Wysokoprzepustowy test na mikropłytkach do ilościowego oznaczania spożycia u Drosophila

Test podawania mikropłytek oferuje ekonomiczną, wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania spożycia płynów u Drosophila. Urządzenie wydrukowane w 3D łączy 96-dołkową mikropłytkę, w której trzymane są muchy, z 1536-dołkową mikropłytką, z której muchy spożywają roztwór pokarmowy z barwnikiem znacznikowym. Spadek objętości roztworu jest mierzony spektrofotometrycznie.

Test podawania mikropłytek zapewnia prostą, wysokowydajną i ekonomiczną metodę pomiaru zachowań żywieniowych Drosophila i oferuje wiele zalet w porównaniu z innymi, bardziej wyszukanymi metodami. Kwantyfikacja zużycia poprzez pomiar absorbancji za pomocą czytnika płytek eliminuje ręczne pomiary i ręczne wprowadzanie danych. Dane można również programowo wyodrębniać i przetwarzać.

Dzięki temu wysokoprzepustowemu testowi możemy określić ilościowo zużycie rozpuszczalnych w wodzie składników odżywczych, leków, farmaceutyków lub toksyn, a system można zmodyfikować pod kątem zastosowań u różnych gatunków owadów. Rozpocznij od wlania stopionej agarozy do koryta z odczynnikami i dozuj 80 mikrolitrów stopionej agarozy do każdej studzienki 96-dołkowej mikropłytki za pomocą wielokanałowej pipety. Wstaw resztki agarozy do lodówki na okres do tygodnia w szczelnie zamkniętej torbie i rozpuść je w celu zrobienia dodatkowych talerzy.

Jeśli paski barierowe są zbyt luźne, owiń je wokół palca, aby nadać im krzywiznę, aby utrzymać je w kanałach. Włóż paski odgradzające do kanałów taśm odgradzających, aby przygotować łączniki. Przymocuj łącznik do płytki głodowej, uważając, aby nie używać łącznika do manipulowania płytą, ponieważ łącznik może się ześlizgnąć.

Upewnij się, że kątowy róg łącznika pasuje do kątowego narożnika mikropłytki, aby zachować prawidłową orientację. W znieczuleniu CO2 sortuj muchy w wieku od trzech do pięciu dni. Załaduj pojedyncze muchy kolumną do płyty głodowej.

Zamknij każdą kolumnę podczas jej wypełniania, ustawiając jej pasek bariery w pozycji zamkniętej. Ostrożnie zapisz układ próbki na mikropłytce. Po napełnieniu płytki głodowej pozwól muszkom spontanicznie zregenerować się po usunięciu CO2 i głodz je przez sześć godzin, zaczynając od początkowego czasu znieczulenia.

Przygotuj 10 mililitrów płynnego pokarmu w 15-mililitrowej stożkowej probówce, rozpuszczając 0,4 grama sacharozy i 0,1 grama ekstraktu drożdżowego w 10 mililitrach wody destylowanej. Wiruj probówkę, aż ciała stałe całkowicie się rozpuszczą. Dodaj 40 mikrolitrów podstawowego roztworu barwnika i przenieś płynny pokarm do 10-mililitrowej strzykawki zakończonej filtrem 0,45 mikrometra.

Przefiltruj jednorazowo około 1,5 mililitra roztworu do 1,7 mililitra probówki wirówkowej. Odstawić strzykawkę zawierającą roztwór na bok i przefiltrować dodatkowy roztwór w razie potrzeby podczas przygotowywania płytki podajnika. Przygotuj płytkę podającą, uszczelniając dno mikropłytki z 1536 dołkami folią uszczelniającą.

Użyj łopatki uszczelniającej, aby dokładnie przykleić się do folii. Następnie odetnij nadmiar folii z lewej i prawej krawędzi żyletką. Dozuj 10 mikrolitrów przefiltrowanej płynnej żywności kolumnowo do lewego górnego dołka dla każdego skupiska czterech dołków 1536-dołkowej mikropłytki.

