Testy immunocytochemiczne żywych komórek 3D rozlanego glejaka pośrodkowego u dzieci

Rozlany glejak linii środkowej jest wysoce inwazyjnym guzem mózgu. Metoda ta pomaga badać w czasie rzeczywistym, w jaki sposób komórki DMG migrują i atakują w kontekście 3D, dostarczając szczegółowych informacji na temat potencjalnej roli kluczowej cząsteczki adhezyjnej. Używając odczynnika znakującego i specyficznego przeciwciała anty-CD44, możemy badać za pomocą obrazowania żywych komórek ekspresję CD44 na błonie plazmatycznej na komórkach DMG również w migracji i inwazji 3D.

Zastosowanie tej techniki uwypukliło potencjalną rolę CD44 w ruchliwości tych komórek, co sugeruje, że może on stanowić cenny i inwazyjny cel molekularny. Na początek należy ponownie nawodnić ALR, dodając 100 mikrolitrów sterylnej wody i wymieszać roztwór, pipetując. Zmieszać przeciwciało z ALR w pożywce TSM na płytce wielodołkowej z okrągłym dnem lub w bursztynowej probówce i chronić przed światłem.

Przygotuj wystarczającą ilość pożywki, aby dozować 25 mikrolitrów na studzienkę przy trzykrotnym końcowym stężeniu testowym, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Rozcieńczyć BSR w pożywce TSM o stężeniu 1,5 milimolowym, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 milimola na końcu testu. Następnie delikatnie i powoli usuń 75 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki, unikając dotykania dna studzienki, w której znajduje się NS i wizualnie sprawdzając obecność NS

Delikatnie dodaj 25 mikrolitrów kompleksu przeciwciał BSR i ALR do każdej studzienki i pozwól kompleksowi przeciwciał ALR zmieszać się z pożywką przez dwie do trzech minut. Używając odwróconego mikroskopu, upewnij się, że każdy NS jest umieszczony centralnie na dnie studni. Unikaj tworzenia się pęcherzyków, usuwając je za pomocą igły.

Umieść talerz na lodzie na pięć minut, aby dno talerza ostygło. Dozuj 75 mikrolitrów BMM na studzienkę, umieszczając wstępnie schłodzoną końcówkę P200 na wewnętrznej ścianie studni, unikając tworzenia się pęcherzyków i dotykając dna studzienki. Pozostaw talerz na lodzie na pięć minut, aby BMM wymieszał się z podłożem.

Za pomocą odwróconego mikroskopu sprawdź położenie NS. A jeśli nie ma go centralnie, odwiruj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w temperaturze 180 razy G przez pięć minut. Następnie przenieś płytkę do przyrządu do analizy żywych komórek umieszczonego w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 95% wilgotności. Gdy studzienki zostaną pokryte BMM, wytnij końcówkę P200.

Weź 50 mikrolitrów pożywki komórkowej i NS z każdej wybranej studzienki i przenieś ją do powlekanej studzienki z płaskim dnem. Sprawdź wizualnie obecność i położenie NS w każdej studzience. Delikatnie dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała BSR i ALR do każdej studzienki, czekając od dwóch do trzech minut, aby odczynniki się wymieszały.

Używając odwróconego mikroskopu, upewnij się, że większość replikatów NS znajduje się centralnie w studni. Po upewnieniu się, że nie ma żadnych pęcherzyków, delikatnie przenieś płytkę do przyrządu do analizy żywych komórek, jak pokazano wcześniej. W oprogramowaniu przyrządu do analizy komórek na żywo wybierz opcję harmonogram pozyskiwania, a następnie kliknij zakładkę plus i wybierz opcję skanowania zgodnie z harmonogramem, aby zeskanować płytki z odstępami czasu, jak wspomniano w rękopisie tekstowym.

W oknie oprogramowania utwórz lub przywróć naczynie, a następnie kliknij opcję Nowy. Wybierz typ skanowania sferoidowego, fazę plus jasne pole, zielone kanały obrazu dla testu inwazji i obiektyw 4X. Wybierz skan klonowania rozcieńczenia, obiektyw typu 4X oraz fazę i kolor zielony dla testu migracji.

Wybierz typ płyty i zdefiniuj dołki, które mają być skanowane, podświetlając je na mapie płyty, a następnie ustaw częstotliwość skanowania. Kliknij Dodaj do harmonogramu i rozpocznij skanowanie. Wybierz zakładkę Utwórz nową definicję analizy.

Następnie na karcie wybierz aplikację inwazji sferoidów lub podstawowego analizatora odpowiednio dla inwazji i migracji. Wybierz odpowiednie kanały inwazji i migracji w kanale obrazu. Wybierz kilka reprezentatywnych obrazów z trzech lub czterech dołków, aby wyświetlić podgląd i doprecyzować ustawienia analizy.

W przypadku testu inwazji, w zakładce definicji analizy, dostosuj ustawienia aplikacji w kanałach jasnego pola i zielonego z ustawieniami wymienionymi w manuskrypcie tekstowym, aby wygenerować precyzyjną segmentację między komórkami sferoidalnymi i inwazyjnymi. W przypadku testu migracji dostosuj ustawienia aplikacji, jak wspomniano w manuskrypcie tekstowym w kanałach fazowych i zielonych, aby wygenerować precyzyjną segmentację między zbiegiem a zielonymi komórkami. Sprawdź, czy ustawienia analizy są poprawne dla NS, klikając losowo kilka dołków.

Wybierz studnie i punkty czasowe do analizy. Zapisz definicję analizy i kliknij przycisk Zakończ. Reprezentatywne immunofluorescencyjne obrazy konfokalne ekspresji CD44 w pierwotnych komórkach pobranych od pacjentów z DMG wykazały rolę CD44 w migracji i inwazji komórek.

Immunochemia komórek 3D na żywo pozwala na wizualizację ekspresji CD44. Reprezentatywne klatki upływu czasu zarówno dla migracji, jak i inwazji pokazują obecność i brak zielonego sygnału fluorescencyjnego na tej samej komórce obserwowanego w czasie, co sugeruje, że ekspresja CD44 jest włączana i wyłączana, gdy komórki migrują i inatakują. Procesy migracji i inwazji są śledzone przez 96 godzin, wykazując komórki QCTB-R059 z wysokim poziomem CD44.

Kwantyfikacja ekspresji CD44 i jej wzrost w czasie mierzono za pomocą ogólnego sygnału zielonej fluorescencji związanego z ALR zarówno dla migracji, jak i inwazji. Kiedy przeciwciało anty-CD44 jest stosowane na żywych komórkach, wpływa na morfologię komórek, indukując przejście od inwazji mezenchymalnej do ameboidalnej oraz zmniejszając zdolność inwazyjną i migracyjną tych komórek. Najbardziej krytycznym etapem metody jest zmieszanie odczynnika znakującego z przeciwciałem, dodanie mieszaniny do Matrigelu i pożywki oraz dostęp do instrumentu do obrazowania żywych komórek.

Metoda ta może być dalej wdrażana poprzez użycie dwóch lub więcej charakterystycznych odczynników znakujących i przeciwciał w celu zbadania interakcji komórek DMG, w której pośredniczą komórki bezpośrednie i kontakt. Nasza metoda oferuje nowe narzędzia do badania w 3D komórkowych i molekularnych mechanizmów migracji i inwazji DMG, zapewniając nowe kierunki hamowania ich fenotypu naciekającego.