Name: Wykrywanie agregacji białek za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Poznaj metodę wykrywania agregacji białek ALS za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS) w lizatach i żywych komórkach Neuro2a. Protokół umożliwia analizę właściwości dyfuzji TDP25 i mutowanego SOD1.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.K. był wspierany przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), przez grant od Nakatani Foundation for Countermeasures against novel coronavirus infections, przez grant z Hokkaido University Office for Developing Future Research Leaders (L-Station) oraz grant in-aid od Hoansha Foundation. M. K. był częściowo wspierany przez JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas " Chemistry for Multimolecular Crowding Biosystems" (#20H04686) oraz grant JSPS na badania naukowe w obszarach innowacyjnych "Fizyka informacyjna materii ożywionej" (#20H05522).

1. Materiały i odczynniki
<ol>
	<li>Do hodowli komórkowej należy stosować roztwory wolne od pirogenów i pożywkę (Tabela 1).</li>
	<li>Przygotuj roztwory do eksperymentu biochemicznego przy użyciu ultraczystej wody i użyj jako wolne od DNaz / RNaz.</li>
	<li>Wybierz odpowiedni FBS dla hodowli komórkowej z procesem kontroli partii. Ponieważ wybrana partia FBS zmienia się regularnie, nie można tutaj przedstawić katalogu i numeru partii dla FBS.</li>
	<li>Plazmidowe DNA
	<ol>
		<li>Przygotowanie pmeGFP-N15 dla wyrażenia monomeru eGFP; pmeGFP-C1-TDP256 dla wyrażenia GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 dla wyrażenia SOD1-G85R-GFP; oraz pCAGGS8 jako nośnik. 
		UWAGA: meGFP jest wariantem monomerycznym przenoszącym mutację A206K wzmocnionego GFP (eGFP). TDP25 jest powiązanym z ALS C-końcowym fragmentem TDP-43. SOD1-G85R jest mutantem SOD1 związanym z ALS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szczep komórek
	<ol>
		<li>Użyj mysiego nerwiaka zarodkowego Neuro2a cells. 
		UWAGA: Komórki Neuro2a mają wysoką wydajność transfekcji i wysoką ekspresję białek egzogennych. Do ekspresji TDP25 wymagane są szczepy komórkowe o wysokiej wydajności ekspresji, takie jak komórki Neuro2a lub HEK293. W komórkach HeLa TDP25 nie był w stanie ulegać efektywnej ekspresji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa i transfekcja
<ol>
	<li>Przygotuj plastikowe naczynie o średnicy 100 mm, w którym komórki Neuro2a będą częściowo zlewać się w normalnym pożywce. 
	UWAGA: Konieczna jest inkubacja w temperaturze 37 °C przez około 48-72 godziny po poprzednim wysiewie, aż do osiągnięcia półzrębowości.</li>
	<li>Usuń nośnik.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml roztworu trypsyny-EDTA do naczynia do hodowli komórkowych i inkubować je w temperaturze 37 °C przez 1 minutę.</li>
	<li>Dodaj 9,5 ml normalnej pożywki wzrostowej do naczynia i zawieś oderwane komórki.</li>
	<li>Używając błękitu trypanowego do barwienia martwych komórek, policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek lub ręcznie. Następnie rozcieńczyć komórki w pożywce hodowlanej (1,0 × 105/ml).</li>
	<li>Dodaj 2 ml zawiesiny komórek do plastikowego naczynia o średnicy 35 mm do lizy komórek lub naczynia ze szklaną podstawą do pomiaru żywych komórek.</li>
	<li>Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C przez 1 dzień.</li>
	<li>Następujące przygotowania należy rozpocząć 15 minut przed dniem transfekcji.</li>
	<li>Przygotuj dwie probówki o pojemności 1,5 ml i dodaj 100 μl Opti-MEM I do każdej probówki.</li>
	<li>W pierwszej probówce wymieszaj 1,0 μg plazmidowego DNA (roztwór A). W drugiej probówce wymieszać 2,5 μl Lipofectaminy 2000 (roztwór B). 
	UWAGA: Aby utrzymać wydajność transfekcji, utrzymuj całkowitą ilość DNA na tym samym poziomie. Aby zmniejszyć poziom ekspresji do pomiaru FCS w żywych komórkach, frakcja plazmidowego DNA do ekspresji białka powinna się zmniejszyć (np. 0,2 μg pmeGFP-N1-SOD1-G85R i 0,8 μg mieszaniny pCAGGS). Ponadto należy zachować ten sam stosunek między objętością Lipofectamine 2000 a ilością plazmidowego DNA.</li>
	<li>Delikatnie wymieszaj roztwór A i B, dodając po jednym do każdej probówki, a następnie inkubuj przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (roztwór C).</li>
	<li>Dodać roztwór C do pożywki hodowlanej i inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
3. Liza komórek i wymiana pożywki
<ol>
	<li>Sprawdź ekspresję GFP za pomocą rutynowego mikroskopu.</li>
	<li>Usuń podłoże z naczynia.</li>
	<li>Dodać 2 ml PBS w temperaturze 25 °C, aby wypłukać pożywkę. Usuń PBS.</li>
	<li>Umieść naczynie na aluminiowej płycie na wierzchu pokruszonego lodu. 
	UWAGA: Jako sprzęt laboratoryjny używamy płyty aluminiowej o grubości 1 mm wyciętej w niedzielnym sklepie z narzędziami lub dostępnej w handlu.</li>
	<li>Dodać 200 μl buforu do lizy w temperaturze 4 °C. Delikatnie wstrząsnąć naczyniem, tak aby bufor był równomiernie rozprowadzony na dnie naczynia.</li>
	<li>Zeskrob naczynie za pomocą skrobaka do komórek i odzyskaj lizat z nierozpuszczonymi resztkami komórek w nowej probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Odwirować roztwór o stężeniu 20 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odzyskać supernatant w nowej probówce o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C lub na lodzie. 
	UWAGA: Nie zamrażaj lizatu.</li>
	<li>W przypadku pomiarów na żywo należy wymienić pożywkę przed pomiarem. Sprawdź przyczepienie ogniw za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym. Potwierdź ekspresję za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>
4. Kalibracja spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS)
<ol>
	<li>Uruchom system i uruchom oprogramowanie operacyjne. Włącz laser Argon+ (458/477/488/514 nm). Ustabilizuj system przez co najmniej 30 minut.</li>
