><td>&nbsp; 89130-896</td><td></td></tr><tr><td>Agar, Criterion</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; C7432</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Denville Scientific</td><td>&nbsp; CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>Marker alkoholowy</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; 52877-310</td><td></td></tr><tr><td>Pepton baktonowy</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; 90000-264</td><td></td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans</td><td>CGC</td><td>N2</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorek wapnia</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; C4901</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; C8667</td><td></td></tr><tr><td>Kontrolne startery do klonowania skroni DNA, do przodu 5'- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kontroluj spłonki klonowania świątyń DNA, Naprzód 5'- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Woda</td><td></td><td></td><td></td>dejonizowana</tr><tr><td>Ditiothreitol</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; 15508-013</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik żelowy DNA, bezpieczny dla SYBR</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; S33102</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka drabinkowa DNA, O' władca genów</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; SM1173</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik ładujący DNA, 6x TriTrack</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; </td><td></td>FERR1161</tr><tr><td>DNaza, linia bazowa-ZERO</td><td>Lucigen</td><td>&nbsp; </td><td></td>DB0715K</tr><tr><td>Suchy lód</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli Szczep OP50</td><td>CGC</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; A38</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; G6279</td><td></td></tr><tr><td>System transkrypcji ekstraktu jądrowego HeLa in vitro, HeLaScribe</td><td>Promega</td><td>&nbsp; E3110</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Solution, 1 M Gibco</td><td>Millipore Sigma</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny 37%</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P0662</td><td></td></tr><tr><td>Wybielacz podchlorynowy</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Rosół</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; L3022</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorek magnezu</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; M8266</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; M7506</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia o średniej wadze</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 02-202-101</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka mikroskopowe, Vista vision</td><td>VWR International</td><td>16004-368</td><td></td></tr><tr><td>woda molekularna,</td><td>Hypure Hyclone Laboratories</td><td>&nbsp; </td><td></td>SH30538</tr><tr><td>Nystatyna</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; System N1638</td><td></td></tr><tr><td>PCR, FailSafe z premiksem A</td><td>Lucigen</td><td>&nbsp; </td><td></td>FS99100</tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P39111</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P3786</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P0662</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy, jednorazowy koktajl Halt 100x</td> zestaw do oznaczania białek <td>ThermoFisher Scientific</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>, Qubit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; Zestaw do odwrotnej transkrypcji Q33211</td><td></td></tr>, zestaw do ekstrakcji RNA <tr><td>Sensiscript</td><td>Qiagen</td><td>205211</td><td></td></tr><tr><td>zestaw mikro RNeasy</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy</td><td>Applied Biosystems</td><td>&nbsp; </td><td></td>N8080119</tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; BDH9286-12KG</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; 1-09137</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny filtr strzykawkowy z 0,2 i mikro; m Membrana polieterosulfonowa</td><td>VWR international</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; 200-334-9</td><td></td></tr><tr><td>startery transkrypcyjne, naprzód 5'- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>startery do transkrypcji, odwrócone 5'- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher Naukowy</td><td>&nbsp; BP152</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P2287</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 &deg; Inkubator C</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &deg; Inkubator C</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; Inkubator C</td><td>Forma Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; C lodówka</td><td>ThermoFisher Scientific-80</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C zamrażarka</td><td>Autoklaw Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balch, homogenizator komórkowy isobiotec</td><td>Wirówka stołowa Isobiotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>, Eppendorf 5418 R</td> Wirówka <td>5401000013</td><td></td><td>Eppendorf</td></tr><tr><td>, VWR Clinical 50</td><td>VWR Polska</td><td>82013-800</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny, Fluorometr Leica M80</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr>, System obrazowania <tr><td>żelowego Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866,</td><td></td></tr><tr><td>iBright FL1500</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; A44241</td><td></td></tr><tr><td>System żelowy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>VWR International</td><td>12621-048</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówki, Eppendorf 5424</td><td>Eppendorf</td><td>22620401</td> Pipeta 155017 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Integra</td> Eppenboy <td>Integra</td></tr><tr><td>L-1000 XLS+, Pipeta 17014382 Pipet-Lite LTS</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-10 XLS+, Pipeta</td> do <td>17014388</td><td></td>Pipet-Lite LTS <td>Rainin</td></tr><tr><td>L-200 XLS+, Pipeta</td> do <td>17014391</td><td></td><td>Rainin</td></tr><tr><td>L-20 XLS+, Pipeta do 17014392</td><td></td><td></td><td>Rainin</td></tr><tr><td>Platforma wahadłowa</td> do pipet <td>VWR International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro</td><td>Eppendorf</td><td>950030010</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja aktywnego ekstraktu jądrowego caenorhabditis elegans i rekonstytucja do transkrypcji in vitro

