Name: Sekwencjonowanie insercji transpozonów jako narzędzie do wyjaśnienia czynników kolonizacji bakteryjnej u mieczyków Burkholderia gladioli z chrząszczami Lagria villosa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Poznaj metodę sekwencjonowania insercji transpozonów do identyfikacji genów niezbędnych dla kolonizacji owadów przez bakterie symbiotyczne Burkholderia gladioli.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Junbeom Lee za dostarczenie szczepu E. coli WM3064+pRL27 do koniugacji i wskazówek w procedurze, Kathrin Hüffmeier za pomoc w rozwiązywaniu problemów podczas tworzenia biblioteki mutantów oraz Prof. André Rodriguesowi za wsparcie w zbieraniu owadów i uzyskiwaniu pozwoleń. Dziękujemy również Rebecce Janke i Dagmar Klebsch za wsparcie w zbieraniu i hodowli owadów. Wyrażamy uznanie dla władz brazylijskich za udzielenie następujących zezwoleń na dostęp, zbieranie i eksport okazów owadów: autoryzacja SISBIO nr 45742-1, 45742-7 i 45742-10, proces CNPq nr 01300.004320/2014-21 i 01300.0013848/2017-33, IBAMA nr 14BR016151DF i 20BR035212/DF). Badania te zostały sfinansowane z grantów badawczych Niemieckiej Fundacji Naukowej (DFG) FL1051/1-1 i KA2846/6-1.

<ol><li>Cain, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+advances+in+transposon-insertion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">A decade of advances in transposon-insertion sequencing.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (9), 526-540 (2020).</li>
<li>Chao, M. C., Abel, S., Davis, B. M., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+and+analysis+of+transposon+insertion+sequencing+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The design and analysis of transposon insertion sequencing experiments.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (2), 119-128 (2016).</li>
<li>Barquist, L., Boinett, C. J., Cain, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+querying+bacterial+genomes+with+transposon-insertion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Approaches to querying bacterial genomes with transposon-insertion sequencing.</a> RNA Biology. 10 (7), 1161-1169 (2013).</li>
<li>Flórez, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic-producing+symbionts+dynamically+transition+between+plant+pathogenicity+and+insect-defensive+mutualism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Antibiotic-producing symbionts dynamically transition between plant pathogenicity and insect-defensive mutualism.</a> Nature Communications. 8 (1), 15172(2017).</li>
<li>Flórez, L. V., Kaltenpoth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiont+dynamics+and+strain+diversity+in+the+defensive+mutualism+between+Lagria+beetles+and+Burkholderia%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Symbiont dynamics and strain diversity in the defensive mutualism between Lagria beetles and Burkholderia.</a> Environmental Microbiology. 19 (9), 3674-3688 (2017).</li>
<li>Flórez, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antifungal+polyketide+associated+with+horizontally+acquired+genes+supports+symbiont-mediated+defense+in+Lagria+villosa+beetles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An antifungal polyketide associated with horizontally acquired genes supports symbiont-mediated defense in Lagria villosa beetles.</a> Nature Communications. 9 (1), 2478(2018).</li>
<li>Andrews, S. FastQC A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2012).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet.journal%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+A+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FeatureCounts%3A+An+efficient+general+purpose+program+for+assigning+sequence+reads+to+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FeatureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.</a> Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>Gaytán, M. O., Martínez-Santos, V. I., Soto, E., González-Pedrajo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+three+secretion+system+in+attaching+and+effacing+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Type three secretion system in attaching and effacing pathogens.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 129(2016).</li>
<li>Hachani, A., Wood, T. E., Filloux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+and+anti-host+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion and anti-host effectors.</a> Current Opinion in Microbiology. 29, 81-93 (2016).</li>
<li>Deep, A., Chaudhary, U., Gupta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing+and+bacterial+pathogenicity%3A+From+molecules+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Physicians%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing and bacterial pathogenicity: From molecules to disease.</a> Journal of Laboratory Physicians. 3 (1), 4-11 (2011).</li>
<li>Silva, A. J., Benitez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+cholerae+biofilms+and+cholera+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Vibrio cholerae biofilms and cholera pathogenesis.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), 0004330(2016).</li>
<li>Navarro-Garcia, F., Ruiz-Perez, F., Cataldi, Á, Larzábal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+system+in+pathogenic+Escherichia+coli%3A+structure%2C+role+in+virulence%2C+and+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion system in pathogenic Escherichia coli: structure, role in virulence, and acquisition.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1965(2019).</li>
<li>Ribet, D., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+bacterial+pathogens+colonize+their+hosts+and+invade+deeper+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues.</a> Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).</li>
<li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burkholderia+Type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Burkholderia Type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathogens. 6 (8), 1001068(2010).</li>
<li>Jones, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kill+and+cure%3A+genomic+phylogeny+and+bioactivity+of+Burkholderia+gladioli+bacteria+capable+of+pathogenic+and+beneficial+lifestyles%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Genomics%22%5BJournal%5D)">Kill and cure: genomic phylogeny and bioactivity of Burkholderia gladioli bacteria capable of pathogenic and beneficial lifestyles.</a> Microbial Genomics. 7 (1), 000515(2021).</li>
<li>Takeshita, K., Kikuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riptortuspedestris+and+Burkholderia+symbiont%3A+an+ideal+model+system+for+insect-microbe+symbiotic+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Riptortuspedestris and Burkholderia symbiont: an ideal model system for insect-microbe symbiotic associations.</a> Research in Microbiology. 168 (3), 175-187 (2017).</li>
<li>Powell, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+screen+identifies+host+colonization+determinants+in+a+bacterial+gut+symbiont%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genome-wide screen identifies host colonization determinants in a bacterial gut symbiont.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (48), 13887-13892 (2016).</li>
<li>Brooks, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+discovery+of+colonization+determinants+in+the+squid+symbiont+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Global discovery of colonization determinants in the squid symbiont Vibrio fischeri.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17284-17289 (2014).</li>
<li>Somprasong, N., McMillan, I., Karkhoff-Schweizer, R. R., Mongkolsuk, S., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+genetic+manipulation+of+Burkholderia+gladioli+pathovar+cocovenenans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Methods for genetic manipulation of Burkholderia gladioli pathovar cocovenenans.</a> BMC Research Notes. 3 (308), (2010).</li>
<li>Garcia, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burkholderia+thailandensis%3A+Genetic+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Burkholderia thailandensis: Genetic manipulation.</a> Current Protocols in Microbiology. 45, 1-15 (2017).</li>
<li>Headd, B., Bradford, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conjugation+window+in+an+Escherichia+coli+K-12+strain+with+an+IncFII+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The conjugation window in an Escherichia coli K-12 strain with an IncFII plasmid.</a> Applied and Environmental Microbiology. 86 (17), 00948(2020).</li>
<li>Van Opijnen, T., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+insertion+sequencing%3A+A+new+tool+for+systems-level+analysis+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transposon insertion sequencing: A new tool for systems-level analysis of microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 435-442 (2013).</li>
<li>Gallagher, L. A., Ramage, E., Patrapuvich, R., Weiss, E., Brittnacher, M., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-defined+transposon+mutant+library+of+Burkholderia+thailandensis%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Sequence-defined transposon mutant library of Burkholderia thailandensis.</a> mBio. 4 (6), 00604-00613 (2013).</li>
<li>Wong, Y. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candidate+essential+genes+in+Burkholderia+cenocepacia+J2315+identified+by+genome-wide+TraDIS%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candidate essential genes in Burkholderia cenocepacia J2315 identified by genome-wide TraDIS.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1288(2016).</li>
<li>Moule, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+saturation+mutagenesis+of+Burkholderia+pseudomallei+K96243+predicts+essential+genes+and+novel+targets+for+antimicrobial+development%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Genome-wide saturation mutagenesis of Burkholderia pseudomallei K96243 predicts essential genes and novel targets for antimicrobial development.</a> mBio. 5 (1), 00926(2014).</li>
<li>Ding, Q., Tan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Himar1+transposon+for+efficient+random+mutagenesis+in+Aggregatibacter+actinomycetemcomitans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Himar1 transposon for efficient random mutagenesis in Aggregatibacter actinomycetemcomitans.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1842(2017).</li>
<li>Green, B., Bouchier, C., Fairhead, C., Craig, N. L., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+site+preference+of+Mu%2C+Tn5%2C+and+Tn7+transposons%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+DNA%22%5BJournal%5D)">Insertion site preference of Mu, Tn5, and Tn7 transposons.</a> Mobile DNA. 3, 3(2012).</li>
<li>Lodge, J. K., Weston-Hafer, K., Berg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+Tn5+target+specificity%3A+Preference+for+insertion+at+G%2FC+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Transposon Tn5 target specificity: Preference for insertion at G/C pairs.</a> Genetics. 120 (3), 645-650 (1988).</li>
<li>Ará Ujo, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequencing+and+transposon+mutagenesis+of+Burkholderia+seminalis+TC3.4.2R3+identify+genes+contributing+to+suppression+of+orchid+necrosis+caused+by+B.+gladioli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-microbe+Interactions%3A+MPMI%22%5BJournal%5D)">Genome sequencing and transposon mutagenesis of Burkholderia seminalis TC3.4.2R3 identify genes contributing to suppression of orchid necrosis caused by B. gladioli.</a> Molecular Plant-microbe Interactions: MPMI. 29 (6), 435-446 (2016).</li>
<li>Dobritsa, A. P., Samadpour, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reclassification+of+Burkholderiainsecticola+as+Caballeroniainsecticola+comb.+nov.+and+reliability+of+conserved+signature+indels+as+molecular+synapomorphies%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Systematic+and+Evolutionary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Reclassification of Burkholderiainsecticola as Caballeroniainsecticola comb. nov. and reliability of conserved signature indels as molecular synapomorphies.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 69 (7), 2057-2063 (2019).</li>
<li>Ohbayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect%27s+intestinal+organ+for+symbiont+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Insect's intestinal organ for symbiont sorting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 5179-5188 (2015).</li>
<li>Ross, C., Scherlach, K., Kloss, F., Hertweck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+conjugated+polyyne+biosynthesis+in+phytopathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of conjugated polyyne biosynthesis in phytopathogenic bacteria.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (30), 7794-7798 (2014).</li>
<li>Atkins, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutant+of+Burkholderia+pseudomallei%2C+auxotrophic+in+the+branched+chain+amino+acid+biosynthetic+pathway%2C+is+attenuated+and+protective+in+a+murine+model+of+melioidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">A mutant of Burkholderia pseudomallei, auxotrophic in the branched chain amino acid biosynthetic pathway, is attenuated and protective in a murine model of melioidosis.</a> Infection and Immunity. 70 (9), 5290-5294 (2002).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów w związku z badaniem.

