Sekwencjonowanie insercji transpozonów jako narzędzie do wyjaśnienia czynników kolonizacji bakteryjnej u mieczyków Burkholderia gladioli z chrząszczami Lagria villosa

Protokół ten jest przydatny do przeprowadzania manipulacji genetycznych na bakteriach symbiotycznych, w tym przypadku w szczególności na Burkholderia, i identyfikacji genów niezbędnych do kolonizacji owadziego gospodarza. Sekwencjonowanie insercji transpozonów jest potężnym narzędziem do jednoczesnej identyfikacji dużej liczby warunkowo istotnych genów w jednym eksperymencie. Zacznij od zaszczepienia świeżej kultury dawcy dawcy E. coli w 10 mililitrach pożywki LB uzupełnionej kanamycyną i DAP pod sterylnym kapturem.

Zaszczepić komórki biorcze szczepu Burkholderia gladioli A w pięciu mililitrach pożywki KB. Inkubuj kultury w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc na wytrząsarce z prędkością 250 obr./min. Po nocnym wzroście odwirować cztery mililitry każdej z kultur w temperaturze 9 600 razy G przez sześć minut, aby osadzać komórki i wyrzucić supernatant.

Pod sterylnym kapturem umyj granulowane kultury komórkowe w pożywce KB zawierającej DAP. I na koniec ponownie zawieś kultury osobno w czterech mililitrach KB plus pożywka DAP. W świeżej 15-mililitrowej probówce wymieszaj 250 mikrolitrów umytych komórek dawcy E. coli z jednym mililitrem umytych komórek biorczych szczepu A mieczyków Burkholderia.

Umieść 10 mikrolitrów tej mieszaniny komórek koniugacyjnych na płytkach agarowych KB zawierających DAP. Pozostawić płytkę w spokoju w sterylnym kapturze w temperaturze pokojowej na jedną godzinę. Inkubować płytki z plamkami koniugacji w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 12 do 18 godzin.

Po inkubacji dodaj od dwóch do czterech mililitrów 1X PBS na płytki pod sterylnym kapturem i użyj skrobaka do komórek, aby uwolnić wyhodowane plamy koniugacji bakterii z agaru. Następnie pipetować sprzężoną komórkę do dwóch mililitrowych probówek do mikrofuge. Granulować komórki, wirując w temperaturze 9 600 razy G przez dwie minuty.

Wyrzucić supernatant i przemyć osad dwukrotnie w jednym mililitrze 1X PBS, pipetując w górę iw dół. Zawiesić ostatnią osadkę w 1 200 mikrolitrach 1X PBS. Dobrze wymieszaj i rozprowadź 100 mikrolitrów mieszaniny komórek na dużych płytkach agarowych KB uzupełnionych kanamycyną i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc.

Policz całkowitą liczbę kolonii transkoniugantów na trzech płytkach i ekstrapoluj, aby obliczyć przybliżoną liczbę mutantów uzyskanych na wszystkich płytkach. Aby zwiększyć szanse na uzyskanie reprezentatywnej biblioteki, upewnij się, że całkowita liczba kolonii jest kilkakrotnie wyższa niż całkowita liczba genów w genomie. Aby potwierdzić powodzenie koniugacji, należy przeprowadzić PCR ukierunkowany na kasetę inseryjną przy użyciu od 10 do 20 kolonii próbek, jak opisano w manuskrypcie.

Pod sterylnym kapturem zeskrob kolonie z płytek, dodając od jednego do dwóch mililitrów 1X PBS na agare. Połącz mieszaninę komórek zeskrobaną z płytek do 50-mililitrowych probówek. Wiruj bibliotekę, aby dokładnie wymieszać, a następnie podziel jeden mililitr połączonej biblioteki mutantów na kilka probówek kriogenicznych.

Dodaj jeden mililitr 70% glicerolu do probówek i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Wybierz lęg jaj L.villosa i policz liczbę jaj kontynuujących, jeśli lęg zawiera więcej niż 100 jaj. Aby wysterylizować całe jajożerce, dodaj 200 mikrolitrów 70% etanolu i delikatnie myj jajka przez pięć minut, a następnie usuń etanol i umyj jajka dwukrotnie wodą z autoklawu.

Dodaj 200 mikrolitrów 12% wybielacza i delikatnie myj jajka przez 30 sekund. Natychmiast usuń wybielacz i ponownie umyj jajka trzy razy 200 mikrolitrami autoklawowanej wody. Zainfekuj jaja w wysterylizowanym lęgu jaj za pomocą dwa razy 10 do sześciu komórek na mikrolitr umytej biblioteki mutantów w PBS.

Dwa dni po wykluciu się zainfekowanych larw chrząszczy zbierz 100 larw drugiego stadium w 1,5 mililitrowej probówce do mikrokrów i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby wygenerować bibliotekę kontrolną in vitro, zaszczepij 250 mikrolitrów dwa razy 10 do sześciu komórek na mikrolitr biblioteki mutantów w 10 mililitrach pożywki KB zawierającej kanamycynę. Po wyekstrahowaniu DNA z bibliotek mutantów hodowanych in vivo i in vitro, należy udostępnić DNA ultradźwiękom.

