Montaż i śledzenie rozwoju społeczności mikrobiologicznej w ramach platformy Microwell Array
6 czerwca 2017
Rozwój społeczności mikroorganizmów zależy od kombinacji czynników, w tym architektury środowiska, liczebności członków, cech i interakcji. Protokół ten opisuje syntetyczne, mikrofabrykowane środowisko do jednoczesnego śledzenia tysięcy społeczności zawartych w studniach femtolitrowych, w którym można przybliżyć kluczowe czynniki, takie jak wielkość niszy i zamknięcie.
Ogólnym celem tej metody jest wysokoprzepustowa analiza równoległa wieloczłonowych społeczności drobnoustrojów w zamkniętych środowiskach przy użyciu układów mikrodołków krzemowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na wysokoprzepustowe, wysoce równoległe badania przesiewowe drobno zlokalizowanych interakcji mikrobiologicznych, które są istotne dla przemysłu, medycyny i środowiska. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie ekologii biomedycznej i mikrobiologicznej, takie jak: w jaki sposób ograniczenia przestrzenne nieodłącznie związane z drobnymi skalami napędzają deterministyczne i stochastyczne parametry rozwoju społeczności oraz jaki są ich kluczowe skutki dla liczebności i organizacji członków mikroorganizmów?
Zacznij od przygotowania układów mikrostudzienek. Najpierw wytnij pojedyncze chipy mikrodołkowe z płytek krzemowych wydrukowanych za pomocą wielu tablic za pomocą rysika diamentowego. Każdy pojedynczy chip zawiera podtablice studzienek o średnicach od pięciu do 100 mikronów przy trzech różnych gęstościach odstępów.
Na każdym chipie czterokrotnie powtarza się również cały motyw studni. Następnie przygotuj nawilżoną komorę za pomocą pudełka z końcówkami do pipet i chusteczki nasączonej PBS. Następnie nałóż 150 mikrolitrów kropli roztworu BSA na każdy chips i inkubuj chipsy w pudełku przez godzinę w temperaturze pokojowej.
W międzyczasie przygotuj bakterie. Odkręć kulturę i ponownie zawieś ją w 500 mikrolitrach świeżej pożywki R2A z dwuprocentowym glicerolem. Następnie zmierz gęstość kultury na 600 nanometrach i dostosuj stężenie do gęstości optycznej 0,02.
Po inkubacji chipsów usuń roztwór BSA i trzykrotnie przepłucz wióry PBS. Po spłukaniu osusz wióry gazowym azotem i włóż je z powrotem do nawilżonej komory. Następnie dodaj 150 mikrolitrów zawiesiny hodowlanej do każdego suchego wióra i inkubuj chipsy przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby bakterie miały czas na przyleganie do studzienek, ale podział komórek ewentualnego zanieczyszczenia jest powolny.
Aby przygotować chip do obrazowania, najpierw wykonaj szkiełko nakrywkowe pokryte agarozą dla każdego wióra. Upłynnić niewielką objętość agarozy, na każde szkiełko nakrywkowe potrzeba około pięciu mililitrów. Następnie umyj jedną stronę szkiełka nakrywkowego etanolem i wyśrodkuj go na szkiełku podstawowym umytą stroną do góry.
Następnie umieść dwie przekładki PDMS o grubości jednego milimetra wzdłuż długich krawędzi szkiełka nakrywkowego i przesuń szkiełko nakrywkowe tak, aby jeden milimetr zwisał ze szkiełka. Teraz wlej tyle agarozy na szkiełko nakrywkowe, aby całkowicie je przykryło. Następnie użyj drugiego szkiełka szkiełkowego, aby spłaszczyć agarozę do jednolitej grubości.
Przygotuj kilka takich zespołów prowadnic równolegle. Gdy agaroza zacznie krzepnąć, przenieś zestawy do czterech stopni Celsjusza. Po 15 minutach schładzania odetnij nadmiar agarozy wokół szkiełek nakrywkowych.
Następnie umieść zestawy na szalkach Petriego i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji chipsów z bakteriami, zanurz je pojedynczo w ultra czystej wodzie na 10 sekund każdy. Następnie połóż mokre frytki na brzegach na chusteczce, aż większość płynu spłynie.
Teraz usuń bakterie, które nie osiadły w studzienkach. Wytnij kawałek taśmy na długości chipa silikonowego i przyklej go do powłoki parylenowej na krzemie. Następnie odklej taśmę, aby usunąć powłokę parylenu i natychmiast przygotuj się do odwrócenia wióra.