Stworzono bibliotekę mutantów transpozonów B. gladioli w celu zidentyfikowania ważnych czynników kolonizacji gospodarza w symbiotycznej interakcji między chrząszczami L. villosa a bakteriami B. gladioli . Głównymi etapami protokołu były koniugacja, infekcja gospodarza, przygotowanie biblioteki DNA i sekwencjonowanie.
Ponieważ wiele szczepów Burkholderia jest podatnych na modyfikację genetyczną przez koniugację24,25, plazmid przenoszący transpozon i kasetę inseryjną antybiotyku został pomyślnie sprzężony z docelowym szczepem B. gladioli Lv-StA z E. coli. Poprzednie próby transformacji za pomocą elektroporacji przyniosły bardzo niskie lub prawie żadne transformatory B. gladioli. Wskazane jest zoptymalizowanie techniki transformacji dla organizmu docelowego, aby skutecznie uzyskać dużą liczbę transformantów.
Jedna runda koniugacji i 40 plam koniugacji zakłóciła 3736 genów u B. gladioli Lv-StA. Patrząc z perspektywy czasu, konieczne byłoby przeprowadzenie wielu rund koniugacji, aby zakłócić działanie większości z 7468 genów i uzyskać nasyconą bibliotekę. Warto zauważyć, że czas inkubacji podczas koniugacji nie mógł przekroczyć 12-18 godzin, co jest końcem fazy wykładniczego wzrostu B. gladioli. Dopuszczenie koniugacji poza fazę wykładniczego wzrostu komórek bakteryjnych zmniejsza szanse na powodzenie otrzymania transkoniugantów26. Dlatego okres koniugacji należy dostosować do wzrostu gatunków bakterii.
Aby skutecznie przeprowadzić eksperyment polegający na zakażeniu zmutowanych bibliotek w gospodarzu, ważne jest oszacowanie wielkości wąskiego gardła populacji bakterii podczas kolonizacji oraz różnorodności mutantów w bibliotece przed infekcją 1,2,27. Przygotowując się do eksperymentu, oszacowaliśmy minimalną liczbę chrząszczy, które muszą zostać zainfekowane, aby mieć dużą szansę na pobranie próbki od każdego mutanta w bibliotece i pozwolenie na kolonizację. Obliczono również przybliżony czas generacji bakterii in vivo oraz liczbę pokoleń w czasie trwania eksperymentu. Kultura in vitro została następnie wyhodowana do porównywalnej liczby pokoleń poprzez dostosowanie czasu inkubacji. W przypadku podobnego eksperymentu z infekcją u innych gospodarzy niebędących modelami pożądana jest zdolność do utrzymania kultury laboratoryjnej i stałego źródła organizmów gospodarza.
Po rozroscie biblioteki mutantów in vivo i in vitro oraz pobraniu próbek, przeprowadzono zmodyfikowany protokół przygotowania biblioteki DNA do sekwencjonowania insercji transpozonów. Modyfikacja protokołu polegała na zaprojektowaniu niestandardowych starterów PCR i dodaniu etapów PCR w celu wybrania fragmentów DNA zawierających kasetę insercji. Ponieważ protokół został dostosowany, dodatkowe cykle PCR w protokole zwiększały ryzyko nadmiernego wzmocnienia i uzyskania hybrydyzowanych fragmentów adapter-adapter w bibliotekach końcowych. W związku z tym zalecany jest końcowy etap czyszczenia (bez wyboru rozmiaru) po dwóch PCR, ponieważ pomaga to w usunięciu tych fragmentów. Rozkład wielkości bibliotek DNA był nadal szerszy niż oczekiwano. Jednak zwiększenie głębokości sekwencjonowania zapewniło wystarczającą ilość danych, które zostały przefiltrowane podczas analizy bioinformatycznej, uzyskując zadowalające wyniki.
Ponieważ mutageneza za pośrednictwem transpozonów generuje tysiące losowych insercji w jednym eksperymencie, możliwe jest wygenerowanie nasyconej biblioteki mutantów, która zawiera wszystkie z wyjątkiem tych mutantów, w których geny niezbędne do wzrostu bakterii zostały zakłócone. Najprawdopodobniej nie pracowaliśmy z nasyconą biblioteką mutantów, biorąc pod uwagę szacunki dotyczące niezbędnych genów w innych badaniach nad Burkholderia sp.Rozdział 28,29. Nienasycona biblioteka pomaga jednak w odkrywaniu różnych genów kandydujących do dalszych badań z wykorzystaniem ukierunkowanej mutagenezy. Przed eksperymentami należy również pamiętać, że niektóre transpozony mają specyficzne miejsca docelowe insercji, które zwiększają liczebność mutantów w określonych loci w genomie30. Wiadomo, że transpozony Marinera celują w miejsca INSERCJI31, a transpozony Tn5 mają odchylenie GC32,33. Uwzględnienie kroków podczas analizy bioinformatycznej w celu rozpoznania gorących punktów dla insercji transpozonów pomoże w ocenie wszelkich odchyleń rozkładu.
Chociaż podatny na niepowodzenia, dobrze zaprojektowany eksperyment sekwencjonowania insercji transpozonów może być potężnym narzędziem do identyfikacji wielu warunkowo ważnych genów u bakterii w jednym eksperymencie. Na przykład tuzin genów u Burkholderia seminalis ważnych dla tłumienia nekrozy liści storczyków zidentyfikowano poprzez połączenie mutagenezy transpozonów i genomiki34. Poza Burkholderia, kilka genów adhezji i ruchliwości oraz transporterów zostało zidentyfikowanych jako ważne czynniki kolonizacji w symbiontach Snodgrassella alvi Apis mellifera (pszczoła miodna)22 oraz w symbiontach Vibrio fischerii Euprymna scolopes (kałamarnica hawajska)23 przy użyciu podejścia mutagenezy transpozonowo-insercyjnej.
Alternatywnym podejściem jest mutageneza transpozonów, po której można przeprowadzić badania przesiewowe w kierunku poszczególnych mutantów przy użyciu pożywek selektywnych zamiast sekwencjonowania. Możliwe są fenotypowe badania przesiewowe lub testy biologiczne w celu zidentyfikowania niedoborów, takich jak ruchliwość, produkcja bioaktywnych metabolitów wtórnych lub specyficzne auksotrofie. Na przykład, badania przesiewowe biblioteki transpozonów Burkholderia insecticola (przypisanej do rodzaju Caballeronia35) były kluczowe w ustaleniu, że symbionty wykorzystują geny ruchliwości do kolonizacji Riptortus pedestris, ich owadziego żywiciela36. Ponadto, korzystając z mutagenezy transpozonów i fenotypowych badań przesiewowych, zidentyfikowano klaster genów biosyntetycznych dla bioaktywnego metabolitu wtórnego karioynyny w Burkholderia caryophylli37. Auksotroficzny mutant Burkholderia pseudomallei został zidentyfikowany po mutagenezie transpozonów i badaniach przesiewowych i jest możliwym atenuowanym kandydatem na szczepionkę przeciwko melioidozie, niebezpiecznej chorobie u ludzi i zwierząt38. W związku z tym mutageneza i sekwencjonowanie transpozonów jest cennym podejściem do badania cech molekularnych bakterii, które są ważne dla interakcji z odpowiednimi gospodarzami w asocjacjach patogennych lub mutualistycznych.