Aby sprawdzić, czy DNA zostało ścięte do pożądanego zakresu rozmiarów, załaduj pięć mikrolitrów nieściętego i ściętego DNA po zmieszaniu z barwnikiem ładującym żel w stosunku jeden do jednego w 1,6% żelu agarozowym przy napięciu 250 woltów przez 40 minut. Aby przygotować końce fragmentów wymagane do ligacji adapterowej, należy rozpocząć od dodania trzech mikrolitrów mieszaniny enzymów i siedmiu mikrolitrów buforu reakcyjnego do 50 mikrolitrów ściętego DNA i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Ustaw termocykler z podgrzewaną pokrywką na temperaturę większą lub równą 75 stopni Celsjusza i inkubuj próbki przez 30 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza i 30 minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza, a następnie utrzymuj temperaturę na poziomie czterech stopni Celsjusza.

W przypadku podwiązania adaptera dodaj 30 mikrolitrów głównej mieszanki podwiązania, jeden mikrolitr wzmacniacza ligacji i 2,5 mikrolitra rozcieńczonego adaptera do produktów na końcowym etapie przygotowania. Dokładnie wymieszać pipetując i inkubować próbkę przez 15 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza w termocyklerze bez podgrzewanej pokrywy. Po 15 minutach dodaj trzy mikrolitry enzymu.

Dobrze wymieszać pipetując i inkubować próbkę przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w termocyklerze z pokrywką podgrzaną do temperatury większej lub równej 47 stopni Celsjusza. Aby wybrać rozmiar zligowanego DNA ukierunkowanego na fragmenty 250 par zasad, zacznij od wirowania roztworu kulek magnetycznych i umieść go w temperaturze pokojowej na 30 minut przed użyciem. Dodaj 0,3 razy kulki do 96,5 mikrolitra mieszaniny ligowanego DNA i wymieszaj, dokładnie pipetując.

Inkubuj mieszaninę kulek przez pięć minut. Umieść probówki na stojaku magnetycznym, aby ściągnąć koraliki i usunąć fragmenty DNA o niepożądanych rozmiarach. Pozwól kulkom osiąść przez pięć minut, a następnie przenieś przezroczysty supernatant do nowej probówki do mikrodmuchowania.

Dodać 0,15 razy świeże kulki do supernatantu i dobrze wymieszać, pipetując. Inkubuj mieszaninę kulek przez pięć minut, a następnie umieść probówki na stojaku magnetycznym, aby ściągnąć w dół kulki związane z docelowym DNA. Odczekaj pięć minut, a następnie wyrzuć supernatant, zachowując kulki.

Z koralikami na stojaku magnetycznym dodaj 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego 80% etanolu i odczekaj 30 sekund przed wyrzuceniem etanolu bez naruszania kulek. Wyjmij probówki ze stojaka i dodaj 17 mikrolitrów 0,1X TE lub Low TE, a następnie wymieszaj pipetując 10 razy i inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Umieść probówkę na podstawce magnetycznej i weź 15 mikrolitrów DNA o wybranej wielkości do PCR-1.

Zwiruj kulki streptawidyny i umieść je w temperaturze pokojowej na co najmniej 30 minut. Weź 32 mikrolitry kulek i umyj je 500 mikrolitrami buforu 1X do wiązania i mycia. Dodaj 32 mikrolitry buforu 2X bind and wash i ponownie zawieś kulki.

Do tego dodaj 32 mikrolitry oczyszczonych produktów PCR-1. Dokładnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Umieść mieszaninę DNA z kulkami na stojaku magnetycznym na dwie minuty.

Odpipetować supernatant, ponieważ DNA znakowane biotyną zawierające krawędź insercyjną wiąże się ze streptawidyną na kulkach. Umyj koraliki 500 mikrolitrami buforu 1X bind and wash, a następnie umyj koraliki 200 mikrolitrami Low TE. Ponownie zawiesić kulki związane z DNA w 17 mikrolitrach o niskim TE. DNA zmutowanych bibliotek wyhodowanych in vivo i in vitro, wyekstrahowanych i rozdrobnionych w ultrasonografie, wykazało, że większość fragmentów obejmuje od 100 do 400 par zasad. W strąku można zaobserwować lokalizację insercji za pośrednictwem transpozonów w czterech replikonach genomu szczepu A mieczyków Burkholderia.

W tabeli przedstawiono podsumowanie wyników sekwencjonowania oraz liczbę unikalnych insercji i trafionych genów w trzech bibliotekach replikowanych in vivo i in vitro. Ważną rzeczą do zapamiętania jest obliczenie wielkości wąskiego gardła populacji podczas kolonizacji gospodarza, aby uzyskać odpowiednią reprezentację biblioteki podczas infekcji. Dostosuj się również do zgodnej liczby pokoleń bakterii in vitro i u gospodarza.

Po wygenerowaniu biblioteki mutantów transpozonów można ją przebadać na selektywnych pożywkach w celu odzyskania mutantów na podstawie różnic fenotypowych. W ten sposób można zidentyfikować konkretne geny ważne dla danego schorzenia.