Metody spektrofotometryczne do badania metabolizmu glikogenu eukariotycznego

Protokoły są znaczące, ponieważ unikają stosowania izotopów promieniotwórczych i usuwają barierę, która może uniemożliwić wielu pracownikom badanie enzymów metabolizmu glikogenu. Opisane procedury są niedrogie, wymagają jedynie dostępu do prostego spektrofotometru. Aby rozpocząć od określenia aktywności syntazy glikogenu, należy rozmrozić wcześniej przygotowane roztwory podstawowe glukozy UDP, ATP, fosfoenolopirogronianu i kinazy NDP na lodzie.

Podgrzej łaźnię wodną do 30 stopni Celsjusza. Gdy roztwory podstawowe są gotowe, należy przygotować wystarczającą ilość mieszaniny testowej zgodnie z liczbą testów syntazy glikogenu, dodając odczynniki do 15-mililitrowej probówki, jak opisano w protokole tekstowym. Przygotować ślepą próbę, zastępując NADH z mieszaniny reakcyjnej wodą i przenieść reakcję do jednorazowej kuwety z metakrylanu.

Użyj ślepej próby, aby wyzerować spektrofotometr na długości fali 340 nanometrów. Weź jedną podwielokrotność mieszaniny reakcyjnej o pojemności 770 mikrolitrów w probówce o pojemności 1,5 mililitra i kolejno dodaj po dwa mikrolitry mieszaniny kinazy NDP i dehydrogenazy mleczanowej kinazy pirogronianowej do probówki. Po wymieszaniu delikatnie inkubuj probówkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza w łaźni wodnej przez trzy minuty, aby wstępnie podgrzać mieszaninę reakcyjną.

Następnie dodać 30 mikrolitrów próbki zawierającej syntazę glikogenu do 20-milimolowego buforu Tris o pH 7,8 i delikatnie wymieszać przed przeniesieniem mieszaniny reakcyjnej do kuwety z metakrylanu. Umieść kuwetę w spektrofotometrze i rejestruj absorbancję przy 340 nanometrach w określonych odstępach czasu przez 10 do 20 minut. Następnie należy wykreślić uzyskane absorbancje w funkcji czasu.

Aby zmierzyć uwolnioną glukozę, przenieś 40 mikrolitrów supernatantu z podgrzanych próbek glikogenu do jednorazowych kuwet z metakrylanu. I dodać odmierzone objętości trietanoloaminy, chlorowodorku, siarczanu magnezu, buforu, mieszaniny NADP, ATP i wody, jak opisano w manuskrypcie. Wymieszaj mieszaninę, delikatnie pipetując w górę i w dół, nie tworząc pęcherzyków powietrza.

Dodaj 0,5 mikrolitra dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej do każdej kuwety. Po wymieszaniu przez pipetowanie inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie zarejestrować absorbancję na poziomie 340 nanometrów. Następnie wymieszaj 0,5 mikrolitra heksokinazy z każdą kuwetą, jak opisano wcześniej, i inkubuj przez 15 minut przed nagraniem zestawu absorpcyjnego 340 nanometrów.

Następnie kontynuuj inkubację w temperaturze pokojowej przez pięć minut, a następnie rejestruj absorbancję. Jeśli absorpcja wzrosła w stosunku do absorpcji zarejestrowanej po 15 minutach, kontynuuj inkubację przez pięć minut przed zarejestrowaniem końcowej absorpcji przy 340 nanometrach. Aby określić rozgałęzienie glikogenu, połącz 650 mikrolitrów odczynnika barwiącego jod i chlorku wapnia ze 100 mikrolitrami wody w probówce o pojemności 1,5 mililitra i dokładnie wymieszaj roztwór przed przeniesieniem do jednorazowej kuwety z metakrylanu.

Umieść kuwetę w spektrofotometrze, aby przeprowadzić przebieg w trybie skanowania długości fali w celu zebrania widma tła od 330 do 800 nanometrów. W osobnej probówce o pojemności 1,5 mililitra połącz 650 mikrolitrów działającego odczynnika barwiącego jodowo-chlorkowo-wapniowego z 50 mikrogramami glikogenu ostrygowego i uzupełnij końcową objętość do 750 mikrolitrów wodą. Po dokładnym wymieszaniu mieszaniny przenieś roztwór do jednorazowej kuwety z metakrylanem, aby zebrać widmo absorpcyjne od 330 do 800 nanometrów.

Podobnie, uzyskaj widmo absorpcji z 50 mikrogramami amylopektyny i 30 mikrogramami amylozy, jak opisano wcześniej. Aby uzyskać wskazanie rozgałęzionej struktury niescharakteryzowanej próbki glikogenu, połącz od 25 do 50 mikrogramów glikogenu z 650 mikrolitrami roboczego odczynnika barwiącego jod i wapnia postępuj zgodnie z wcześniejszymi wyjaśnieniami w celu uzyskania widma absorpcji. W testach syntazy glikogenu zaobserwowano liniowy spadek absorpcji przy 340 nanometrach w czasie.

Dodanie zbyt dużej ilości syntazy glikogenu do testu spowodowało, że reakcja osiągnęła zakończenie w ciągu pierwszych dwóch minut. Reakcja kontrolna, która nie zawierała syntazy glikogenu, nie wykazała mierzalnego spadku absorbancji. Dane z testu fosforylazy glikogenu przy użyciu oczyszczonego enzymu miały fazę liniową trwającą trzy minuty.

Optymalna jest szybkość wzrostu absorbancji o około 0,01 do 0,04 jednostki na minutę. W teście enzymu rozgałęziającego glikogen reakcja wykazała fazę liniową utrzymującą się przez co najmniej 10 minut. Reprezentatywne dane z testów enzymów rozgałęziających glikogen wykazały różnicę w absorbancji między próbkami kontrolnymi, które nie miały enzymu rozgałęziającego, a reakcjami, które zawierały enzym rozgałęziający.

Zilustrowano wąski zakres dynamiki testu. Maksymalna zmiana absorbancji, jaką można uzyskać, wynosi 0,4 jednostki absorbancji, a liniowość jest tracona, gdy zmiana absorpcji wynosi około 0,2 jednostki absorbancji. Masy glikogenu, amylopektyny i amylozy użyte w ocenie rozgałęzień glikogenu wykazały maksymalny odczyt absorbancji około 0,7 do 0,8, przy każdym przy różnych maksimach absorbancji.

Próbka glikogenu wytworzyła dwa piki o długości około 400 nanometrów i 460 nanometrach. Odczynnik barwiący jod i chlorek wapnia jest bardzo gęsty. Ważne jest, aby upewnić się, że próbki glikogenu są całkowicie wymieszane z odczynnikiem przed pobraniem widma absorpcyjnego.