Name: Metody spektrofotometryczne do badania metabolizmu glikogenu eukariotycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Poznaj spektrofotometryczne metody pomiaru aktywności enzymów metabolizmu glikogenu w komórkach eukariotycznych. Techniki te są niezawodne, ekonomiczne i nie wymagają izotopów promieniotwórczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor chciałby podziękować Karoline Dittmer i Andrew Brittinghamowi za ich spostrzeżenia i wiele pomocnych dyskusji. Praca ta była częściowo wspierana przez granty z Iowa Osteopathic Education and Research Fund (IOER 03-17-05 i 03-20-04).

<ol><li>Wilson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glycogen+metabolism+in+yeast+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).</li>
<li>Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+function+of+carbohydrate+reserve+biosynthesis+in+parasitic+protists%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasitic protists.</a> Trends in Parasitology. 1471 (21), 00144-00146 (2021).</li>
<li>Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+and+its+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Glycogen and its metabolism.</a> Current Molecular Medicine. 2 (2), 101-120 (2002).</li>
<li>Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+filter+paper+assay+for+UDPglucose-glycogen+glucosyltransferase%2C+including+an+improved+biosynthesis+of+UDP-14C-glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid filter paper assay for UDPglucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose.</a> Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).</li>
<li>Fox, J., Kawaguchi, K., Greenberg, E., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+B+ADPglucose%3A1%2C4-alpha-D-glucan+4-alpha-glucosyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli B ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan 4-alpha-glucosyltransferase.</a> Biochemistry. 15 (4), 849-857 (1976).</li>
<li>Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioactive+method+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases.</a> Analytical Biochemistry. 47 (1), 20-27 (1972).</li>
<li>Brown, D. H., Illingworth, B., Cori, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+the+de+novo+synthesis+of+polysaccharide+by+phosphorylase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The mechanism of the de novo synthesis of polysaccharide by phosphorylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (4), 479-485 (1961).</li>
<li>Nelson, T. E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+micro+assay+method+for+amylo-1%2C6-glucosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid micro assay method for amylo-1,6-glucosidase.</a> Analytical Biochemistry. 33 (1), 87-101 (1970).</li>
<li>Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+glycogen+from+uridine+diphosphate+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 81 (2), 508-520 (1959).</li>
<li>Danforth, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+synthetase+activity+in+skeletal+muscle.+Interconversion+of+two+forms+and+control+of+glycogen+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 240, 588-593 (1965).</li>
<li>Wayllace, N. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-coupled+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycogen+synthases%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases.</a> Molecular Biology Reports. 39 (1), 585-591 (2012).</li>
<li>Shapiro, B., Wertheimer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorolysis+and+synthesis+of+glycogen+in+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Phosphorolysis and synthesis of glycogen in animal tissues.</a> Biochemical Journal. 37 (3), 397-403 (1943).</li>
<li>Mezl, V. A., Knox, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+methods+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+tissue+homogenates%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme%22%5BJournal%5D)">Comparison of two methods for the assay of glycogen phosphorylase in tissue homogenates.</a> Enzyme. 13 (4), 197-202 (1972).</li>
<li>Mendicino, J., Afou-Issa, H., Medicus, R., Kratowich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fructose-1%2C+6-diphosphatase%2C+phosphofructokinase%2C+glycogen+synthetase%2C+phosphorylase%2C+and+protein+kinase+from+swine+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Fructose-1, 6-diphosphatase, phosphofructokinase, glycogen synthetase, phosphorylase, and protein kinase from swine kidney.</a> Methods in Enzymology. 42, 375-397 (1975).</li>
<li>Schreiber, W. E., Bowling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+the+direction+of+phosphorolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An automated assay of glycogen phosphorylase in the direction of phosphorolysis.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 27, Pt 2 129-132 (1990).</li>
<li>Nelson, T. E., Kolb, E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+properties+of+rabbit+muscle+amylo-1%2C6-glucosidase-oligo-1%2C4-1%2C4-transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and properties of rabbit muscle amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase.</a> Biochemistry. 8 (4), 1419-1428 (1969).</li>
<li>Taylor, C., Cox, A. J., Kernohan, J. C., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Debranching+enzyme+from+rabbit+skeletal+muscle.+Purification%2C+properties+and+physiological+role%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Debranching enzyme from rabbit skeletal muscle. Purification, properties and physiological role.</a> European Journal of Biochemistry. 51 (1), 105-115 (1975).</li>