Mieczyki Burkholderia mogą angażować się w symbiozę z chrząszczami Lagria villosa, odgrywając ważną rolę w obronie przed mikrobiologicznymi antagonistami owada gospodarza4,5,6. Samice chrząszczy zawierają kilka szczepów B. gladioli w wyspecjalizowanych gruczołach pomocniczych do układu rozrodczego. Po złożeniu jaj samice rozmazują komórki B. gladioli na powierzchni jaja, gdzie związki przeciwdrobnoustrojowe wytwarzane przez B. gladioli hamują infekcje grzybami entomopatogenicznymi4,6. W późnym rozwoju embrionalnym lub wcześnie po wykluciu się larw bakterie kolonizują wgłębienia kutykularne na grzbietowej powierzchni larw. Pomimo tej wyspecjalizowanej lokalizacji i pionowej drogi transmisji symbiontów, L. villosa może przypuszczalnie również pozyskiwać B. gladioli poziomo ze środowiska4. Ponadto znaleziono co najmniej trzy szczepy B. gladioli w związku z L. villosa4,6. Wśród nich B. gladioli Lv-StA jest jedynym, który nadaje się do uprawy in vitro.
B. gladioli Lv-StA ma rozmiar genomu 8,56 Mb6 i zawiera 7 468 genów. Które z tych genów są ważne dla bakterii B. gladioli do kolonizacji gospodarza chrząszcza? Aby odpowiedzieć na to pytanie, użyliśmy sekwencjonowania transpozonowo-inserekcyjnego (Tn-seq), metody eksploracyjnej do identyfikacji warunkowo niezbędnych genów drobnoustrojów1,2,3. Zmutowana biblioteka B. gladioli Lv-StA została stworzona przy użyciu transpozonu Tn5. Poprzez koniugację komórek dawcy Escherichia coli z B. gladioli Lv-StA, przeniesiono plazmid pRL27 przenoszący transpozon Tn5 i kasetę oporności na antybiotyki otoczoną odwróconymi powtórzeniami (<silna klasa = "xfig">Figura 1). W ten sposób wygenerowano zestaw mutantów, które indywidualnie przenoszą zakłócenia 3 736 genów symbiont (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).
Pula mutantów została zainfekowana na jajach chrząszczy w celu zidentyfikowania czynników kolonizacji i, jako kontrola, była również hodowana in vitro na pożywce King's B (KB). Po zapewnieniu wystarczającej ilości czasu na kolonizację, wyklute larwy zebrano i zebrano w celu ekstrakcji DNA. Fragmenty DNA zawierające wstawkę transpozonu i flankujący region genomowy B. gladioli Lv-StA wybrano przy użyciu zmodyfikowanego protokołu przygotowania biblioteki DNA do sekwencjonowania. Przetwarzanie jakości odczytu, a następnie analizę za pomocą DESeq2 przeprowadzono w celu zidentyfikowania określonych genów kluczowych dla B. gladioli Lv-StA do kolonizacji larw L. villosa po przeniesieniu przez powierzchnię jaja.

