Wskaźniki uwalniania i wychwytu glutaminianu w pojedynczych synapsach w ostrych wycinkach mózgu od myszy normalnych i myszy z chorobą Huntingtona
11 marca 2020
Przedstawiamy protokół do oceny równowagi między uwalnianiem glutaminianu a klirensem w pojedynczych synapsach glutaminergicznym korowo-prążkowych w ostrych wycinkach od dorosłych myszy. Protokół ten wykorzystuje czujnik fluorescencyjny iGluu do wykrywania glutaminianu, kamerę sCMOS do akwizycji sygnału oraz urządzenie do ogniskowego oświetlenia laserowego.
Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości pojedynczych synaps z ekspresją szybkiego czujnika glutaminianu pozwala na wykrycie lokalnego niedopasowania między uwalnianiem nadajnika a wychwytem. W przypadku choroby metoda ta może być wykorzystana do identyfikacji dysfunkcyjnych synaps. W celu korekcji autofluorescencji najpierw umieść wycinek mózgu interesującej nas myszy w komorze rejestracyjnej mikroskopu jednofotonowego.
Zanurz plasterek w natlenionym, sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym i użyj obiektywu 20-krotnego zanurzenia w wodzie, aby zlokalizować prążkowie grzbietowe. Przymocuj plastry za pomocą nylonowej siatki na platynowej harfie, aby zminimalizować ruchy tkanki, i przełącz się na obiektyw 63x zanurzony w wodzie. Używając filtra górnoprzepustowego o długości nanometra 510 nanometrów, uzyskaj obraz struktur dodatnich czujnika autofluorescencyjnego i glutaminianu razem.
Używając filtra górnoprzepustowego o długości nanometra 600 nanometrów, uzyskaj drugi obraz samych struktur autofluorescencyjnych. Aby zdefiniować zakres, użyj średniej intensywności 10 najjaśniejszych i 10 najciemniejszych pikseli, aby przeskalować obrazy czerwone i żółte. Następnie wykonaj odejmowanie obrazu żółtego minus czerwonego i przeskaluj odjęty obraz, aby wygenerować standardowy 8-bitowy plik TIFF w celu wygodnej wizualizacji interesującego Cię obrazu.
Do wyszukania czułych butonów potrzebna jest odpowiednia szklana mikropipeta do stymulacji elektrycznej. Za pomocą ściągacza do mikropipet można wytwarzać pipety stymulacyjne z kapilar ze szkła borokrzemianowego o wewnętrznej średnicy końcówki około jednego mikrometra. Aby zbadać zależne od potencjału czynnościowego uwalnianie glutaminianu z zestawu potencjalnych boutonów, wybierz 63-krotne powiększenie i filtr emisyjny 510 nanometrów.
Załaduj odjęty obraz, aby umożliwić umieszczenie szklanej elektrody stymulacyjnej obok fluorescencyjnego żyla, unikając bliskości dodatkowych aksonów. W jakich żylakach związanych z maksymalnym rozwidleniem lub alokacją w głębszej części plastra. Umieść elektrodę stymulacyjną w pobliżu interesującego Cię miejsca i wyłącz światło, ponieważ nagrania muszą być wykonywane w całkowitej ciemności.
Następnie włącz wielokanałowy system aplikacji kąpieli, w którym jeden kanał dostarcza standardowy roztwór do kąpieli, a pozostałe kanały dostarczają niezbędne blokery kanałów jonowych, transportery lub receptory błonowe, w tym tetrototoksynę, aby zablokować generowanie potencjału czynnościowego. Kontroluj przepływ w miejscu nagrywania i włącz stymulator, aby dostarczyć impulsy prądu depolaryzacyjnego o natężeniu od dwóch do 10 mikroamperów do pipety stymulującej. Uwalnianie jest teraz aktywowane przez bezpośredni napływ wapnia przez kanały bramkowane napięciem.
Aby zobrazować uwalnianie glutaminianu w klimenie, za pomocą napędów mikroskopu X, Y należy umieścić badany czujnik glutaminianu dodatni w pobliżu środka pola widzenia. Po zatrzymaniu akwizycji kliknij na obraz lewym przyciskiem myszy, aby określić pozycję X, Y spoczywającego środka bouton. Zostaną wyświetlone współrzędne X, Y ustawionego kursora.
