Name: Montaż i śledzenie rozwoju społeczności mikrobiologicznej w ramach platformy Microwell Array (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-06T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Poznaj metodę analizy społeczności mikrobiologicznych w mikrostudniach krzemowych. Technika umożliwia równoległe śledzenie interakcji mikroorganizmów w ograniczonych przestrzeniach, co ma zastosowanie w medycynie i ekologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Matryce Microwell zostały wyprodukowane i scharakteryzowane w Center for Nanophase Materials Sciences User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, U.S. Department of Energy. Wsparcie finansowe dla tych prac zostało zapewnione za pośrednictwem Funduszu Badawczo-Rozwojowego Dyrektora Narodowego Laboratorium Oak Ridge. Autorzy pragną również podziękować J. Mougous Laboratory (University of Washington, Seattle, WA) za dostarczenie szczepów P. aeruginosa wykorzystanych w tych badaniach.

<ol><li>Zhou, J., Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochasticity%2C+succession%2C+and+environmental+perturbations+in+a+fluidic+ecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Stochasticity, succession, and environmental perturbations in a fluidic ecosystem.</a> Proc Natl Acad Sci. 111, E836-E845 (2014).</li>
<li>Valm, A. M., Welch, J. L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-level+analysis+of+microbial+community+organization+through+combinatorial+labeling+and+spectral+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Systems-level analysis of microbial community organization through combinatorial labeling and spectral imaging.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (10), 4152-4157 (2011).</li>
<li>Satoh, H., Miura, Y., Tsushima, I., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layered+structure+of+bacterial+and+archaeal+communities+and+their+in+situ+activities+in+anaerobic+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Layered structure of bacterial and archaeal communities and their in situ activities in anaerobic granules.</a> Appl Environ Microbiol. 73 (22), 7300-7307 (2007).</li>
<li>Kim, H. J., Boedicker, J. Q., Choi, J. W., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+spatial+structure+stabilizes+a+synthetic+multispecies+bacterial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Defined spatial structure stabilizes a synthetic multispecies bacterial community.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (47), 18188-18193 (2008).</li>
<li>Nunan, N., Wu, K., Young, I. M., Crawford, J. W., Ritz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+distribution+of+bacterial+communities+and+their+relationships+with+the+micro-architecture+of+soil%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Spatial distribution of bacterial communities and their relationships with the micro-architecture of soil.</a> FEMS Microbiol Ecol. 44, 203-215 (2003).</li>
<li>Grundmann, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+scales+of+soil+bacterial+diversity+-+The+size+of+a+clone%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Spatial scales of soil bacterial diversity - The size of a clone.</a> FEMS Microbiol Ecol. 48, 119-127 (2004).</li>
<li>Langenheder, S., Lindstrom, E. S., Tranvik, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Function+of+Bacterial+Communities+Emerging+from+Different+Sources+under+Identical+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structure and Function of Bacterial Communities Emerging from Different Sources under Identical Conditions.</a> Appl Environ Microbiol. 72 (1), 212-220 (2006).</li>
<li>Camp, J. G., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+and+Scales+in+Gastrointestinal+Microbial+Ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Patterns and Scales in Gastrointestinal Microbial Ecology.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1989-2002 (2009).</li>
<li>Renner, L. D., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+regulation+of+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bull%22%5BJournal%5D)">Physicochemical regulation of biofilm formation.</a> MRS Bull. 36 (5), 347-355 (2011).</li>
<li>Wessel, A. K., Hmelo, L., Parsek, M. R., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+local%3A+technologies+for+exploring+bacterial+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Going local: technologies for exploring bacterial microenvironments.</a> Nat Rev Microbiol. 11 (5), 337-348 (2013).</li>
<li>Stacy, A., McNally, L., Darch, S. E., Brown, S. P., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biogeography+of+polymicrobial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biogeography of polymicrobial infection.</a> Nat Rev Microbiol. 14 (2), 93-105 (2015).</li>
<li>Hansen, R. R., Shubert, K. R., Morrell-Falvey, J. L., Lokitz, B. S., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructured+block+copolymer+surfaces+for+control+of+microbe+adhesion+and+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Microstructured block copolymer surfaces for control of microbe adhesion and aggregation.</a> Biosensors. 4 (1), 63-75 (2014).</li>
<li>Hansen, R. R., Hinestrosa, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin-functionalized+poly%28glycidyl+methacrylate%29-+block+-poly%28vinyldimethyl+azlactone%29+surface+scaffolds+for+high+avidity+microbial+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Lectin-functionalized poly(glycidyl methacrylate)- block -poly(vinyldimethyl azlactone) surface scaffolds for high avidity microbial capture.</a> Biomacromolecules. 14 (10), 3742-3748 (2013).</li>