<table><tbody><tr><td>2,6- Kwas diaminopimeliczny</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22391</td><td>Dla E.coli WM3064+ pRL27</td></tr><tr><td>Agar - Agar</td><td>Roth</td><td>5210</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki AMPure XP (kulki makrantowe + glikol polietylenowy + sole)</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Wybór rozmiaru w kroku 6.6</td></tr><tr><td>Wybielacz (NaOCl) 12%</td><td>Roth</td><td>9062</td><td></td></tr><tr><td>Bowtie2 v.2.4.2</td><td></td><td></td><td>Bioinfromatyczne narzędzie do mapowania odczytu. Odnośnik 10 w głównym rękopisie.</td></tr><tr><td>Buffer-S</td><td>Peqlab</td><td>PEQL01-1020</td><td>Do PCR</td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>Sarstedt</td><td>83.1830</td><td></td></tr><tr><td>Cutadapt v.2.10</td><td></td><td></td><td>Narzędzie bioinformatyczne do usuwania określonych sekwencji adapterów z odczytów. Odnośnik 8 w głównym rękopisie.</td></tr><tr><td>Pakiet DESeq2</td><td></td><td></td><td>RStudio do oceny zróżnicowanej liczebności mutantów. Zwykle używany do analizy RNAseq. Odnośnik 12 w głównym rękopisie.</td></tr><tr><td>Drabinka DNA 100 pz</td><td>Roth</td><td>T834.1</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Life Technology</td><td>R0182</td><td>PCR do potwierdzenia sukcesu koniugacji</td></tr><tr><td>EDTA, sól di-sodowa</td><td>Roth</td><td>8043</td><td></td></tr><tr><td>Epicentre MasterPure Kompletny zestaw do oczyszczania DNA i RNA</td><td>Lucigen</td><td>MC85200</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Roth</td><td>2218.1</td><td></td></tr><tr><td>FastQC v.0.11.8</td><td></td><td></td><td>Narzędzie bioinformatyczne do oceny jakości danych sekwencjonowania. Odnośnik 7 w głównym rękopisie.</td></tr><tr><td>FeatureCounts v.2.0.1</td><td></td><td></td><td>Narzędzie bioinformatyczne do uzyskiwania liczby odczytów na cechę genomową. Odnośnik 11 w głównym rękopisie.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Roth</td><td>7530</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Roth</td><td>P749</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan kanamycyny</td><td>Serva</td><td>26899</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>4936</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Roth</td><td>PO27</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Roth</td><td>P030</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (zestaw starterów indeksu 1)</td><td>New England Biolabs</td><td>E7335S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II zestaw do przygotowania biblioteki DNA dla Illumina</td><td>New England Biolabs</td><td>E7645S</td><td></td></tr><tr><td>Pepton (soja)</td><td>Roth</td><td>2365</td><td>Dla Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium</td></tr><tr><td>peqGOLD 'Hot' Taq- DNA Polimeraza DNA</td><td>VWR</td><td>PEQL01-1020</td><td>do potwierdzania powodzenia koniugacji</td></tr><tr><td>Płytki Petriego - 145 x 20 mm</td><td>Roth</td><td>XH90.1</td><td>Do selekcji transkoniugantów</td></tr><tr><td>Płytki Petriego - 90 x 16 mm</td><td>Roth</td><td>N221.2</td><td></td></tr><tr><td>Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Niemcy)Kontrola</td><td></td><td></td> <td>jakości po przygotowaniu biblioteki DNA</td></tr><tr><td>Koraliki streptawidyny</td><td>Roth</td><td>HP57.1</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Taq</td><td>VWR</td><td>01-1020</td><td></td></tr><tr><td>Trimmomatic v.0.36</td><td></td><td></td><td>Bioinformatyczne narzędzie do przycinania odczytów o niskiej jakości, a także sekwencji adapterów. Odnośnik 9 w głównym rękopisie.</td></tr><tr><td>Tris -HCl</td><td>Roth</td><td>9090.1</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Roth</td><td>2366</td><td>Dla Escherichia coli WM3064+pRL27 LB medium</td></tr><tr><td>Ultrasonograf</td><td>Bandelin</td><td>GM 70 HD</td><td>Do ścinania</td></tr><tr><td>enzymu USER (glikozylaza DNA uracylu + glikozylaza DNA - liaza Endonukleaza VIII)</td> <td>New England Biolabs</td><td>E7645S</td><td>Etap ligacji 6.5.2</td></tr><tr><td>Ekstrakt</td> <td>drożdżowyRoth</td><td>2363</td><td></td></tr></tbody></table> powiedział:

sekwencjonowanie insercji transpozonów jako narzędzie do wyjaśnienia czynników kolonizacji bakteryjnej u mieczyków burkholderia gladioli z chrząszczami lagria villosa

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Wnioskowanie o funkcji genów poprzez manipulowanie ich aktywnością jest niezbędnym narzędziem do zrozumienia genetycznych podstaw większości procesów biologicznych. Postępy w mikrobiologii molekularnej doprowadziły do pojawienia się różnych technik mutagenezy do manipulacji genami. Wśród nich sekwencjonowanie transpozonowo-insercyjne (Tn-seq) jest cennym narzędziem do jednoczesnej oceny funkcjonalności wielu genów kandydujących w sposób nieukierunkowany. Technika ta odegrała kluczową rolę w zidentyfikowaniu mechanizmów molekularnych kolonizacji gospodarzy eukariotycznych w kilku drobnoustrojach chorobotwórczych i kilku pożytecznych symbiontach.
Tutaj Tn-seq jest ustanawiany jako metoda identyfikacji czynników kolonizacyjnych u mutualistycznego symbionta Burkholderia gladioli chrząszcza Lagria villosa. Przez koniugację, insercja transpozonu Tn5 kasety opornej na antybiotyki jest przeprowadzana w losowych lokalizacjach genomu u B. gladioli. Aby zidentyfikować wpływ zakłóceń genów na zdolność bakterii do kolonizacji gospodarza chrząszcza, wygenerowaną bibliotekę transpozonów B. gladioli zaszczepia się jaja chrząszczy, podczas gdy kontrolę hoduje się in vitro w płynnej pożywce hodowlanej. Po zapewnieniu wystarczającej ilości czasu na kolonizację, DNA jest ekstrahowane z bibliotek hodowanych in vivo i in vitro. Zgodnie z protokołem przygotowania biblioteki DNA, próbki DNA są przygotowywane do sekwencjonowania transpozonowo-insercyjnego. Fragmenty DNA, które zawierają krawędź wstawki transpozonu i flankujące DNA bakteryjne, są wybierane, a miejsca mutacji są określane przez sekwencjonowanie z dala od krawędzi wstawki transpozonu. Wreszcie, analizując i porównując częstości występowania każdego mutanta w bibliotekach in vivo i in vitro, można przewidzieć znaczenie określonych genów symbiontów podczas kolonizacji chrząszczy.

