Name: Testy immunocytochemiczne żywych komórek 3D rozlanego glejaka pośrodkowego u dzieci (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Poznaj metodę immunocytochemii żywych komórek 3D do badania migracji i inwazji komórek glejaka pośrodkowego u dzieci. Technika ta pozwala obserwować w czasie rzeczywistym ekspresję CD44 na błonie komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować dr Silvii Soddu i dr Giulii Federici (Jednostka Sieci Komórkowych i Molekularnych Celów Terapeutycznych, IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute, Rzym, Włochy) za dostęp do Systemu Obrazowania Żywych Komórek IncuCyte S3 we wstępnym przygotowaniu protokołu obrazowania. Ponadto dziękujemy Bernadett Kolozsvari za doradztwo techniczne. Badanie było wspierane przez grant Children with Cancer UK (16-234) oraz włoskie Ministerstwo Zdrowia Ricerca Corrente. M Vinci jest stypendystką organizacji Children with Cancer w Wielkiej Brytanii. R Ferretti jest stypendystą Fondazione Veronesi Fellowship (2018 i 2019). Autorzy dziękują Fondazione Heal za wsparcie oraz Fundacji Szpitala Dziecięcego za finansowanie Queensland Children's Tumor Bank.

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etycznych ds. badań na ludziach.
UWAGA: To badanie zostało przeprowadzone przy użyciu przyrządu do analizy żywych komórek Incucyte S3 i/lub SX5 (określanego jako instrument do analizy żywych komórek).
1. Generowanie sferoid guza o powtarzalnej wielkości
UWAGA: Protokół (sekcja 1) opisany przez Vinci et al. 20157,12, został użyty zgodnie z poniższymi zmianami, z pewnymi modyfikacjami:
<ol>
	<li>Zebrać zmutowane neurosfery DMG H3K27M (NS) i odwirować przy 170 x g przez 10 minut (min) w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Inkubować NS z 500 μl roztworu akutazy przez 3 minuty w temperaturze 37 °C w celu ich rozdrobnienia.</li>
	<li>Zneutralizować roztwór akutazy za pomocą media7 i odwirować zawiesinę komórkową przy 355 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki TSM, a następnie policzyć komórki za pomocą komory do liczenia komórek.</li>
	<li>Rozcieńczyć zawiesinę komórek, aby uzyskać 2,5-5 x 103komórek/ml i wysiać 100 μl/studzienkę na 96-dołkowe płytki okrągłodenne o bardzo niskim przyczepie (ULA) (patrz tabela materiałów). Użyj odpowiedniej gęstości komórek, aby uzyskać pojedyncze NS o średnicy ~300 μm, 4 dni po wysianiu komórek (250-500 komórek/dołek dla bardzo agresywnych komórek glejaka).</li>
	<li>Wizualnie potwierdź tworzenie się NS za pomocą odwróconego mikroskopu 4 dni po wysianiu komórek.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kompleksu ALR/przeciwciało i przygotowanie do testu inwazji
UWAGA: Do procedury znakowania przeciwciał stosuje się protokół znakowania przeciwciał barwników10 dla immunocytochemii żywych komórek z pewnymi modyfikacjami, jak opisano poniżej. W przypadku testu inwazji przestrzegany jest protokół opisany wcześniej przez Vinci et al. 201512.
<ol>
	<li>Weź pod uwagę liczbę dołków (np. 60 dołków), aby przeanalizować i obliczyć objętość potrzebną dla każdego odczynnika. Należy również uwzględnić studzienki do kontroli ujemnej (próbki z ALR, ale bez przeciwciał).</li>
	<li>Dodać 100 μl sterylnej wody do ALR w celu uwodnienia odczynnika (stężenie końcowe = 0,5 mg/ml). Odpipetować do wymieszania roztworu. 
	UWAGA: Odczynnik jest wrażliwy na światło; Dlatego trzymaj się w ciemności. Podzielić pozostały odczynnik na porcje i przechowywać w temperaturze -80 °C (unikać zamrażania i rozmrażania).</li>
	<li>Wymieszać przeciwciało z ALR w pożywce TSM (lub pożywce odpowiedniej do wzrostu komórek dla wybranej linii komórkowej) na okrągłej płytce wielodołkowej lub w bursztynowej probówce i chronić przed światłem.</li>
	<li>Przygotować wystarczającą ilość pożywki, aby dozować 25 μl/studzienkę przy 3-krotnym końcowym stężeniu testowym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min. 
	UWAGA: Zalecany jest stosunek molowy przeciwciała do ALR 1:3, przy końcowym (1x) stężeniu badanego przeciwciała <1,5 μg/ml. Do eksperymentów w tym protokole stosuje się mysie przeciwciało anty-ludzkie CD44 (stężenie początkowe 86 μg/ml) przy końcowym stężeniu 0,1 μg/ml (3x stężenie = 0,3 μg/ml). Dodaj odczynniki w następującej kolejności: i) przeciwciało; ii) ALR; iii) Podłoże TSM. Wymieszać pipetując.</li>