<li>Timm, C. M., Hansen, R. R., Doktycz, M. J., Retterer, S. T., Pelletier, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstencils+to+generate+defined%2C+multi-species+patterns+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microstencils to generate defined, multi-species patterns of bacteria.</a> Biomicrofluidics. 9 (6), (2015).</li>
<li>Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+metapopulations+in+nanofabricated+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (46), 17290-17295 (2006).</li>
<li>Zhang, Q., Lambert, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+Emergence+of+Bacterial+Antibiotic+Resistance+in+Connected+Microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acceleration of Emergence of Bacterial Antibiotic Resistance in Connected Microenvironments.</a> Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).</li>
<li>Friedlander, R. S., Vlamakis, H., Kim, P., Khan, M., Kolter, R., Aizenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+flagella+explore+microscale+hummocks+and+hollows+to+increase+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Bacterial flagella explore microscale hummocks and hollows to increase adhesion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (14), 5624-5629 (2013).</li>
<li>Zhou, J., Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+Assembly+Leads+to+Alternative+Communities+with+Distinct+Functions+in+a+Bioreactor+Microbial+Community%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Stochastic Assembly Leads to Alternative Communities with Distinct Functions in a Bioreactor Microbial Community.</a> MBio. 4 (2), 1-8 (2013).</li>
<li>van Vliet, S., Hol, F. J., Weenink, T., Galajda, P., Keymer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+chemical+interactions+and+culture+history+on+the+colonization+of+structured+habitats+by+competing+bacterial+populations%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The effects of chemical interactions and culture history on the colonization of structured habitats by competing bacterial populations.</a> BMC Microbiol. 14 (1), 116(2014).</li>
<li>Niepa, T. H. R., Hou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+Nanoculture+as+an+Artificial+Microniche%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Microbial Nanoculture as an Artificial Microniche.</a> Sci Rep. 6, 30578(2016).</li>
<li>Hansen, R. H., Timm, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+Assembly+of+Bacteria+in+Microwell+Arrays+Reveals+the+Importance+of+Confinement+in+Community+Development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Stochastic Assembly of Bacteria in Microwell Arrays Reveals the Importance of Confinement in Community Development.</a> PLoS ONE. 11 (5), e0155080(2016).</li>
<li>Hood, R. D., Singh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Type+VI+Secretion+System+of+Pseudomonas+aeruginosa+Targets+a+Toxin+to+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">A Type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria.</a> Cell Host Microbe. 7 (1), 25-37 (2010).</li>
<li>LeRoux, M., Ja De Leon,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+single-cell+characterization+of+bacterial+interactions+reveals+type+VI+secretion+is+a+double-edged+sword%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative single-cell characterization of bacterial interactions reveals type VI secretion is a double-edged sword.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (48), 19804-19809 (2012).</li>
<li>Whitney, J. C., Beck, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+distinct+pathways+guide+effector+export+through+the+type+VI+secretion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetically distinct pathways guide effector export through the type VI secretion system.</a> Mol Microbiol. 92 (3), 529-542 (2014).</li>
<li>Warrick, J. W., Timm, A., Swick, A., Yin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+Single-Cell+Kinetic+Analysis+of+Virus-Host+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Tools for Single-Cell Kinetic Analysis of Virus-Host Interactions.</a> PLoS ONE. 11 (1), e0145081(2016).</li>
<li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., Van't Riet, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16348228">Modeling of the Bacterial Growth Curve.</a> Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).</li>
<li>Halsted, M., Wilmoth, J. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/308753041_Development_of_transparent_microwell_arrays_for_optical_monitoring_and_dissection_of_microbial_communities">Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities.</a> J Vac Sci Technol B Nanotechnol Microelectron. 34 (6), 06KI03(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule tym przedstawiono urządzenie do tworzenia matryc mikrodołkowych oraz protokoły eksperymentalne zaprojektowane w celu umożliwienia wysokoprzepustowej i opartej na obrazowaniu żywych komórek analizy rozwoju społeczności bakteryjnej opartej na obrazowaniu żywych komórek. Podczas gdy celem demonstracji było zbadanie wpływu kontaktowego wydzielania typu VI na rozwój społeczności, matryce zostały zaprojektowane tak, aby były elastyczne i umożliwiały badanie szerokiego zakresu społeczności drobnoustrojów i interakcji...