Korzystając z danych kalibracyjnych, oblicz współrzędne miejsca, do którego powinna zostać wysłana wiązka laserowa w celu wzbudzenia fluorescencji czujnika glutaminianu, korzystając ze wskazanych wzorów. Aby utworzyć sekwencję jednopunktową w oprogramowaniu do sterowania laserem, wybierz punkt w polu Dodaj do sekwencji na stronie sekwencji oprogramowania sterującego laserem i ustaw przebiegi i opóźnienie biegu na zero, a sekwencję na TLL. Następnie kliknij przycisk rozpocznij sekwencję.
W oprogramowaniu do sterowania kamerą wybierz odpowiednie parametry obrazowania i wybierz start zewnętrzny jako tryb wyzwalania. Kliknij opcję take signal w oprogramowaniu do sterowania kamerą. Następnie należy zainicjować protokół eksperymentalny określony dla urządzenia wyzwalającego i przeprowadzić próbę protokołu eksperymentalnego z odpowiednią osią czasu, tak aby kamera zarejestrowała 400 klatek o częstotliwości 2,48 kiloherca podczas jednej próby, z częstotliwością powtarzania 0,1 Hz lub niższą.
Aby zidentyfikować patologiczne synapsy, włącz procedury podnoszenia wysokości i oblicz intensywność fluorescencji, średnią i odchylenie standardowe dla wybranego obszaru zainteresowania w spoczynku. Określ i obramuj obszar zajmowany przez piksele o intensywności fluorescencji w spoczynku większej niż średnia plus trzy odchylenia standardowe, a następnie określ wirtualną średnicę w mikronach, przyjmując okrągłą formę obszaru progowego supra. Wykreślić intensywność fluorescencji w czasie, jako różnicę między rzeczywistą wartością intensywności fluorescencji a wartością intensywności fluorescencji w spoczynku podzieloną przez wartość intensywności fluorescencji w spoczynku.
Określ amplitudę piku odpowiedzi fluorescencyjnej. Wykonaj dopasowanie monowykładnicze dla rozpadu od szczytu odpowiedzi fluorescencyjnej i wyznacz stałą czasową rozpadu, TauD. Aby oszacować maksymalną amplitudę w danej synapsie, wybierz piksel o największej zmianie intensywności fluorescencji, który jest najlepszym wskaźnikiem obciążenia glutaminianu prezentowanego maszynerii klirensu synapsy.
Obrazowanie pojedynczych synaps można wykorzystać do identyfikacji dwóch klas synaps korowo-prążkowych przy użyciu kryteriów wielkości i współczynnika parzystych impulsów. W odstępach między bodźcami od 20 do 50 milisekund mniejsze zakończenia międzyjelitowo-rdzeniowe są podatne na sparowaną depresję impulsu, podczas gdy większe zakończenia drogi piramidowej wykazywały sparowane ułatwienie impulsu. Testy zachowań motorycznych przeprowadzone na myszach typu dzikiego i myszach wykazujących fenotyp Huntingtona ujawniają istotną dodatnią korelację między wynikami uzyskanymi dla całkowitej ścieżki przebiegniętej w otwartym polu a opóźnieniem przekroczenia kroku.
Co więcej, obrazowanie glutaminianu w pojedynczej synapsie pokazuje, że myszy z objawami choroby Huntingtona wykazywały deficyt szybkości rozpadu glutaminianu w zestawieniu, co znajduje odzwierciedlenie w wartościach TauD odpowiedzi glutaminianu na stymulację pojedynczej synapsy. U zwierząt w typie dzikim takie wydłużenie obserwowano dopiero po zastosowaniu selektywnego, nieprzenośnego inhibitora wychwytu glutaminianu. Ocena prawdopodobieństwa wystąpienia danej wartości TauD w wycinkach myszy typu dzikiego i myszy wyrażających objawy choroby Huntingtona ujawniła, że u zwierząt typu dzikiego TauD nigdy nie przekracza 15 milisekund.