Bakterie związane z gospodarzem mogą wykorzystywać szereg czynników w celu ustanowienia asocjacji, w tym te pośredniczące w adhezji, motylości, chemotaksji, odpowiedziach stresowych lub specyficzne transportery. Choć w przypadku wielu bakterii13,14,15,16,17,18, w tym przedstawicieli rodzaju Burkholderia19,20, opisano czynniki istotne dla oddziaływań patogen-gospodarz, znacznie mniej badań poświęcono molekularnym mechanizmom wykorzystywanym przez korzystne symbionty do kolonizacji21,22,23. Wykorzystując sekwencjonowanie insercji transpozonowych, postawiono sobie za cel zidentyfikowanie czynników molekularnych, które umożliwiają B. gladioli kolonizację chrząszczy L. villosa.
Mutagenezę za pośrednictwem transpozonu przeprowadzono przy użyciu plazmidu pRL27, który niesie transpozon Tn5 oraz kasetę oporności na kanamycynę flankowaną miejscami powtórzeń odwróconych. Plazmid wprowadzono do docelowych komórek B. gladioli Lv-StA poprzez koniugację ze szczepem donora plazmidu E. coli WM3064 (jak pokazano na Rysunku 1). Po koniugacji mieszaninę koniugacyjną zawierającą komórki biorcy B. gladioli oraz donora E. coli wysiano na selektywne płytki agarowe z dodatkiem kanamycyny. Brak DAP na płytkach wyeliminował komórki donora E. coli , a obecność kanamycyny pozwoliła na wyselekcjonowanie udanych transkonjugantów B. gladioli Lv-StA. Połączona biblioteka mutantów B. gladioli Lv-StA, otrzymana z zebrania 100 000 kolonii transkonjugantów, została przygotowana do sekwencjonowania przy użyciu zmodyfikowanego zestawu do przygotowania biblioteki DNA i specjalnie zaprojektowanych starterów. Rysunek 2 przedstawia etapy przygotowania biblioteki DNA. Sekwencjonowanie dostarczyło 4 Mio odczytów sparowanych; zakłócono działanie 3 736 genów z 7 468 genów w B. gladioli Lv-StA.
Aby zidentyfikować mutanty z defektem kolonizacji gospodarza, B. gladioli Bibliotekę mutantów Lv-StA zainfekowano w jajach chrząszcza i poddano hodowli. in vitro w podłożu KB jako kontrolę. in vivo przed eksperymentem obliczono wielkość wąskiego gardła kolonizacji. Znana liczba B. gladioli Komórki Lv-StA zainfekowano w jajach chrząszcza, a liczbę kolonizujących komórek w nowo wyklutych larwach pierwszego stadium uzyskano poprzez wysiewanie zawiesiny z każdej larwy i liczenie jednostek tworzących kolonie na osobnika. Obliczenia te przeprowadzono w celu upewnienia się, że liczba kolonizujących komórek jest wystarczająca do oceny zdolności do kolonizacji gospodarza dla wszystkich lub wysokiego odsetka mutantów w bibliotece. Dodatkowo, czas wzrostu pomiędzy in vitro i in vivo warunki znormalizowano w oparciu o liczbę generacji bakterii, aby uczynić te próbki porównywalnymi.
Po wykluciu się jaj zebrano 1296 larw, które podzielono na 13 pul. Odpowiadające im in vitro hodowle mutantów namnożono i przechowywano jako zapasy w glicerolu. DNA z tych in vivo i in vitro wyhodowane biblioteki mutantów wyekstrahowano i pofragmentowano w sonikatorze ultradźwiękowym. Rycina 3 przedstawia rozkład wielkości fragmentów ścinanego DNA, w którym większość fragmentów mieści się w przedziale od 100 do 400 bp, zgodnie z oczekiwaniami. Następnie zastosowano zmodyfikowany protokół przygotowania biblioteki DNA do sekwencjonowania. Na każdym etapie protokołu sprawdzano stężenie pozostałego DNA, aby upewnić się, że poszczególne kroki zostały wykonane prawidłowo oraz aby monitorować straty DNA. Kontrola jakości (patrz: w Tabela materiałów) przed sekwencjonowaniem wykazało, że biblioteki DNA zawierały niespodziewanie duże (&gt;fragmenty DNA (800 bp), co było bardziej wyraźne w in vivo biblioteki. Ze względu na trudności w optymalizacji klastrowania fragmentów w kanałach sekwencjonowania, konieczne było zwiększenie głębokości sekwencjonowania do 10 mln odczytów sparowanych w in vivo biblioteki w celu uzyskania pożądanej liczby odczytów. Analiza wyników sekwencjonowania wykazała, że średnio 4 mln odczytów w in vivo biblioteki oraz 3,1 mln odczytów w in vitro biblioteki zawierały krawędź transpozonu na końcu 5' Read-1 (Tabela 9), co było satysfakcjonujące w tym eksperymencie. Rozkład 24 224 unikalnych insercji w obrębie B. gladioli genom w oryginalnej bibliotece pokazano w Rycina 4Analiza przeprowadzona przy użyciu oprogramowania DESeq2 wykazała, że liczebność 271 mutantów różniła się istotnie pomiędzy in vivo i in vitro warunki
<img alt="Wyniki elektroforezy żelowej; rozdział prążków DNA; drabinka, 100-1000 bp; analiza molekularna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62843/62843fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3Żele agarozowe mutanta i bibliotek DNA. (A) Żel agarozowy z niefragmentowanym DNA mutanta w ścieżce x oraz drabiną 1 kbp dla skali. (B) Żel z biblioteką fragmentowanego DNA. Wielkości prążków drabinki w pierwszej ścieżce są wskazane po lewej stronie. Pierwsze trzy ścieżki a, b i c zawierają fragmenty fragmentowanego DNA o in vivo biblioteki. Ścieżki d, e, f i g zawierają fragmenty pociętego DNA z in vitro biblioteki <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62843/62843fig03large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykres pokrycia sekwencjonowania genomowego; analiza sekwencji, dane porównawcze dla chromosomów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62843/62843fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Lokalizacja unikalnych miejsc insercji w oryginalnej bibliotece w obrębie czterech replikonów w genomie Burkholderia gladioli Lv-StA. Każdy słupek wzdłuż osi x znajduje się w miejscu insercji. Wysokość słupka wzdłuż osi y odpowiada liczbie odczytów przypisanych do tego miejsca. Należy zauważyć, że dwa chromosomy i dwa plazmidy są przedstawione w pełnej długości, a zatem mają różne skale na osi x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62843/62843fig04large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">podłoże/agar King’s B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepton (sojowy)</td>
			<td>20 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>1,5 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO₄4.7H2O</td>
			<td>1,5 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>15 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Rozpuszczone w wodzie destylowanej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">podłoże/agar LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptona</td>
			<td>10 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ekstrakt drożdżowy</td>
			<td>5 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>10 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Rozpuszczone w wodzie destylowanej</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Składniki pożywek.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nie.</td>
			<td>Startery</td>
			<td colspan="2">Sekwencja</td>
			<td>Temperatura przyłączania starterów w PCR (°C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>tpnRL17–1RC</td>
			<td colspan="2">5’-CGTTACATCCCTGGCTTGTT-3’</td>
			<td rowspan="2">58.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>tpnRL13–2RC</td>