Społeczności mikrobiologiczne są kształtowane zarówno przez czynniki deterministyczne, takie jak struktura środowiska, jak i procesy stochastyczne, które są związane ze śmiercią komórki, podziałem, koncentracją białek, liczbą organelli i mutacją1. W środowisku naturalnym analiza indywidualnego wpływu tych wpływów na skład i aktywność społeczności może być prawie niemożliwa. Zasłonięte przez naturalne struktury i zakopane w środowisku chemicznym i biologicznym, identyfikacja członków społeczności i dalsze określenie ich czasoprzestrzennego rozmieszczenia w środowisku naturalnym jest niezwykle trudne. Niemniej jednak ostatnie wysiłki podkreśliły znaczenie organizacji przestrzennej dla funkcjonowania społeczności i wskazują na potrzebę uwzględnienia zarówno liczebności, jak i organizacji członków w trwających badaniach2,3,4.
Jest jasne, że lokalne środowisko chemiczne (tj. dostępność składników odżywczych i metabolitów wtórnych), struktura fizyczna (np. architektura gleby, korzenie roślin, cząsteczki oceanu lub mikrokosmki jelitowe), obecność lub brak tlenu oraz wprowadzenie gatunków chorobotwórczych wpływają na skład, architekturę i funkcję społeczności mikroorganizmów5,6,7,8,9,10,11. Niemniej jednak tradycyjne techniki stosowane w kulturach, które zaniedbują uchwycenie tych czynników, nadal przeważają. Skład społeczności (np. obecność współzależnych gatunków), fizyczne przywiązanie, stężenie cząsteczki sygnałowej i bezpośredni kontakt komórka-komórka są ważnymi czynnikami kształtowania społeczności drobnoustrojów i mogą zostać utracone w konwencjonalnych warunkach hodowli. Właściwości te są trudne do odtworzenia w masowej kulturze płynnej lub na płytce agarowej. Dostępność technik mikroprzepływowych, mikrowzorcowych i nanowytwarzania, które pozwalają na odtworzenie kluczowych cech fizycznych i chemicznych środowiska naturalnego, umożliwiła jednak wielu badaczom zbudowanie społeczności bakteryjnych w celu zbadania ich interakcji12,13,14 oraz opracowanie syntetycznych środowisk naśladujących warunki naturalne4,15,16,17,18,19,20.
Ten protokół opisuje metodę wytwarzania urządzenia do mikrodołków i dostarcza szczegółowych procedur eksperymentalnych, które mogą być wykorzystane do funkcjonalizacji studzienek w tablicy i do hodowli bakterii, zarówno jako kolonie jednogatunkowe, jak i w społecznościach wieloosobowych. Praca ta pokazuje również, w jaki sposób bakterie zmodyfikowane do produkcji fluorescencyjnych białek reporterowych mogą być wykorzystywane do monitorowania wzrostu bakterii w studzienkach w czasie. Podobna matryca została zaprezentowana wcześniej i wykazała, że możliwe jest śledzenie wzrostu jednogatunkowych kolonii Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) w mikrostudzienkach. Modulując wielkość studni i gęstość wysiewu, warunki początkowe tysięcy eksperymentów wzrostu mogą być zmieniane równolegle, aby określić, jak początkowe warunki inokulacji wpływają na zdolność bakterii do wzrostu21. W obecnych pracach wykorzystano nieco zmodyfikowaną wersję macierzy mikrostudzienek, która opiera się na poprzedniej pracy, umożliwiając jednoczesne porównywanie wielu macierzy i stosując bardziej niezawodny protokół eksperymentalny. Tablica użyta w tej pracy zawiera wiele podtablic lub zespołów tablicowych, zawierających studnie o różnych rozmiarach, w zakresie średnic od 15 do 100 μm, które są rozmieszczone w trzech różnych odstępach (tj. 2x, 3x i 4x średnica studni). Matryce są wytrawiane w krzemie, a wzrost bakterii zasianych w matrycach krzemowych jest możliwy dzięki uszczelnieniu matryc szkiełkiem nakrywkowym, które zostało pokryte średnio nasyconym żelem agarozowym. W tej demonstracji wykorzystano mutanty P. aeruginosa przeznaczone do badania systemu wydzielania typu VI.
Przedstawione tutaj wyniki przybliżają do ostatecznego celu, jakim jest analiza wieloczłonowych społeczności w mikroukładach studzienek, umożliwiając badaczom monitorowanie obfitości i organizacji bakterii in situ, jednocześnie kontrolując i badając środowisko chemiczne. Powinno to ostatecznie dostarczyć informacji na temat "zasad", które rządzą rozwojem i dziedziczeniem społeczności.