<li>Makino, Y., Omichi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+glycogen+debranching+enzyme+from+porcine+brain%3A+evidence+for+glycogen+catabolism+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%2C+Biotechnology%2C+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification of glycogen debranching enzyme from porcine brain: evidence for glycogen catabolism in the brain.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70 (4), 907-915 (2006).</li>
<li>Lee, E. Y. C., Whelan, W. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLee%2C+EYC+%22The+Enzymes+Vol.+5%22">The Enzymes Vol. 5</a>. Boyer, P. D. , Academic Press. 191-234 (1971).</li>
<li>Yu, X., Houtman, C., Atalla, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+of+amylose+and+iodine%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Research%22%5BJournal%5D)">The complex of amylose and iodine.</a> Carbohydrate Research. 292, 129-141 (1996).</li>
<li>Boyer, C., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+b+alpha-1%2C4%2C-glucan%3A+alpha-1%2C4-glucan+6-glycosyltansferase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli b alpha-1,4,-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltansferase.</a> Biochemistry. 16 (16), 3693-3699 (1977).</li>
<li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+colorimetric+estimation+of+glycogen+with+iodine%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A method for the colorimetric estimation of glycogen with iodine.</a> Analytical Biochemistry. 4, 17-23 (1962).</li>
<li>Friedman, D. L., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase.+iii.+Interconversion+of+two+forms+of+muscle+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase+by+a+phosphorylation-dephosphorylation+reaction+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Studies on UDPG-alpha-glucan transglucosylase. iii. Interconversion of two forms of muscle UDPG-alpha-glucan transglucosylase by a phosphorylation-dephosphorylation reaction sequence.</a> Biochemistry. 2, 669-675 (1963).</li>
<li>Hanashiro, I., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+muscle+glycogen+synthase+that+disable+activation+by+glucose+6-phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Mutations of muscle glycogen synthase that disable activation by glucose 6-phosphate.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 397 (2), 286-292 (2002).</li>
<li>Huang, K. P., Cabib, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+glycogen+synthetase+in+the+glucose+6-phosphate-dependent+form.+I.+Purification+and+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Yeast glycogen synthetase in the glucose 6-phosphate-dependent form. I. Purification and properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (12), 3851-3857 (1974).</li>
<li>Pederson, B. A., Cheng, C., Wilson, W. A., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glycogen+synthase.+Identification+of+residues+involved+in+regulation+by+the+allosteric+ligand+glucose-6-P+and+by+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of glycogen synthase. Identification of residues involved in regulation by the allosteric ligand glucose-6-P and by phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (36), 27753-27761 (2000).</li>
<li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+and+its+metabolism%3A+some+new+developments+and+old+themes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes.</a> Biochemical Journal. 441 (3), 763-787 (2012).</li>
<li>Gosselin, S., Alhussaini, M., Streiff, M. B., Takabayashi, K., Palcic, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycosyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A continuous spectrophotometric assay for glycosyltransferases.</a> Analytical Biochemistry. 220 (1), 92-97 (1994).</li>
<li>Wilson, W. A., Pradhan, P., Madhan, N., Gist, G. C., Brittingham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+synthase+from+the+parabasalian+parasite+Trichomonas+vaginalis%3A+An+unusual+member+of+the+starch%2Fglycogen+synthase+family%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Glycogen synthase from the parabasalian parasite Trichomonas vaginalis: An unusual member of the starch/glycogen synthase family.</a> Biochimie. 138, 90-101 (2017).</li>
<li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-1%2C4-glucan%3A+alpha-1%2C4-glucan+6-glycosyltransferase+from+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">alpha-1,4-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltransferase from liver.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 65, 307-315 (1962).</li>
<li>Sandhya Rani, M. R., Shibanuma, K., Hizukuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+structure+of+oyster+glucogen%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Research%22%5BJournal%5D)">The fine structure of oyster glucogen.</a> Carbohydrate Research. 227, 183-194 (1992).</li>
<li>Dittmer, K. E., Pradhan, P., Tompkins, Q. C., Brittingham, A., Wilson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+glycogen+branching+and+debranching+enzymes+from+the+parasitic+protist+Trichomonas+vaginalis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of glycogen branching and debranching enzymes from the parasitic protist Trichomonas vaginalis.</a> Biochimie. 186, 59-72 (2021).</li>
</ol>

Nie są znane żadne konflikty interesów związane z tymi pracami i nie zapewniono im wsparcia finansowego, które mogłoby wpłynąć na ich wynik.

Ogólnie rzecz biorąc, kluczowymi zaletami wszystkich przedstawionych metod są ich niski koszt, łatwość, szybkość i brak polegania na specjalistycznym sprzęcie. Główną wadą, którą wszystkie dzielą, jest czułość w porównaniu z innymi dostępnymi metodami. Wrażliwość procedur, które wiążą się z produkcją lub zużyciem NADH/NADPH, jest łatwa do oszacowania. Biorąc pod uwagę, że współczynnik ekstynkcji NADH/NADPH wynosi 6,22 M-1 cm-1, prosta arytmetyka wskazuje, że ~10-20 μM zmian stężenia można łatwo wykr...

