Montaż i śledzenie rozwoju społeczności mikrobiologicznej w ramach platformy Microwell Array
6 czerwca 2017
Rozwój społeczności mikroorganizmów zależy od kombinacji czynników, w tym architektury środowiska, liczebności członków, cech i interakcji. Protokół ten opisuje syntetyczne, mikrofabrykowane środowisko do jednoczesnego śledzenia tysięcy społeczności zawartych w studniach femtolitrowych, w którym można przybliżyć kluczowe czynniki, takie jak wielkość niszy i zamknięcie.
Ogólnym celem tej metody jest wysokoprzepustowa analiza równoległa wieloskładnikowych społeczności drobnoustrojów w środowiskach ograniczonych z wykorzystaniem krzemowych matryc mikrootworów. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wysokoprzepustowego, wysoce równoległego przesiewania precyzyjnie zlokalizowanych interakcji mikrobiologicznych, które mają istotne znaczenie dla przemysłu, medycyny i środowiska. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach biomedycznych i ekologii mikroorganizmów, takie jak: w jaki sposób ograniczenia przestrzenne występujące w małych skalach wpływają na parametry deterministyczne i stochastyczne rozwoju społeczności oraz jakie są ich kluczowe efekty w odniesieniu do liczebności i organizacji członków mikroorganizmów?
Zacznij od przygotowania macierzy mikroszczelin. Najpierw wytnij pojedyncze chipy z macierzami mikroszczelin z wafli krzemowych z nadrukowanymi wieloma macierzami, używając diamentowego rysika. Każdy pojedynczy chip zawiera podmacierze szczelin o średnicach od 5 do 100 µm w trzech różnych gęstościach rozmieszczenia.
Na każdym chipie kompletny motyw studzienek jest również powtórzony czterokrotnie. Następnie przygotuj komorę nawilżoną, wykorzystując pudełko na końcówki do pipety oraz chusteczkę nasączoną PBS. Następnie nanieś kroplę 150 µL roztworu BSA na każdy chip i inkubuj chipy w pudełku przez godzinę w temperaturze pokojowej.
W międzyczasie należy przygotować bakterie. Wirować kulturę, a następnie zawiesić ją ponownie w 500 µL świeżej pożywki R2A z dwupocentrowym dodatkiem glicerolu. Następnie zmierzyć gęstość kultury przy 600 nm i dostosować stężenie do gęstości optycznej 0,02.
Po inkubacji chipów usunąć roztwór BSA i trzykrotnie przepłukać chipy roztworem PBS. Po płukaniu wysuszyć chipy strumieniem azotu i przenieść je z powrotem do komory nawilżonej. Następnie nanieść 150 µL zawiesiny hodowli na każdy suchy chip i inkubować chipy przez godzinę w temperaturze 4 °C, aby bakterie miały czas na przyczepienie się do studzienek, a podział komórkowy ewentualnych zanieczyszczeń był spowolniony.
Aby przygotować chip do obrazowania, należy najpierw przygotować szkiełko zakrywające powleczone agarozą dla każdego chipu. Upłynnić niewielką objętość agarozy – do każdego szkiełka zakrywającego potrzeba około pięciu mililitrów. Następnie przemyć jedną stronę szkiełka zakrywającego etanolem i umieścić je na szkiełku przedmiotowym stroną przemytą do góry.
Następnie umieść dwa podkładki z PDMS o grubości 1 mm wzdłuż długich krawędzi szkiełka nakrywowego i przesuń szkiełko tak, aby 1 mm wystawało poza krawędź preparatu. Teraz wlej na szkiełko nakrywowe odpowiednią ilość agarozy, aby całkowicie je pokryć. Następnie użyj drugiego szkiełka przedmiotowego, aby wyrównać agarozę do uzyskania jednolitej grubości.
Przygotuj równolegle kilka takich zestawów z szkiełek. Gdy agaroza zacznie krzepnąć, przenieś zestawy do temperatury 4°C. Po 15 minutach chłodzenia odetnij nadmiar agarozy wokół szkiełek nakrywkowych.
Następnie umieść złożone układy w szalkach Petriego i przechowuj je w temperaturze 4 °C. Po inkubacji chipów z bakteriami, zanurzaj poszczególne chipy w wodzie ultraczystej, jeden po drugim, na 10 sekund każdy. Następnie ustaw mokre chipy pionowo na chusteczce papierowej, aż większość cieczy spłynie.