<table><tbody><tr><td>Specjalistyczne systemy powłokowe</td> <td>Parylene N</td> Nr <td>CAS: 1633-22-3</td><td></td></tr><tr><td>Powlekarka Parylene</td><td>Specjalistyczne systemy powlekania</td><td>Labcoter 2 Jednostka osadzania parylenu PDS2010</td><td></td></tr><tr><td>Wafel krzemowy</td><td>WRS Materiały</td> o <td>średnicy 100 mm, 500-550 i mu; m grubość, Prime, 10-20 rezystywność, N/Phos< 100>,</td><td></td></tr> <tr><td>promotor adhezji</td><td>Shin-Etsu Microsci</td><td>MicroPrime P20 promotor</td><td></td>przyczepności</tr><tr><td>postive tone photoresist</td><td>Rohm and Haas Electronics Materials LLC (własność Dow)</td><td>Microposit S1818 Positive Photoresist (kod 10018357)</td><td></td></tr><tr><td>Quintel Contact Aligner</td><td>Neutronix Quintel Corp</td><td>NXQ 7500 Mask Aligner</td><td></td></tr><tr><td>Reaktywne narzędzie do trawienia jonowego</td><td>Oxford Instrumenty</td><td>Plasmalab System 100 Reaktywny wytrawiacz</td><td></td>jonowy</tr><tr><td>R2A Rosół</td><td>TEKnova</td><td>R0005</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Wielomodowy czytnik płytek</td><td>Perkin Elmer</td><td>Enspire, 2300-0000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>Automated Stage</td><td>Prior</td><td>ProScan III</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>Nikon</td><td>DS-QiMc</td><td></td></tr><tr><td>Stage-top komora kontroli środowiska</td><td>In Vivo Scientific</td><td>STEV ECU-HOC</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agaroza</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 mm No. 1.5 szkiełko nakrywkowe</td><td>Nexterion</td><td>Wysoka wydajność #1.5H Szkiełka</td><td></td>nakrywkowe</tr><tr><td>Fluorescencyjne preparaty referencyjne</td><td>Ted Pella</td><td>2273</td><td></td></tr><tr><td>Fizyczny rysik Profilometr</td><td>KLA Chusteczki laboratoryjne Tencor</td><td>P-6</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kimberly Clark</td><td>Kimipe KIMTECH SCIENCE Marka, 34155</td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie komercyjne</td><td>Nikon</td><td>NIS Elements</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Zeiss 710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kostki filtracyjne</td><td>Nikon</td><td>Nikon FITC (96311), Nikon Texas Czerwony(96313)</td><td></td></tr></tbody></table>

montaż i śledzenie rozwoju społeczności mikrobiologicznej w ramach platformy microwell array

