Name: Wskaźniki uwalniania i wychwytu glutaminianu w pojedynczych synapsach w ostrych wycinkach mózgu od myszy normalnych i myszy z chorobą Huntingtona (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Poznaj metodę oceny dynamiki glutaminianu w pojedynczych synapsach korowo-prążkowych myszy z wykorzystaniem sensora iGlu u. Technika ta pozwala identyfikować dysfunkcjonalne synapsy w chorobie Huntingtona.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez CHDI (A-12467), Niemiecką Fundację Badawczą (Exc 257/1 i DFG Project-ID 327654276 - SFB 1315) oraz wewnętrzne fundusze badawcze Charité. Dziękujemy K. Törökowi z St. George's z Uniwersytetu Londyńskiego i N. Helassa z Uniwersytetu w Liverpoolu za plazmid iGluu i wiele pomocnych dyskusji. D. Betances i A. Schönherr zapewnili doskonałą pomoc techniczną.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Eksperymenty dotyczą kwestii o znaczeniu ogólnym - niezależności synaps i jej możliwej utraty w przebiegu neurodegeneracji, a my opisujemy nowe podejście do identyfikacji dotkniętych synaps w ostrych wycinkach mózgu od starszych (>1 roku) myszy. Wykorzystując ulepszone właściwości kinetyczne niedawno wprowadzonego czujnika glutaminianu iGluu , eksperymenty rzucają światło na związek między uwalnianiem a wychwytem glutaminianu synaptycznego w sposób, który wcześniej nie był możliwy.
...