	<li>Ustaw tor optyczny: Rozdzielacz świateł głównych: HFT488; Lustro dichroiczne: NFT600; Filtr barierowy fluorescencyjny: filtr pasmowoprzepustowy 505-540 (BP505-540); Detektor: fotodioda lawinowa (APD)).</li>
	<li>Ustaw rozmiar otworu, wprowadzając wartość bezpośrednio (66 μm; 1 jednostka przewiewna).</li>
	<li>Dodać roztwór rodaminy 6G (Rh6G) do studzienki szklanej komory nakrywkowej na scenie.</li>
	<li>Dodaj zanurzeniową ultraczystą wodę na obiektywie. Nie używaj olejku immersyjnego.</li>
	<li>Ustaw komorę na stoliku mikroskopu. Przesuń stół montażowy do odpowiedniej pozycji.</li>
	<li>Skoncentruj się na górnej powierzchni szkła, mierząc rozproszone światło od powierzchni szkła. Po opuszczeniu soczewki obiektywu do dołu obróć pokrętło ostrości zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby wyregulować. 
	UWAGA: Sprawdź kierunek obracania pokrętła ostrości, ponieważ jest ono przeciwne między tymi wyprodukowanymi w Japonii i Niemczech.</li>
	<li>Podnieś ogniskową 200 μm ponad górną powierzchnię szkła, aby obserwować wnętrze roztworu.</li>
	<li>Kliknij opcję Szybkość zliczania i monitoruj szybkość zliczania fotonów.</li>
	<li>Stopniowo zwiększaj wartość przestrajalnych filtrów akustyczno-optycznych (AOTF) (np. transmisja lasera wzbudzenia), tak aby wartość szybkości zliczania była większa niż 10 kHz.</li>
	<li>Kliknij opcję Regulacja otworków i otwórz kreatora regulacji otworków. Znajdź pozycję otworkową z najwyższą (szczytową) liczbą fotonów zarówno na osi x, jak i y.</li>
	<li>Obróć pierścień korekcyjny soczewki obiektywu tak, aby wartość liczby na cząsteczkę (CPM) była najwyższa. 
	UWAGA: Ponieważ podana tutaj grubość szkła nakrywkowego komory wynosi 0,12-0,17 mm, pierścień korekcyjny znajduje się mniej więcej na minimalnym poziomie lub zaledwie kilka obrotów od niego, gdzie CPM jest maksymalny.</li>
	<li>Stopniowo zmniejszaj wartość AOTF, tak aby wartość CPM wynosiła 2-3 kHz.</li>
	<li>Uzyskaj funkcję autokorelacji (ACF) Rh6G przez 90 s.</li>
	<li>Po zakończeniu pomiaru kliknij przycisk Dopasuj, aby przeprowadzić analizę dopasowania krzywej.</li>
	<li>Wybierz model jednoskładnikowej dyfuzji trójwymiarowej (3D) ze stanem trypletowym. 
	UWAGA: Rh6G jest monodyspersyjny i jednoskładnikowy dyfuzyjny ze stanem trypletowym.</li>
	<li>Ustaw czas rozpoczęcia montażu, przesuwając czerwoną linię. Kliknij opcję Dopasuj wszystko i sprawdź odchylenie pasowania. Po wykonaniu dopasowania krzywej upewnij się, że czas dyfuzji (DT) i parametr konstrukcji (SP) mieszczą się w przybliżeniu w zakresie odpowiednio 20-30 μs i 4-8.</li>
	<li>Zapamiętaj wartość parametru konstrukcyjnego. Wartość SP należy wykorzystać do analizy dopasowania krzywej wszystkich ACF zmierzonych tego samego dnia, w tych samych warunkach optycznych i przy użyciu tego samego rodzaju szklanej podstawki lub komorowego zestawu szkła nakrywkowego na stoliku mikroskopu.</li>
</ol>
5. Pomiar FCS w lizacie komórkowym
<ol>
	<li>Przygotować lizaty komórkowe (patrz wyżej).</li>
	<li>Umieść lizat w komorze ze szkłem nakrywkowym. Umieść pokrywkę, aby uniknąć wysuszenia, i pokrywę sceny, aby uzyskać lekkie zacienienie.</li>
	<li>Ustaw warunek akwizycji, moc lasera, czas pomiaru i powtórzenia.</li>
	<li>Kliknij opcję Count rate (Szybkość zliczania) i dostosuj wartość AOTF lasera tak, aby wartość CPM była większa niż 1 kHz.</li>
	<li>Wykonaj pomiar próbny przez 1 minutę. Sprawdź, czy obliczony ACF wykazuje dodatnią amplitudę i płynny zanik.</li>
	<li>Wykonaj główny pomiar przez 5 min. 
	UWAGA: Całkowity czas pomiaru jest stopniowo zwiększany, aż kształt ACF nie zmieni się, nawet jeśli czas pomiaru zostanie zwiększony.</li>
	<li>Kliknij przycisk Dopasuj, aby przeprowadzić analizę dopasowania krzywej.</li>
	<li>Wybierz model dla dwuskładnikowej dyfuzji 3D ze stanem trypletowym. Pamiętaj, aby wprowadzić wartość SP i zmienić jej ustawienie na "Stałe", a nie "Wolne" przed kliknięciem Dopasuj wszystko.</li>
	<li>Wyeksportuj dopasowaną tabelę jako plik tekstowy rozdzielany tabulatorami.</li>
	<li>W razie potrzeby wyeksportuj rekord ACF i Count rate jako plik tekstowy rozdzielany tabulatorami.</li>
</ol>
6. Pomiar FCS w żywych komórkach
<ol>
	<li>Przed pomiarem wymień pożywkę na nową.</li>
	<li>Użyj inkubatora z temperaturą. Ustaw naczynie z kulturą komórkową na stoliku mikroskopu.</li>
	<li>Potwierdź ostrość i pozycję za pomocą mikropu konfokalnego. Wybierz celę pomiarową. Powiększ i dostosuj położenie komórki. Uzyskaj obrazy fluorescencyjne komórki wykazującej ekspresję GFP w trybie niskiej prędkości skanowania.</li>
	<li>Wybierz pozycję pomiaru FCS za pomocą opcji Pozycja w sekcji "FCS".</li>
	<li>Wybierz co najmniej jeden punkt pomiarowy FCS za pomocą krzyżyka (Rysunek 1).</li>
	<li>Zmierz ACF przez 1 min. 
	UWAGA: Ponieważ białka fluorescencyjne mają tendencję do fotowybielania w żywych komórkach z powodu powolnego ruchu w porównaniu z roztworem, czas pomiaru powinien być minimalny. Na ogół trudno jest uzyskać ACF w komórce tak płynnie, jak pomiary roztworu, ponieważ długotrwały pomiar doprowadzi do fotowybielania białek fluorescencyjnych.</li>
	<li>Kliknij przycisk Dopasuj, aby przeprowadzić analizę dopasowania krzywej przy użyciu modelu dwuskładnikowej dyfuzji 3D ze stanem trypletowym. 
	UWAGA: W przypadku pomiarów żywych komórek model dwuskładnikowej dyfuzji 3D ze stanem trypletowym byłby lepszy, ponieważ empirycznie trudno jest zmniejszyć wartość chi-kwadrat za pomocą jednoskładnikowego modelu dyfuzji 3D ze względu na istnienie różnych ruchomych komponentów w żywej komórce. Ale nawet przy użyciu modelu do trójskładnikowej dyfuzji 3D, składniki dyfuzyjne zwykle nie są rozdzielane w porównaniu z użyciem modelu dla dwuskładnikowych.</li>
</ol>