Glikogen jest szeroko rozpowszechniony w przyrodzie, a związek ten występuje w bakteriach, wielu protistach, grzybach i zwierzętach. W mikroorganizmach glikogen jest ważny dla przetrwania komórek, gdy składniki odżywcze są ograniczone, a u organizmów wyższych, takich jak ssaki, synteza i degradacja glikogenu służą do buforowania poziomu glukozy we krwi1,2,3. Badania nad metabolizmem glikogenu mają zatem znaczenie dla tak różnych dziedzin, jak mikrobiologia i fizjologia ssaków. Zrozumienie metabolizmu glikogenu wymaga zbadania kluczowych enzymów syntezy glikogenu (syntazy glikogenu i enzymu rozgałęziającego) oraz degradacji glikogenu (fosforylaza glikogenu i enzym rozgałęziający). Złote standardy testów syntazy glikogenu, fosforylazy, aktywności enzymów rozgałęziających i rozgałęziających wykorzystują izotopy promieniotwórcze. Na przykład syntazę glikogenu mierzy się na ogół w zatrzymanym teście radiochemicznym po włączeniu glukozy z UDP-[14C]glukozy (w przypadku enzymów zwierzęcych i grzybowych) lub ADP-[14C]glukozy (w przypadku enzymów bakteryjnych) do glikogenu4,5. Podobnie, fosforylaza glikogenu jest mierzona w kierunku syntezy glikogenu, po włączeniu glukozy z [14C]glukozo-1-fosforanu do glikogenu6. Enzym rozgałęziający jest oznaczany przez pomiar zdolności tego enzymu do stymulowania inkorporacji [14C]glukozy z glukozo-1-fosforanu do łańcuchów połączonych α1,4 przez fosforylazę glikogenu7, a aktywność enzymu rozgałęziającego określa się, śledząc zdolność enzymu do włączania [14C]glukozy do glikogenu8. Chociaż substraty radioaktywne są bardzo wrażliwe, co pozwala na ich stosowanie w surowych ekstraktach komórkowych o niskim poziomie aktywności enzymatycznej, są drogie i podlegają wymogom regulacyjnym związanym ze stosowaniem izotopów promieniotwórczych. Bariery te sprawiają, że stosowanie niektórych testów jest poza zasięgiem wielu pracowników. Jednak na przestrzeni wielu lat opisano imponującą różnorodność podejść spektrofotometrycznych do pomiaru tych enzymów. Ogólnie rzecz biorąc, podejścia te ostatecznie opierają się na pomiarze produkcji lub zużycia NADH/NADPH lub wytwarzaniu kolorowych kompleksów między glikogenem a jodem. Dzięki temu są proste i można je przeprowadzić za pomocą prostych spektrofotometrów wyposażonych tylko w wolframowe lub ksenonowe lampy błyskowe.
Testy spektrofotometryczne syntazy glikogenu polegają na pomiarze difosforanu nukleozydu uwalnianego z donora nukleotydów cukrowych, gdy glukoza jest dodawana do rosnącego łańcucha glikogenu9,10. Procedura pomiaru aktywności syntazy glikogenu opisana w sekcji 1 protokołu, poniżej, jest modyfikacją tej opisanej przez Wayllace et al.11, a schemat sprzężenia jest pokazany poniżej:
(Glukoza)n + UPD-glukoza → (Glukoza)n+1 + UDP
UDP + ATP → ADP + UTP
ADP + fosfoenolopirogronian → pirogronian + ATP
Pirogronian + NADH + H+ → Mleczan + NAD+
Syntaza glikogenu dodaje glukozę z UDP-glucose do glikogenu. Powstający w tym procesie UDP jest przekształcany w UTP przez kinazę difosforanową nukleozydów (kinazę NDP), w reakcji, która generuje ADP. ADP z kolei służy następnie jako substrat dla kinazy pirogronianowej, która fosforyluje ADP przy użyciu fosfoenolopirogronianu jako donora fosforanów. Powstały pirogronian jest przekształcany w mleczan przez enzym dehydrogenazę mleczanową w reakcji, która zużywa NADH. Test można zatem przeprowadzić w sposób ciągły, monitorując spadek absorbancji przy 340 nm w miarę zużywania NADH. Jest łatwo przystosowany do stosowania z enzymami, które wymagają ADP-glukozy jako dawcy glukozy. W tym przypadku etapy sprzęgania są prostsze, ponieważ ADP uwalniany przez działanie syntazy glikogenu jest bezpośrednio oddziaływany przez kinazę pirogronianową.
Dostępne są różne testy spektrofotometryczne do określania aktywności fosforylazy glikogenu. W wersji klasycznej enzym jest napędzany do tyłu, w kierunku syntezy glikogenu, jak pokazano poniżej:
(Glukoza)n + Glukozo-1-fosforan → (Glukoza)n+1 + Pi
W określonych odstępach czasu, porcje mieszaniny reakcyjnej są usuwane, a ilość uwolnionego fosforanu jest określana ilościowo12,13. W naszych rękach test ten miał ograniczone zastosowanie ze względu na obecność łatwo mierzalnego wolnego fosforanu w wielu komercyjnych preparatach glukozo-1-fosforanu, w połączeniu z wysokimi stężeniami glukozo-1-fosforanu wymaganymi do działania fosforylazy. Zamiast tego rutynowo zastosowaliśmy alternatywny test, który mierzy glukozo-1-fosforan uwalniany, gdy glikogen jest degradowany przez fosforylazę13. Zastosowano sprzężony schemat reakcji, zilustrowany poniżej.
(Glukoza)n + Pi → (Glukoza)n-1 + Glukoza-1-fosforan
Glukozo-1-fosforan → Glukozo-6-fosforan
Glukozo-6-fosforan + NADP+ → 6-fosfoglukonolakton + NADPH + H+