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

Rozwój społeczności mikrobiologicznych zależy od kombinacji złożonych czynników deterministycznych i stochastycznych, które mogą radykalnie zmienić rozkład przestrzenny i działania członków społeczności. Opracowaliśmy platformę macierzy mikrostudzienek, która może być używana do szybkiego łączenia i śledzenia tysięcy społeczności bakteryjnych równolegle. Protokół ten podkreśla użyteczność platformy i opisuje jej zastosowanie do optycznego monitorowania rozwoju prostych, dwuosobowych społeczności w zespole tablic w ramach platformy. W tej demonstracji wykorzystano dwa mutanty Pseudomonas aeruginosa, będące częścią serii mutantów opracowanych w celu badania patogenności wydzielania typu VI. Wstawione chromosomy genów mCherry lub GFP ułatwiają konstytutywną ekspresję białek fluorescencyjnych o różnych długościach fal emisyjnych, które można wykorzystać do monitorowania liczebności i lokalizacji członków społeczności w każdej mikrostudzince. Protokół ten opisuje szczegółową metodę łączenia mieszanin bakterii w studzienkach macierzy oraz wykorzystania obrazowania fluorescencyjnego w czasie i ilościowej analizy obrazu do pomiaru względnego wzrostu populacji każdego członka w czasie. Omówiono zasiewanie i montaż platformy mikrostudzienki, procedury obrazowania niezbędne do analizy ilościowej społeczności drobnoustrojów w obrębie sieci oraz metody, które można wykorzystać do ujawnienia interakcji między obszarem gatunków drobnoustrojów.

Przedstawiona tutaj platforma eksperymentalna została zaprojektowana do wysokoprzepustowych i wysokotreściowych badań społeczności bakteryjnych. Taka konstrukcja umożliwia jednoczesną analizę tysięcy społeczności hodowanych w studzienkach o różnych rozmiarach. Dzięki zastosowaniu tej macierzy mikrostudzienek można określić zależność końcowego składu społeczności od początkowej gęstości szczepienia, wielkości studzienki oraz środowiska chemicznego. Niniejsza praca demonstruje wzrost dwuczł...

Rozwój społeczności mikroorganizmów zależy od kombinacji czynników, w tym architektury środowiska, liczebności członków, cech i interakcji. Protokół ten opisuje syntetyczne, mikrofabrykowane środowisko do jednoczesnego śledzenia tysięcy społeczności zawartych w studniach femtolitrowych, w którym można przybliżyć kluczowe czynniki, takie jak wielkość niszy i zamknięcie.

Montaż i śledzenie rozwoju społeczności mikrobiologicznej w ramach platformy Microwell Array