<ol><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).</li>
<li>Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteostasis+network+and+its+decline+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The proteostasis network and its decline in ageing.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).</li>
<li>Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+analysis+of+misfolded+protein+aggregation+by+FRET+and+live-cell+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques.</a> International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).</li>
<li>Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+with+High+Count+Rate+and+Low-Background+-+Analysis+of+Translational+Diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal+with+Biophysics+Letters%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).</li>
<li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li>
<li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+RNA+with+a+C-terminal+fragment+of+the+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+TDP43+reduces+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity.</a> Scientific Reports. 6, 19230(2016).</li>
<li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+the+proteasome+increases+the+toxicity+of+ALS-linked+mutant+SOD1%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1.</a> Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li>
<li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+chaperonin+prevents+polyglutamine+toxicity+with+altering+the+aggregation+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state.</a> Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).</li>
<li>Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+substrate+recognition+state+of+TDP-43+to+single-stranded+DNA+using+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).</li>
<li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+steps+for+fluorescence+correlation+spectroscopy+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).</li>
<li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKinjo%2C+M+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2011 (10), 1267-1269 (2011).</li>
<li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKinjo%2C+M+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2011 (10), 1262-1266 (2011).</li>
<li>Jazani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+framework+for+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nature Communication. 10 (1), 3662(2019).</li>
<li>Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment+and+effect+of+energy+depletion+in+the+nucleus+analyzed+by+mobility+of+multiple+oligomeric+EGFPs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).</li>
<li>Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+determination+of+membrane+dynamics+with+line-scan+FCS%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).</li>
<li>Fujioka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+separation+organizes+the+site+of+autophagosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phase separation organizes the site of autophagosome formation.</a> Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).</li>
<li>Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+fluorescence+cross-correlation+analyses+highlight+the+importance+of+competitive+effects+in+the+regulation+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).</li>
<li>Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-fluorescent+HaloTag+blocker+for+improved+measurement+and+visualization+of+protein+synthesis+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells.</a> F1000Research. 9, (2020).</li>
</ol>

