Zautomatyzowane obrazowanie i analiza w celu ilościowego oznaczania makropinosomów znakowanych fluorescencyjnie

Makropinocytoza to szlak endocytarny, który jest ważny dla różnych procesów komórkowych, w tym metabolizmu raka. Protokół ten pozwala na ilościowe określenie zakresu makropinocytozy w komórkach in vitro. Automatyzacja ma na celu maksymalizację odtwarzalności, produktywności i zmniejszenie zmienności eksperymentalnej.

Co więcej, mikroskopia fluorescencyjna pozwala na wizualną kontrolę próbki w celu określenia jakości eksperymentalnej i oceny dodatkowych cech makropinosomów. Procedurę zademonstruje mi Cheska Marie Galapate, asystentka naukowa z mojego laboratorium. W przypadku płytki 24-dołkowej z formatem szkiełka nakrywkowego należy chwycić pojedyncze szkiełko nakrywkowe z kąpieli etanolowej za pomocą kleszczyków.

Przyłóż szkiełko nakrywkowe do wewnętrznej ścianki płytki, aby usunąć nadmiar etanolu i umieść szkiełko nakrywkowe płasko na dnie studzienki. Po odparowaniu etanolu należy dwukrotnie przepłukać szkiełko nakrywkowe DPBS, a następnie wysiać komórki na wierzchu szkiełka nakrywkowego, dodając 500 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki. Umieść komórki w inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, aż zbieg komórek osiągnie 60 do 80% w dniu poprzedzającym znakowanie makropinosomów.

Dzień przed znakowaniem makropinosomów zastąp pożywkę w studzienkach 500 mikrolitrami wstępnie podgrzanej pożywki bez surowicy i umieść komórki w inkubatorze na 16 do 24 godzin. W przypadku 96-dołkowej mikropłytki należy rozpocząć od przeniesienia zawiesiny komórek do 25-mililitrowego zbiornika odczynnika. Następnie za pomocą pipety wielokanałowej rozsiewaj 100 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdego dołka czarnej 96-dołkowej mikropłytki przesiewowej o wysokiej zawartości z optycznie przezroczystą cykliczną olefiną lub szklanym dnem.

Inkubuj komórki, aż zbieg komórek osiągnie 60 do 80% w dniu poprzedzającym znakowanie makropinosomów. Dzień przed etykietowaniem makropinosomów usuń i wyrzuć pożywkę z każdej studzienki za pomocą wielokanałowego adaptera aspiracyjnego do standardowych końcówek podłączonych do pompy próżniowej. Alternatywnie można użyć pipety wielokanałowej.

Używając zbiornika na odczynnik i pipety wielokanałowej, delikatnie dodaj 100 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki bez surowicy do każdej studzienki, a następnie umieść komórki w inkubatorze komórkowym na 16 do 24 godzin. W przypadku płytki 24-dołkowej w formacie szkiełka nakrywkowego należy zastąpić pożywkę w studzienkach 200 mikrolitrami pożywki bez surowicy z dekstranem o wysokiej masie cząsteczkowej znakowanym fluoroforem i umieścić komórki w inkubatorze komórkowym na 30 minut. Po inkubacji odessać pożywkę i delikatnie, ale szybko przemyć komórki pięciokrotnie lodowatym PBS za pomocą wstępnie schłodzonej butelki do mycia.

Podczas mycia należy mocno potrząsnąć płytką ręcznie, aby ułatwić usuwanie kruszyw dekstranu, które przyklejają się do szkiełek nakrywkowych. Następnie utrwal komórki, dodając 350 mikrolitrów 3,7% formaldehydu i inkubując przez 20 minut, a następnie odessać roztwór utrwalający i dwukrotnie przemyć komórki PBS. Wybarwić jądra 350 mikrolitrami DAPI w PBS.

Po 20 minutach odessać roztwór DAPI i trzykrotnie przemyć komórki PBS. Izolatory silikonowe należy przykleić obok siebie na szkiełku mikroskopowym, aby uzyskać równomierne odstępy i powtarzalną lokalizację szkiełek nakrywkowych wymaganych do automatyzacji obrazowania. Następnie do każdego szkiełka nakrywkowego dodaj kroplę utwardzającego fluorescencyjnego medium mocującego na szkiełko mikroskopowe w otwartej przestrzeni izolatora.

Podnieś szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszków i usuń nadmiar PBS, delikatnie stukając w bok szkiełek nakrywkowych niestrzępiącą się chusteczką. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe do góry nogami na upuszczeniu nośnika montażowego i delikatnie postukaj w szkiełko nakrywkowe za pomocą zamkniętych kleszczy, aby usunąć pęcherzyki z nośnika montażowego. Przechowuj szkiełka w ciemnym miejscu i pozwól nośnikom montażowym wyschnąć w temperaturze pokojowej, co zwykle zajmuje od 16 do 24 godzin.

Przed obrazowaniem należy zdjąć izolatory ze szkiełka mikroskopowego. Po wyrównaniu szkiełek do temperatury pokojowej wyczyść szkiełka nakrywkowe za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką zwilżonego środkiem do czyszczenia szkła bez amoniaku. Następnie użyj czystego aplikatora z bawełnianą końcówką zwilżonego 70% etanolem, aby wyczyścić szkiełko nakrywkowe i pozostawić je do wyschnięcia.