	<li>Rozcieńczyć odczynnik supresorowy tła (BSR) w pożywce TSM (lub odpowiedniej pożywce do wzrostu komórek dla wybranej linii komórkowej) o stężeniu 1,5 mM (3x), aby uzyskać pod koniec testu końcowe stężenie 0,5 mM.</li>
	<li>Przeprowadzić test inwazji bezpośrednio w 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem ULA, w której początkowo wysiano komórki. Przed rozpoczęciem sprawdź wizualnie NS za pomocą odwróconego mikroskopu.</li>
	<li>Delikatnie i powoli usunąć 75 μl/studzienkę pożywki, unikając dotykania dna studzienki, w której znajduje się NS. Sprawdź wizualnie obecność NS.</li>
	<li>Delikatnie dodaj 25 μl BSR do każdej studzienki.</li>
	<li>Delikatnie dodaj 25 μl kompleksu ALR/przeciwciało do każdej studzienki. Odczekać 2 lub 3 minuty, aby kompleks ALR/przeciwciało zmieszał się z pożywką.</li>
	<li>Sprawdź wzrokowo za pomocą odwróconego mikroskopu, aby upewnić się, że każdy NS jest umieszczony centralnie na dnie studni. Unikaj tworzenia się pęcherzyków. Jeśli pojawi się bąbelek, usuń go za pomocą igły.</li>
	<li>Umieść talerz na lodzie i odczekaj 5 minut, aby spód talerza ostygł.</li>
	<li>Za pomocą wstępnie schłodzonej końcówki p200 dozuj 75 μl/studzienkę podstawowej matrycy membranowej (BMM), umieszczając końcówkę pipety na wewnętrznej ścianie studzienki i unikając dotykania dna studzienki. Unikać tworzenia się pęcherzyków i usunąć sterylną igłą istniejące. 
	UWAGA: Upewnij się, że BMM został rozmrożony w temperaturze 4 °C z poprzedniej nocy.</li>
	<li>Pozostaw talerz na lodzie na 5 minut, aby BMM wymieszał się z podłożem. Sprawdź wzrokowo za pomocą odwróconego mikroskopu obecność NS i czy są one centralnie umieszczone w studni. W przeciwnym razie odwirować płytkę w temperaturze 4 °C przy 180 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Przenieść płytkę do przyrządu do analizy żywych komórek (tabela materiałów) umieszczonego w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2, wilgotności 95%.</li>
</ol>
3. Przygotowanie kompleksu ALR/przeciwciało i konfiguracja do testu migracji
UWAGA: Do procedury znakowania przeciwciał stosuje się protokół znakowania barwników10 dla immunocytochemii żywych komórek.
<ol>
	<li>Weź pod uwagę liczbę studzienek do analizy i oblicz objętość potrzebną dla każdego odczynnika. Należy również uwzględnić studzienki potrzebne do kontroli ujemnych. Przed rozpoczęciem sprawdź wizualnie NS za pomocą odwróconego mikroskopu.</li>
	<li>Używaj 96-dołkowych płytek z płaskim dnem. Wykonaj procedurę powlekania zgodnie z opisem Vinci et al., 201314. W tym badaniu BMM jest używany jako cienka powłoka.</li>
	<li>Gdy powłoka jest gotowa, usuń nadmiar powłoki BMM za pomocą końcówki p200, umieszczając końcówkę na krawędzi studzienki i unikając dotykania dna. W przypadku pracy z wieloma studzienkami należy użyć pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Wytnij końcówkę p200, weź 50 μl pożywki komórkowej + NS z każdej wybranej studzienki i przenieś ją do powlekanej studzienki z płaskim dnem. Sprawdź wizualnie obecność i położenie NS w każdej studzience. 
	UWAGA: Każdy NS musi być umieszczony centralnie w studni. Unikaj opierania się o końcówkę na krawędzi studzienki podczas przenoszenia, ale upuść podłoże centralnie do studzienki bez dotykania dna. W przypadku komórek masowo migrujących należy wziąć pod uwagę większą liczbę powtórzeń niż standardowe trzy kontrpróby. Dzieje się tak dlatego, że gdy NS znajduje się zbyt blisko krawędzi studni, migrujące komórki mogą pokryć mniejszy obszar studni.</li>
	<li>Ponownie uwodnić ALR zgodnie z powyższym opisem (kroki 2.2-2.3). 
	UWAGA: Odczynnik jest wrażliwy na światło. Patrz wyżej, aby zapoznać się z prawidłowymi procedurami obchodzenia się z produktem.</li>
	<li>Wymieszać przeciwciało z ALR w odpowiednim kompletnym pożywce do wzrostu komórek na okrągłej płytce wielodołkowej lub w bursztynowej probówce i chronić przed światłem. Przygotuj wystarczającą ilość, aby dozować 50 μl/studzienkę przy 3-krotnym stężeniu końcowym testu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min. 