Glukozo-1-fosforan jest przekształcany w glukozo-6-fosforan przez fosfoglukututazę, a glukozo-6-fosforan jest następnie utleniany do 6-fosfoglukonolaktonu, przy jednoczesnej redukcji NADP+ do NADPH. Procedura opisana szczegółowo w sekcji 2 protokołu, poniżej, wywodzi się z metod opisanych przez Mendicino et al.14 oraz Schreiber & Bowling15. Test można łatwo przeprowadzić w sposób ciągły, ze wzrostem absorbancji przy 340 nm w czasie, co pozwala na określenie szybkości reakcji.
Spektrofotometryczne określenie aktywności enzymu rozgałęziającego opiera się na pomiarze glukozy uwalnianej przez działanie enzymu na limit fosforylazy dekstryny16. Związek ten jest wytwarzany przez wyczerpujące traktowanie glikogenu fosforylazą glikogenu. Ponieważ działanie fosforylazy glikogenu zatrzymuje 4 reszty glukozy z dala od punktu rozgałęzienia α1,6, graniczna dekstryna zawiera glikogen, którego zewnętrzne łańcuchy zostały skrócone do ~ 4 reszt glukozy. Przygotowanie dekstryny granicznej fosforylazy opisano tutaj, przy użyciu procedury zaczerpniętej z procedur opracowanych przez Taylora i wsp.17 oraz Makino & Omichi18.
Rozgałęzianie to proces dwuetapowy. Aktywność 4-α-glukanotransferazy dwufunkcyjnego enzymu rozgałęziającego najpierw przenosi trzy reszty glukozy z punktu rozgałęzienia na nieredukujący koniec pobliskiego łańcucha glukozowego połączonego α1,4. Pojedyncza, połączona z α1,6 reszta glukozy pozostająca w punkcie rozgałęzienia jest następnie hydrolizowana przez aktywność α1,6-glukozydazy19. Test jest zwykle wykonywany w sposób zatrzymany, a glukoza uwolniona po określonym czasie (lub serii razy) jest mierzona w sprzężonym teście enzymatycznym, jak pokazano poniżej:
(Glukoza)n → (Glukoza)n-1 + Glukoza
Glukoza + ATP → Glukozo-6-fosforan + ADP
Glukozo-6-fosforan + NADP+ → 6-fosfoglukonolakton + NADPH + H+
Określenie wyprodukowanego NADPH daje miarę produkcji glukozy. Procedura opisana w sekcji 3 protokołu, poniżej, jest oparta na procedurze opisanej przez Nelsona i wsp.16. Podobnie jak inne metody, które opierają się na zużyciu lub wytwarzaniu NADH/NADPH, test jest dość czuły. Jednak obecność amylaz lub innych glukozydaz, które mogą również uwalniać wolną glukozę z dekstryny granicznej fosforylazy, spowoduje znaczne zakłócenia (patrz Dyskusja).
Kolorymetryczne określenie aktywności rozgałęziającego się enzymu opiera się na fakcie, że łańcuchy glukozy połączone α1,4 przyjmują spiralne struktury, które wiążą się z jodem, tworząc kolorowe kompleksy20. Kolor utworzonego kompleksu zależy od długości łańcuchów połączonych α1,4. Tak więc amyloza, która składa się z długich, w dużej mierze nierozgałęzionych łańcuchów glukozy połączonej z α1,4, tworzy ciemnoniebieski kompleks z jodem. Natomiast glikogeny, których zewnętrzne łańcuchy mają na ogół długość zaledwie 6 do 8 reszt glukozy, tworzą pomarańczowo-czerwone kompleksy. Jeśli roztwór amylozy jest inkubowany z enzymem rozgałęziającym, wprowadzenie rozgałęzień do amylozy powoduje wytworzenie krótszych łańcuchów glukozy połączonych α1,4. W ten sposób maksimum absorpcji kompleksów amylozy/jodu przesuwa się w kierunku krótszych fal. Omawiana tutaj procedura wywodzi się z procedury opisanej przez Boyer & Preiss21, a aktywność enzymu rozgałęziającego się jest określana ilościowo jako zmniejszenie wchłaniania kompleksu amylozy/jodu przy 660 nm w czasie.
Jak powinno być łatwo zauważyć z powyższej dyskusji, fakt, że kolory kompleksów utworzonych między łańcuchami jodu i α1,4-glukozy różnią się wraz z długością łańcucha, oznacza, że widma absorbancji kompleksów glikogen/jod powinny zmieniać się wraz ze stopniem rozgałęzienia glikogenu. Tak jest w istocie, a mniej rozgałęzione glikogeny/glikogeny z dłuższymi łańcuchami zewnętrznymi pochłaniają światło o większej długości fali niż glikogeny, które są bardziej rozgałęzione/mają krótsze łańcuchy zewnętrzne. Reakcja barwienia jodem może być zatem wykorzystana do uzyskania szybkich, jakościowych danych na temat stopnia rozgałęzienia glikogenu22. Pomarańczowo-brązowy kolor powstaje, gdy kompleksy glikogenu z jodem nie są szczególnie intensywne. Jednak rozwój koloru można wzmocnić poprzez włączenie nasyconego roztworu chlorku wapnia22. Zwiększa to około 10-krotnie czułość metody i umożliwia łatwą analizę mikrogramowych ilości glikogenu. Test do oznaczania rozgałęzień opisany w sekcji 4 protokołu, poniżej, jest zaadaptowany z procedury opracowanej przez Krisman22. Przeprowadza się go po prostu poprzez połączenie próbki glikogenu z roztworem jodu i chlorkiem wapnia w kuwecie i zebranie widma absorpcji od 330 nm do 800 nm. Maksymalna absorbancja przesuwa się w kierunku dłuższych fal wraz ze spadkiem stopnia rozgałęzienia.
Podsumowując, opisane tutaj metody dostarczają prostych, niezawodnych metod oceny aktywności kluczowych enzymów metabolizmu glikogenu oraz uzyskiwania jakościowych danych na temat stopnia rozgałęzienia glikogenu.