Jednak w objawowej chorobie Huntingtona 40% synaps wykazuje wartości TauD między 16 a 58 milisekund, pomimo tendencji do zmniejszania ilości uwalnianego glutaminianu. Dlatego TauD może być uważany za biomarker dysfunkcyjnych synaps w chorobie Huntingtona i może być dalej wykorzystywany do weryfikacji powrotu do stanu funkcjonalnego w eksperymentach ukierunkowanych na transport glutaminianu astrocytów. Ten protokół monitorowania glutaminianu w poszczególnych synapsach korowo-prążkowych może pomóc w wyjaśnieniu roli niedoboru wychwytu glutaminianu w patogenezie choroby neurodegeneracyjnej.
Obrazowanie pojedynczych synaps jest szczególnie przydatne do badania presynaptycznych miejsc synaps pobudzających.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół oceny równowagi między uwalnianiem a usuwaniem glutaminianu w pojedynczych synapsach glutaminergicznych w obrębie połączeń korowo-prążkowiowych z wykorzystaniem ostrych skrawków tkanek dorosłych myszy. Dzięki zastosowaniu fluorescencyjnego sensora iGlu u do detekcji glutaminianu, badacze mogą zidentyfikować lokalne niezgodności w dynamice neuroprzekaźnika, co wspomaga badanie dysfunkcyjnych synaps w kontekście chorobowym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Neurofarmakologia
- Fizjologia synaptyczna
Wprowadzenie
- Uwalnianie i usuwanie glutaminianu są kluczowe dla neurotransmisji.
- Techniki obrazowania pozwalają zidentyfikować zaburzenia w dynamice neuroprzekaźników.
- Stany patologiczne mogą zmieniać funkcję synaptyczną.
- Ocena tych zmian może dostarczyć wiedzy na temat chorób takich jak choroba Huntingtona.
Cel badania
- Opracowanie metody oceny dynamiki glutaminianu w synapsach.
- Zbadanie reakcji synaps na stymulację w różnych warunkach.
- Identyfikacja zaburzeń czynnościowych w synapsach związanych z chorobami neurologicznymi.
Zastosowane metody
- Do badań obrazowych wykorzystano preparaty skrawków mózgu ex vivo pobranych od dorosłych myszy.
- Głównym obiektem badań były pojedyncze glutaminergiczne synapsy korowo-prążkowiowe.
- Do detekcji glutaminianu zastosowano sensor fluorescencyjny iGlu u.
- Układ mikroskopu dwufotonowego umożliwił obrazowanie i stymulację o wysokiej rozdzielczości.
- W celu zapewnienia precyzyjnych warunków eksperymentalnych, w tym stymulacji elektrycznej i pomiaru fluorescencji, zastosowano dedykowane protokoły.
Główne wyniki
- Protokół umożliwił wykrycie uwalniania i usuwania glutaminianu na poziomie pojedynczych synaps.
- Zaobserwowano różnice w dynamice glutaminianu pomiędzy myszami typu dzikiego a mutantami.
- Specyficzne parametry zaniku dostarczyły informacji na temat funkcji synaptycznej oraz potencjalnych zaburzeń w modelach choroby Huntingtona.
- Charakterystyka odpowiedzi synaptycznych ujawniła zróżnicowane mechanizmy uwalniania glutaminianu.
Wnioski
- Niniejsze badanie umożliwia szczegółową ocenę dynamiki neuroprzekaźników w poszczególnych synapsach, co przyczynia się do zrozumienia dysfunkcji synaptycznych w chorobach neurologicznych.
- Wyniki mogą pomóc w identyfikacji celów dla interwencji terapeutycznych.
- Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta poszerza naszą wiedzę na temat mechanizmów przekaźnictwa glutaminergicznego oraz ich plastyczności w stanach zdrowia i choroby.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia precyzyjną kwantyfikację uwalniania i wychwytu glutaminianu w pojedynczych synapsach korowo-prążkowiowych, zapewniając mechanistyczny odczyt dysfunkcji synaptycznej w modelach choroby Huntingtona. Poprzez identyfikację synaps z upośledzonym oczyszczaniem za pomocą prolongacji TauD, metoda ta wspiera walidację celów terapeutycznych i ograniczanie ryzyka w programach badań nad chorobami neurodegeneracyjnymi. Podejście to oferuje ilościowy biomarker wczesnego wykrywania zmian patofizjologicznych istotnych dla przesiewu terapeutycznego i decyzji dotyczących portfolio badawczego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie funkcji transportera glutaminianu jako celu terapeutycznego w chorobie Huntingtona.