	UWAGA: Dodaj odczynniki w kolejności wskazanej powyżej (krok 2.4).</li>
	<li>Postępuj zgodnie z tą samą procedurą, co opisano w kroku 2.5.</li>
	<li>Delikatnie dodaj 50 μl BSR do każdej studzienki.</li>
	<li>Delikatnie dodaj 50 μl ALR/przeciwciała do każdej studzienki. Odczekaj 2 lub 3 minuty, aby odczynniki się wymieszały i sprawdź wizualnie za pomocą odwróconego mikroskopu, aby upewnić się, że większość powtórzonych NS znajduje się centralnie w studzience.</li>
	<li>Unikaj tworzenia się pęcherzyków i usuń wszelkie istniejące za pomocą igły. Delikatnie przenieść płytkę w przyrządzie do analizy żywych komórek umieszczonym w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2, wilgotności 95%.</li>
</ol>
4. Ustawienia instrumentu do analizy żywych komórek do akwizycji obrazu
<ol>
	<li>Zeskanuj płytki za pomocą przyrządu do analizy żywych komórek (specyfikacje znajdują się w Tabeli materiałów) z interwałami skanowania, zaczynając od punktu zerowego (t0) testów inwazji i migracji ustawionych odpowiednio po kroku 2.14 i 3.10. do 96 godz. 
	UWAGA: Upewnij się, że masz możliwość pozbycia się przyrządu do analizy żywych komórek natychmiast po rozpoczęciu testu inwazji i migracji. W zależności od typu nowotworu, komórki mogą rozpocząć inwazję lub migrację z NS już w ciągu 1 godziny od ustawienia testu.</li>
	<li>W oprogramowaniu przyrządu do analizy na żywo wybierz opcję Zaplanuj pozyskiwanie. Kliknij zakładkę + i wybierz opcję Skanuj zgodnie z harmonogramem.</li>
	<li>W oknie oprogramowania Utwórz lub przywróć naczynie kliknij opcję Nowy.</li>
	<li>Wybierz konkretną aplikację w instrumencie do analizy żywych komórek dla pozyskiwania inwazji i migracji. Wybierz typ skanowania sferoidów, obiektyw 4x, Faza+Jasne pole i zielone kanały obrazu dla testu inwazji. Wybierz typ skanowania Klonowanie rozcieńczenia, obiektyw 4x oraz Fazę i Zielony dla testu migracji.</li>
	<li>Wybierz typ płyty i zdefiniuj studnie, które mają zostać zeskanowane, podświetlając je na mapie płyty.</li>
	<li>Ustaw częstotliwość skanowania (dla eksperymentów w tym protokole częstotliwość skanowania wynosiła 15 minut dla inwazji i 30 minut dla migracji).</li>
	<li>Kliknij Dodaj do harmonogramu i rozpocznij skanowanie.</li>
</ol>
5. Ustawienie instrumentu do analizy na żywo do analizy obrazu
<ol>
	<li>Wybierz zakładkę Utwórz nową definicję analizy.</li>
	<li>Wybierz aplikację Spheroid Invasion lub Basic Analyzer odpowiednio dla inwazji i migracji na karcie.</li>
	<li>Wybierz kanały odpowiednie dla inwazji i migracji (dla Inwazji: Faza+Brightfield-Zielony; dla Migracji: Faza-Zielona) w kanale obrazu.</li>
	<li>Wybierz kilka reprezentatywnych obrazów z 3-4 dołków, aby wyświetlić podgląd i doprecyzować ustawienia analizy.</li>
	<li>W przypadku testu inwazji, na karcie Definicja analizy, dostosuj ustawienia aplikacji w kanałach Brightfield i Green z następującym ustawieniem, aby wygenerować precyzyjną segmentację między całą sferoidą a komórkami atakującymi (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 5; niebieska maska): 
	Segmentacja jasnego pola: Czułość całego sferoidu = 50; Czułość komórki atakującej = 100; Oczyść = default. 
	Całe filtry sferoidalne: ustaw wszystkie parametry jako domyślne. 
	Filtry atakujących komórek: ustaw wszystkie parametry jako domyślne. 
	Zielona segmentacja: promień = 900.</li>
	<li>W przypadku testu migracji dostosuj ustawienia aplikacji w kanałach Faza i Zielony, aby wygenerować precyzyjną segmentację między Confluence i Green Cells (patrz <silna klasa = "xfig" >Rysunek 5, żółte i różowe maski) z następującym ustawieniem: 
	Faza: ustaw wszystkie parametry jako domyślne. 
	Zielona segmentacja: promień = 300; Próg = 1000 
	Czyszczenie: Wypełnienie otworu = 400; Filtry = default. 
	Whole Well: ustaw wszystkie parametry jako domyślne.</li>
	<li>Sprawdź, czy ustawienia analizy są poprawne dla NS, klikając losowo kilka dołków. Segmentacja musi wyznaczać kontur sferoidy. Jeśli nie, odpowiednio dostosuj ustawienie.</li>
	<li>Wybierz studnie i punkty czasowe do analizy.</li>
	<li>Zapisz definicję analizy i kliknij przycisk Zakończ.</li>
</ol>