<table><tbody><tr><td>Amylopektyna (bez amylozy) z woskowej kukurydzy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A0456</td><td></td></tr><tr><td>Amylose</td><td>Biosynth Carbosynth</td><td>YA10257</td><td></td></tr><tr><td>ATP, sól disodowa</td><td>MilliporeSigma</td><td>A3377</td><td></td></tr><tr><td>D-glukozo-1,6-bisfosforan, sól potasowa</td><td>MilliporeSigma</td><td>G6893</td><td></td></tr><tr><td>D-glukozo-6-fosforan, sól sodowa</td><td>MilliporeSigma</td><td>G7879</td><td></td></tr><tr><td>Dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa, stopień I, z drożdży</td><td>MilliporeSigma</td><td>10127655001</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen, typ II z ostrygi</td><td>MilliporeSigma</td><td>G8751</td><td></td></tr><tr><td>Hexokinase</td><td>MilliporeKuwety metakrylanowe Sigma</td><td>11426362001</td><td></td></tr>, <tr><td>1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-128</td><td>Metakrylan jest wymagany, ponieważ niektóre procedury są prowadzone przy długości fali 340 nm lub niższej</td></tr><tr><td>&beta;-Sól sodowa fosforanu dinukleotydu nikotynamidoadeninowego</td><td>MilliporeSigma</td><td>N0505</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-dinukleotyd nikotynamidoadeninowy, zredukowana sól disodowa</td><td>MilliporeSigma</td><td>43420</td><td></td></tr><tr><td>Kinaza nukleozydowa 5'-difosforanowa</td><td>MiliporeSigma</td><td>N0379</td><td></td></tr><tr><td>Fosfoenolopirugronian, sól</td> <td>monopotasowaMilliporeSigma</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>Fosfoglukutaza z mięśni królika</td><td>MilliporeSigma</td><td>P3397</td><td></td></tr><tr><td>Fosforylaza A z mięśni królika</td><td>MilliporeSigma</td><td>P1261</td><td></td></tr><tr><td>Kinaza pirogronianowa/enzymy dehydrogenazy mlekowej z mięśni królika</td><td>MilliporeSigma</td><td>P0294</td><td></td></tr><tr><td>UDP-glukoza, sól disodowa</td><td>MiliporeSigma</td><td>U4625</td><td></td></tr></tbody></table>