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Ogólnym celem tej metody jest wysokoprzepustowa analiza równoległa wieloskładnikowych społeczności drobnoustrojów w środowiskach ograniczonych z wykorzystaniem krzemowych matryc mikrootworów. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wysokoprzepustowego, wysoce równoległego przesiewania precyzyjnie zlokalizowanych interakcji mikrobiologicznych, które mają istotne znaczenie dla przemysłu, medycyny i środowiska. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach biomedycznych i ekologii mikroorganizmów, takie jak: w jaki sposób ograniczenia przestrzenne występujące w małych skalach wpływają na parametry deterministyczne i stochastyczne rozwoju społeczności oraz jakie są ich kluczowe efekty w odniesieniu do liczebności i organizacji członków mikroorganizmów?Zacznij od przygotowania macierzy mikroszczelin. Najpierw wytnij pojedyncze chipy z macierzami mikroszczelin z wafli krzemowych z nadrukowanymi wieloma macierzami, używając diamentowego rysika. Każdy pojedynczy chip zawiera podmacierze szczelin o średnicach od 5 do 100 µm w trzech różnych gęstościach rozmieszczenia.Na każdym chipie kompletny motyw studzienek jest również powtórzony czterokrotnie. Następnie przygotuj komorę nawilżoną, wykorzystując pudełko na końcówki do pipety oraz chusteczkę nasączoną PBS. Następnie nanieś kroplę 150 µL roztworu BSA na każdy chip i inkubuj chipy w pudełku przez godzinę w temperaturze pokojowej.W międzyczasie należy przygotować bakterie. Wirować kulturę, a następnie zawiesić ją ponownie w 500 µL świeżej pożywki R2A z dwupocentrowym dodatkiem glicerolu. Następnie zmierzyć gęstość kultury przy 600 nm i dostosować stężenie do gęstości optycznej 0,02.Po inkubacji chipów usunąć roztwór BSA i trzykrotnie przepłukać chipy roztworem PBS. Po płukaniu wysuszyć chipy strumieniem azotu i przenieść je z powrotem do komory nawilżonej. Następnie nanieść 150 µL zawiesiny hodowli na każdy suchy chip i inkubować chipy przez godzinę w temperaturze 4 °C, aby bakterie miały czas na przyczepienie się do studzienek, a podział komórkowy ewentualnych zanieczyszczeń był spowolniony.Aby przygotować chip do obrazowania, należy najpierw przygotować szkiełko zakrywające powleczone agarozą dla każdego chipu. Upłynnić niewielką objętość agarozy – do każdego szkiełka zakrywającego potrzeba około pięciu mililitrów. Następnie przemyć jedną stronę szkiełka zakrywającego etanolem i umieścić je na szkiełku przedmiotowym stroną przemytą do góry.Następnie umieść dwa podkładki z PDMS o grubości 1 mm wzdłuż długich krawędzi szkiełka nakrywowego i przesuń szkiełko tak, aby 1 mm wystawało poza krawędź preparatu. Teraz wlej na szkiełko nakrywowe odpowiednią ilość agarozy, aby całkowicie je pokryć. Następnie użyj drugiego szkiełka przedmiotowego, aby wyrównać agarozę do uzyskania jednolitej grubości.Przygotuj równolegle kilka takich zestawów z szkiełek. Gdy agaroza zacznie krzepnąć, przenieś zestawy do temperatury 4°C. Po 15 minutach chłodzenia odetnij nadmiar agarozy wokół szkiełek nakrywkowych.Następnie umieść złożone układy w szalkach Petriego i przechowuj je w temperaturze 4 °C. Po inkubacji chipów z bakteriami, zanurzaj poszczególne chipy w wodzie ultraczystej, jeden po drugim, na 10 sekund każdy. Następnie ustaw mokre chipy pionowo na chusteczce papierowej, aż większość cieczy spłynie.Następnie należy usunąć bakterie, które nie osiadły w studzienkach. Odciąć kawałek taśmy o długości chipa krzemowego i przykleić go do powłoki z parylenu na krzemie. Następnie odkleić taśmę, aby usunąć powłokę z parylenu, i niezwłocznie przygotować chip do odwrócenia.Następnie umieść chip na zestawie do slajdów w taki sposób, aby mikrootwory stykały się z agarozą. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie przesunąć ani nie przesunąć chipu po zetknięciu z agarozą. Teraz przenieś cały zestaw do uchwytu na slajdy w komorze środowiskowej montowanej na stole mikroskopu i wykonaj obrazy time-lapse w ciągu następnych 24 godzin w wybranym odstępach czasowych i przy 10-krotnym powiększeniu.Przetwórz stosy obrazów, korzystając z konwencjonalnego, ogólnodostępnego oprogramowania. Najpierw zaimportuj sekwencję obrazów. W celu uśredniania załaduj obrazy korekcyjne lub obrazy ciemnego pola.Następnie wykonaj odjęcie tła. Podaj wartość promienia, na przykład 135 pikseli, i wybierz opcję sliding paraboloid. Następnie odejmij średni obraz ciemnego pola od średniego obrazu pola oświetlenia, wybierając oba obrazy i korzystając z operacji odejmowania.Teraz należy zastosować korekcję oświetlenia w następujący sposób. Wybrany typ operacji ustaw na dzielenie (divide), i1 ustaw na obraz dołka, i2 ustaw na obraz korekcyjny, k1 ustaw na średnią obrazu korekcyjnego, a k2 ustaw na zero. Następnie kliknij Create New Window.Aby określić ilościowo wzrost bakterii w mikrodofkach, najpierw wybierz obszary zainteresowania za pomocą wtyczki do mikrotablic. W menu mapy kliknij resetuj siatkę i określ liczbę wierszy, kolumn oraz średnice dofek. Następnie z menu kształtu ROI wybierz koło.Aby dopasować macierz ROI do obrazu, można ją przesunąć, naciskając klawisz ALT lub ALT+SHIFT i zaznaczając myszą lewy górny obszar ROI. Aby zmienić rozmiar obszarów ROI, należy nacisnąć klawisz shift, zaznaczając prawy dolny róg macierzy ROI. Aby dostosować odstępy między obszarami ROI, należy nacisnąć klawisz shift i przeciągnąć górną lub dolną krawędź macierzy.Gdy macierz ROI zostanie dopasowana do dołków na obrazie, należy kliknąć Measure RT. Następnie zostanie wygenerowana tabela ze wszystkimi pomiarami dla każdego obrazu lub punktu czasowego, którą można skopiować do arkusza kalkulacyjnego w celu przeprowadzenia analizy. Porównano wzrost dwóch szczepów Pseudomonas aeruginosa. Jeden szczep konstytutywnie ekspresuje toksyczne białka efektorowe związane z sekrecją typu VI.Drugi jest podatny na patogenezę typu sześć z powodu utraty funkcji. Oba ekspresują inne białko fluorescencyjne. Ko-kultury badano podłużnie i w dołkach o różnych rozmiarach.Bakterie hodowano osobno oraz w kokulturze. Przez 20 godzin wzrostu obrazowanie przeprowadzano w odstępach 30-minutowych. Po zastosowaniu korekt programowych w danych obrazowych wykreślono ilościowe trajektorie wzrostu.W przypadku kokultury dane nie wskazują na istotne zmiany w wzroście. Aby rozszerzyć analizę, każdą trajektorię dopasowano do zmodyfikowanej funkcji logistycznej z trzema parametrami: sygnałem maksymalnym, szybkością maksymalną oraz czasem opóźnienia. Analiza ta sugeruje, że kokultura tych gatunków miała pomijalny wpływ na ich ogólny wzrost, a zmienność widoczna na krzywych wzrostu wynika najprawdopodobniej z czynników środowiskowych.Po opanowaniu techniki, przygotowanie zestawu może zostać wykonane w zaledwie kilka godzin, jeśli procedura zostanie przeprowadzona prawidłowo. Podczas realizacji tej procedury ważne jest posiadanie komórek w fazie intensywnego wzrostu, aby właściwie dostosować końcowe wartości OD komórek w celu uzyskania jednorodnych warstw świdrowych w zestawach chipów, a także zachowanie szczególnej ostrożności podczas etapu odrywania parylenu. Po wykonaniu tej procedury, analiza materiału genetycznego pozwoli na udzielenie odpowiedzi na pytania dotyczące tego, jak ekspresja genów w obrębie każdej społeczności zmienia się w zależności od składu i organizacji tej społeczności.Należy pamiętać, że praca z Pseudomonas aeruginosa może być potencjalnie niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy stosować środki ostrożności, takie jak rękawiczki, fartuch, gogle oraz odpowiednie techniki aseptyki.

