Wykrywanie agregacji białek za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji

Najlepsza zasada spektroskopii korelacji fluorescencji, FCS, została wynaleziona po raz pierwszy w latach siedemdziesiątych XX wieku. W latach dziewięćdziesiątych XX wieku wprowadzono ważne i wiele ulepszeń w zakresie FCS poprzez połączenie z mikroskopią aparatu konfokalnego. Od tego czasu FCS jest używany do wielu zastosowań związanych z leczeniem chemicznym i wirusowym, takich jak interakcje molekularne i analiza agregacji białek.

Agregacja białek jest cechą charakterystyczną zaburzeń neurodegeneracyjnych. Jasność fluorescencji to pojedyncze cząstki działające o rozmiarach molekularnych wyjaśnione właściwościami dyfuzyjnymi. Jest to bardzo ważne w pomiarze agregacji białek, ponieważ może określić przewidywane cykle życia cząsteczek, ale także rozróżnić polimeryzację homo lub hetero.

W tym miejscu wprowadzamy procedurę pomiaru dyfuzji stwardnienia zanikowego bocznego związanego z zagregowaną formą białka za pomocą FCS w lizatach komórkowych i żywych komórkach. Przygotuj 100-milimetrowe plastikowe naczynie do uprawy komórek Neuro2a, siedząc wygodnie w normalnym podłożu wzrostowym. Potwierdź zbieg komórek.

Usuń nośnik. Dodaj 3,5 mililitra roztworu trypsyny-EDTA do trzeciego naczynia z wkładem i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną minutę. Dodaj 9,5 mililitra normalnej pożywki do naczynia i zawieś je.

Zawiesinę komórek miesza się z błękitem trypanowym w celu zabarwienia martwych komórek. Dodaj zawieszenie do slajdu zliczania komórek. Policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek lub ręcznie.

Sprawdź numer aktywnej komórki i jej żywotność. Rozcieńczyć komórkę w policzonym podłożu w proporcji 1,0 razy 10 do mocy 5 na mililitr. Dodaj dwa mililitry zawiesiny komórek do 35-milimetrowej plastikowej naczynia do lizy komórek lub naczynia do wzrostu komórek do pomiaru żywych komórek.

Inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden dzień. Następnego dnia przygotuj mieszaninę plazmidowego DNA i odczynników do transfekcji. Dodać mieszaninę transfekcji do pożywki zliczającej komórki i inkubować komórki przez 24 godziny.

Dzień później. Sprawdź ekspresję GFP za pomocą rutynowego mikroskopu. W komórkach można zobaczyć bardzo jasne ciała składników TDP25.

Liza komórek powinna być wykonywana na stanowisku biochemicznym. Usuń podłoże z naczynia. Dodaj dwa mililitry PBS w temperaturze 25 stopni Celsjusza do prania jako medium.

Usuń PBS. Umieść naczynie na aluminiowej płycie na wierzchu pokruszonego lodu. Natychmiast dodaj do naczynia 200 mikrolitrów buforu do lizy.

Zeskrob naczynie za pomocą skrobaka do komórek. Odzyskaj lizat z nierozpuszczonymi resztkami komórek w nowej 1,5-milimetrowej probówce. Odwirować lizat w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

W przypadku pomiarów na żywych komórkach przed pomiarem należy wymienić pożywkę na nową. Sprawdź przyczepienie ogniw za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym. Sprawdź również ekspresję GFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Użyj systemu FCS połączonego z mikroskopem konfokalnym. Włącz laser 488 nm. Ustabilizuj system przez co najmniej 30 minut.

Skonfiguruj ścieżkę optyczną. Użyj lasera o długości fali 488 nm, aby uzyskać natychmiastowe światło. Użyj odpowiedniego rozdzielacza wiązki i mierników dichroicznych.

A także utrwalacze fluorescencyjne. Zazwyczaj używamy komór ze szkła nakrywkowego do kalibracji i pomiarów roztworów. Ostrożnie weź komorę ze szkłem nakrywkowym.

Umieść szklaną powierzchnię na papierze do ekranowania soczewek. Wlej kalibrację FCS. Dodaj również roztwór rodaminy 6G.

Dodaj ultraczystą wodę na obiektyw. Nie używaj oleju. Ustaw komorę na stoliku mikroskopu.

Przesuń stół montażowy do odpowiedniej pozycji. Utwórz regulację otworkową i otwórz kreatora regulacji otworka. Monitoruj szybkość zliczania fotonów jako zgrubny ruch otworka dla kierunku x.

Najjaśniejsza pozycja została prawidłowo określona. Następnie monitoruj szybkość zliczania fotonów jako drobny ruch. Udało się określić najjaśniejszą pozycję Jest to pozycja otworkowa dla kierunku x.

W ten sam sposób wyszukaj najjaśniejsze położenie otworka dla kierunku y. Udało się również określić najjaśniejsze położenie dla kierunku y. Złóż położenie x i y otworu.

Lepiej jest dostosować pozycję otworka przed pomiarem każdego dnia. Po zmianie ścieżki pod napięciem należy ponownie wyregulować położenie otworka. Utwórz wskaźnik zliczania i monitoruj wskaźnik zliczania telefonów.