metody spektrofotometryczne do badania metabolizmu glikogenu eukariotycznego

Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

Glikogen jest syntetyzowany jako forma magazynowania glukozy przez szeroki wachlarz organizmów, od bakterii po zwierzęta. Cząsteczka składa się z liniowych łańcuchów reszt glukozy połączonych α1,4 z rozgałęzieniami wprowadzonymi przez dodanie wiązań α1,6. Zrozumienie, w jaki sposób synteza i degradacja glikogenu są regulowane oraz w jaki sposób glikogen osiąga swoją charakterystyczną rozgałęzioną strukturę, wymaga zbadania enzymów magazynowania glikogenu. Jednak metody najczęściej stosowane do badania tych aktywności enzymatycznych zazwyczaj wykorzystują odczynniki lub techniki, które nie są dostępne dla wszystkich badaczy. W tym miejscu omawiamy zestaw procedur, które są technicznie proste, opłacalne, a mimo to nadal są w stanie dostarczyć cennych informacji na temat kontroli magazynowania glikogenu. Techniki te wymagają dostępu do spektrofotometru, pracującego w zakresie od 330 do 800 nm i są opisane przy założeniu, że użytkownicy będą korzystać z jednorazowych, plastikowych kuwet. Procedury te są jednak łatwo skalowalne i mogą być modyfikowane do użytku w czytniku mikropłytek, co pozwala na wysoce równoległą analizę.

Oznaczanie aktywności syntazy glikogenu 
Rycina 1 przedstawia reprezentatywne wyniki testów syntazy glikogenu z użyciem oczyszczonych enzymów. Na panelu A, po krótkiej fazie opóźnienia, zaobserwowano liniowy spadek absorbancji przy 340 nm w czasie przez okres około 12 min. Szybkość zmiany absorbancji na Rycina 1A wynosiła ~0,12 jednostek absorbancji/min. Optymalna szybkość zmiany absorbancji mieści się w przedziale od ~0,010 do ~0,20 jednoste...

Techniki pomiaru aktywności kluczowych enzymów metabolizmu glikogenu są prezentowane przy użyciu prostego spektrofotometru działającego w zakresie widzialnym.

Metody spektrofotometryczne do badania metabolizmu glikogenu eukariotycznego

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...