			<td colspan="2">5’-TCGTGAAGAAGGTGTTGCTG-3’</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Primery do potwierdzenia sukcesu konjugacji.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponent</td>
			<td>Objętość (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>woda oczyszczona do HPLC</td>
			<td>4.92</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor S 10x (wysoka specyficzność)</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (25 mM)</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP (2 mM)</td>
			<td>1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starter 1 (10 pmol/µL)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starter 2 (10 pmol/µL)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq (5 J/µL)</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Całkowita objętość mastermixu</td>
			<td>9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szablon</td>
			<td>1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Mieszanina PCR (master mix) do potwierdzenia sukcesu koniugacji. Skróty: HPLC = wysokosprawna chromatografia cieczowa; dNTPs = odwrotny nukleozydotrifosforan.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kroki</td>
			<td>Temperatura °C</td>
			<td>Czas</td>
			<td>Cykle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denaturacja początkowa</td>
			<td>95</td>
			<td>3 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denaturacja</td>
			<td>95</td>
			<td>40 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wyżarzanie</td>
			<td>58.2</td>
			<td>40 s</td>
			<td>30 do 35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozszerzenie</td>
			<td>72</td>
			<td>1-2 min</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ostateczne przedłużenie</td>
			<td>72</td>
			<td>4 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przytrzymać</td>
			<td>4</td>
			<td colspan="2">∞</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Warunki PCR w celu potwierdzenia sukcesu konjugacji.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Startery</td>
			<td colspan="2">Sekwencja</td>
			<td>Tm °C</td>
			<td>Zastosowanie</td>
			<td>Proszę o podanie tekstu źródłowego do tłumaczenia.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotynilowany starter specyficzny dla transpozonu</td>
			<td colspan="2">5’-Biotyna-ACAGGAACACTTAACGGCTGACATG 
			-3’</td>
			<td>63.5</td>
			<td>6.7.1. PCR I</td>
			<td>Niestandardowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zmodyfikowana uniwersalna starter PCR</td>
			<td colspan="2">5’- AATGATACGGCGACCACCGAGATC 
			TACACTCTTTCCCTACACGACGCTC 
			TTCCGATCTGAATTCATCGATGAT 
			GGTTGAGATGTGT – 3’</td>
			<td>62</td>
			<td>6.10.1. PCR II</td>
			<td>Niestandardowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starter indeksowy</td>
			<td colspan="3">Należy zapoznać się z instrukcją producenta</td>
			<td>6.7.1. PCR I &amp; 6.10.1. PCR II</td>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Zestaw starterów indeksujących 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter</td>
			<td colspan="3">Należy zapoznać się z instrukcją producenta</td>
			<td>6.5. Ligacja adapterów</td>
			<td>Zestaw do przygotowania bibliotek DNA NEBNext Ultra II dla systemu Illumina</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 5: Primery i adapter dla PCR I i II podczas przygotowania biblioteki DNA. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>mieszanina PCR</td>
			<td>(µL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragmenty DNA z przyligowanymi adapterami</td>
			<td>15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mieszanka master mix NEBNext Ultra II Q5</td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starter indeksujący (10 pmol/ µL)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specyficzna biotynilowana starter do transpozonu (10 pmol/ µL)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość całkowita</td>
			<td>50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 6: Przygotowanie biblioteki DNA-mieszanina PCR I master mix.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Etapy</td>
			<td >Temperatura</td>
			<td >Czas</td>
			<td >Cykle</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Denaturacja wstępna</td>
			<td >98 °C</td>
			<td >30 s</td>
			<td >1</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Denaturacja</td>
			<td >98 °C</td>
			<td >10 s</td>
			<td rowspan="3">6 do 12</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Przyłączanie (annealing)</td>
			<td >65 °C</td>
			<td >30 s</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Elongacja</td>
			<td >72 °C</td>
			<td >30 s</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Elongacja końcowa</td>
			<td >72 °C</td>
			<td >2 min</td>
			<td >1</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Przechowywanie</td>
			<td >16 °C</td>
			<td colspan="2">∞</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 7: Przygotowanie biblioteki DNA-warunki PCR I i II.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>mieszanina PCR</td>
			<td>(µL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA wyselekcjonowane za pomocą kulek</td>
			<td>15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II Q5 master mix</td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starter indeksujący</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modyfikowany uniwersalny starter PCR</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość całkowita</td>
			<td>50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 8: Przygotowanie biblioteki DNA-mieszanina PCR II master mix.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Biblioteki</td>
			<td>In vivo-1</td>
			<td>In vivo-2</td>
			<td>Invivo-3</td>
			<td>In vitro-1</td>
			<td>In vitro-2</td>
			<td>In vitro-3</td>
			<td>Biblioteka oryginalna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Liczba odczytów (PE)</td>
			<td>56,57,710</td>
			<td>39,19,051</td>
			<td>30,65,849</td>
			<td>35,73,494</td>
			<td>28,83,440</td>
			<td>36,61,956</td>
			<td>46,09,410</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Liczba odczytów zawierających krawędź Tn na końcu 5’ Read-1</td>
			<td>54,15,880</td>
			<td>37,31,169</td>
			<td>29,36,247</td>
			<td>33,00,499</td>
			<td>27,35,705</td>
			<td>33,50,402</td>
			<td>41,53,270</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ogólny wskaźnik dopasowania Bowtie2 (%) (tylko Read-1)</td>
			<td>95.53%</td>
			<td>83.71%</td>
			<td>89.87%</td>
			<td>80.79%</td>
			<td>78.00%</td>
			<td>73.06%</td>
			<td>74.92%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Liczba unikalnych insercji</td>
			<td>8,539</td>
			<td>4,134</td>
			<td>7,183</td>
			<td>18,930</td>
			<td>18,421</td>
			<td>20,438</td>
			<td>24,224</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Liczba trafionych genów</td>
			<td>1575</td>
			<td>993</td>
			<td>1450</td>
			<td>2793</td>
			<td>2597</td>
			<td>3037</td>
			<td>3736</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 9: Podsumowanie wyników sekwencjonowania i częstotliwości insercji transpozonów dla każdej biblioteki. Skrót: PE = paired-end.