Względny wpływ każdego zakończenia synaptycznego należącego do "unitarnego połączenia" (tj. połączenia między 2 komórkami nerwowymi) jest zazwyczaj oceniany na podstawie jego wpływu na początkowy segment neuronu postsynaptycznego1,2. Zapisy somatyczne i/lub dendrytyczne z neuronów postsynaptycznych stanowią najpowszechniejszy i do tej pory również najbardziej produktywny sposób wyjaśniania przetwarzania informacji w perspektywie odgórnej lub pionowej3,4,5. Jednak obecność astrocytów z ich dyskretnymi i (u gryzoni) nienakładającymi się terytoriami może przyczynić się do perspektywy horyzontalnej, która opiera się na lokalnych mechanizmach wymiany, integracji i synchronizacji sygnałów w miejscach synaptycznych6,7,8,9,10.
Ponieważ wiadomo, że astroglej odgrywa, ogólnie rzecz biorąc, główną rolę w patogenezie chorób neurodegeneracyjnych11,12 a w szczególności rolę w utrzymaniu i plastyczności synaps glutaminergiczne13,14,15,16, można sobie wyobrazić, że zmiany w wydajności synaps ewoluują zgodnie ze stanem astrocytów we wspólnym obszarze docelowym włókien doprowadzających o różnym pochodzeniu. Aby dokładniej zbadać lokalne mechanizmy regulacyjne w zdrowiu i chorobie pochodzące od celu/astrogleju, konieczna jest ocena poszczególnych synaps. Niniejsze podejście zostało opracowane w celu oszacowania zakresu funkcjonalnych wskaźników uwalniania i klirensu glutaminianu oraz zdefiniowania kryteriów, które mogą być wykorzystane do identyfikacji dysfunkcyjnych (lub odzyskanych) synaps w obszarach mózgu najściślej związanych z inicjacją ruchu (tj. przede wszystkim w korze ruchowej i prążkowiu grzbietowym).
Prążkowie nie posiada wewnętrznych neuronów glutaminergicznym. Dlatego stosunkowo łatwo jest zidentyfikować aferenty glutaminergiczne pochodzenia pozaprążkowiowego. Te ostatnie pochodzą głównie z przyśrodkowego wzgórza i kory mózgowej (zobacz17,18,19,20 po więcej). Synapsy korowo-korowe są tworzone przez aksony neuronów piramidowych zlokalizowanych w warstwach korowych 2/3 i 5. Odpowiednie aksony tworzą obustronne połączenia śródmózgowiowe (IT) lub połączenia ipsilateralne za pośrednictwem systemu światłowodowego, który bardziej doogonowo tworzy drogę piramidową (PT). Zasugerowano ponadto, że terminale typu IT i PT różnią się charakterystyką wydania i rozmiarem21,22. W świetle tych danych można również spodziewać się pewnych różnic w obchodzeniu się z glutaminianem.
Prążkowie jest najbardziej dotkniętym obszarem mózgu w chorobie Huntingtona (HD)5. Choroba Huntingtona u ludzi jest ciężką chorobą neurodegeneracyjną dziedziczoną genetycznie. Mysi model Q175 daje możliwość zbadania komórkowych podstaw hipokinetycznie sztywnej postaci HD, stanu, który ma wiele wspólnego z parkinsonizmem. Począwszy od wieku około 1 roku, homozygoty Q175 myszy (HOM) wykazują oznaki hipokinezji, co ujawniono poprzez pomiar czasu spędzonego bez ruchu na otwartym polu23. Obecne eksperymenty na heterozygotach Q175 (HET) potwierdziły wcześniejsze deficyty motoryczne obserwowane w HOM, a ponadto wykazały, że obserwowanym deficytom motorycznym towarzyszył obniżony poziom białka astrocytowego transportera aminokwasów pobudzających 2 (EAAT2) w bezpośrednim sąsiedztwie korowo-striatalicznych zakończeń synaptycznych 24. W związku z tym wysunięto hipotezę, że deficyt wychwytu glutaminianu astrocytarnego może prowadzić do dysfunkcji, a nawet utraty odpowiednich synaps25,26.
Tutaj opisujemy nowe podejście, które pozwala ocenić klirens glutaminianu pojedynczej synapsy w stosunku do ilości uwolnionego neuroprzekaźnika. Nowy czujnik glutaminianu iGluu uległ ekspresji w neuronach piramidowych kory mózgowej. Został opracowany przez Katalin Török27 i stanowi modyfikację wcześniej wprowadzonego czujnika glutaminianu o wysokim powinowactwie, ale powolnym iGluSnFR28. Oba czujniki są pochodnymi wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP). Aby zapoznać się z charakterystykami spektralnymi i kinetycznymi, zobacz Helassa et al.27. Krótko mówiąc, iGluu jest czujnikiem o niskim powinowactwie z kinetyką szybkiej dezaktywacji i dlatego szczególnie dobrze nadaje się do badania klirensu glutaminianu na końcach synaptycznych uwalniających glutaminian. Stała czasowa dysocjacji iGluu została wyznaczona w urządzeniu z zatrzymanym przepływem, które dało wartośćTau off 2,1 ms w 20 °C, ale 0,68 ms przy ekstrapolacji do temperatury 34 °C27. Pojedyncze końcówki poboczne Schaffera badane w temperaturze 34 °C za pomocą spiralnego skaningu laserowego w regionie CA1 organtypowych kultur hipokampa pod mikroskopem 2-fotonowym wykazywały średnią stałą czasową rozpadu wynoszącą 2,7 ms.