- Wartość operacyjna: Zapewnia bezpośredni odczyt wydajności pobierania glutaminianu przez astrocyty w poszczególnych synapsach.
- Wartość prognostyczna: Wydłużenie TauD służy jako mierzalny biomarker dysfunkcji synaptycznej i ryzyka ekscytotoksyczności.
Przesiewy i opracowywanie analiz
- Gotowość analizy: Generuje ilościowe wskaźniki zaniku fluorescencji (TauD) odpowiednie dla platform obrazowania wysokoprzepustowego (high-content imaging).
- Powtarzalność: Wykorzystuje zestandaryzowane parametry stymulacji i obrazowania, co umożliwia porównania między synapsami oraz między różnymi warunkami.
- Skalowalność: Kompatybilność z kamerami sCMOS i systemami pozycjonowania laserowego w celu analizy wielu synaps jednocześnie.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Łączy upośledzony wychwyt glutaminianu z podatnością specyficzną dla szlaku kory-prążkowia u objawowych myszy z chorobą Huntingtona.
- Ciągłość translacyjna: Wspiera oparty na biomarkerach proces przechodzenia od dysfunkcji synaptycznej do wyników fenotypowych, takich jak hipokineza.
- Decyzje dostosowane do ryzyka: Identyfikuje ok. 40% synaps typu PT z TauD >15 ms jako wysokiego ryzyka uszkodzeń ekscytotoksycznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w przepływy pracy od wczesnego etapu odkrywania leków do badań przedklinicznych, zapewniając analizę na poziomie synaptycznym w celu oceny zaangażowania celu oraz walidacji funkcjonalnej w strategiach modulacji glutaminianu.
- Biologia odkrywcza: Testowanie hipotez dotyczących równowagi między uwalnianiem a wychwytem glutaminianu oraz funkcji transporterów w modelach chorób.
- Przesiewanie: Umożliwienie opracowania testów dla związków mających na celu zwiększenie astrocytycznego oczyszczania z glutaminianu.
- Analityka: Dostarczenie TauD i amplitudy szczytu jako ilościowych punktów końcowych do porównywania stanów synaptycznych w różnych genotypach i wariantach leczenia.
- Badania translacyjne: Powiązanie zmian TauD w synapsach z deficytami motorycznymi w modelach choroby Huntingtona.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stworzenie platformy wielokrotnego użytku do oceny funkcji synaps glutaminergicznych w modelach chorób neurodegeneracyjnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w dysfunkcji glutaminergicznej poprzez izolowanie deficytów wychwytu w pojedynczych synapsach.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje pomiar kinetyki oczyszczania glutaminianu za pomocą TauD pomiędzy laboratoriami i partiami eksperymentalnymi.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez identyfikację celów synaptycznych z mierzalnym potencjałem funkcjonalnego ratunku.
- Wpływ na portfolio: Wspiera dostosowaną do ryzyka priorytetyzację modulatorów transportu glutaminianu w oparciu o odpowiedź biomarkerów synaptycznych.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresie elektrofizjologii, mikroskopii fluorescencyjnej oraz ekspresji genetycznych sensorów.
- Zależność od kamer sCMOS, systemów laserowych 473 nm oraz sprzętu do pozycjonowania laserów w celu precyzyjnego wzbudzenia.
- Konieczność standaryzacji parametrów stymulacji oraz analizy ROI pomiędzy poszczególnymi sesjami obrazowania.
- Adaptacja do innych obszarów mózgu lub typów synaps może wymagać walidacji kryteriów wielkości i plastyczności.
- Ograniczenie wynikające z konieczności przygotowania ostrych skrawków oraz zachowania ciemności podczas rejestracji w celu zapobiegania zakłóceniom sygnału.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:28
Autofluorescence Correction
1:48
Bouton Search
3:19
Glutamate Release and Clearance Visualization
4:49
Off-Line Glutamate Transient Construction and Rapid Glutamate Release and Clearance Assessment
6:01
Results: Representative Identification of Dysfunctional Synapses in Q175 Mice with a Hypokinetic Phenotype
7:51
Conclusion