To jest dostosowana metoda identyfikacji potencjalnych czynników kolonizacji owadów w korzystnym symbiontie Burkholderia. Gospodarz chrząszcza jest zainfekowany losową zmutowaną biblioteką wygenerowaną przez mutagenezę transpozonów, a złożoność biblioteki po kolonizacji jest porównywana z kontrolą wyhodowaną in vitro.

Sekwencjonowanie insercji transpozonów jako narzędzie do wyjaśnienia czynników kolonizacji bakteryjnej u mieczyków Burkholderia gladioli z chrząszczami Lagria villosa

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological ...

Protokół ten jest przydatny do przeprowadzania manipulacji genetycznych na bakteriach symbiotycznych, w tym przypadku w szczególności na Burkholderia, i identyfikacji genów niezbędnych do kolonizacji owadziego gospodarza. Sekwencjonowanie insercji transpozonów jest potężnym narzędziem do jednoczesnej identyfikacji dużej liczby warunkowo istotnych genów w jednym eksperymencie. Zacznij od zaszczepienia świeżej kultury dawcy dawcy E. coli w 10 mililitrach pożywki LB uzupełnionej kanamycyną i DAP pod sterylnym kapturem.Zaszczepić komórki biorcze szczepu Burkholderia gladioli A w pięciu mililitrach pożywki KB. Inkubuj kultury w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc na wytrząsarce z prędkością 250 obr./min. Po nocnym wzroście odwirować cztery mililitry każdej z kultur w temperaturze 9 600 razy G przez sześć minut, aby osadzać komórki i wyrzucić supernatant.Pod sterylnym kapturem umyj granulowane kultury komórkowe w pożywce KB zawierającej DAP. I na koniec ponownie zawieś kultury osobno w czterech mililitrach KB plus pożywka DAP. W świeżej 15-mililitrowej probówce wymieszaj 250 mikrolitrów umytych komórek dawcy E. coli z jednym mililitrem umytych komórek biorczych szczepu A mieczyków Burkholderia.Umieść 10 mikrolitrów tej mieszaniny komórek koniugacyjnych na płytkach agarowych KB zawierających DAP. Pozostawić płytkę w spokoju w sterylnym kapturze w temperaturze pokojowej na jedną godzinę. Inkubować płytki z plamkami koniugacji w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 12 do 18 godzin.Po inkubacji dodaj od dwóch do czterech mililitrów 1X PBS na płytki pod sterylnym kapturem i użyj skrobaka do komórek, aby uwolnić wyhodowane plamy koniugacji bakterii z agaru. Następnie pipetować sprzężoną komórkę do dwóch mililitrowych probówek do mikrofuge. Granulować komórki, wirując w temperaturze 9 600 razy G przez dwie minuty.Wyrzucić supernatant i przemyć osad dwukrotnie w jednym mililitrze 1X PBS, pipetując w górę iw dół. Zawiesić ostatnią osadkę w 1 200 mikrolitrach 1X PBS. Dobrze wymieszaj i rozprowadź 100 mikrolitrów mieszaniny komórek na dużych płytkach agarowych KB uzupełnionych kanamycyną i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc.Policz całkowitą liczbę kolonii transkoniugantów na trzech płytkach i ekstrapoluj, aby obliczyć przybliżoną liczbę mutantów uzyskanych na wszystkich płytkach. Aby zwiększyć szanse na uzyskanie reprezentatywnej biblioteki, upewnij się, że całkowita liczba kolonii jest kilkakrotnie wyższa niż całkowita liczba genów w genomie. Aby potwierdzić powodzenie koniugacji, należy przeprowadzić PCR ukierunkowany na kasetę inseryjną przy użyciu od 10 do 20 kolonii próbek, jak opisano w manuskrypcie.Pod sterylnym kapturem zeskrob kolonie z płytek, dodając od jednego do dwóch mililitrów 1X PBS na agare. Połącz mieszaninę komórek zeskrobaną z płytek do 50-mililitrowych probówek. Wiruj bibliotekę, aby dokładnie wymieszać, a następnie podziel jeden mililitr połączonej biblioteki mutantów na kilka probówek kriogenicznych.Dodaj jeden mililitr 70% glicerolu do probówek i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Wybierz lęg jaj L.villosa i policz liczbę jaj kontynuujących, jeśli lęg zawiera więcej niż 100 jaj. Aby wysterylizować całe jajożerce, dodaj 200 mikrolitrów 70% etanolu i delikatnie myj jajka przez pięć minut, a następnie usuń etanol i umyj jajka dwukrotnie wodą z autoklawu.Dodaj 200 mikrolitrów 12% wybielacza i delikatnie myj jajka przez 30 sekund. Natychmiast usuń wybielacz i ponownie umyj jajka trzy razy 200 mikrolitrami autoklawowanej wody. Zainfekuj jaja w wysterylizowanym lęgu jaj za pomocą dwa razy 10 do sześciu komórek na mikrolitr umytej biblioteki mutantów w PBS.Dwa dni po wykluciu się zainfekowanych larw chrząszczy zbierz 100 larw drugiego stadium w 1,5 mililitrowej probówce do mikrokrów i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby wygenerować bibliotekę kontrolną in vitro, zaszczepij 250 mikrolitrów dwa razy 10 do sześciu komórek na mikrolitr biblioteki mutantów w 10 mililitrach pożywki KB zawierającej kanamycynę. Po wyekstrahowaniu DNA z bibliotek mutantów hodowanych in vivo i in vitro, należy udostępnić DNA ultradźwiękom.Aby sprawdzić, czy DNA zostało ścięte do pożądanego zakresu rozmiarów, załaduj pięć mikrolitrów nieściętego i ściętego DNA po zmieszaniu z barwnikiem ładującym żel w stosunku jeden do jednego w 1,6% żelu agarozowym przy napięciu 250 woltów przez 40 minut. Aby przygotować końce fragmentów wymagane do ligacji adapterowej, należy rozpocząć od dodania trzech mikrolitrów mieszaniny enzymów i siedmiu mikrolitrów buforu reakcyjnego do 50 mikrolitrów ściętego DNA i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Ustaw termocykler z podgrzewaną pokrywką na temperaturę większą lub równą 75 stopni Celsjusza i inkubuj próbki przez 30 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza i 30 minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza, a następnie utrzymuj temperaturę na poziomie czterech stopni Celsjusza.W przypadku podwiązania adaptera dodaj 30 mikrolitrów głównej mieszanki podwiązania, jeden mikrolitr wzmacniacza ligacji i 2,5 mikrolitra rozcieńczonego adaptera do produktów na końcowym etapie przygotowania. Dokładnie wymieszać pipetując i inkubować próbkę przez 15 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza w termocyklerze bez podgrzewanej pokrywy. Po 15 minutach dodaj trzy mikrolitry enzymu.Dobrze wymieszać pipetując i inkubować próbkę przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w termocyklerze z pokrywką podgrzaną do temperatury większej lub równej 47 stopni Celsjusza. Aby wybrać rozmiar zligowanego DNA ukierunkowanego na fragmenty 250 par zasad, zacznij od wirowania roztworu kulek magnetycznych i umieść go w temperaturze pokojowej na 30 minut przed użyciem. Dodaj 0,3 razy kulki do 96,5 mikrolitra mieszaniny ligowanego DNA i wymieszaj, dokładnie pipetując.Inkubuj mieszaninę kulek przez pięć minut. Umieść probówki na stojaku magnetycznym, aby ściągnąć koraliki i usunąć fragmenty DNA o niepożądanych rozmiarach. Pozwól kulkom osiąść przez pięć minut, a następnie przenieś przezroczysty supernatant do nowej probówki do mikrodmuchowania.Dodać 0,15 razy świeże kulki do supernatantu i dobrze wymieszać, pipetując. Inkubuj mieszaninę kulek przez pięć minut, a następnie umieść probówki na stojaku magnetycznym, aby ściągnąć w dół kulki związane z docelowym DNA. Odczekaj pięć minut, a następnie wyrzuć supernatant, zachowując kulki.Z koralikami na stojaku magnetycznym dodaj 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego 80% etanolu i odczekaj 30 sekund przed wyrzuceniem etanolu bez naruszania kulek. Wyjmij probówki ze stojaka i dodaj 17 mikrolitrów 0,1X TE lub Low TE, a następnie wymieszaj pipetując 10 razy i inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Umieść probówkę na podstawce magnetycznej i weź 15 mikrolitrów DNA o wybranej wielkości do PCR-1.Zwiruj kulki streptawidyny i umieść je w temperaturze pokojowej na co najmniej 30 minut. Weź 32 mikrolitry kulek i umyj je 500 mikrolitrami buforu 1X do wiązania i mycia. Dodaj 32 mikrolitry buforu 2X bind and wash i ponownie zawieś kulki.Do tego dodaj 32 mikrolitry oczyszczonych produktów PCR-1. Dokładnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Umieść mieszaninę DNA z kulkami na stojaku magnetycznym na dwie minuty.Odpipetować supernatant, ponieważ DNA znakowane biotyną zawierające krawędź insercyjną wiąże się ze streptawidyną na kulkach. Umyj koraliki 500 mikrolitrami buforu 1X bind and wash, a następnie umyj koraliki 200 mikrolitrami Low TE. Ponownie zawiesić kulki związane z DNA w 17 mikrolitrach o niskim TE. DNA zmutowanych bibliotek wyhodowanych in vivo i in vitro, wyekstrahowanych i rozdrobnionych w ultrasonografie, wykazało, że większość fragmentów obejmuje od 100 do 400 par zasad. W strąku można zaobserwować lokalizację insercji za pośrednictwem transpozonów w czterech replikonach genomu szczepu A mieczyków Burkholderia.W tabeli przedstawiono podsumowanie wyników sekwencjonowania oraz liczbę unikalnych insercji i trafionych genów w trzech bibliotekach replikowanych in vivo i in vitro. Ważną rzeczą do zapamiętania jest obliczenie wielkości wąskiego gardła populacji podczas kolonizacji gospodarza, aby uzyskać odpowiednią reprezentację biblioteki podczas infekcji. Dostosuj się również do zgodnej liczby pokoleń bakterii in vitro i u gospodarza.Po wygenerowaniu biblioteki mutantów transpozonów można ją przebadać na selektywnych pożywkach w celu odzyskania mutantów na podstawie różnic fenotypowych. W ten sposób można zidentyfikować konkretne geny ważne dla danego schorzenia.