<table><tbody><tr><td>Stereo microsope</td><td>WPI</td><td>PZMIII</td><td>Precyzyjny mikroskop lornetkowy stereo Zoom</td></tr><tr><td>Ramka stereotaktyczna</td><td>Stoelting</td><td>51500D</td><td>Digital Lab Nowy standard stereotaktycznej ramki</td></tr><tr><td>Wiertarka szybkobieżna</td><td>Stoelting</td><td>514439V</td><td>Foredom K1070 cromoter Kit</td></tr><tr><td>System wtryskowy</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td>Kwintesencja wtryskiwacza stereopodatkowego (QSI)</td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton 5 i mikro; l</td><td>Hamilton</td><td>87930</td><td>75RN Syr (26s/51/2)</td></tr><tr><td>Laserowy system pozycjonowania</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA-40</td><td>UGA-40</td></tr><tr><td>Niebieski laser do wzbudzenia iGluu</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>DL-473-020-S</td><td>Lustro</td></tr><tr><td>dichroiczne 473 nm do 473 nm</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>ROE TB-355-405-473</td><td>Dichroiczny</td></tr><tr><td>mikroskop pionowy 1P</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1066-600</td><td>Axioskop 2 FS</td></tr><tr><td>Plus Obiektyw 63x/1.0</td><td>Carl Zeiss</td><td>421480-9900</td><td>W Plan-apochromat</td></tr><tr><td>4x</td><td>obiektyw Carl Zeiss</td><td>44-00-20</td><td>Achroplan 4x/0,10</td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne do iGluu</td><td>Omega optyczne</td><td>XF2030</td><td></td></tr><tr><td>Filtr emisyjny do iGluu</td><td>Omega optyczne</td><td>XF3086</td><td></td></tr><tr><td>Zwierciadło dichroiczne</td><td>Omega optyczne</td><td></td><td></td>QMAX_DI580LP</tr><tr><td>Filtr emisyjny do autofluorescencji subtr.</td><td>Kamera optyczna Omega</td><td>QMAX EM600-650</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS</td><td>Andor</td><td>ZYLA4.2PCL10</td><td>ZYLA 4.2MP Plus</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do pozyskiwania</td><td>Andor</td><td>4.30.30034.0</td><td>Solis</td></tr><tr><td>AD/DA konwerter</td><td>HEKA Elektronik</td><td>895035</td><td>InstruTECH LIH8+8</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Aquisition</td><td>HEKA Elektronik</td><td>895153</td><td>TIDA5.25</td></tr><tr><td>System pozycjonowania elektrod</td><td>Sutter Instrument</td><td>MPC-200</td><td>Mikromanipulator</td></tr><tr><td>Stymulator elektryczny</td><td>Warsztaty Charite</td><td>STIM-26</td><td></td></tr><tr><td>Krajalnica</td><td>Leica</td><td>VT1200 S</td><td>Ściągacz wibrotomiczny</td></tr><tr><td>/płomieniowy</td><td>Sutter Instr</td><td>SU-P1000</td><td>P-1000</td></tr><tr><td>Szklane rurki do pipet iniekcyjnych</td><td>WPI</td><td>1B100F3</td><td></td></tr><tr><td>Szklane rurki do stymulacji pipety</td><td>WPI</td><td>R100-F3</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoksyna</td><td>Abcam</td><td>ab120054</td><td>TTX</td></tr><tr><td>iGluu plazmid</td><td>Addgene</td><td>106122</td><td>myszy pCI-syn-iGluu</td></tr><tr><td>Q175</td> Jackson <td>Lab</td><td>27410</td><td>Z-Q175-KI</td></tr></tbody></table>

wskaźniki uwalniania i wychwytu glutaminianu w pojedynczych synapsach w ostrych wycinkach mózgu od myszy normalnych i myszy z chorobą huntingtona

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Synapsy to wysoce podzielone jednostki funkcjonalne, które działają niezależnie od siebie. W chorobie Huntingtona (HD) i innych zaburzeniach neurodegeneracyjnych ta niezależność może być zagrożona z powodu niewystarczającego klirensu glutaminianu i wynikających z tego efektów rozlewania się i wylewania. Zmienione pokrycie astrocytarne zakończeń presynaptycznych i / lub kolców dendrytycznych, a także zmniejszony rozmiar klastrów transportera glutaminianu w miejscach uwalniania glutaminianu są zaangażowane w patogenezę chorób powodujących objawy dys-/hiperkinezji. Jednak mechanizmy prowadzące do dysfunkcji synaps glutaminergicznego w chorobie Huntingtona nie są dobrze poznane. Udoskonalając i stosując obrazowanie synaps, uzyskaliśmy dane rzucające nowe światło na mechanizmy utrudniające inicjację ruchów. W tym miejscu opisujemy podstawowe elementy stosunkowo niedrogiego podejścia do osiągnięcia rozdzielczości pojedynczej synapsy przy użyciu nowego genetycznie kodowanego ultraszybkiego czujnika glutaminianu iGluu, optyki szerokokątnej, naukowej kamery CMOS (sCMOS), lasera 473 nm i laserowego systemu pozycjonowania do oceny stanu synaps korowo-prążkowych w ostrych wycinkach od zdrowych lub chorych myszy odpowiednich do wieku. Stan przejściowy glutaminianu skonstruowano z jednego lub wielu pikseli, aby uzyskać szacunki i) uwalniania glutaminianu na podstawie maksymalnego wzrostu stężenia glutaminianu [Glu] obok strefy aktywnej oraz ii) wychwytu glutaminianu odzwierciedlonego w stałej czasowej rozpadu (TauD) perysynaptyki [Glu]. Różnice w spoczynkowej wielkości butonu i kontrastujące wzorce krótkotrwałej plastyczności posłużyły jako kryteria identyfikacji zakończeń korowo-prążkowych jako należących do szlaku śródmózgowiowego (IT) lub drogi piramidowej (PT). Korzystając z tych metod, odkryliśmy, że u objawowych myszy HD ~40% synaps korowo-prążkowych typu PT wykazywało niewystarczający klirens glutaminianu, co sugeruje, że synapsy te mogą być narażone na uszkodzenia ekscytotoksyczne. Wyniki podkreślają przydatność TauD jako biomarkera dysfunkcyjnych synaps u myszy z chorobą Huntingtona o fenotypie hipokinetycznym.

