Wzorce mikroprzepływowe i śledzenie wzrostu bakterii jednokomórkowych na podstawie fluorescencji

Zacznij od fluorescencyjnie znakowanej kultury bakteryjnej dodanej do buforu bezwęglowego.

Odwirować w celu osadzenia bakterii i wyrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić granulat w świeżym, bezwęglowym buforze zawierającym łagodny detergent.

Brak źródła węgla hamuje wzrost, a detergent zapobiega zbrylaniu się i utrzymuje komórki w zawieszeniu.

Załadować zawiesinę bakteryjną do strzykawki i podłączyć ją do pompy.

Wstrzyknąć zawiesinę do wlotu chipa mikroprzepływowego zawierającego kanał z pułapkami osadzonymi w podłodze.

Powoli wyciągnij ciecz z wylotu kanału.

Gdy ciecz się cofa, siły kapilarne kierują bakterie w kierunku ujścia.

W tym procesie pojedyncze komórki bakteryjne osadzają się w pułapkach, powodując powstawanie wzorców bakteryjnych.

Ciągle przepłukuj kanał podgrzanym, bogatym w składniki odżywcze bulionem.

Bakterie wznawiają wzrost i tworzą mikrokolonie wewnątrz pułapek.

Użyj mikroskopii fluorescencyjnej, aby uchwycić obrazy poklatkowe i przeanalizować wzrost bakterii w kontrolowanym środowisku.

Odpipetować jeden mililitr pożywki MOPS do fiolki wirówkowej i dodać 10 mikrolitrów 0,132 molowego fosforanu potasu.

Podać 100 mikrolitrów nocnej kultury do fiolki wirówki i odwirować kulturę w temperaturze 2300 razy g przez dwie minuty. Delikatnie wyrzucić sklarat sklaratu, aby ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze świeżej pożywki MOPS z 0,015% Tween 20 i 0,01% fosforanu potasu i załadować zawiesinę bakteryjną do jednomililitrowej strzykawki. Aby zabezpieczyć strzykawkę i połączenie rurki, należy bezpośrednio włożyć igłę do rurki.

Teraz zamontuj strzykawkę na pompie strzykawkowej i wstrzyknij zawiesinę do chipa mikroprzepływowego przez wlot znajdujący się w górnej części kanału, aż zawiesina pokryje obszar szablonu pułapkami. Ustaw pompę strzykawkową na natężenie przepływu od 0,07 do 0,2 mikrolitra na minutę, aby pobrać zawiesinę bakteryjną i monitorować proces tworzenia wzoru za pomocą oprogramowania mikroskopowego. Po ułożeniu matrycy z komórkami zwiększ natężenie przepływu pobierania, aby szybko opróżnić kanał mikroprzepływowy i przepłukać go świeżym LB, który został wcześniej odgazowany przez co najmniej 30 minut i wstępnie podgrzany w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Teraz ustaw pompę strzykawkową na natężenie przepływu dwóch mikrolitrów na minutę, aby delikatnie przepłukać kanał. Po napełnieniu kanału ponownie zwiększ natężenie przepływu. Uzyskuj obrazy rosnących bakterii w żądanym powiększeniu i odstępie czasu.