Następnie należy usunąć bakterie, które nie osiadły w studzienkach. Odciąć kawałek taśmy o długości chipa krzemowego i przykleić go do powłoki z parylenu na krzemie. Następnie odkleić taśmę, aby usunąć powłokę z parylenu, i niezwłocznie przygotować chip do odwrócenia.
Następnie umieść chip na zestawie do slajdów w taki sposób, aby mikrootwory stykały się z agarozą. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie przesunąć ani nie przesunąć chipu po zetknięciu z agarozą. Teraz przenieś cały zestaw do uchwytu na slajdy w komorze środowiskowej montowanej na stole mikroskopu i wykonaj obrazy time-lapse w ciągu następnych 24 godzin w wybranym odstępach czasowych i przy 10-krotnym powiększeniu.
Przetwórz stosy obrazów, korzystając z konwencjonalnego, ogólnodostępnego oprogramowania. Najpierw zaimportuj sekwencję obrazów. W celu uśredniania załaduj obrazy korekcyjne lub obrazy ciemnego pola.
Następnie wykonaj odjęcie tła. Podaj wartość promienia, na przykład 135 pikseli, i wybierz opcję sliding paraboloid. Następnie odejmij średni obraz ciemnego pola od średniego obrazu pola oświetlenia, wybierając oba obrazy i korzystając z operacji odejmowania.
Teraz należy zastosować korekcję oświetlenia w następujący sposób. Wybrany typ operacji ustaw na dzielenie (divide), i1 ustaw na obraz dołka, i2 ustaw na obraz korekcyjny, k1 ustaw na średnią obrazu korekcyjnego, a k2 ustaw na zero. Następnie kliknij Create New Window.
Aby określić ilościowo wzrost bakterii w mikrodofkach, najpierw wybierz obszary zainteresowania za pomocą wtyczki do mikrotablic. W menu mapy kliknij resetuj siatkę i określ liczbę wierszy, kolumn oraz średnice dofek. Następnie z menu kształtu ROI wybierz koło.
Aby dopasować macierz ROI do obrazu, można ją przesunąć, naciskając klawisz ALT lub ALT+SHIFT i zaznaczając myszą lewy górny obszar ROI. Aby zmienić rozmiar obszarów ROI, należy nacisnąć klawisz shift, zaznaczając prawy dolny róg macierzy ROI. Aby dostosować odstępy między obszarami ROI, należy nacisnąć klawisz shift i przeciągnąć górną lub dolną krawędź macierzy.
Gdy macierz ROI zostanie dopasowana do dołków na obrazie, należy kliknąć Measure RT. Następnie zostanie wygenerowana tabela ze wszystkimi pomiarami dla każdego obrazu lub punktu czasowego, którą można skopiować do arkusza kalkulacyjnego w celu przeprowadzenia analizy. Porównano wzrost dwóch szczepów Pseudomonas aeruginosa. Jeden szczep konstytutywnie ekspresuje toksyczne białka efektorowe związane z sekrecją typu VI.
Drugi jest podatny na patogenezę typu sześć z powodu utraty funkcji. Oba ekspresują inne białko fluorescencyjne. Ko-kultury badano podłużnie i w dołkach o różnych rozmiarach.
Bakterie hodowano osobno oraz w kokulturze. Przez 20 godzin wzrostu obrazowanie przeprowadzano w odstępach 30-minutowych. Po zastosowaniu korekt programowych w danych obrazowych wykreślono ilościowe trajektorie wzrostu.
W przypadku kokultury dane nie wskazują na istotne zmiany w wzroście. Aby rozszerzyć analizę, każdą trajektorię dopasowano do zmodyfikowanej funkcji logistycznej z trzema parametrami: sygnałem maksymalnym, szybkością maksymalną oraz czasem opóźnienia. Analiza ta sugeruje, że kokultura tych gatunków miała pomijalny wpływ na ich ogólny wzrost, a zmienność widoczna na krzywych wzrostu wynika najprawdopodobniej z czynników środowiskowych.