Protokoły są znaczące, ponieważ unikają stosowania izotopów promieniotwórczych i usuwają barierę, która może uniemożliwić wielu pracownikom badanie enzymów metabolizmu glikogenu. Opisane procedury są niedrogie, wymagają jedynie dostępu do prostego spektrofotometru. Aby rozpocząć od określenia aktywności syntazy glikogenu, należy rozmrozić wcześniej przygotowane roztwory podstawowe glukozy UDP, ATP, fosfoenolopirogronianu i kinazy NDP na lodzie.Podgrzej łaźnię wodną do 30 stopni Celsjusza. Gdy roztwory podstawowe są gotowe, należy przygotować wystarczającą ilość mieszaniny testowej zgodnie z liczbą testów syntazy glikogenu, dodając odczynniki do 15-mililitrowej probówki, jak opisano w protokole tekstowym. Przygotować ślepą próbę, zastępując NADH z mieszaniny reakcyjnej wodą i przenieść reakcję do jednorazowej kuwety z metakrylanu.Użyj ślepej próby, aby wyzerować spektrofotometr na długości fali 340 nanometrów. Weź jedną podwielokrotność mieszaniny reakcyjnej o pojemności 770 mikrolitrów w probówce o pojemności 1,5 mililitra i kolejno dodaj po dwa mikrolitry mieszaniny kinazy NDP i dehydrogenazy mleczanowej kinazy pirogronianowej do probówki. Po wymieszaniu delikatnie inkubuj probówkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza w łaźni wodnej przez trzy minuty, aby wstępnie podgrzać mieszaninę reakcyjną.Następnie dodać 30 mikrolitrów próbki zawierającej syntazę glikogenu do 20-milimolowego buforu Tris o pH 7,8 i delikatnie wymieszać przed przeniesieniem mieszaniny reakcyjnej do kuwety z metakrylanu. Umieść kuwetę w spektrofotometrze i rejestruj absorbancję przy 340 nanometrach w określonych odstępach czasu przez 10 do 20 minut. Następnie należy wykreślić uzyskane absorbancje w funkcji czasu.Aby zmierzyć uwolnioną glukozę, przenieś 40 mikrolitrów supernatantu z podgrzanych próbek glikogenu do jednorazowych kuwet z metakrylanu. I dodać odmierzone objętości trietanoloaminy, chlorowodorku, siarczanu magnezu, buforu, mieszaniny NADP, ATP i wody, jak opisano w manuskrypcie. Wymieszaj mieszaninę, delikatnie pipetując w górę i w dół, nie tworząc pęcherzyków powietrza.Dodaj 0,5 mikrolitra dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej do każdej kuwety. Po wymieszaniu przez pipetowanie inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie zarejestrować absorbancję na poziomie 340 nanometrów. Następnie wymieszaj 0,5 mikrolitra heksokinazy z każdą kuwetą, jak opisano wcześniej, i inkubuj przez 15 minut przed nagraniem zestawu absorpcyjnego 340 nanometrów.Następnie kontynuuj inkubację w temperaturze pokojowej przez pięć minut, a następnie rejestruj absorbancję. Jeśli absorpcja wzrosła w stosunku do absorpcji zarejestrowanej po 15 minutach, kontynuuj inkubację przez pięć minut przed zarejestrowaniem końcowej absorpcji przy 340 nanometrach. Aby określić rozgałęzienie glikogenu, połącz 650 mikrolitrów odczynnika barwiącego jod i chlorku wapnia ze 100 mikrolitrami wody w probówce o pojemności 1,5 mililitra i dokładnie wymieszaj roztwór przed przeniesieniem do jednorazowej kuwety z metakrylanu.Umieść kuwetę w spektrofotometrze, aby przeprowadzić przebieg w trybie skanowania długości fali w celu zebrania widma tła od 330 do 800 nanometrów. W osobnej probówce o pojemności 1,5 mililitra połącz 650 mikrolitrów działającego odczynnika barwiącego jodowo-chlorkowo-wapniowego z 50 mikrogramami glikogenu ostrygowego i uzupełnij końcową objętość do 750 mikrolitrów wodą. Po dokładnym wymieszaniu mieszaniny przenieś roztwór do jednorazowej kuwety z metakrylanem, aby zebrać widmo absorpcyjne od 330 do 800 nanometrów.Podobnie, uzyskaj widmo absorpcji z 50 mikrogramami amylopektyny i 30 mikrogramami amylozy, jak opisano wcześniej. Aby uzyskać wskazanie rozgałęzionej struktury niescharakteryzowanej próbki glikogenu, połącz od 25 do 50 mikrogramów glikogenu z 650 mikrolitrami roboczego odczynnika barwiącego jod i wapnia postępuj zgodnie z wcześniejszymi wyjaśnieniami w celu uzyskania widma absorpcji. W testach syntazy glikogenu zaobserwowano liniowy spadek absorpcji przy 340 nanometrach w czasie.Dodanie zbyt dużej ilości syntazy glikogenu do testu spowodowało, że reakcja osiągnęła zakończenie w ciągu pierwszych dwóch minut. Reakcja kontrolna, która nie zawierała syntazy glikogenu, nie wykazała mierzalnego spadku absorbancji. Dane z testu fosforylazy glikogenu przy użyciu oczyszczonego enzymu miały fazę liniową trwającą trzy minuty.Optymalna jest szybkość wzrostu absorbancji o około 0,01 do 0,04 jednostki na minutę. W teście enzymu rozgałęziającego glikogen reakcja wykazała fazę liniową utrzymującą się przez co najmniej 10 minut. Reprezentatywne dane z testów enzymów rozgałęziających glikogen wykazały różnicę w absorbancji między próbkami kontrolnymi, które nie miały enzymu rozgałęziającego, a reakcjami, które zawierały enzym rozgałęziający.Zilustrowano wąski zakres dynamiki testu. Maksymalna zmiana absorbancji, jaką można uzyskać, wynosi 0,4 jednostki absorbancji, a liniowość jest tracona, gdy zmiana absorpcji wynosi około 0,2 jednostki absorbancji. Masy glikogenu, amylopektyny i amylozy użyte w ocenie rozgałęzień glikogenu wykazały maksymalny odczyt absorbancji około 0,7 do 0,8, przy każdym przy różnych maksimach absorbancji.Próbka glikogenu wytworzyła dwa piki o długości około 400 nanometrów i 460 nanometrach. Odczynnik barwiący jod i chlorek wapnia jest bardzo gęsty. Ważne jest, aby upewnić się, że próbki glikogenu są całkowicie wymieszane z odczynnikiem przed pobraniem widma absorpcyjnego.

spectrophotometric-methods-for-study-eukaryotic-glycogen

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film opisuje test spektrofotometryczny do szacowania aktywności syntazy glikogenu. Metoda polega na zmniejszaniu się absorbancji NADH w czasie i wskazuje na aktywność syntazy glikogenu.