Przełącz się na tryb monitorowania CPM. Policz pierścień korekcyjny uruchomionego obiektu, tak aby wartość CPM była najwyższa. Zamknij okno szybkości zliczania.

Zacznij od pomiaru roztworu rodaminy 6G. Po zakończeniu pomiaru kliknij pasowanie, aby przeprowadzić analizę dopasowania krzywej. Wybierz model do dopasowania starej funkcji korelacji.

Dla rodaminy 6G należy wybrać model dla 1-składnikowej, 3-wymiarowej dyfuzji ze stanem trypletowym. Ustaw czas rozpoczęcia montażu, przesuwając czerwoną linię. Kliknij przycisk Dopasuj wszystko, aby rozpocząć obliczanie dopasowania.

Sprawdź odchylenie pasowania. Upewnij się, że boki są wysunięte i negatywne, około zera. Sprawdź zamontowane wartości.

Upewnij się, że czas dyfuzji mieści się mniej więcej w zakresie 20-30 mikrosekund. Ponadto parametr strukturalny wynosi od czterech do ośmiu. Otwórz panel dopasowania i wybierz model do pomiaru.

Wprowadź tę samą wartość parametru konstrukcyjnego w modelu dla próbki w panelu dopasowania. Upewnij się, że typ powinien być ustawiony jako Stały. Pomiar GFP-TDP25 w lizacie komórkowym.

Umieść lizat w komorze ze szkłem nakrywkowym. Umieść pokrywkę, aby uniknąć wyschnięcia lizatu. Umieść pokrywę sceny, aby uzyskać lekkie zacienienie.

W panelu akwizycji ustaw moc lasera, czas pomiaru i jego powtórzenia. Rozpocznij nabywanie. Zaobserwowano gwałtowny wzrost.

Ponownie zaobserwowano gwałtowny wzrost. Kolec wskazuje, że jasne cząsteczki przeszły przez ciało detekcji. Kolce wskazują rozpuszczalne oligomery lub agregaty.

Utwórz pasowanie, aby przeprowadzić analizę dopasowania krzywej. Wybierz model dla 2-składnikowej, 3-wymiarowej dyfuzji ze stanem trypletowym. Ustaw czas rozpoczęcia montażu.

Kliknij przycisk Dopasuj do wszystkich. Sprawdź zamontowane wartości. SOD1-G85R oznaczony pomiarem GFP w żywej komórce.

W przeciwieństwie do pomiaru roztworu, zalecam użycie inkubatora z temperaturą. Ustaw naczynie do hodowli komórek na stoliku mikroskopu. Potwierdź ostrość i pozycję za pomocą okularu.

Wybierz celę pomiarową. Powiększ i dostosuj pozycję komórki w trybie szybkiego skanowania. Uzyskaj migawkę komórek w trybie niskiej prędkości skanowania.

Wybierz pozycję pomiaru SKO za pomocą narzędzia Pozycja. Celownik wskazuje pozycję pomiaru. Rozpocznij pomiar.

Niewielki spadek rekordu szybkości zliczania fotonów sugeruje fotobielenie GFP. Wykonaj dopasowanie krzywej. Przedstawiono reprezentatywne wyniki GFP-TDP25 w lizacie komórkowym.

Górny wykres to zapis szybkości zliczania fotonów. Tam, gdzie znajdują się strzały, znajduje się kolec, sugerujący rozpuszczalne oligomery i agregaty. Środkowy wykres reprezentuje starą funkcję korelacji.

Szara linia pokazuje niską, starą funkcję korelacji. Karmazynowa linia pokazuje dopasowaną funkcję. Przerywane linie wskazują czas rozpoczęcia i zakończenia montażu.

Dolna tabela pokazuje dopasowaną wartość. Następnie pokazane są reprezentatywne wyniki SOD1-G85R-GFP w żywej komórce. Górny wykres przedstawia zapis naszego współczynnika zliczania fotonów.

Zaobserwowano stopniowy spadek zarejestrowanego tempa zliczania fotonów, co sugeruje fotobielenie wzrostu GFP dla różnych pomiarów. Dzieje się tak ze względu na niską prędkość dyfuzji w żywych komórkach. Środkowy wykres przedstawia starą funkcję korelacji SOD1.

Szara linia pokazuje niską, starą funkcję korelacji. Karmazynowa linia pokazuje dopasowaną funkcję. Przerywane linie wskazują czas rozpoczęcia i zakończenia z dopasowaniem.

Dolna tabela przedstawia dopasowane wartości. Tutaj pokazujemy tę procedurę pomiaru dyfuzji z każdej komórki związanej TDP-25 w lizacie komórkowym i wszystkiego, co zmutowane SOD1 w żywych komórkach za pomocą FCS. Rozpuszczalne oligomery i agregacja w lizacie komórkowym mogą być często obserwowane jako skoki lub pęknięcia.

Z drugiej strony, w żywych komórkach takie kolce są rzadko obserwowane, z wyjątkiem możliwie oczywistych żywych struktur. Powoli dyfuzyjny gatunek zmutowanego SOD1 dodaje nam średniej jasności dla pojedynczych cząstek, takich jak homopolimeryzacja SOD1 w środku. Przedstawiona tutaj procedura jest prosta i warta zachodu.

FCS nie zawiera promieniowania; bezpośrednio w stanie uśpienia. To tylko wasza i nasza wyobraźnia empatia.