Teraz umieść chip na zespole szkiełkowym tak, aby mikro studzienki stykały się z agarozą. Bądź bardzo ostrożny, aby nie przesunąć ani nie przesunąć chipa w kontakcie z agarozą. Teraz przenieś cały zespół do uchwytu szkiełka w komorze kontroli środowiska na górze sceny i uzyskaj zdjęcia poklatkowe w ciągu następnych 24 godzin w żądanym odstępie czasu i pod 10-krotnym powiększeniem.
Przetwarzaj stosy obrazów za pomocą konwencjonalnego, ogólnodostępnego oprogramowania. Najpierw zaimportuj sekwencję obrazów. Aby uśrednić, załaduj korekcję lub obrazy ciemnego pola.
Następnie wykonaj odejmowanie tła. Podaj wartość promienia, taką jak 135 pikseli, i wybierz paraboloidę ślizgową. Następnie usuń średni obraz ciemnego pola z przeciętnego obrazu pola oświetlenia, wybierając dwa obrazy i używając operacji odejmowania.
Teraz zastosuj korekcję oświetlenia w następujący sposób. Ustaw operację na dzielenie, ustaw i1 na obraz dołka, ustaw i2 na obraz korekcyjny, ustaw k1 na średnią obrazu korekcyjnego i ustaw k2 na zero. Następnie kliknij Utwórz nowe okno.
Aby określić ilościowo wzrost bakterii w mikrostudzienkach, najpierw wybierz obszary zainteresowania za pomocą wtyczki mikromacierzy. W menu mapy kliknij przycisk resetuj siatkę i określ wiersze, kolumny i średnice studni. Następnie z menu Kształt ROI wybierz okrąg.
Aby dostosować tablicę ROI do obrazu, tablicę ROI można przesuwać, naciskając ALT lub ALT+SHIFT i wybierając myszą ROI w lewym górnym rogu. Aby zmienić rozmiar ROI, naciśnij Shift, zaznaczając prawy dolny róg tablicy ROI. Aby dostosować odstępy między obszarami ROI, naciśnij Shift podczas przeciągania górnej lub dolnej strony tablicy.
Gdy tablica ROI znajdzie się w dołkach obrazu, kliknij opcję Zmierz RT. Następnie zostanie wyświetlona tabela ze wszystkimi pomiarami dla każdego obrazu lub punktu czasowego, którą można skopiować do arkusza kalkulacyjnego w celu analizy. Porównano wzrost dwóch szczepów Pseudomonas aeruginosa. Jeden szczep konstytutywnie eksprymuje toksyczne białka efektorowe związane z wydzielinami typu szóstego.
Drugi jest podatny na patogenezę typu szóstego z powodu utraty funkcji. Oba wyrażają różne białka fluorescencyjne. Kokultury badano podłużnie i w różnych rozmiarach studzienek.
Bakterie hodowano indywidualnie i jako kokulturę. 20 godzin wzrostu obrazowano w odstępach 30-minutowych. Po wprowadzeniu poprawek programowych na danych obrazowych, wykreślono ilościowe trajektorie wzrostu.
W przypadku kokultury dane nie sugerują zbyt dużej zmiany we wzroście. Aby posunąć analizę do przodu, każda trajektoria została dopasowana do zmodyfikowanej funkcji logistycznej z trzema parametrami: maksymalnym sygnałem, maksymalną szybkością i czasem opóźnienia. Analiza ta sugeruje, że kokultura tych gatunków miała znikomy wpływ na ich ogólny wzrost, a ich zmienność widoczna na krzywych wzrostu jest najprawdopodobniej spowodowana czynnikami środowiskowymi.
Po opanowaniu konfiguracji można ją wykonać w ciągu zaledwie kilku godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby mieć solidnie rosnące komórki, aby prawidłowo dostosować końcowe wartości średnicy zewnętrznej ogniwa, aby mieć jednolite warstwy ślimaka w zespołach chipów i zachować ostrożność na etapie odklejania parylenu. Podążając za tą procedurą, można odpowiedzieć na pytania, takie jak to, w jaki sposób zmienia się ekspresja genów w każdej społeczności w funkcji składu i organizacji społeczności, za pomocą analizy materiału genetycznego.
Nie zapominaj, że praca z Pseudomonas aeruginosa może być potencjalnie niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak rękawice, kurtka, okulary i odpowiednie techniki aseptyki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę wysoko przepustowości analizy społeczności mikrobiologicznych w ograniczonych środowiskach przy użyciu krzemianowych mikro dołeczków. Umożliwia śledzenie interakcji mikrobiologicznych istotnych dla różnych dziedzin, w tym przemysłu i medycyny.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Ekologia mikrobiologiczna
- Badania biomedyczne
- Nauki o środowisku
Tło
- Społeczności mikrobiologiczne są wpływane przez architekturę środowiskową i interakcje członków.