Po opanowaniu techniki, przygotowanie zestawu może zostać wykonane w zaledwie kilka godzin, jeśli procedura zostanie przeprowadzona prawidłowo. Podczas realizacji tej procedury ważne jest posiadanie komórek w fazie intensywnego wzrostu, aby właściwie dostosować końcowe wartości OD komórek w celu uzyskania jednorodnych warstw świdrowych w zestawach chipów, a także zachowanie szczególnej ostrożności podczas etapu odrywania parylenu. Po wykonaniu tej procedury, analiza materiału genetycznego pozwoli na udzielenie odpowiedzi na pytania dotyczące tego, jak ekspresja genów w obrębie każdej społeczności zmienia się w zależności od składu i organizacji tej społeczności.
Należy pamiętać, że praca z Pseudomonas aeruginosa może być potencjalnie niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy stosować środki ostrożności, takie jak rękawiczki, fartuch, gogle oraz odpowiednie techniki aseptyki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę wysokoprzepustowej analizy społeczności drobnoustrojów w środowiskach zamkniętych z wykorzystaniem krzemowych matryc mikrootworów. Umożliwia ona śledzenie interakcji drobnoustrojów istotnych w różnych dziedzinach, w tym w przemyśle i medycynie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Ekologia mikrobiologiczna
- Badania biomedyczne
- Nauki o środowisku
Wstęp
- Społeczności mikrobiologiczne są kształtowane przez architekturę środowiskową oraz interakcje między ich członkami.
- Zrozumienie tych społeczności może dostarczyć cennych informacji w odpowiedzi na pytania z zakresu ekologii i biomedycyny.
- Metody wysokoprzepustowe są niezbędne do analizy złożonych interakcji.
- W niniejszym badaniu wykorzystano środowiska mikrofabrykowane w celu precyzyjnego śledzenia procesów.
Cel badania
- Analiza wieloczłonowych społeczności drobnoustrojów w ograniczonych przestrzeniach.
- Badanie wpływu ograniczeń przestrzennych na rozwój społeczności.
- Badanie wpływu na liczebność i organizację członków społeczności drobnoustrojów.
Zastosowane Metody
- Przygotowanie matryc mikrootworów z wafli krzemowych.
- Wykorzystanie matryc z otworami o średnicy od 5 do 100 mikronów.
- Przesiewowe badanie interakcji mikrobiologicznych metodą wysokoprzepustową.
- Równoległa analiza dynamiki społeczności w środowiskach zamkniętych.
Główne wyniki
- Wykazano zdolność do jednoczesnego śledzenia tysięcy społeczności drobnoustrojów.
- Zidentyfikowano kluczowe oddziaływania zależne od wielkości niszy i ograniczenia przestrzennego.
- Przedstawiono spostrzeżenia dotyczące parametrów deterministycznych i stochastycznych rozwoju społeczności.
- Podkreślono znaczenie tej metody dla zastosowań przemysłowych i środowiskowych.
Wnioski
- Metoda ta oferuje nowatorskie podejście do badania oddziaływań mikrobiologicznych.
- Umożliwia ona lepsze zrozumienie dynamiki społeczności w środowiskach zamkniętych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach, aby rozwiązywać problemy ekologiczne i biomedyczne.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta platforma z matrycą mikrowykopalisk umożliwia wysokoprzepustową równoległą analizę rozwoju społeczności mikrobiologicznych w ograniczonych środowiskach, wspierając redukcję ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkryć poprzez kwantyfikację efektów przestrzennych i interakcji wpływających na wzrost drobnoustrojów. Metoda ta zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych, ujawniając, w jaki sposób drobnoziarniste ograniczenia przestrzenne wpływają na parametry deterministyczne i stochastyczne dynamiki społeczności, co bezpośrednio przekłada się na istotność biomarkerów translacyjnych i modeli przedklinicznych. Jej skalowalność i powtarzalność wspierają przedsiębiorcze procesy badawczo-rozwojowe (R&D) w zakresie screeningu celów przeciwdrobnoustrojowych oraz zastosowań w screeningu fenotypowym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez kwantyfikację wpływu ograniczenia przestrzennego na liczebność i organizację członków mikrobiomu w systemach kokultur.