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+metastasis%3A+markers+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Breast cancer metastasis: markers and models.</a> Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).</li>
<li>Magrì, A., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+early+metastatic+seeding+occur+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).</li>
<li>Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neurocentric+perspective+on+glioma+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A neurocentric perspective on glioma invasion.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).</li>
<li>Caretti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+spread+of+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).</li>
<li>Pericoli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+multiple+platforms+for+the+analysis+of+multifluorescent+marking+technology+applied+to+pediatric+GBM+and+DIPG%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763(2020).</li>
<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversity+and+cooperativity+between+subclonal+populations+of+pediatric+glioblastoma+and+diffuse+intrinsic+pontine+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).</li>
<li>Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+lentiviral-inducible+transgene+expression+systems+and+versatile+single-plasmid+reporters+for+in+vitro+and+in+vivo+cancer+biology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies.</a> Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).</li>
<li>Huang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-regulated+ROS+from+xanthine+oxidase+acts+as+an+early+effector+for+triggering+late+mitochondria-dependent+apoptosis+in+cathepsin+s-targeted+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells.</a> PLoS One. 10 (6), 0128045(2015).</li>
<li>Prudner, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+starvation+and+docetaxel+induce+c-Myc-driven+hENT1+surface+expression+to+overcome+gemcitabine+resistance+in+ASS1-negative+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors.</a> Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).</li>
<li>Ferretti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+invasion+into+Matrigel%3A+optimized+protocol+for+RNA+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction.</a> Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).</li>
<li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+%283D%29+tumor+spheroid+invasion+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686(2015).</li>
<li>Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+role+of+CD44+in+cancer+progression%3A+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications.</a> Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 64(2018).</li>
<li>Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+spheroid-based+migration+assays+for+evaluation+of+therapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents.</a> Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).</li>
<li>Taylor, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+activating+ACVR1+mutations+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).</li>
<li>Mount, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+antitumor+efficacy+of+anti-GD2+CAR+T+cells+in+H3-K27M%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M.</a> Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).</li>
<li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2016+World+Health+Organization+classification+of+tumors+of+the+central+nervous+system%3A+A+summary%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary.</a> Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).</li>
<li>Czabanka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctional+adhesion+molecule-C+mediates+the+recruitment+of+embryonic-endothelial+progenitor+cells+to+the+perivascular+niche+during+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209(2020).</li>
<li>Pardoll, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blockade+of+immune+checkpoints+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).</li>
<li>Panková, K., Rösel, D., Novotný, M., Brábek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+mechanisms+of+transition+between+mesenchymal+and+amoeboid+invasiveness+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).</li>
<li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych istotnych powiązań ani nie są zaangażowani finansowo w żadną organizację lub podmiot mający interes finansowy lub konflikt finansowy z tematyką lub materiałami omawianymi w manuskrypcie.