Autorzy ci nie pozostają w konflikcie interesów.

Jeśli chodzi o kalibrację systemu przed pomiarami, należy użyć tych samych naczyń szklanych, które są używane do pomiaru próbki (np. 8-dołkowa szklana komora przykrywająca lizat komórkowy i szklana podstawa o średnicy 35 mm dla żywych komórek). Ze względu na adsorpcję Rh6G na szkle, jego efektywne stężenie może czasami się zmniejszać. Jeśli tak, należy użyć wysoce stężonego roztworu Rh6G, takiego jak 1 μM, tylko do regulacji otworka. W celu ochrony detektora należy unikać ekstremalnie wysokich szybkości zliczania fotonów...

Agregacje białek związane z zaburzeniami neurodegeneracyjnymi, takimi jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS), choroba Alzheimera, choroba Parkinsona, choroba Huntingtona i tak dalej1 są znane jako toksyczne i zakłócają homeostazę białek (proteostazę) w komórkach i organach, co może prowadzić do starzenia się2. Oczekuje się, że klirens agregacji białek będzie strategią terapeutyczną; Jednak substancje chemiczne, które zapobiegają tworzeniu się agregacji białek i rozkładają agregaty białkowe (np. małe cząsteczki lub leki), nie zostały jeszcze ustalone. Co więcej, sposób, w jaki agregacja białek wywiera toksyczność, pozostaje nieuchwytny. Dlatego, aby promować projekty badawcze związane z agregacją białek, ważne jest wprowadzenie procedur o wysokiej przepustowości, aby po prostu wykrywać agregację białek. Wykrywanie agregacji białek za pomocą przeciwciał rozpoznających konformację agregacji białek i barwnika fluorescencyjnego specyficznego dla agregacji jest szeroko stosowane3. Jednak trudno jest wykryć agregację, zwłaszcza w żywych komórkach przy użyciu tak klasycznych procedur. 
Förster resonance energy transfer (FRET) to procedura do wykrywania agregacji białek i zmian strukturalnych. Jednak FRET nie jest w stanie analizować dynamiki białek (np. dyfuzji i oligomeryzacji białka w żywych komórkach)3. Dlatego wprowadzamy tutaj prosty protokół wykrywania agregacji białek w roztworze (np. Lizacie komórkowym) i żywych komórkach za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS), która mierzy właściwości dyfuzyjne i jasność cząsteczek fluorescencyjnych z czułością pojedynczej cząsteczki<klasa sup = 'xref'>4. FCS to metoda zliczania fotonów przy użyciu laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego (LSM). Za pomocą bardzo czułego detektora fotonów i obliczenia funkcji autokorelacji (ACF) czasu nadejścia fotonu, mierzy się czas przejścia i jasność cząsteczek fluorescencyjnych w objętości detekcji. Dyfuzja zwalnia wraz ze wzrostem masy cząsteczkowej; w ten sposób oddziaływanie międzycząsteczkowe można oszacować za pomocą FCS. Jeszcze silniej wzrost jasności cząsteczki fluorescencji wskazuje na homooligomeryzację cząsteczek. Dlatego FCS jest potężnym narzędziem do wykrywania takiej agregacji białek.