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Caenorhabditis elegans jest ważnym modelowym systemem dla badań biologicznych od czasu jego wprowadzenia w 1963 roku. Jednak C. elegans nie został w pełni wykorzystany w biochemicznych badaniach reakcji biologicznych z wykorzystaniem jego ekstraktów jądrowych, takich jak transkrypcja in vitro i replikacja DNA. Istotną przeszkodą w wykorzystaniu C. elegans w badaniach biochemicznych jest przerwanie grubego zewnętrznego naskórka nicienia bez poświęcania aktywności ekstraktu jądrowego. Chociaż do przerwania naskórka stosuje się kilka metod, takich jak homogenizacja Dounce lub sonikacja, często prowadzą one do niestabilności białka. Nie ma ustalonych protokołów izolowania aktywnych białek jądrowych od larw lub dorosłych C. elegans w reakcjach in vitro. W tym miejscu protokół szczegółowo opisuje homogenizację C. elegans w stadium larwalnym 4 za pomocą homogenizatora Balch. Homogenizator Balch wykorzystuje nacisk, aby powoli przepchnąć zwierzęta przez wąską szczelinę, łamiąc w ten sposób naskórek. Jednolita konstrukcja i precyzyjna obróbka homogenizatora Balch pozwalają na równomierne mielenie zwierząt między eksperymentami. Frakcjonowanie homogenatu uzyskanego z homogenizatora Balch daje funkcjonalnie aktywny ekstrakt jądrowy, który można zastosować w metodzie in vitro do oznaczania aktywności transkrypcyjnej C. elegans.

Postępowanie zgodnie z opisanymi krokami powinno pozwolić na uzyskanie funkcjonalnego ekstraktu jądrowego (Rysunek 1); odstępstwa w etapach rozcierania lub przemywania mogą prowadzić do niskiej aktywności lub małej wydajności. Jeśli uzyskany zostanie funkcjonalny ekstrakt jądrowy C. elegans, będzie on transkrybować region za promotorem CMV na matrycy DNA po dodaniu do wcześniej opisanego testu in vitro. Powstały transkrypty RNA można oczyśc...

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji aktywnego ekstraktu jądrowego z larwalnego stadium 4 C. elegans i wizualizacji aktywności transkrypcyjnej w systemie in vitro.

Izolacja aktywnego ekstraktu jądrowego Caenorhabditis elegans i rekonstytucja do transkrypcji in vitro

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

Protokół ten wypełnia lukę techniczną w badaniach biochemicznych C. elegans i rozszerza ich użyteczność jako organizmu modelowego. Technika ta jest zarówno prosta, jak i solidna, co pozwala na konsekwentną izolację funkcjonalnie aktywnego ekstraktu jądrowego C.elegans. Zacznij od umieszczenia zsynchronizowanych zwierząt L1 na 10 150-milimetrowych płytkach zawierających pożywkę do wzrostu nicieni obsianych Escherichia coli OP50 i pozwól zwierzętom rosnąć przez 48 godzin w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż osiągną etap L4.Po przygotowaniu hipotonicznych i hipertonicznych należy oczyścić homogenizator Balch, zalewając komorę mielenia 70% etanolem. Następnie przepłucz komorę wodą dejonizowaną, aby usunąć nadmiar etanolu. Włóż kulkę z węglika wolframu do komory mielenia.Zakręć końce cylindra homogenizatora Balch i zabezpiecz nakrętki dostarczonymi skrzydełkowymi. Następnie należy przygotować pięć mililitrów kompletnych hipotonicznych i hipertonicznych na próbkę, zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstu. Następnie napełnij sterylną, dwumililitrową strzykawkę jednym mililitrem kompletnego buforu hipotonicznego i delikatnie przepłucz komorę mielenia homogenizatora Balch, pozostawiając w k

isolation-active-caenorhabditis-elegans-nuclear-extract

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszym protokole opisano metodę izolacji i aktywacji spermatyd z samców C. elegans. Odcięcie tylnego końca samca powoduje uwolnienie spermatyd. Spermatydy można aktywować poprzez dodanie proteazy.

Izolacja i aktywacja in vitro plemników Caenorhabditis elegans

Niniejszy protokół opisuje przygotowanie syntetycznego substratu tRNA dla homologu metylotransferazy DNA/tRNA 2 (Dnmt2) z Entamoeba histolytica, Ehmeth, oraz pomiar jego aktywności metylotransferazy. To podejście eksperymentalne może być wykorzystane do badania aktywności innych białek Dnmt2.