Identyfikacja dwóch typów glutaminergicznych żargonów korowo-prążkowiowych 
Aferenty IT i PT biorą swój początek odpowiednio w warstwie 2/3 i 5 oraz wykazują odmienne wzorce ramifikacji i zakończeń w prążkowiu ipsilateralnym i kontralateralnym (tylko zakończenia IT). Wciąż niewiele wiadomo o właściwościach uwalniania i usuwania glutaminianu w warunkach powtarzającej się aktywacji, jakich można doświadczyć podczas inicjacji ruchów, lecz dobrze udokumentowano, że odpowiednie żargony uwalniające glutam...

Przedstawiamy protokół do oceny równowagi między uwalnianiem glutaminianu a klirensem w pojedynczych synapsach glutaminergicznym korowo-prążkowych w ostrych wycinkach od dorosłych myszy. Protokół ten wykorzystuje czujnik fluorescencyjny iGluu do wykrywania glutaminianu, kamerę sCMOS do akwizycji sygnału oraz urządzenie do ogniskowego oświetlenia laserowego.

Wskaźniki uwalniania i wychwytu glutaminianu w pojedynczych synapsach w ostrych wycinkach mózgu od myszy normalnych i myszy z chorobą Huntingtona

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other ...

Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości pojedynczych synaps z ekspresją szybkiego czujnika glutaminianu pozwala na wykrycie lokalnego niedopasowania między uwalnianiem nadajnika a wychwytem. W przypadku choroby metoda ta może być wykorzystana do identyfikacji dysfunkcyjnych synaps. W celu korekcji autofluorescencji najpierw umieść wycinek mózgu interesującej nas myszy w komorze rejestracyjnej mikroskopu jednofotonowego.Zanurz plasterek w natlenionym, sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym i użyj obiektywu 20-krotnego zanurzenia w wodzie, aby zlokalizować prążkowie grzbietowe. Przymocuj plastry za pomocą nylonowej siatki na platynowej harfie, aby zminimalizować ruchy tkanki, i przełącz się na obiektyw 63x zanurzony w wodzie. Używając filtra górnoprzepustowego o długości nanometra 510 nanometrów, uzyskaj obraz struktur dodatnich czujnika autofluorescencyjnego i glutaminianu razem.Używając filtra górnoprzepustowego o długości nanometra 600 nanometrów, uzyskaj drugi obraz samych struktur autofluorescencyjnych. Aby zdefiniować zakres, użyj średniej intensywności 10 najjaśniejszych i 10 najciemniejszych pikseli, aby przeskalować obrazy czerwone i żółte. Następnie wykonaj odejmowanie obrazu żółtego minus czerwonego i przeskaluj odjęty obraz, aby wygenerować standardowy 8-bitowy plik TIFF w celu wygodnej wizualizacji interesującego Cię obrazu.Do wyszukania czułych butonów potrzebna jest odpowiednia szklana mikropipeta do stymulacji elektrycznej. Za pomocą ściągacza do mikropipet można wytwarzać pipety stymulacyjne z kapilar ze szkła borokrzemianowego o wewnętrznej średnicy końcówki około jednego mikrometra. Aby zbadać zależne od potencjału czynnościowego uwalnianie glutaminianu z zestawu potencjalnych boutonów, wybierz 63-krotne powiększenie i filtr emisyjny 510 nanometrów.Załaduj odjęty obraz, aby umożliwić umieszczenie szklanej elektrody stymulacyjnej obok fluorescencyjnego żyla, unikając bliskości dodatkowych aksonów. W jakich żylakach związanych z maksymalnym rozwidleniem lub alokacją w głębszej części plastra. Umieść elektrodę stymulacyjną w pobliżu interesującego Cię miejsca i wyłącz światło, ponieważ nagrania muszą być wykonywane w całkowitej ciemności.Następnie włącz wielokanałowy system aplikacji kąpieli, w którym jeden kanał dostarcza standardowy roztwór do kąpieli, a pozostałe kanały dostarczają niezbędne blokery kanałów jonowych, transportery lub receptory błonowe, w tym tetrototoksynę, aby zablokować generowanie potencjału czynnościowego. Kontroluj przepływ w miejscu nagrywania i włącz stymulator, aby dostarczyć impulsy prądu depolaryzacyjnego o natężeniu od dwóch do 10 mikroamperów do pipety stymulującej. Uwalnianie jest teraz aktywowane przez bezpośredni napływ wapnia przez kanały bramkowane napięciem.Aby zobrazować uwalnianie glutaminianu w klimenie, za pomocą napędów mikroskopu X, Y należy umieścić badany czujnik glutaminianu dodatni w pobliżu środka pola widzenia. Po zatrzymaniu akwizycji kliknij na obraz lewym przyciskiem myszy, aby określić pozycję X, Y spoczywającego środka