assembly-tracking-microbial-community-development-within-microwell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opis tworzenia polimerowej mikrosieci przy użyciu techniki fotopolimeryzacji na chipie. Opisano również wysokoprzepustową charakterystykę powierzchni z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych, pomiarów kąta zwilżania wodą, rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronowej, spektrometrii mas jonów wtórnych czasu przelotu oraz testu adhezji komórek.

Polimerowe mikromacierze do wysokoprzepustowego odkrywania biomateriałów

Opisano kombinatoryczną metodę przesiewania funkcjonalnego służącą do pogłębienia wiedzy na temat wpływu składu molekularnego mikrośrodowisk na funkcje komórkowe. Metoda ta wykorzystuje istniejące technologie oparte na mikromacierzych do generowania macierzy zdefiniowanych kombinatorycznych mikrośrodowisk, które umożliwiają adhezję komórek oraz analizę funkcjonalną.

Wytwarzanie i zastosowanie mikroarrayów mikrośrodowiskowych (MEArrays)

Źródło: Fattahi, N., et al. Fotodegradowalne interfejsy hydrożelowe do badań przesiewowych, selekcji i izolacji bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje zastosowanie fotodegradowalnych hydrożeli do izolowania kolonii bakteryjnych w układach mikrostudzienek krzemowych. Komórki bakteryjne są najpierw ładowane do mikrostudzienek, zamykane w usieciowanym hydrożelu i hodowane w odrębnych koloniach. Po wystawieniu na działanie światła ultrafioletowego ukierunkowana degradacja hydrożelu...