Po napełnieniu wszystkich studzienek nałóż folię uszczelniającą na górną część płytki, wykonując te same czynności, które są używane do uszczelniania dolnej części mikropłytki. Powtórz dla żądanej liczby płytek. Odwirować płytki w temperaturze 200 razy G przez 10 sekund, aby osadzić płyn.

Nie dopuścić do schłodzenia płytki, ponieważ może to spowodować kondensację pary wodnej w studzienkach, zasłaniając odczyty absorbancji. Wykonaj perforację dołków na górnej powierzchni płytki za pomocą sondy igłowej wyposażonej w igłę o średnicy 0,25 milimetra, używając tej samej kolejności perforacji, jaka została użyta podczas dozowania roztworów. Wytrzeć igłę między roztworami, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.

Odwróć płytkę i przebij dołki na dnie. Odczytaj absorbancję płytki przy 630 nanometrach bez pokrywki. Umieść wewnętrzną pokrywę na górnej folii uszczelniającej, aby upewnić się, że pierścienie kondensacyjne otaczają perforowane studzienki, a następnie umieść zewnętrzną pokrywę na płycie.

Umieść płytę podającą na złączu stroną zadrukowaną do góry, tak aby prowadnice wyrównały odpowiednie otwory płyty podajnika i płyty głodowej. Upewnij się, że łącznik i płytki są prawidłowo zorientowane. Gdy wszystkie płyty podające zostaną załadowane na łączniki, otwórz dołki na płyty, regulując paski barierowe na łączniku.

Umieść zespoły łącznika i płyty w pojemniku wtórnym. Umieść dolną połowę pudełka na pipety zawierającego nasączone ręczniki papierowe w każdym dodatkowym pojemniku, aby zapewnić wilgotność. Zamknij pokrywę pojemnika wtórnego i przenieś go do kontrolowanego środowiska.

Pozwól muchom spożywać przez 22 godziny. Po 22 godzinach ekspozycji sprawdź każdą płytkę pod kątem martwych much i odpowiednio zaktualizuj układ płytki. Po sprawdzeniu wszystkich płytek należy masowo znieczulić muchy, pompując CO2 do pojemnika wtórnego.

Po około 60 sekundach upewnij się, że wszystkie muchy są unieruchomione. Delikatnie wbij muchy w płytkę głodową i wymień plastikowe paski odgradzające. Zdejmij płyty podajnika do odczytu.

Ponownie odczytaj absorbancję płytki przy 630 nanometrach. Powtarzaj proces, aż wszystkie tabliczki zostaną odczytane. Parowanie określono ilościowo dla każdego dołka i stwierdzono, że istnieją jakiekolwiek korelacje między studzienkami poszczególnych płyt.

Współczynniki korelacji Pearsona dla parowania w stosunku do rzędów i parowania w stosunku do kolumn obliczono w celu oceny trendów między parowaniem a lokalizacjami odwiertów. Konsumpcja trzy- do pięciodniowych much Canton-SB została określona ilościowo w celu ustalenia ważności protokołu. Muchom dano wybór między 4% roztworem sacharozy z 1% ekstraktem drożdżowym a 4% roztworem sacharozy uzupełnionym 15% etanolem i 1% ekstraktem drożdżowym.

Zarówno mężczyźni, jak i kobiety wykazywali zdecydowaną preferencję dla roztworu z etanolem i ekstraktem drożdżowym. Istotne jest zachowanie spójności podczas konstruowania płyt karmnikowych, zapewniając, że każda mucha ma identyczny scenariusz konsumpcji pod względem objętości pokarmu, parowania i dostępu. Technika ta pozwoli naukowcom zajmującym się badaniem Drosophila na przeprowadzanie wysokoprzepustowych testów zachowań konsumpcyjnych i preferencji z większą przepustowością i przy niższych kosztach w porównaniu z tradycyjnymi metodami.