bouton. Zostaną wyświetlone współrzędne X, Y ustawionego kursora.Korzystając z danych kalibracyjnych, oblicz współrzędne miejsca, do którego powinna zostać wysłana wiązka laserowa w celu wzbudzenia fluorescencji czujnika glutaminianu, korzystając ze wskazanych wzorów. Aby utworzyć sekwencję jednopunktową w oprogramowaniu do sterowania laserem, wybierz punkt w polu Dodaj do sekwencji na stronie sekwencji oprogramowania sterującego laserem i ustaw przebiegi i opóźnienie biegu na zero, a sekwencję na TLL. Następnie kliknij przycisk rozpocznij sekwencję.W oprogramowaniu do sterowania kamerą wybierz odpowiednie parametry obrazowania i wybierz start zewnętrzny jako tryb wyzwalania. Kliknij opcję take signal w oprogramowaniu do sterowania kamerą. Następnie należy zainicjować protokół eksperymentalny określony dla urządzenia wyzwalającego i przeprowadzić próbę protokołu eksperymentalnego z odpowiednią osią czasu, tak aby kamera zarejestrowała 400 klatek o częstotliwości 2,48 kiloherca podczas jednej próby, z częstotliwością powtarzania 0,1 Hz lub niższą.Aby zidentyfikować patologiczne synapsy, włącz procedury podnoszenia wysokości i oblicz intensywność fluorescencji, średnią i odchylenie standardowe dla wybranego obszaru zainteresowania w spoczynku. Określ i obramuj obszar zajmowany przez piksele o intensywności fluorescencji w spoczynku większej niż średnia plus trzy odchylenia standardowe, a następnie określ wirtualną średnicę w mikronach, przyjmując okrągłą formę obszaru progowego supra. Wykreślić intensywność fluorescencji w czasie, jako różnicę między rzeczywistą wartością intensywności fluorescencji a wartością intensywności fluorescencji w spoczynku podzieloną przez wartość intensywności fluorescencji w spoczynku.Określ amplitudę piku odpowiedzi fluorescencyjnej. Wykonaj dopasowanie monowykładnicze dla rozpadu od szczytu odpowiedzi fluorescencyjnej i wyznacz stałą czasową rozpadu, TauD. Aby oszacować maksymalną amplitudę w danej synapsie, wybierz piksel o największej zmianie intensywności fluorescencji, który jest najlepszym wskaźnikiem obciążenia glutaminianu prezentowanego maszynerii klirensu synapsy.Obrazowanie pojedynczych synaps można wykorzystać do identyfikacji dwóch klas synaps korowo-prążkowych przy użyciu kryteriów wielkości i współczynnika parzystych impulsów. W odstępach między bodźcami od 20 do 50 milisekund mniejsze zakończenia międzyjelitowo-rdzeniowe są podatne na sparowaną depresję impulsu, podczas gdy większe zakończenia drogi piramidowej wykazywały sparowane ułatwienie impulsu. Testy zachowań motorycznych przeprowadzone na myszach typu dzikiego i myszach wykazujących fenotyp Huntingtona ujawniają istotną dodatnią korelację między wynikami uzyskanymi dla całkowitej ścieżki przebiegniętej w otwartym polu a opóźnieniem przekroczenia kroku.Co więcej, obrazowanie glutaminianu w pojedynczej synapsie pokazuje, że myszy z objawami choroby Huntingtona wykazywały deficyt szybkości rozpadu glutaminianu w zestawieniu, co znajduje odzwierciedlenie w wartościach TauD odpowiedzi glutaminianu na stymulację pojedynczej synapsy. U zwierząt w typie dzikim takie wydłużenie obserwowano dopiero po zastosowaniu selektywnego, nieprzenośnego inhibitora wychwytu glutaminianu. Ocena prawdopodobieństwa wystąpienia danej wartości TauD w wycinkach myszy typu dzikiego i myszy wyrażających objawy choroby Huntingtona ujawniła, że u zwierząt typu dzikiego TauD nigdy nie przekracza 15 milisekund.Jednak w objawowej chorobie Huntingtona 40% synaps wykazuje wartości TauD między 16 a 58 milisekund, pomimo tendencji do zmniejszania ilości uwalnianego glutaminianu. Dlatego TauD może być uważany za biomarker dysfunkcyjnych synaps w chorobie Huntingtona i może być dalej wykorzystywany do weryfikacji powrotu do stanu funkcjonalnego w eksperymentach ukierunkowanych na transport glutaminianu astrocytów. Ten protokół monitorowania glutaminianu w poszczególnych synapsach korowo-prążkowych może pomóc w wyjaśnieniu roli niedoboru wychwytu glutaminianu w patogenezie choroby neurodegeneracyjnej.Obrazowanie pojedynczych synaps jest szczególnie przydatne do badania presynaptycznych miejsc synaps pobudzających.