Immunocytochemia żywych komórek 3D, którą przyjęliśmy do inwazji i migracji DMG u dzieci, może być łatwo dostosowana również do innych wysoce inwazyjnych typów komórek nowotworowych, w tym linii komórkowych raka piersi i jelita grubego. 
W odróżnieniu od wcześniej wykonywanych testów immunocytochemicznych na żywych komórkach 2D10, podczas pracy w 3D sugeruje się zwrócenie uwagi na kilka krytycznych kroków. W szczególności w przypadku opisanego przez nas testu inwazji za...

Zdolność komórek nowotworowych do unikania i rozprzestrzeniania się w otaczającej tkance jest cechą charakterystyczną raka1. W szczególności ruchliwość komórek nowotworowych jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych, niezależnie od tego, czy jest to guz z przerzutami, taki jak breast2 lub rak jelita grubego3, czy też typ miejscowo inwazyjny, taki jak glejak rozlany4,5.
Obrazowanie odgrywa centralną rolę w badaniu wielu aspektów fenotypów komórek nowotworowych; jednak obrazowanie żywych komórek jest zdecydowanie preferowane podczas badania dynamicznych procesów komórkowych, takich jak migracja i inwazja, gdy zmiany w morfologii i interakcji komórka-komórka6,7 występują i mogą być łatwiej zbadane w miarę upływu czasu. Do obrazowania żywych komórek można stosować różne systemy mikroskopii optycznej, od kontrastu fazowego po konfokalne mikroskopy fluorescencyjne, a akwizycję obrazu przeprowadza się w krótkim lub długim okresie czasu na mikroskopie odwróconym wyposażonym w komorę do kontroli temperatury i CO2 lub w systemach analizy obrazu o wysokiej zawartości, które mają wbudowane komory, lub alternatywnie w systemach obrazowania, które mogą znajdować się w inkubatorze bez konieczności zakłócania pracy komórek przez cały czas trwania eksperymentu. Wybór zastosowanego systemu jest często podyktowany szeregiem czynników, takich jak wymagana rozdzielczość, długość całkowitego czasu pobierania i odstępy czasowe, rodzaj użytego naczynia i przepustowość testu (płytka jednokomorowa lub wielodołkowa), czułość użytych komórek (komórki cenne i/lub rzadkie) oraz fototoksyczność komórek, jeśli obecne są fluorofory.
Jeśli chodzi o obrazowanie fluorescencyjne w trybie na żywo, można to osiągnąć poprzez transdukcję komórek do ekspresji białek fluorescencyjnych albo w celu stabilnej ekspresji, albo jako system indukowalny8, przez transfekcję komórek przejściowych, lub za pomocą barwników komórkowych, które są teraz dostępne do znakowania żywych komórek7, do śledzenia żywych komórek, jak również do oznaczania organelli subkomórkowych9.
Ostatnio opracowano użyteczne podejście do immunocytochemii żywych komórek, gdzie przeciwciało rozpoznające wybrany marker powierzchniowy może być powiązane z odczynnikiem znakującym, a po dodaniu do pożywki, komórki wyrażające specyficzny marker mogą być łatwo zobrazowane w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania żywych komórek. Wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji markerów przy użyciu takiego systemu może być łatwo osiągnięta, gdy komórki są hodowane w dwuwymiarowych (2D) warunkach hodowli10.
W tym badaniu zoptymalizowaliśmy protokoły inwazji immunocytochemicznej żywych komórek 3D i migracji komórek pochodzących od pacjentów z rozlanym glejakiem linii środkowej (DMG) u dzieci11,12. DMG to wysoce agresywne nowotwory mózgu dotykające dzieci, w zdecydowanej większości związane z mutacją K27M w wariantach histonu H3. DMG powstają w pniu mózgu i obszarach linii środkowej ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i charakteryzują się wysoce naciekającym charakterem. Wykazano, że ta inwazyjna zdolność jest przynajmniej częściowo spowodowana przez niejednorodność wewnątrz guza i cechy rakopodobne komórek macierzystych komórek DMG7.
Aby zilustrować nasze testy, użyto odczynnika do znakowania przeciwciał (ALR) w połączeniu z przeciwciałem dla CD44. CD44 jest transbłonową glikoproteiną i cząsteczką adhezyjną ulegającą ekspresji na komórkach macierzystych i innych typach komórek, związaną z fenotypem komórek macierzystych raka oraz migracją i inwazją komórek nowotworowych13. Protokoły obejmują przygotowanie próbki, akwizycję obrazu w jasnym polu i trybie fluorescencyjnym oraz analizę na przyrządzie do analizy żywych komórek, który pozwolił na ilościowy pomiar w czasie rzeczywistym ogólnej ekspresji CD44 na błonie komórkowej DMG podczas inwazji i migracji 3D. Testy umożliwiły również wizualizację przerywanego sygnału fluorescencyjnego CD44 na poszczególnych komórkach podczas migracji i inwazji. Co ciekawe, zaobserwowano również działanie przeciwciała anty-CD44, które potencjalnie działając jako przeciwciało blokujące, również wydawało się zmniejszać migrację i inwazję komórek, a także indukować zmianę wzorca inwazji z zbiorowego fenotypu mezenchymalnego na bardziej monokomórkowy podobny do ameboidu.

<table><tbody><tr><td>96 dobrze poddanych działaniu TC mikropłytek</td><td>Corning</td><td>3595</td><td>rozmiar 96 studzienek, płytka polistyrenowa, płaskie dno</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Euroclone</td><td>ECB3056D</td><td>rozwiązanie do dysocjacji neurosfery</td></tr><tr><td>Komora Burkera</td><td>Mv medyczna</td><td></td><td>komora do zliczania komórek</td></tr><tr><td>FFL16034 CD-44 (156-3C11)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>3570</td><td>Mysi mAb IgG2a</td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>356237</td><td>Podstawna matryca membranowa (BMM), bez czerwieni fenolowej, bez LDEV</td></tr><tr><td>Fabfluor-488 Barwnik do znakowania przeciwciał</td><td>Incucyte</td><td>4743</td><td>Odczynnik do znakowania przeciwciał (ALR): Mysie przeciwciało IgG2a 488 do immunocytochemii żywych komórek</td></tr><tr><td>Incucyte S3 i/lub SX5 Instrument do analizy żywych komórek</td><td>Sartorius</td><td>-</td><td>Instrument Incucyte S3 i/lub SX5 jest używany do monitorowania i nadzoru komórek w czasie rzeczywistym, zdrowia i żywotności komórek, migracji i inwazji, a także do szerokiego zakresu testów fenotypowych opartych na komórkach.</td></tr><tr>Mikroskop <td></td><td>odwrócony</td> <td>-</td> <td>dowolny mikroskop odwrócony</td></tr> Odczynnik tłumiący <tr><td>tło Opti-Green</td><td>Incucyte</td><td>6500-0045</td><td>Odczynnik tłumiący tło (BSR)</td></tr> <tr><td>Pożywka dla komórek macierzystych nowotworu (TSM)</td> <td>-</td><td></td> <td>pożywka dla komórek wzrostu (patrz odniesienie w tekście, aby uzyskać szczegółowe informacje)</td></tr> <tr><td>Ultra-niskie mocowanie Płytka wielodołkowa</td><td>Corning Costar</td><td>7007</td><td>rozmiar 96 dołek, okrągłe dno jasny</td></tr></tbody></table>

testy immunocytochemiczne żywych komórek 3d rozlanego glejaka pośrodkowego u dzieci