Fotodegradowalna izolacja kolonii bakteryjnych na bazie hydrożelu w układach mikrodołków

Źródło: Pioli, R., et al., Modeling of microorganisms and microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje metodę wychwytywania pojedynczych, znakowanych fluorescencyjnie komórek Escherichia coli (E. coli) w pułapkach mikroprzepływowych przy użyciu bezwęglowej zawiesiny i kontrolowanego przepływu, a następnie dodawania składników odżywczych w celu wyzwalania wzrostu i obrazowania fluorescencyjnego mikrokolonii.

Wzorce mikroprzepływowe i śledzenie wzrostu bakterii jednokomórkowych na podstawie fluorescencji

Źródło: Cabeen, M. T. i in. Analiza mikrofluidyczna pojedynczych komórek Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)Film pokazuje użycie urządzenia mikrofluidycznego do obserwacji wzrostu bakterii na poziomie pojedynczych komórek. Pokazuje, jak nieruchome komórki bakteryjne, zamknięte w mikroskalowych rowach, są nieustannie odżywiane i obrazowane pod mikroskopem fluorescencyjnym. System ten umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym podziału komórek i śledzenia linii genealogicznej na przestrzeni...

Śledzenie wzrostu bakterii z rozdzielczością pojedynczych komórek w układzie mikrofluidowym

Opisane są protokoły ilościowego określania interakcji mechanicznych między przylegającymi komórkami a mikrostrukturalnymi substratami. Interakcje te są ściśle związane z podstawowymi zachowaniami komórek, w tym migracją, proliferacją, różnicowaniem i apoptozą. Protokoły prezentują oprogramowanie do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym o nazwie MechProfiler, które umożliwia określenie zaangażowanych sił dla każdego mikrosłupka.

Łatwe i dokładne profilowanie mechaniczne na matrycach Micropost

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli pojedynczych komórek za pomocą platformy mikroprzepływowej, który wykorzystuje nową koncepcję projektowania mikrostudzienek, aby umożliwić wysokowydajną izolację pojedynczych komórek i długoterminową hodowlę klonalną.

Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

Różnicowanie komórek jest regulowane przez wiele czynników mikrośrodowiskowych, w tym zarówno skład matrycy, jak i właściwości materiału substratu. Opisujemy tutaj technikę wykorzystującą mikromacierze komórkowe w połączeniu z mikroskopią sił trakcyjnych do oceny zarówno różnicowania komórek, jak i biomechanicznych interakcji komórka-substrat w funkcji kontekstu mikrośrodowiskowego.

Wysokowydajna platforma mikromacierzy komórkowych do korelacyjnej analizy różnicowania komórek i sił trakcyjnych

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię przygotowania matrycy Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) do wysokoprzepustowej manipulacji fizycznych i chemicznych sygnałów naśladujących mikrośrodowiska komórkowe in vivo oraz do identyfikacji optymalnego środowiska komórkowego dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) z profilowaniem pojedynczych komórek.

Wytwarzanie multipleksowanej sztucznej macierzy mikrośrodowiska komórkowego

Prezentujemy technologię, która wykorzystuje wspomagany kapilarność montaż w platformie mikroprzepływowej do modelowania mikroobiektów zawieszonych w cieczy, takich jak bakterie i koloidy, w określone tablice na podłożu z polidimetylosiloksanu.

Modelowanie mikroorganizmów i mikrocząstek poprzez sekwencyjny montaż wspomagany kapilarnością

Minibioreactor Array (MBRA) to wysokowydajny, konfigurowalny system hodowli o ciągłym przepływie, który umożliwia hodowlę złożonych społeczności drobnoustrojów, wspierając równoległe eksperymenty w celu badania dynamiki mikrobiomu, interakcji terapeutycznych i reakcji drobnoustrojów na czynniki środowiskowe.

Zaktualizowany protokół montażu i użytkowania macierzy minibioreaktorów (MBRA)

Poznaj metodę analizy społeczności mikrobiologicznych w mikrostudniach krzemowych. Technika umożliwia równoległe śledzenie interakcji mikroorganizmów w ograniczonych przestrzeniach, co ma zastosowanie w medycynie i ekologii.

Montaż i śledzenie rozwoju społeczności mikrobiologicznej w ramach platformy Microwell Array

Przeglądaj więcej filmów