single-synapse-indicators-glutamate-release-uptake-acute-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano przygotowanie ostrych skrawków mózgu z izolowanych struktur hipokampa oraz jednoczesne rejestracje elektrofizjologiczne astrocytów i neuronów w stratum radiatum podczas stymulacji kolaterali Schaffera. Zaprezentowano farmakologiczną izolację prądów transporterów potasu i glutaminianu w astroglei.

Podwójne rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi astroglialnych i neuronalnych wywołanych synaptycznie w ostrych skrawkach hipokampa

Ten film demonstruje ocenę uwalniania i usuwania glutaminianu w pojedynczych synapsach korowo-prążkowych w wycinku mózgu myszy. Stymulacja elektryczna ułatwia uwalnianie glutaminianu w synapsie. Uwolniony glutaminian zmienia fluorescencję białka czujnika, która zanika z czasem, wskazując na skuteczność uwalniania i klirensu.

Analiza uwalniania i klirensu glutaminianu w pojedynczej synapsie neuronu w wycinku mózgu myszy

Źródło: McLeod, F., et al. Ocena gęstości synaps w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie. J. Vis. Exp. (2017). Ten film przedstawia metodę wizualizacji markerów synaptycznych w wycinkach mózgu hipokampa za pomocą konfokalnej analizy immunofluorescencyjnej. Plastry są barwione immunologicznie przeciwciałami pierwszorzędowymi skierowanymi przeciwko markerom presynaptycznym i postsynaptycznym, a następnie przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem. Oznaczone markery są następnie...