- Wartość operacyjna: Umożliwia walidację celów funkcjonalnych dzięki podłużnemu śledzeniu szczepów znakowanych fluorescencyjnie w zdefiniowanych środowiskach mikroworków.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów z portfela poprzez pomiar trajektorii wzrostu i efektów interakcji w kontrolowanych rozmiarach nisz.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych analiz przesiewowych poprzez standaryzację wysiewu drobnoustrojów w matrycach o średnicach otworów od 5 do 100 mikronów.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie powtarzalności testu dzięki pasywacji BSA, kontrolowanej inkubacji oraz podłożom obrazującym powlekanym agarozą, które minimalizują parowanie i dryft.
- Wartość skalowalności: Umożliwienie równoległej analizy tysięcy społeczności, co wspiera ponowne wykorzystanie platformy w badaniach nad przeciwdrobnoustrojowymi właściwościami i patogennością.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Łączy dane dotyczące oddziaływań z fazy odkrywania z ciągłością przedkliniczną poprzez modelowanie wpływu ograniczeń przestrzennych na wyniki patogenne w kokulturach Pseudomonas aeruginosa.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Ilościowo określa pomijalne efekty wzrostu w kokulturze, co pomaga zredukować ryzyko wyników fałszywie dodatnich w badaniach walidacyjnych celów terapeutycznych.
- Pewność predykcyjna: Wykorzystuje zmodyfikowane dopasowanie logistyczne krzywych wzrostu w celu wyodrębnienia maksymalnego sygnału, szybkości oraz czasu opóźnienia dla analizy porównawczej szczepów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania, od testowania hipotez po identyfikację związków wiodących, dostarczając ilościowych danych o oddziaływaniach, które stanowią podstawę do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac w programach poszukiwania celów przeciwdrobnoustrojowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez, ujawniając, w jaki sposób ograniczenia przestrzenne wpływają na parametry rozwoju społeczności w systemach wieloczłonowych.
- Screening: Zapewnia gotowość do analizy poprzez standaryzację przygotowania chipów, adhezję bakterii w 4°C oraz obrazowanie fluorescencyjne time-lapse w odstępach 30-minutowych przez 20 godzin.
- Analityka: Generuje ilościowe trajektorie wzrostu za pomocą odejmowania tła, korekcji oświetlenia i pomiaru fluorescencji opartego na ROI, co umożliwia statystyczne porównanie warunków.
- Badania translacyjne: Odnosi się do istotności przedklinicznej poprzez modelowanie oddziaływań zależnych od sekrecji typu VI u Pseudomonas aeruginosa, patogenu o znaczeniu biomedycznym.
- Zastosowania przemysłowe: Służy jako platforma wielokrotnego użytku do screeningu interakcji mikrobiologicznych w przemyśle, medycynie i aplikacjach środowiskowych dzięki wysokiej przepustowości równoległej i precyzji w środowisku ograniczonym.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność predykcyjna w walidacji celu poprzez kwantyfikację efektów interakcji mikrobiologicznych w środowiskach o ograniczonej przestrzeni.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki kontrolowanemu przygotowaniu chipów, znakowaniu fluorescencyjnemu oraz zautomatyzowanym przepływom analizy obrazu.
- Wartość strategiczna: Usprawnienie decyzji go/no-go poprzez redukcję ryzyka wynikającego z niejednoznaczności mechanistycznej we wczesnej fazie identyfikacji celów przeciwdrobnoustrojowych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko w oparciu o ilościowe dane dotyczące interakcji z wysokoprzepustowych macierzy społeczności.
Kwestie implementacyjne
- Wymagana jest wiedza z zakresu mikrobiologii, mikroskopii fluorescencyjnej oraz oprogramowania do analizy obrazów w celu wyznaczania ROI i pomiarów ilościowych.
- Metoda zależy od infrastruktury mikrofabrykacji krzemu, zestawów szkiełek pokrytych agarozą oraz komór kontroli środowiskowej zapewniających stabilny obrazowanie przez 24 godziny.
- Niezbędna jest standaryzacja międzyzespołowa etapów przygotowania bakterii, regulacji OD oraz usuwania parylenu, aby zapewnić specyficzne przyleganie do studni.
- W przypadku rozszerzenia badań poza Pseudomonas aeruginosa na inne modele mikrobiologiczne konieczne jest uwzględnienie adaptacji ze względu na chemię powierzchni i zmienność wzrostu.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność stosowania technik aseptycznych podczas pracy z Pseudomonas aeruginosa oraz potencjalną zmienność między studniami w obrębie struktur poniżej 10 mikronów.