<table><tbody><tr><td>0,25% (w/v) Trypsyna-1 mmol/L EDTA&middot; Roztwór 4Na z czerwienią fenolową (trypsyna-EDTA)</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>201-16945</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia plastikowe 100 mm</td><td>CORNING</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>35-milimetrowa szklana podstawa</td><td>IWAKI</td><td>3910-035</td><td>Do pomiaru żywych komórek</td></tr><tr><td>Plastikowe naczynia 35 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>Płyta aluminiowa</td><td>Bio-Bik</td><td>AB-TC1</td><td></td></tr><tr><td>C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw Skrobak do komórek</td><td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td><td>MS-93100</td><td></td></tr><tr><td>Membrana filtracyjna z octanu celulozy (0,22 mm)</td><td>Advantech Toyo</td><td>25CS020AS</td><td></td></tr><tr><td>Szklana komora pokrywowa 8-dołkowa</td><td>IWAKI</td><td>5232-008</td><td>Do pomiaru roztworu</td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka Eagle's Medium firmy Dulbecco (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>podłoże podstawowe</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>biosurowice</td><td></td><td>Wymagane sprawdzenie partii</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>LSM510 META + ConfoCor3</td><td>System FCS</td><td>Carl Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Mysi nerwiak zarodkowy Komórki Neuro2a</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td>Linia komórkowa</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS</td><td>RIKEN</td><td>RDB08938</td><td>Plazmidowe DNA dla nośnika transfekcji</td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny (&razy; 100</td>) <td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>pmeGFP-C1-TDP25</td><td></td><td></td><td>Plazmidowe DNA dla TDP25 znakowane monomerycznym eGFP</td></tr><tr><td>pmeGFP-N1</td><td></td><td></td><td>Plazmidowe DNA do ekspresji monomeru eGFP</td></tr><tr><td>pmeGFP-N1-SOD1-G85R</td><td></td><td></td><td>Plazmidowe DNA dla mutanta G85R SOD1 sprzężonego z ALS oznaczonego monomerycznym</td></tr><tr><td>koktajlem inhibitorów proteazy</td> eGFP <td>Sigma-Aldrich</td><td>P8304</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie agregacji białek za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Agregacja białek jest cechą charakterystyczną zaburzeń neurodegeneracyjnych, takich jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS), choroba Alzheimera (AD), choroba Parkinsona (PD), choroba Huntingtona (HD) i tak dalej. Do wykrywania i analizowania rozpuszczalnych lub dyfuzyjnych oligomerów lub agregatów białkowych zastosowano spektroskopię korelacji fluorescencji (FCS), która może wykryć prędkość dyfuzji i jasność pojedynczej cząstki przy czułości pojedynczej cząsteczki. Jednak właściwa procedura i know-how w zakresie wykrywania agregacji białek nie były szeroko udostępniane. W tym miejscu przedstawiono standardową procedurę pomiaru FCS właściwości dyfuzyjnych białek podatnych na agregację w lizacie komórkowym i żywych komórkach: związany z ALS karboksylowy fragment 25 kDa białka wiążącego TAR DNA/RNA 43 kDa (TDP25) i dysmutaza ponadtlenkowa 1 (SOD1). Reprezentatywne wyniki pokazują, że część agregatów TDP25 znakowanego białkiem zielonej fluorescencji (GFP) była nieznacznie zawarta w rozpuszczalnej frakcji lizatu komórkowego Neuro2a mysiego nerwiaka zarodkowego. Co więcej, SOD1 znakowany GFP z mutacją związaną z ALS wykazuje wolniejszą dyfuzję w żywych komórkach. W związku z tym wprowadzamy tutaj procedurę wykrywania agregacji białka poprzez jego właściwości dyfuzyjne za pomocą FCS.

Przeprowadziliśmy pomiar FCS dla GFP-TDP25 w lizacie komórkowym oraz SOD1-G85R-GFP w żywych komórkach. W obu przypadkach udało się uzyskać dodatnią amplitudę oraz gładkie ACF. Wykazaliśmy, że część GFP-TDP25 wykazującego ekspresję w komórkach Neuro2a odzyskano w frakcji rozpuszczalnej w określonych warunkach6. W frakcji rozpuszczalnej lizatu komórkowego, w zapisie szybkości zliczania fotonów za pomocą FCS, wykryto niezwykle jasne cząsteczki fluorescencyjne (Rycyna 2A,...

Wprowadzamy tutaj procedurę pomiaru oligomerów białkowych i agregacji w lizacie komórkowym i żywych komórkach za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji.

Wykrywanie agregacji białek za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