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Migracja i inwazja komórek są specyficznymi cechami charakterystycznymi rozlanego glejaka linii środkowej (DMG) z mutacją H3K27M. Udało nam się już wymodelować te cechy za pomocą trójwymiarowych (3D) testów inwazji i migracji opartych na komórkach. W tym badaniu zoptymalizowaliśmy te testy 3D pod kątem immunocytochemii żywych komórek. Odczynnik do znakowania przeciwciał użyto do wykrycia w czasie rzeczywistym ekspresji cząsteczki adhezyjnej CD44 na błonie plazmatycznej migrujących i inwazyjnych komórek pierwotnej linii komórkowej DMG H3K27M pochodzącej od pacjenta. CD44 jest związany z fenotypem nowotworowych komórek macierzystych oraz migracją i inwazją komórek nowotworowych oraz bierze udział w bezpośrednich interakcjach z macierzą zewnątrzkomórkową ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Neurosfery (NS) z linii komórkowej DMG H3K27M osadzono w macierzy błony podstawnej (BMM) lub umieszczono na cienkiej warstwie powłoki BMM, w obecności przeciwciała anty-CD44 w połączeniu z odczynnikiem znakującym przeciwciała (ALR). Analizę obrazu immunocytochemicznego żywych komórek 3D przeprowadzono na przyrządzie do analizy żywych komórek w celu ilościowego pomiaru ogólnej ekspresji CD44, w szczególności na migrujących i atakujących komórkach. Metoda pozwala również na wizualizację w czasie rzeczywistym przerywanej ekspresji CD44 na błonie komórkowej migrujących i inwazyjnych komórek. Co więcej, test dostarczył również nowych informacji na temat potencjalnej roli CD44 w przejściu mezenchymalnym do ameboidalnym w komórkach DMG H3K27M.

Protokół immunocytochemii Live-3D-Cell dla inwazji i migracji został podsumowany w prostym i powtarzalnym schemacie postępowania na Rysunku 1. Poprzez wysianie komórek DMG na okrągłe płytki 96-dołkowe typu ULA uzyskuje się sferoidy (NS) o powtarzalnej wielkości, które są wykorzystywane w opisanych etapach. Gdy NS osiągną optymalną wielkość ok. 300 µm (około 4 dni po wysianiu), rozpoczyna się analizy inwazji12 oraz migracji14. Dodanie kompleksu ...

To badanie przedstawia protokół immunocytochemii żywych komórek 3D zastosowany do pediatrycznej linii komórkowej rozlanego glejaka pośrodkowego, przydatny do badania w czasie rzeczywistym ekspresji białek na błonie plazmatycznej podczas dynamicznych procesów, takich jak inwazja i migracja komórek 3D.

Testy immunocytochemiczne żywych komórek 3D rozlanego glejaka pośrodkowego u dzieci