W przypadku 96-dołkowego formatu mikropłytki, po zaaspirowaniu studzienek, jak wykazano wcześniej, dodać 40 mikrolitrów pożywki bez surowicy z dekstranem o wysokiej masie cząsteczkowej znakowanym fluoroforem do studzienek, a następnie inkubować komórki w inkubatorze komórkowym przez 30 minut. Po inkubacji wyrzucić pożywkę z mikropłytki, ręcznie przesuwając płytkę do góry nogami do pustej pięciolitrowej zlewki, a następnie dwukrotnie przepłukać komórki i mikropłytkę, powoli zanurzając płytkę pionowo pod niewielkim kątem w dwulitrowej zlewce wypełnionej lodowatym PBS, a następnie wyrzucając PBS z mikropłytki, przesuwając płytkę do góry nogami do pięciolitrowej zlewki. Po ostatnim płukaniu PBS utrwal komórki, dodając 100 mikrolitrów 3,7% formaldehydu w PBS do każdej studzienki za pomocą 25-mililitrowego zbiornika na odczynnik i wielokanałowej pipety.

Po 20-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej usunąć roztwór utrwalający i przemyć komórki PBS przy użyciu techniki zanurzania i miażdżenia. Po drugim płukaniu PBS wybarwić jądra 100 mikrolitrami DAPI w PBS na studzienkę. Po 20 minutach przepłucz komórki trzykrotnie lodowatym PBS, jak pokazano wcześniej.

Usuń wszelkie pozostałości PBS, stukając mikropłytką do góry nogami w niestrzępiącą się chusteczkę. Następnie dodaj 100 mikrolitrów świeżego PBS do każdej studzienki za pomocą 25-mililitrowego zbiornika na odczynnik i wielokanałowej pipety. Przed obrazowaniem pozwól płytce zrównoważyć się do temperatury pokojowej, a następnie wytrzyj płytkę do hodowli komórkowej do sucha niestrzępiącą się ściereczką.

Alternatywnie, przechowuj płytkę pod przykryciem z dala od światła w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego tygodnia. W przypadku automatycznego obrazowania makropinosomów utwórz protokół automatyzacji do pozyskiwania obrazów za pomocą obiektywu powietrznego 40X w kanale długości fali fluoroforu dekstranu i DAPI. Następnie zoptymalizuj ustawienia ekspozycji, używając próbki, co do której przewiduje się, że będzie miała najwyższy poziom makropinocytozy, aby uniknąć nadmiernej ekspozycji, która może spowodować nasycenie sygnału i utratę danych o intensywności.

Korzystaj z ustawień ostrości, które łatwo i spójnie lokalizują próbkę, aby uzyskać obrazy o wysokiej jakości. Uzyskaj wiele obrazów w każdym dołku lub szkiełku nakrywkowym, aby uwzględnić zmienność próbki i uzyskać dokładne odwzorowanie próbki. Aby określić indeks makropinocytarny, odejmij tło dla DAPI i odpowiadającego mu obrazu dekstranu, stosując odpowiednią funkcję, często nazywaną funkcją toczącej się kuli.

Dostosuj ustawienia tak, aby szum tła był zminimalizowany z minimalnym lub zerowym efektem odejmowania sygnału DAPI i dekstranu. Następnie, używając pola z wysokim sygnałem dekstranu, określ ustawienia sygnału intensywności, często nazywane funkcją progową, aby wybrać jądra, a następnie określ minimalne ustawienie sygnału intensywności wymagane do wybrania tylko makropinosomów. W przypadku obrazu dekstranu oblicz całkowitą fluorescencję w utworzonym zaznaczeniu makropinosomów lub użyj zaznaczenia, aby określić całkowitą powierzchnię dodatnią dla dekstranu.

W przypadku obrazu DAPI użyj zaznaczenia, aby określić liczbę jąder na obrazie, aby odzwierciedlić liczbę obecnych komórek. Następnie określ indeks makropinocytarny, dzieląc całkowitą fluorescencję lub powierzchnię dekstranu przez liczbę komórek określoną przez DAPI. W komórkach AsPC-1 PDAK dodanie EGF w dawce 100 nanogramów na mililitr przez pięć minut przed dodaniem dekstranu aktywuje makropinocytozę.

Co więcej, autokrynna aktywacja makropinocytozy EGF może być wywołana przez deprywację glutaminy przez 16 do 24 godzin. Komórki MIA PaCa-2 wykazują konstytutywną makropinocytozę, która jest hamowana przez 30-minutową kurację 75 mikromolowym EIPA lub dwugodzinną kurację 10 mikromolowym EHop-016. W eksperymencie z odpowiedzią na dawkę indeks makropinocytarny stopniowo zmniejszał się przy wyższych stężeniach EHop-016 i EIPA, potwierdzając w ten sposób istnienie konstytutywnej makropinocytozy zależnej od Rac1.

Możesz dostosować tę procedurę do oceny makropinocytozy innych fluorescencyjnie znakowanych ładunków, takich jak albumina. Ponadto zaleca się ocenę, czy wychwyt albuminy w makropinocytach przyczynia się do sprawności komórek, wykonując testy żywotności komórek. Technika ta odegrała kluczową rolę w identyfikacji zaopatrzenia w składniki odżywcze makropinocytarów w komórkach nowotworowych i zrębowych, a automatyzacja znacznie zwiększyła nasze możliwości testowania stanu.