Najlepsza zasada spektroskopii korelacji fluorescencji, FCS, została wynaleziona po raz pierwszy w latach siedemdziesiątych XX wieku. W latach dziewięćdziesiątych XX wieku wprowadzono ważne i wiele ulepszeń w zakresie FCS poprzez połączenie z mikroskopią aparatu konfokalnego. Od tego czasu FCS jest używany do wielu zastosowań związanych z leczeniem chemicznym i wirusowym, takich jak interakcje molekularne i analiza agregacji białek.Agregacja białek jest cechą charakterystyczną zaburzeń neurodegeneracyjnych. Jasność fluorescencji to pojedyncze cząstki działające o rozmiarach molekularnych wyjaśnione właściwościami dyfuzyjnymi. Jest to bardzo ważne w pomiarze agregacji białek, ponieważ może określić przewidywane cykle życia cząsteczek, ale także rozróżnić polimeryzację homo lub hetero.W tym miejscu wprowadzamy procedurę pomiaru dyfuzji stwardnienia zanikowego bocznego związanego z zagregowaną formą białka za pomocą FCS w lizatach komórkowych i żywych komórkach. Przygotuj 100-milimetrowe plastikowe naczynie do uprawy komórek Neuro2a, siedząc wygodnie w normalnym podłożu wzrostowym. Potwierdź zbieg komórek.Usuń nośnik. Dodaj 3,5 mililitra roztworu trypsyny-EDTA do trzeciego naczynia z wkładem i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną minutę. Dodaj 9,5 mililitra normalnej pożywki do naczynia i zawieś je.Zawiesinę komórek miesza się z błękitem trypanowym w celu zabarwienia martwych komórek. Dodaj zawieszenie do slajdu zliczania komórek. Policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek lub ręcznie.Sprawdź numer aktywnej komórki i jej żywotność. Rozcieńczyć komórkę w policzonym podłożu w proporcji 1,0 razy 10 do mocy 5 na mililitr. Dodaj dwa mililitry zawiesiny komórek do 35-milimetrowej plastikowej naczynia do lizy komórek lub naczynia do wzrostu komórek do pomiaru żywych komórek.Inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden dzień. Następnego dnia przygotuj mieszaninę plazmidowego DNA i odczynników do transfekcji. Dodać mieszaninę transfekcji do pożywki zliczającej komórki i inkubować komórki przez 24 godziny.Dzień później. Sprawdź ekspresję GFP za pomocą rutynowego mikroskopu. W komórkach można zobaczyć bardzo jasne ciała składników TDP25.Liza komórek powinna być wykonywana na stanowisku biochemicznym. Usuń podłoże z naczynia. Dodaj dwa mililitry PBS w temperaturze 25 stopni Celsjusza do prania jako medium.Usuń PBS. Umieść naczynie na aluminiowej płycie na wierzchu pokruszonego lodu. Natychmiast dodaj do naczynia 200 mikrolitrów buforu do lizy.Zeskrob naczynie za pomocą skrobaka do komórek. Odzyskaj lizat z nierozpuszczonymi resztkami komórek w nowej 1,5-milimetrowej probówce. Odwirować lizat w temperaturze czterech stopni Celsjusza.W przypadku pomiarów na żywych komórkach przed pomiarem należy wymienić pożywkę na nową. Sprawdź przyczepienie ogniw za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym. Sprawdź również ekspresję GFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.Użyj systemu FCS połączonego z mikroskopem konfokalnym. Włącz laser 488 nm. Ustabilizuj system przez co najmniej 30 minut.Skonfiguruj ścieżkę optyczną. Użyj lasera o długości fali 488 nm, aby uzyskać natychmiastowe światło. Użyj odpowiedniego rozdzielacza wiązki i mierników dichroicznych.A także utrwalacze fluorescencyjne. Zazwyczaj używamy komór ze szkła nakrywkowego do kalibracji i pomiarów roztworów. Ostrożnie weź komorę ze szkłem nakrywkowym.Umieść szklaną powierzchnię na papierze do ekranowania soczewek. Wlej kalibrację FCS. Dodaj również roztwór rodaminy 6G.Dodaj ultraczystą wodę na obiektyw. Nie używaj oleju. Ustaw komorę na stoliku mikroskopu.Przesuń stół montażowy do odpowiedniej pozycji. Utwórz regulację otworkową i otwórz kreatora regulacji otworka. Monitoruj szybkość zliczania fotonów jako zgrubny ruch otworka dla kierunku x.Najjaśniejsza pozycja została prawidłowo określona. Następnie monitoruj szybkość zliczania fotonów jako drobny ruch. Udało się określić najjaśniejszą pozycję Jest to pozycja otworkowa dla kierunku x.W ten sam sposób wyszukaj najjaśniejsze położenie otworka dla kierunku y. Udało się również określić najjaśniejsze położenie dla kierunku y. Złóż położenie x i y otworu.Lepiej jest dostosować pozycję otworka przed pomiarem każdego dnia. Po zmianie ścieżki pod