Analiza mikroskopowa synaps w mysich wycinkach hipokampa przy użyciu immunofluorescencji

Opracowaliśmy model wycinka mózgu, który może być wykorzystany do zbadania mechanizmów molekularnych związanych z uszkodzeniem mózgu za pośrednictwem ekscytotoksyczności. Ta technika generuje żywotną dojrzałą tkankę mózgową i zmniejsza liczbę zwierząt wymaganych do eksperymentów, jednocześnie utrzymując częściowo nienaruszone obwody neuronalne, interakcje komórkowe i przedziały postsynaptyczne.

Ekscytotoksyczna stymulacja mikrowycinków mózgu jako model udaru in vitro

Opisujemy połączenie ogniskowej fotoaktywacji związków neuroaktywnych wywołanej promieniowaniem UV z całokomórkowym patch-clampem i wielofotonowym obrazowaniem wewnątrzkomórkowych tranustów sodu w dendrytach i kolcach neuronów hipokampa w ostrych wycinkach tkanki mózgu myszy.

Wielofotonowe wewnątrzkomórkowe obrazowanie sodu w połączeniu z ogniskowym rozpakowywaniem glutaminianu za pośrednictwem promieniowania UV w neuronach piramidowych CA1

Tutaj opisujemy konfigurację, nawigację po oprogramowaniu i analizę danych dla przestrzennie i czasowo precyzyjnej metody pomiaru tonicznych i fazowych zmian zewnątrzkomórkowego glutaminianu in vivo za pomocą układów mikroelektrod połączonych enzymami (MEA).

Wykorzystanie bioczujników opartych na enzymach do pomiaru toniku i glutaminianu fazowego w mysich modelach choroby Alzheimera

Protokół do dokładnej identyfikacji i analizy synaps w wycinkach hipokampa za pomocą immunofluorescencji jest opisany w tym artykule.

Ocena gęstości synaps w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie

To jest protokół do przygotowania ostrych plastrów z dorosłych i starzejących się hipokampów myszy, który wykorzystuje transcardialną perfuzję i cięcie plastrów za pomocą lodowatego NMDG-aCSF w celu zmniejszenia niedotlenienia tkanki. Uzyskane w ten sposób plastry pozostają zdrowe przez wiele godzin i nadają się do długotrwałych nagrań typu patch-clamp i nagrań terenowych.

Minimalizacja niedotlenienia w plastrach hipokampa od dorosłych i starzejących się myszy

Ten artykuł ma na celu opisanie systematycznego protokołu uzyskiwania poziomych wycinków mózgu hipokampa u myszy. Celem tej metodologii jest zachowanie integralności szlaków włókien hipokampa, takich jak ścieżka perforantu i szlak włókien omszałych, w celu oceny procesów neurologicznych związanych z zakrętem zębatym.

Poziome wycinki hipokampa mózgu myszy

Ta metoda wprowadza prostą technikę wykrywania endogennego uwalniania monoamin za pomocą ostrych wycinków mózgu. Zestaw wykorzystuje 48-dołkową płytkę zawierającą uchwyt na tkankę do uwalniania monoamin. Uwolniona monoamina jest analizowana za pomocą HPLC w połączeniu z detekcją elektrochemiczną. Ponadto technika ta zapewnia metodę przesiewową w celu odkrywania leków.

Test na płytce do pomiaru endogennego uwalniania monoamin w ostrych wycinkach mózgu

Poznaj metodę oceny dynamiki glutaminianu w pojedynczych synapsach korowo-prążkowych myszy z wykorzystaniem sensora iGlu u. Technika ta pozwala identyfikować dysfunkcjonalne synapsy w chorobie Huntingtona.

Wskaźniki uwalniania i wychwytu glutaminianu w pojedynczych synapsach w ostrych wycinkach mózgu od myszy normalnych i myszy z chorobą Huntingtona (Wideo) | JoVE Journal

Wskaźniki uwalniania i wychwytu glutaminianu w pojedynczych synapsach w ostrych wycinkach mózgu od myszy normalnych i myszy z chorobą Huntingtona

Przeglądaj więcej filmów