transposon-insertion-sequencing-as-tool-to-elucidate-bacterial

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Kazi, M. I., et al., Generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych do sekwencjonowania wysokoprzepustowego. J . Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje selekcję, kwantyfikację i zachowanie bakterii biorców Gram-ujemnych przenoszących inserpozycje transpozonów w oparciu o oporność na kanamycynę.

Izolacja bakterii Gram-ujemnych z insercją transpozonów genomowych

Enterobacter sp. YSU rośnie w pożywce z minimalnymi solami glukozy. Auksotrofy są generowane przez przekształcenie go w transposom, który losowo wstawia się do genomu gospodarza. Mutanty są znajdowane przez replikowanie posiewu ze złożonej pożywki do minimalnej pożywki. Przerwane geny są identyfikowane przez ratowanie genów i sekwencjonowanie.

Wytwarzanie auksotrofów Enterobacter sp. YSU z wykorzystaniem mutagenezy transpozonów

Coxiella burnetii jest obligatoryjną wewnątrzkomórkową bakterią Gram-ujemną odpowiedzialną za chorobę odzwierzęcą Q gorączkę. W tym miejscu opisujemy metody generowania mutantów transpozonów fluorescencyjnych Coxiella, a także automatyczną identyfikację i analizę powstałych fenotypów internalizacji, replikacji i cytotoksyczności.

Wytwarzanie i wielofenotypowe badania przesiewowe o wysokiej zawartości mutantów transpozonów Coxiella burnetii

Tutaj moc losowej insercji niekodującego elementu DNA za pośrednictwem transpozonu została wykorzystana do określenia jego optymalnej pozycji chromosomalnej.

Określenie optymalnej lokalizacji chromosomalnej dla elementu DNA w Escherichia coli przy użyciu nowatorskiego podejścia opartego na transpozonach

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda tworzenia biblioteki wstawiania transpozonów o dużej gęstości w Escherichia coli lub Shigella flexneri przy użyciu koniugacji bakteryjnej. Protokół ten pozwala na stworzenie kolekcji setek tysięcy unikalnych mutantów w bakteriach poprzez losową insercję genomową transpozonu.

Stworzenie gęstej biblioteki insercji transpozonów za pomocą koniugacji bakteryjnej w szczepach enterobakteryjnych, takich jak Escherichia coli czy Shigella flexneri

Opisujemy tutaj technikę, która łączy mutagenezę transpozonów z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości w celu identyfikacji i ilościowego określenia transpozonów mutantów leptospiralnych w tkankach po wyzwaniu chomików. Protokół ten może być stosowany do badań przesiewowych mutantów pod kątem przeżycia i rozprzestrzeniania się u zwierząt, a także może być stosowany w badaniach in vitro.

Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie równoległe w celu pomiaru sprawności Leptospira interrogans Mutanty insercji transpozonów podczas infekcji złotego chomika syryjskiego

Wzajemna hemizygotyczność poprzez sekwencjonowanie (RH-seq) to nowa, potężna metoda mapowania genetycznych podstaw różnic między gatunkami. Pule hemizygot są generowane przez mutagenezę transpozonów, a ich sprawność jest śledzona poprzez wzrost konkurencyjności przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej długości czasu. Analiza uzyskanych danych wskazuje geny leżące u podstaw tej cechy.

Mapowanie genetyczne różnic w termotolerancji między gatunkami drożdży Saccharomyces za pomocą analizy wzajemnej hemizygotyczności całego genomu

Opisujemy metodę generowania nasyconych bibliotek mutantów transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych i późniejszego przygotowania bibliotek amplikonów DNA do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Jako przykład skupiamy się na patogenie ESKAPE, Acinetobacter baumannii, ale ten protokół jest podatny na szeroką gamę organizmów Gram-ujemnych.

Generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych w celu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Mikroby jelitowe, w tym bakterie zewnątrzkomórkowe i patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak wirus Orsay i mikrosporydia (grzyby), są często kojarzone z dzikimi nicieniami Caenorhabditis. W artykule przedstawiono protokół wykrywania i ilościowego oznaczania drobnoustrojów, które kolonizują i/lub infekują nicienie C. elegans, a także pomiaru obciążenia patogenami po kontrolowanych infekcjach w laboratorium.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNA (FISH) w celu wizualizacji kolonizacji i infekcji mikrobiologicznej w jelitach Caenorhabditis elegans

Test rotarod jest wykorzystywany do oceny stanu motorycznego w ruchu chodu u szczurów w modelu hemi-Parkinsona.

Wykorzystanie rotarod jako metody jakościowej analizy chodu u szczura

Poznaj metodę sekwencjonowania insercji transpozonów do identyfikacji genów niezbędnych dla kolonizacji owadów przez bakterie symbiotyczne Burkholderia gladioli.

Sekwencjonowanie insercji transpozonów jako narzędzie do wyjaśnienia czynników kolonizacji bakteryjnej u mieczyków Burkholderia gladioli z chrząszczami Lagria villosa (Wideo) | JoVE Journal

Sekwencjonowanie insercji transpozonów jako narzędzie do wyjaśnienia czynników kolonizacji bakteryjnej u mieczyków Burkholderia gladioli z chrząszczami Lagria villosa

Przeglądaj więcej filmów