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Rozlany glejak linii środkowej jest wysoce inwazyjnym guzem mózgu. Metoda ta pomaga badać w czasie rzeczywistym, w jaki sposób komórki DMG migrują i atakują w kontekście 3D, dostarczając szczegółowych informacji na temat potencjalnej roli kluczowej cząsteczki adhezyjnej. Używając odczynnika znakującego i specyficznego przeciwciała anty-CD44, możemy badać za pomocą obrazowania żywych komórek ekspresję CD44 na błonie plazmatycznej na komórkach DMG również w migracji i inwazji 3D.Zastosowanie tej techniki uwypukliło potencjalną rolę CD44 w ruchliwości tych komórek, co sugeruje, że może on stanowić cenny i inwazyjny cel molekularny. Na początek należy ponownie nawodnić ALR, dodając 100 mikrolitrów sterylnej wody i wymieszać roztwór, pipetując. Zmieszać przeciwciało z ALR w pożywce TSM na płytce wielodołkowej z okrągłym dnem lub w bursztynowej probówce i chronić przed światłem.Przygotuj wystarczającą ilość pożywki, aby dozować 25 mikrolitrów na studzienkę przy trzykrotnym końcowym stężeniu testowym, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Rozcieńczyć BSR w pożywce TSM o stężeniu 1,5 milimolowym, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 milimola na końcu testu. Następnie delikatnie i powoli usuń 75 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki, unikając dotykania dna studzienki, w której znajduje się NS i wizualnie sprawdzając obecność NS.Delikatnie dodaj 25 mikrolitrów kompleksu przeciwciał BSR i ALR do każdej studzienki i pozwól kompleksowi przeciwciał ALR zmieszać się z pożywką przez dwie do trzech minut. Używając odwróconego mikroskopu, upewnij się, że każdy NS jest umieszczony centralnie na dnie studni. Unikaj tworzenia się pęcherzyków, usuwając je za pomocą igły.Umieść talerz na lodzie na pięć minut, aby dno talerza ostygło. Dozuj 75 mikrolitrów BMM na studzienkę, umieszczając wstępnie schłodzoną końcówkę P200 na wewnętrznej ścianie studni, unikając tworzenia się pęcherzyków i dotykając dna studzienki. Pozostaw talerz na lodzie na pięć minut, aby BMM wymieszał się z podłożem.Za pomocą odwróconego mikroskopu sprawdź położenie NS. A jeśli nie ma go centralnie, odwiruj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w temperaturze 180 razy G przez pięć minut. Następnie przenieś płytkę do przyrządu do analizy żywych komórek umieszczonego w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 95% wilgotności. Gdy studzienki zostaną pokryte BMM, wytnij końcówkę P200.Weź 50 mikrolitrów pożywki komórkowej i NS z każdej wybranej studzienki i przenieś ją do powlekanej studzienki z płaskim dnem. Sprawdź wizualnie obecność i położenie NS w każdej studzience. Delikatnie dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała BSR i ALR do każdej studzienki, czekając od dwóch do trzech minut, aby odczynniki się wymieszały.Używając odwróconego mikroskopu, upewnij się, że większość replikatów NS znajduje się centralnie w studni. Po upewnieniu się, że nie ma żadnych pęcherzyków, delikatnie przenieś płytkę do przyrządu do analizy żywych komórek, jak pokazano wcześniej. W oprogramowaniu przyrządu do analizy komórek na żywo wybierz opcję harmonogram pozyskiwania, a następnie kliknij zakładkę plus i wybierz opcję skanowania zgodnie z harmonogramem, aby zeskanować płytki z odstępami czasu, jak wspomniano w rękopisie tekstowym.W oknie oprogramowania utwórz lub przywróć naczynie, a następnie kliknij opcję Nowy. Wybierz typ skanowania sferoidowego, fazę plus jasne pole, zielone kanały obrazu dla testu inwazji i obiektyw 4X. Wybierz skan klonowania rozcieńczenia, obiektyw typu 4X oraz fazę i kolor zielony dla testu migracji.Wybierz typ płyty i zdefiniuj dołki, które mają być skanowane, podświetlając je na mapie płyty, a następnie ustaw częstotliwość skanowania. Kliknij Dodaj do harmonogramu i rozpocznij skanowanie. Wybierz zakładkę Utwórz nową definicję analizy.Następnie na karcie wybierz aplikację inwazji sferoidów lub podstawowego analizatora odpowiednio dla inwazji i migracji. Wybierz odpowiednie kanały inwazji i migracji w kanale obrazu. Wybierz kilka reprezentatywnych obrazów z trzech lub czterech dołków, aby wyświetlić podgląd i doprecyzować ustawienia analizy.W przypadku testu inwazji, w zakładce definicji analizy, dostosuj ustawienia aplikacji w kanałach jasnego pola i zielonego z ustawieniami wymienionymi w manuskrypcie tekstowym, aby wygenerować precyzyjną segmentację między komórkami sferoidalnymi i inwazyjnymi. W przypadku testu migracji dostosuj ustawienia aplikacji, jak wspomniano w manuskrypcie tekstowym w kanałach fazowych i zielonych, aby wygenerować precyzyjną segmentację między zbiegiem a zielonymi komórkami. Sprawdź, czy ustawienia analizy są poprawne dla NS, klikając losowo kilka dołków.Wybierz studnie i punkty czasowe do analizy. Zapisz definicję analizy i kliknij przycisk Zakończ. Reprezentatywne immunofluorescencyjne obrazy konfokalne ekspresji CD44 w pierwotnych komórkach pobranych od pacjentów z DMG wykazały rolę CD44 w migracji i inwazji komórek.Immunochemia komórek 3D na żywo pozwala na wizualizację ekspresji CD44. Reprezentatywne klatki upływu czasu zarówno dla migracji, jak i inwazji pokazują obecność i brak zielonego sygnału fluorescencyjnego na tej samej komórce obserwowanego w czasie, co sugeruje, że ekspresja CD44 jest włączana i wyłączana, gdy komórki migrują i inatakują. Procesy migracji i inwazji są śledzone przez 96 godzin, wykazując komórki QCTB-R059 z wysokim poziomem CD44.Kwantyfikacja ekspresji CD44 i jej wzrost w czasie mierzono za pomocą ogólnego sygnału zielonej fluorescencji związanego z ALR zarówno dla migracji, jak i inwazji. Kiedy przeciwciało anty-CD44 jest stosowane na żywych komórkach, wpływa na morfologię komórek, indukując przejście od inwazji mezenchymalnej do ameboidalnej oraz zmniejszając zdolność inwazyjną i migracyjną tych komórek. Najbardziej krytycznym etapem metody jest zmieszanie odczynnika znakującego z przeciwciałem, dodanie mieszaniny do Matrigelu i pożywki oraz dostęp do instrumentu do obrazowania żywych komórek.Metoda ta może być dalej wdrażana poprzez użycie dwóch lub więcej charakterystycznych odczynników znakujących i przeciwciał w celu zbadania interakcji komórek DMG, w której pośredniczą komórki bezpośrednie i kontakt. Nasza metoda oferuje nowe narzędzia do badania w 3D komórkowych i molekularnych mechanizmów migracji i inwazji DMG, zapewniając nowe kierunki hamowania ich fenotypu naciekającego.

live-3d-cell-immunocytochemistry-assays-pediatric-diffuse-midline

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Źródło: Pericoli, G. et. al., Testy immunocytochemiczne żywych komórek 3D rozlanego glejaka linii środkowej u dzieci. J. Vis. Exp. (2021)Ten film przedstawia obrazowanie żywych komórek w celu obserwacji migracji komórek glejaka rozlanego w linii środkowej u dzieci za pomocą znakowania immunohistochemicznego przeciwciałami anty-CD44.