napięciem należy ponownie wyregulować położenie otworka. Utwórz wskaźnik zliczania i monitoruj wskaźnik zliczania telefonów.Przełącz się na tryb monitorowania CPM. Policz pierścień korekcyjny uruchomionego obiektu, tak aby wartość CPM była najwyższa. Zamknij okno szybkości zliczania.Zacznij od pomiaru roztworu rodaminy 6G. Po zakończeniu pomiaru kliknij pasowanie, aby przeprowadzić analizę dopasowania krzywej. Wybierz model do dopasowania starej funkcji korelacji.Dla rodaminy 6G należy wybrać model dla 1-składnikowej, 3-wymiarowej dyfuzji ze stanem trypletowym. Ustaw czas rozpoczęcia montażu, przesuwając czerwoną linię. Kliknij przycisk Dopasuj wszystko, aby rozpocząć obliczanie dopasowania.Sprawdź odchylenie pasowania. Upewnij się, że boki są wysunięte i negatywne, około zera. Sprawdź zamontowane wartości.Upewnij się, że czas dyfuzji mieści się mniej więcej w zakresie 20-30 mikrosekund. Ponadto parametr strukturalny wynosi od czterech do ośmiu. Otwórz panel dopasowania i wybierz model do pomiaru.Wprowadź tę samą wartość parametru konstrukcyjnego w modelu dla próbki w panelu dopasowania. Upewnij się, że typ powinien być ustawiony jako Stały. Pomiar GFP-TDP25 w lizacie komórkowym.Umieść lizat w komorze ze szkłem nakrywkowym. Umieść pokrywkę, aby uniknąć wyschnięcia lizatu. Umieść pokrywę sceny, aby uzyskać lekkie zacienienie.W panelu akwizycji ustaw moc lasera, czas pomiaru i jego powtórzenia. Rozpocznij nabywanie. Zaobserwowano gwałtowny wzrost.Ponownie zaobserwowano gwałtowny wzrost. Kolec wskazuje, że jasne cząsteczki przeszły przez ciało detekcji. Kolce wskazują rozpuszczalne oligomery lub agregaty.Utwórz pasowanie, aby przeprowadzić analizę dopasowania krzywej. Wybierz model dla 2-składnikowej, 3-wymiarowej dyfuzji ze stanem trypletowym. Ustaw czas rozpoczęcia montażu.Kliknij przycisk Dopasuj do wszystkich. Sprawdź zamontowane wartości. SOD1-G85R oznaczony pomiarem GFP w żywej komórce.W przeciwieństwie do pomiaru roztworu, zalecam użycie inkubatora z temperaturą. Ustaw naczynie do hodowli komórek na stoliku mikroskopu. Potwierdź ostrość i pozycję za pomocą okularu.Wybierz celę pomiarową. Powiększ i dostosuj pozycję komórki w trybie szybkiego skanowania. Uzyskaj migawkę komórek w trybie niskiej prędkości skanowania.Wybierz pozycję pomiaru SKO za pomocą narzędzia Pozycja. Celownik wskazuje pozycję pomiaru. Rozpocznij pomiar.Niewielki spadek rekordu szybkości zliczania fotonów sugeruje fotobielenie GFP. Wykonaj dopasowanie krzywej. Przedstawiono reprezentatywne wyniki GFP-TDP25 w lizacie komórkowym.Górny wykres to zapis szybkości zliczania fotonów. Tam, gdzie znajdują się strzały, znajduje się kolec, sugerujący rozpuszczalne oligomery i agregaty. Środkowy wykres reprezentuje starą funkcję korelacji.Szara linia pokazuje niską, starą funkcję korelacji. Karmazynowa linia pokazuje dopasowaną funkcję. Przerywane linie wskazują czas rozpoczęcia i zakończenia montażu.Dolna tabela pokazuje dopasowaną wartość. Następnie pokazane są reprezentatywne wyniki SOD1-G85R-GFP w żywej komórce. Górny wykres przedstawia zapis naszego współczynnika zliczania fotonów.Zaobserwowano stopniowy spadek zarejestrowanego tempa zliczania fotonów, co sugeruje fotobielenie wzrostu GFP dla różnych pomiarów. Dzieje się tak ze względu na niską prędkość dyfuzji w żywych komórkach. Środkowy wykres przedstawia starą funkcję korelacji SOD1.Szara linia pokazuje niską, starą funkcję korelacji. Karmazynowa linia pokazuje dopasowaną funkcję. Przerywane linie wskazują czas rozpoczęcia i zakończenia z dopasowaniem.Dolna tabela przedstawia dopasowane wartości. Tutaj pokazujemy tę procedurę pomiaru dyfuzji z każdej komórki związanej TDP-25 w lizacie komórkowym i wszystkiego, co zmutowane SOD1 w żywych komórkach za pomocą FCS. Rozpuszczalne oligomery i agregacja w lizacie komórkowym mogą być często obserwowane jako skoki lub pęknięcia.Z drugiej strony, w żywych komórkach takie kolce są rzadko obserwowane, z wyjątkiem możliwie oczywistych żywych struktur. Powoli dyfuzyjny gatunek zmutowanego SOD1 dodaje nam średniej jasności dla pojedynczych cząstek, takich jak homopolimeryzacja SOD1 w środku. Przedstawiona tutaj procedura jest prosta i warta zachodu.FCS nie zawiera promieniowania; bezpośrednio w stanie uśpienia. To tylko wasza i nasza wyobraźnia empatia.