Analiza metylacji tRNA in vitro z użyciem enzymu DNA i tRNA metylotransferazy Dnmt2 (Ehmeth) z Entamoeba histolytica

Przeprowadzono analizę mikromacierzy w celu określenia profili ekspresji genów u C. elegans, a w celu walidacji i kwantyfikacji danych z mikromacierzy zastosowano reakcję PCR w czasie rzeczywistym.

Wyznaczanie profili ekspresji genetycznej w C. elegans z wykorzystaniem mikromacierzy i PCR w czasie rzeczywistym

Tutaj prezentujemy protokół do analizy interakcji RNA/białko. Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) opiera się na zróżnicowanej migracji kompleksów RNA/białko i wolnego RNA podczas natywnej elektroforezy żelowej. Za pomocą znakowanej radioaktywnie sondy RNA, kompleksy RNA/białko można uwidocznić za pomocą autoradiografii.

Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) do badania interakcji RNA-białko: przykład IRE/IRP

Ten protokół opisuje, jak badać procesy komórkowe podczas przekształcania losu komórki u Caenorhabditis elegans in vivo. Wykorzystując transgeniczne zwierzęta, można zaobserwować in vivo nadekspresję czynnika transkrypcyjnego CHE-1 indukującego los neuronu pod wpływem promotora szoku cieplnego i pośredniczące w RNAi wyczerpanie komórki rozrodczej czynnika regulującego chromatynę LIN-53 do przeprogramowania neuronów.<br...

Zastosowanie RNAi i ekspresji czynnika transkrypcyjnego wywołanej szokiem cieplnym do przeprogramowania komórek rozrodczych na neurony u C. elegans

Opisano procedurę tandemowej izolacji RNA (TRIP) w celu odzyskania endogennie utworzonych kompleksów mRNA-białko. W szczególności kompleksy RNA-białko są sieciowane in vivo, poliadenylowane RNA są izolowane z ekstraktów z kulkami oligo(dT), a poszczególne mRNA są wychwytywane za pomocą zmodyfikowanych oligonukleotydów antysensownych RNA. Białka związane z mRNA są wykrywane za pomocą analizy immunoblot.

Procedura izolacji tandemowego RNA oparta na oligonukleotydach w celu odzyskania eukariotycznych kompleksów mRNA-białko

Tutaj prezentujemy protokół izolacji RNA, DNA i białka z tej samej próbki, w celu zmniejszenia zmienności, poprawy odtwarzalności i ułatwienia interpretacji.

Połączone ekstrakcje nukleotydów i białek w Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół prostej izolacji określonych grup żywych komórek neuronalnych wyrażających zielone białko fluorescencyjne z transgenicznych linii Caenorhabditis elegans. Metoda ta umożliwia różnorodne badania ex vivo skoncentrowane na konkretnych neuronach i ma zdolność izolowania komórek do dalszej krótkoterminowej hodowli.

Izolacja określonych populacji neuronów od glisty Caenorhabditis elegans

Ta metoda opisuje protokół wysokoprzepustowego przygotowania ekstraktu białkowego z próbek Caenorhabditis elegans i późniejszej koimmunoprecypitacji.

Preparat ekstraktu białkowego i koimmunoprecypitacja z Caenorhabditis elegans

Prezentowany tutaj jest opis prostej i stosunkowo szybkiej izolacji genomowego DNA Caenorhabditis elegans od jednego lub kilku zwierząt przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu tkanek. Otrzymany preparat gDNA jest odpowiednią matrycą do PCR.

Ekstrakcja genomowego DNA Caenorhabditis elegans na małą skalę

Obecny protokół opisuje metody suplementacji lipidów w kulturach płynnych i na płytkach dla Caenorhabditis elegans, w połączeniu z badaniami podłużnymi i analizą transkrypcji genów z dużej ilości lub kilku robaków i tkanek robaków.

Suplementacja lipidów w celu długowieczności i analizy transkrypcji genów w Caenorhabditis elegans

Poznaj izolację aktywnych ekstraktów jądrowych z Caenorhabditis elegans i rekonstytucję transkrypcji in vitro. Ta metoda umożliwia badanie aktywności transkrypcyjnej i regulacji ekspresji genów.

Izolacja aktywnego ekstraktu jądrowego Caenorhabditis elegans i rekonstytucja do transkrypcji in vitro

Przeglądaj więcej filmów