Obrazowanie oparte na immunocytochemii do wizualizacji migracji komórek glejaka u dzieci

Zrozumienie złośliwego zachowania raka wymaga stworzenia dokładnych modeli interakcji komórek nowotworowych z elementami mikrośrodowiska guza, takimi jak makrofagi. W tym miejscu opisujemy dwie metody badania interakcji komórek glejaka z makrofagami związanymi z nowotworem i mikroglejem, w których oceniany jest wpływ na inwazję glejaka.

Testy kokulturowe w celu zbadania stymulacji makrofagów i mikrogleju inwazji glejaka

Ten protokół opisuje metodę szybkiego przetwarzania pośmiertnego rozlanego wewnętrznego glejaka mostu w celu stworzenia modeli hodowli komórkowych pochodzących od pacjenta lub bezpośredniej charakterystyki komórek nowotworowych i mikrośrodowiskowych.

Protokół szybkiej pośmiertnej hodowli komórkowej rozlanego wewnętrznego glejaka mostu (DIPG)

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i stereotaktycznego podawania allogenicznych ludzkich limfocytów u myszy z niedoborem odporności z ortotopowymi ludzkimi pierwotnymi guzami mózgu. Badanie to dostarcza dowodów na słuszność koncepcji zarówno wykonalności, jak i skuteczności przeciwnowotworowej immunoterapii komórkowych dostarczanych do mózgu.

Stereotaktyczny transfer adoptywny cytotoksycznych komórek odpornościowych w mysich modelach ortotopowego ludzkiego glejaka wielopostaciowego ksenoprzeszczepów

Tutaj opisujemy techniki obrazowania żywych komórek, aby ilościowo zmierzyć migrację i inwazję komórek macierzystych glejaka mózgu w czasie i w wielu warunkach leczenia.

Testy obrazowania żywych komórek w celu zbadania migracji i inwazji komórek macierzystych glejaka wielopostaciowego guza mózgu

Neurosfery wyhodowane jako kultury 3D stanowią potężne narzędzie do badania biologii glejaka. W tym miejscu przedstawiamy protokół przeprowadzania immunohistochemii przy zachowaniu struktury 3D neurosfer glejaka poprzez zatapianie parafiny. Metoda ta umożliwia scharakteryzowanie właściwości neurosfery glejaka, takich jak łodyga i różnicowanie neuronalne.

Ocena biomarkerów w glejaku za pomocą immunohistochemii na kulturach neurosfery 3D glejaka zatopionych w parafinie

Tutaj opisujemy łatwy w użyciu test na inwazję glejaka. Ten test jest odpowiedni dla komórek macierzystych podobnych do glejaka. Opisano również makro Fidżi do łatwego ilościowego określania inwazji, migracji i proliferacji.

Model sferoidalny 3D glejaka wielopostaciowego

Ostatnie prace odkrywają wpływ neuronów na komórki glejaka dziecięcego (pHGG) wysokiego stopnia i ich wzajemne interakcje. Niniejsza praca pokazuje rozwój modelu in vitro kokulturującego komórki pHGG i neurony glutaminergiczne oraz rejestrującego ich interakcje elektrofizjologiczne w celu naśladowania tych interakcji.

Wspólna hodowla neuronów glutaminergicznego i pediatrycznych komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości w urządzeniach mikroprzepływowych w celu oceny interakcji elektrycznych

Zgłaszamy technikę pozwalającą na obrazowanie na żywo dynamiki mikrotubul w komórkach glejaka (GBM) atakujących tkankę mózgową kręgowców. Sprzężenie ortotopowego wstrzykiwania fluorescencyjnie znakowanych komórek GBM do przezroczystego mózgu danio pręgowanego z obrazowaniem przyżyciowym o wysokiej rozdzielczości umożliwia pomiar dynamiki cytoszkieletu podczas inwazji raka in situ.

Obrazowanie na żywo dynamiki mikrotubul w komórkach glejaka atakujących mózg danio pręgowanego

Przedstawiamy trójwymiarowy model migracji glejaka glejaka wykorzystującego magnetyczne gliomasfery pochodzące od pacjentów, generowane z nowo zdiagnozowanych i nawracających guzów. Platforma ta umożliwia wizualizację specyficznych dla pacjenta dynamiki migracji oraz ocenę skuteczności terapeutycznej. Test może być multipleksowany po migracji, aby ocenić lokalizację i wzorce ekspresji białek.

Powtarzalny 3D test migracji glejaka z magnetyczną lokalizacją sferoidów za pośrednictwem nanocząstek magnetycznych w warunkach hipoksycznych

Poznaj metodę immunocytochemii żywych komórek 3D do badania migracji i inwazji komórek glejaka pośrodkowego u dzieci. Technika ta pozwala obserwować w czasie rzeczywistym ekspresję CD44 na błonie komórkowej.

Testy immunocytochemiczne żywych komórek 3D rozlanego glejaka pośrodkowego u dzieci

Przeglądaj więcej filmów