- Rozumienie tych społeczności może dostarczyć wglądu w ekologiczne i biomedyczne pytania.
- Metody wysoko przepustowości są niezbędne do analizowania złożonych interakcji.
- To badanie wykorzystuje mikrofabrykowane środowiska dla precyzyjnego śledzenia.
Cel badania
- Analiza wieloczłonowych społeczności mikrobiologicznych w ograniczonych przestrzeniach.
- Badanie, jak ograniczenie przestrzenne wpływa na rozwój społeczności.
- Zbadanie wpływu na liczebność i organizację członków mikrobiologicznych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie mikro dołeczków z krzemianowych płytek.
- Wykorzystanie dołeczków o średnicach od pięciu do 100 mikrometrów.
- Selekcja interakcji mikrobiologicznych w sposób wysoko przepustowości.
- Równoległa analiza dynamiki społeczności w ograniczonych środowiskach.
Główne wyniki
- Wykazano zdolność do śledzenia tysięcy społeczności mikrobiologicznych jednocześnie.
- Zidentyfikowano kluczowe interakcje wpływające na wielkość niszy i ograniczenie.
- Dostarczono wglądu w deterministyczne i losowe parametry rozwoju społeczności.
- Podkreślono znaczenie tej metody dla przemysłu i zastosowań środowiskowych.
Konkluzje
- Ta metoda oferuje nowatorskie podejście do badania interakcji mikrobiologicznych.
- Poprawia zrozumienie dynamiki społeczności w ograniczonych środowiskach.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych odkryciach, aby zająć się wyzwaniami ekologicznymi i biomedycznymi.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This microwell array platform enables high-throughput parallel analysis of microbial community development in confined environments, supporting mechanistic de-risking in early discovery by quantifying spatial and interaction effects on microbial growth. The method provides predictive confidence in target validation by revealing how fine-scale spatial constraints influence deterministic and stochastic parameters of community dynamics, directly informing translational biomarker and preclinical model relevance. Its scalability and reproducibility support enterprise R&D workflows in antimicrobial target screening and phenotypic screening applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying how spatial confinement alters microbial member abundance and organization in co-culture systems.
- Operational Value: Enables functional target validation through longitudinal tracking of fluorescently labeled strains in defined microwell environments.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by measuring growth trajectories and interaction effects under controlled niche sizes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by standardizing microbial seeding in arrays with well diameters from 5 to 100 microns.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through BSA passivation, controlled incubation, and agarose-coated imaging substrates that minimize evaporation and drift.
- Scalability Value: Enables parallel analysis of thousands of communities, supporting platform reuse across antimicrobial and pathogenicity studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Connects discovery-phase interaction data to preclinical continuity by modeling how spatial constraints affect pathogenic outcomes in Pseudomonas aeruginosa co-cultures.
- Mechanistic De-risking: Quantifies negligible growth effects in co-culture, helping de-risk false positives in target validation screens.
- Predictive Confidence: Uses modified logistic fitting of growth curves to extract maximum signal, rate, and lag time for comparative strain analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, providing quantitative interaction data that informs go/no-go decisions in antimicrobial target programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing how spatial constraints drive community development parameters in multi-member systems.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized chip preparation, bacterial adhesion at 4°C, and time-lapse fluorescence imaging at 30-minute intervals over 20 hours.
- Analytics: Generates quantitative growth trajectories via background subtraction, illumination correction, and ROI-based fluorescence measurement, enabling statistical comparison of conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical relevance by modeling Type VI secretion-dependent interactions in Pseudomonas aeruginosa, a pathogen with biomedical significance.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for screening microbial interactions across industry, medicine, and environmental applications due to its parallel throughput and confined-environment precision.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through quantification of microbial interaction effects in spatially constrained environments.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via controlled chip preparation, fluorescence labeling, and automated image analysis workflows.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by de-risking mechanistic ambiguity in early-stage antimicrobial target identification.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative interaction data from high-throughput community arrays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiology, fluorescence microscopy, and image analysis software for ROI setup and quantitative measurement.
- Depends on silicon microfabrication infrastructure, agarose-coated slide assemblies, and environmental control chambers for stable 24-hour imaging.
- Necessitates cross-team standardization of bacterial preparation, OD adjustment, and parylene removal steps to ensure well-specific adhesion.
- Requires adaptation considerations when extending beyond Pseudomonas aeruginosa to other microbial models due to surface chemistry and growth variability.
- Practical limitations include the need for aseptic technique when handling Pseudomonas aeruginosa and potential well-to-well variability in sub-10 micron features.