detection-protein-aggregation-using-fluorescence-correlation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie demonstrujemy komórkowy test agregacji białek za pomocą inhibitorów proteasomów, które blokują aktywność proteasomu, zapobiegając nieprawidłowo sfałdowanym, zmutowanym białkom, połączonym z fluorescencyjnym znacznikiem, przed degradacją proteasomalną zależną od ubikwityny, prowadzącą do ich akumulacji w cytoplazmie komórki. Agregaty białkowe są następnie wizualizowane i oznaczane ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Test tworzenia agregatów białkowych: metoda wykrywania i ilościowego określania agregacji białek w hodowanych komórkach po indukcji przez inhibitor proteasomu

Ten film demonstruje technikę spektroskopii fluktuacji fluorescencji (FFS) do badania homooligomeryzacji białek. Białka znakowane fluorescencyjnie w próbce są dimeryzowane przy użyciu środka podczas badania oligomeryzacji białek za pomocą FFS. Za pomocą mikroskopu konfokalnego, gdy białka wchodzą i wychodzą z małej objętości obserwacyjnej, przeprowadza się analizę wahań jasności cząsteczek fluorescencyjnych w celu określenia stanu oligomerycznego białek.

Spektroskopia fluktuacji fluorescencji w celu zbadania homooligomeryzacji białek

W tym filmie opisujemy technikę anizotropii fluorescencji do badania interakcji między białkiem zespołu Shwachmana-Diamonda (SBDS) oznaczonym fluoroforem a czynnikiem wydłużenia 1 GTPazą (EFL1). Podczas inkubacji białek SBDS ze stopniowo rosnącymi stężeniami EFL1 obserwuje się stały wzrost anizotropii, co wskazuje na udaną interakcję między tymi dwoma białkami.

Wykrywanie interakcji białko-białko oparte na anizotropii fluorescencyjnej

Żywotność komórek zależy od szybkiego i skutecznego radzenia sobie z nieprawidłowym fałdowaniem białek.  W tym miejscu opisujemy metodę wizualizacji różnych potencjalnych losów nieprawidłowo sfałdowanego białka: ponownego fałdowania, degradacji lub sekwestracji w inkluzjach. Demonstrujemy zastosowanie czujnika składania, Ubc9ts, do monitorowania proteostazy i kontroli jakości agregacji w żywych komórkach za pomocą mikroskopii 4D.

Obrazowanie 4D agregacji białek w żywych komórkach

Przeciwciała, które wiążą się z docelowymi receptorami na powierzchni komórki, mogą powodować zmiany konformacji i grupowania. Te dynamiczne zmiany mają implikacje dla charakterystyki rozwoju leków w komórkach docelowych. Protokół ten wykorzystuje mikroskopię konfokalną i spektroskopię korelacji obrazów za pomocą ImageJ/FIJI w celu ilościowego określenia zakresu grupowania receptorów na powierzchni komórki.

Mikroskopia konfokalna ujawnia agregację receptorów na powierzchni komórki za pomocą spektroskopii korelacji obrazu

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Ten artykuł opisuje protokół cytometrii przepływowej oparty na FRET, który pozwala określić ilościowo samoorganizację białek zarówno w komórkach S. cerevisiae, jak i HEK293T.

Wykrywanie i charakterystyka samoorganizacji białek in vivo za pomocą cytometrii przepływowej

Opisujemy zastosowanie nanospektroskopii w podczerwieni i mikroskopii sił atomowych o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji procesu samoorganizacji białek w agregaty oligomeryczne i fibryle amyloidowe, co jest ściśle związane z powstawaniem i rozwojem szerokiego zakresu ludzkich zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Charakterystyka poszczególnych agregatów białkowych za pomocą nanospektroskopii w podczerwieni i mikroskopii sił atomowych

Czasowo-rozdzielcze wzmocnienie fluorescencji pojedynczej cząsteczki jest użytecznym czujnikiem zbliżeniowym spektroskopowym fluorescencji, wrażliwym na lokalne zmiany strukturalne w białkach. Tutaj pokazujemy, że można go użyć do odkrycia stabilnych lokalnych konformacji w α-synukleinie, która jest inaczej znana jako kulisto nieustrukturyzowana i niestabilna, gdy jest mierzona za pomocą linijki FRET o większym zasięgu.

Wykorzystanie czasowo rozdzielczego wzmocnienia fluorescencji indukowanego białkiem w celu identyfikacji stabilnych lokalnych konformacji po jednym monomerze α-synukleiny na raz

Prezentujemy eksperymentalny protokół i proces analizy danych do przeprowadzenia dwukolorowej spektroskopii korelacji krzyżowej fluorescencji (FCCS) na żywo w połączeniu z transferem energii rezonansowej Förster (FRET) w celu zbadania dynamiki receptorów błonowych w żywych komórkach przy użyciu nowoczesnych technik znakowania fluorescencji.

Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach

Ten protokół opisuje unikalną metodę wykrywania wiązania między związkami a cząsteczkami białka, oferując korzyści w postaci minimalnej utraty próbki białka i wysokiej dokładności danych.

Wykrywanie interakcji białko-baldaszek CD40 za pomocą różnicowej fluorescencji skaningowej

Poznaj metodę wykrywania agregacji białek ALS za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS) w lizatach i żywych komórkach Neuro2a. Protokół umożliwia analizę właściwości dyfuzji TDP25 i mutowanego SOD1.

Wykrywanie agregacji białek za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji

Przeglądaj więcej filmów