Test spektrofotometryczny w celu określenia aktywności syntazy glikogenu

W tym filmie opisujemy jakościowy test spektrofotometryczny, aby określić zakres rozgałęzień w próbce glikogenu o niescharakteryzowanej strukturze. Porównanie maksimów absorbancji próbki niescharakteryzowanej z maksimum polisacharydów o znanych strukturach rozgałęzionych wskazuje na obecność rozgałęzień w próbce niescharakteryzowanej.

Test rozgałęzień glikogenu w celu zmierzenia stopnia rozgałęzienia glikogenu

Opisujemy tutaj dokładną, powtarzalną i wygodną biochemiczną metodę miareczkowania glikogenu in vitro. Technika ta wykorzystuje zestaw do oznaczania glikogenu Abcam i opiera się na sukcesywnej hydrolizie glikogenu do glukozy i miareczkowaniu glukozy przez fluorescencję.

Miareczkowanie biochemiczne glikogenu in vitro

Barwienie Schiffa kwasem okresowym to technika, która wizualizuje zawartość polisacharydów w tkankach. W artykule przedstawiono protokół barwienia Schiffa kwasem okresowym przystosowany do stosowania na komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej oczyszczonych z ludzkiej krwi żylnej. Takie próbki są wzbogacone o limfocyty i inne białe krwinki układu odpornościowego.

Wykrywanie glikogenu w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej za pomocą barwienia Schiffa kwasem okresowym

Tutaj prezentujemy wiarygodny i łatwy test do pomiaru zawartości glikogenu w komórkach sinic. Procedura polega na wytrącaniu, selektywnej depolimeryzacji i wykrywaniu pozostałości glukozy. Metoda ta jest odpowiednia zarówno dla szczepów dzikich, jak i genetycznie modyfikowanych i może ułatwić inżynierię metaboliczną sinic.

Oznaczanie zawartości glikogenu w sinicach

Optymalne stężenie sacharozy zostało określone do ekstrakcji glikogenu wątrobowego za pomocą wirowania w gradicynie gęstości sacharozy. Korzystne okazało się dodanie 10-minutowego etapu wrzenia w celu zahamowania enzymów rozkładających glikogen.

Ekstrakcja cząsteczek glikogenu wątrobowego w celu określenia struktury glikogenu

Zmodyfikowana procedura po utrwaleniu zwiększa kontrast cząsteczek glikogenu w tkance. W tym artykule przedstawiono protokół krok po kroku opisujący, jak obchodzić się z tkanką, przeprowadzać obrazowanie i stosować metody stereologiczne w celu uzyskania bezstronnych i ilościowych danych na temat specyficznej dla typu włókien subkomórkowej dystrybucji glikogenu w mięśniach szkieletowych.

Kwantyfikacja subkomórkowego rozkładu glikogenu we włóknach mięśni szkieletowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Test tkań zwierzęcych wykorzystuje detekcję scyntylacji jądrowej do określenia aktywności enzymatycznej syntazy glikogenu poprzez pomiar włączenia radioaktywnie znakowanej glukozy do glikogenu.

Ocena radiochemiczna aktywności enzymu syntazy glikogenowej w tkankach zwierzęcych

Opisujemy tutaj nowatorską, solidną i efektywną metodę tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP) do ekspresji, izolacji i charakterystyki kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych. Protokół ten może być wykorzystany do biochemicznej charakterystyki dyskretnych kompleksów, a także do identyfikacji nowych interaktorów i modyfikacji potranslacyjnych, które regulują ich funkcję.

Tandemowe oczyszczanie kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych

Opisujemy zmodyfikowaną ekstrakcję na małą skalę i testy kolorymetryczne mleczanu i pirogronianu u nicieni C. elegans. W przypadku korzystania z komercyjnych zestawów testowych ważny jest techniczny rozwój ich czułości i dokładności. Wytrącanie białek podczas ekstrakcji jest najbardziej krytycznym etapem ilościowego oznaczania metabolitów wewnątrzkomórkowych.

Małoskalowe testy kolorymetryczne wewnątrzkomórkowego mleczanu i pirogronianu u nicienia Caenorhabditis elegans

Poznaj spektrofotometryczne metody pomiaru aktywności enzymów metabolizmu glikogenu w komórkach eukariotycznych. Techniki te są niezawodne, ekonomiczne i nie wymagają izotopów promieniotwórczych.

Metody spektrofotometryczne do badania metabolizmu glikogenu eukariotycznego

Przeglądaj więcej filmów