Izolacja aktywnego ekstraktu jądrowego Caenorhabditis elegans i rekonstytucja do transkrypcji in vitro

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji aktywnego ekstraktu jądrowego z larwalnego stadium 4 C. elegans i wizualizacji aktywności transkrypcyjnej w systemie in vitro.

Protokół ten wypełnia lukę techniczną w badaniach biochemicznych C. elegans i rozszerza ich użyteczność jako organizmu modelowego. Technika ta jest zarówno prosta, jak i solidna, co pozwala na konsekwentną izolację funkcjonalnie aktywnego ekstraktu jądrowego C.elegans. Zacznij od umieszczenia zsynchronizowanych zwierząt L1 na 10 150-milimetrowych płytkach zawierających pożywkę do wzrostu nicieni obsianych Escherichia coli OP50 i pozwól zwierzętom rosnąć przez 48 godzin w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż osiągną etap L4.

Po przygotowaniu hipotonicznych i hipertonicznych należy oczyścić homogenizator Balch, zalewając komorę mielenia 70% etanolem. Następnie przepłucz komorę wodą dejonizowaną, aby usunąć nadmiar etanolu. Włóż kulkę z węglika wolframu do komory mielenia.

Zakręć końce cylindra homogenizatora Balch i zabezpiecz nakrętki dostarczonymi skrzydełkowymi. Następnie należy przygotować pięć mililitrów kompletnych hipotonicznych i hipertonicznych na próbkę, zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstu. Następnie napełnij sterylną, dwumililitrową strzykawkę jednym mililitrem kompletnego buforu hipotonicznego i delikatnie przepłucz komorę mielenia homogenizatora Balch, pozostawiając w komorze około 500 mikrolitrów kompletnego buforu hipotonicznego.

Przepłukany homogenizator należy przechowywać na lodzie i pozostawić do ostygnięcia na 30 minut. Zebrać dobrze odżywione zwierzęta L4 z buforem M9 w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów i odwirować zwierzęta pod ciśnieniem 1000 g przez trzy minuty. Usunąć supernatant i kontynuować mycie osadu zwierzęcego, aż stanie się klarowny.

Następnie umyj zwierzęta trzema mililitrami zimnego buforu hipotonicznego i ponownie odwiruj, jak pokazano. Po usunięciu supernatantu buforu hipotonicznego dodać jeden mililitr kompletnego buforu hipotonicznego do osadu zwierzęcego i przenieść zawiesinę zwierzęcą do nowej sterylnej strzykawki o pojemności dwóch mililitrów. W celu homogenizacji zwierząt trzymanych na lodzie należy delikatnie przepchnąć zwierzęta przez komorę mielenia homogenizatora Balch załadowanego kulką wolframową.

Następnie zbierz zwierzęta z powrotem do strzykawki i powtórz tę procedurę 30 razy. Po 30 cyklach homogenizacji zbierz maksymalną zawiesinę zwierzęcą z homogenizatora Balch i przechowuj strzykawkę końcówką skierowaną w dół w mikroprobówce o pojemności 1,7 mililitra. Wyjmij kulkę wolframową i wyczyść komorę mielenia wodą dejonizowaną.

Wysuszyć i włożyć piłkę z powrotem do odpowiedniej oznaczonej tuby. Następnie włóż kulkę wolframową o średnicy 7,9880 milimetra i odstępie 12 mikrometrów do komory mielenia i ponownie zamknij homogenizator. Ponownie przepłukać komorę mielenia jednym mililitrem lodowatego kompletnego buforu hipotonicznego.

Zmiel zawieszenie 25 razy, jak pokazano. Przenieś zawiesinę zwierzęcą do czystej, mikroprobówki o pojemności 1,7 mililitra i przechowuj zawiesinę na lodzie. Ciała zwierząt i szczątki rozdrobnić przez odwirowanie.

Odpipetować 40 mikrolitrów supernatantu do probówki oznaczonej jako frakcja wejściowa i przechowywać frakcję na lodzie. Przenieś pozostały supernatant do nowej probówki o pojemności 1,7 mililitra bez naruszania osadu i odwiruj w celu osadzania jąder. Następnie przenieś supernatant bez naruszania granulowanych jąder do nowej 1,7-mililitrowej probówki oznaczonej jako frakcja cytozolowa.

Aby umyć osad jądrowy, dodaj 500 mikrolitrów całkowitego buforu hipotonicznego do osadu, zawiesić osad i odwirować przy 4 000 razy g w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Pod koniec wirowania ponownie zawiesić osad jądrowy w 500 mikrolitrach świeżego kompletnego buforu hipotonicznego i ponownie odwirować próbkę, jak pokazano. Następnie rozpuść osad w 40 mikrolitrach pełnego buforu hipertonicznego.

Przenieś zawiesinę jądrową do nowej 1,7-mililitrowej probówki oznaczonej frakcją jądrową i przechowuj ją na lodzie. Określić stężenie białka w trzech frakcjach za pomocą fluorescencyjnego zestawu do oznaczania ilościowego. Porcjować frakcje jądrowe do jednorazowych probówek zawierających sześć mikrogramów białka jądrowego i zamrażać błyskawicznie w suchym lodzie i kąpieli etanolowej.

Próbki należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia. Reprezentatywny obraz żelu przedstawia produkty transkrypcji ekstraktu jądrowego L4 larw Caenorhabditis elegans przy użyciu matrycy DNA promotora CMV. Udana izolacja aktywnych białek jądrowych spowodowała powstanie prążka 132 par zasad po transkrypcji in vitro, a nieudana izolacja spowodowała słabą prążek lub brak prążka.

Pamiętaj, aby wyraźnie oznaczyć kompletne. Niewłaściwe mogą zaszkodzić funkcjonalności białek jądrowych. Utrzymuj homogenizator w lodowatej temperaturze, aby zapobiec denaturacji białek.

Opracowanie tej techniki pozwoliło naukowcom zmierzyć tempo transkrypcji RNA C. elegans w warunkach stresowych, pokazując, że tempo transkrypcji zwierzęcia może się zmieniać w zależności od warunków środowiskowych.