Wysoce wydajna transfekcja ludzkich makrofagów THP-1 metodą nukleofekcji

Ogólnym celem tej procedury jest niezawodna transfekcja ludzkich makrofagów THP one o wysokiej żywotności komórek i braku aktywacji komórek. Osiąga się to poprzez wstępne różnicowanie monocytów THP przez 48 godzin. Drugim etapem zabiegu jest odłączenie przedwczesnych makrofagów TP one.

Trzecim krokiem jest transfekcja komórek za pomocą IRNA lub plazmidowego DNA przy użyciu technologii czynnika nukleokowego lonzy. Ostatnim krokiem jest ponowne zasianie i dalsze różnicowanie komórek. Ostatecznie, udane knockdown lub nadekspresja genu można wykazać poprzez ilościowy PCR w czasie rzeczywistym, Western blot wsteczny i tak dalej.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi podejściami do transfekcji, takimi jak lipofekcja, jest to, że możemy osiągnąć wysoką wydajność transfekcji wraz z wysoką żywotnością komórek oraz że nie zmieniamy funkcji i zachowania mikrofagów. Niestety, ta technika nie nadaje się do zastosowań o dużej mocy, ponieważ nie można wykonać bardziej intensywnego transfektu na raz dla tego protokołu. Hoduj komórki THP one w RPMI 1640 z 10% FCS i 1% paciorkowcową L glutaminą na 24 godziny przed transfekcją podziel komórki i dostarcz im świeże podłoże.

Następnego dnia. Wstępnie różnicuj komórki, wysiewając od 10 do 15 milionów komórek w kolbie tkankowej o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych z następującymi dodatkami do uzupełnionej pożywki RPMI, 1% aminokwasów endogennych, 1% pirogronianu sodu, 10 nanogramów na mililitr, PMA i 50 mikromolowych beta merkaptoetanolu po 48 godzinach, odessać pożywkę i zastąpić ją sześcioma mililitrami Accutane. Jeden z nich rozgrzał się do 37 stopni Celsjusza, aby odłączyć ogniwa.

Inkubuj je przez 30 minut podczas inkubacji. Przygotuj wystarczającą ilość pożywki do transfekcji i pożywki hodowlanej do pielęgnacji komórek po chorobie jądrowej. Po 30 minutach sprawdź, czy komórki są odłączone i rozejrzyj się dookoła.

Jeśli niektóre ogniwa są nadal podłączone, delikatnie przepompuj kolbę za pomocą mikropipety lub użyj prostego mieszania, aby je odłączyć. Nie używaj skrobaka. Przenieść zawiesinę do 15-mililitrowej probówki i odwirować ją przez pięć minut w temperaturze 300 G i w temperaturze pokojowej, usunąć supernatant przez aspirację i ponownie zawiesić osad komórkowy.

W jednym mililitrze RPMI, podgrzanym do 37 stopni Celsjusza, policz komórki i utwórz porcje mikroprobówek zawierających od dwóch do dwóch i pół miliona komórek do natychmiastowej transfekcji. Szybkie wykonanie tego protokołu jest niezbędne. Aby uniknąć utraty śmiertelności komórek, upewnij się, że wszystkie materiały są przygotowane z wyprzedzeniem Pierwsza wirówka, wszystkie porcje transfekcji przez 10 minut w 250 GS i w temperaturze pokojowej podczas wirowania, załaduj wszystkie weterynarze efektorów nukleograficznych pół mikrograma plazmidowego DNA lub jeden mikrogram SI RNA Użyj wysoce skoncentrowanego rozcieńczenia, aby zajmowały minimalną objętość weterynarza.

Teraz odessać supernatant tylko z jednego z podwielokrotności komórek. Zawieś komórki do 100 mikrolitrów w roztworze czynnika nukleograficznego. Nie pozwól, aby komórki pozostały wystawione na działanie roztworu dłużej niż 15 minut.

Przenieś komórki do weterynarza Q i wymieszaj je, delikatnie stukając. Następnie przetransfekuj komórki za pomocą programu Y 0 0 1 na modelu dwóch czynników nukleosowych B. Za pomocą jednorazowej pipety przenieś elektroporowane ogniwa do fiolki reakcyjnej i natychmiast dodaj pół mililitra wstępnie ostrzeżonej pożywki transfekcyjnej do komórek.

Teraz powtarzaj proces z każdą podwielokrotnością komórek jedna po drugiej, aż wszystkie zostaną transfekowane. Po zakończeniu afekcji nukleologicznej przenieś każdą transfekcję komórek do studzienki sześciodołkowej płytki z 2,5 mililitra ciepłej pożywki do transfekcji. Dokładnie wymieszaj każdą studzienkę za pomocą mikropipety.

Po pozostawieniu wszystkich załadowanych płytek do inkubacji przez cztery godziny, sprawdź stan komórek pod mikroskopem. Po czterech godzinach większość komórek należy w razie potrzeby przykleić do płytki. Góra.

Kolejna godzina inkubacji zapewni wystarczającą ilość sahe, która działa dobrze pojedynczo. Odessać pożywkę do transfekcji z przylegających komórek i zastąpić ją równą objętością ciepłej pożywki hodowlanej. Uważaj, aby uniknąć odłączenia komórek na tym etapie.

Teraz inkubuj komórki tak długo, jak to konieczne. W razie potrzeby wymieniaj pożywkę co 48 godzin, zaplanuj stosowanie zabiegów tak, aby zakończyły się, gdy transfekowane DNA lub RNA osiągnie szczytowy efekt. Podczas traktowania komórek efektorami należy użyć pożywki wolnej od surowicy bez PMA i bez beta merkaptoetanolu.

Uważaj, aby nie dopuścić do inkubacji komórek dłużej niż 24 godziny bez surowicy. Protokół zastosowano do transfekcji, oceniono THP jeden makrofag z morfologią komórkową IRNA. Zgodnie z pomiarem cytometrii przepływowej.

Szybkość apoptozy i nekrozy w komórkach była niska zarówno w hodowlach transfekowanych, jak i kontrolnych. Jednak dokładne liczenie wykazało, że zarówno apoptoza, jak i nekroza były nieco wyższe w przypadku transfekowanych próbek. Może to wynikać z faktu, że transfekowane makrofagi THP one były trudniejsze do oderwania od płytek niż komórki transfekowane UNT.

Ogólnie rzecz biorąc, wskaźniki transfekcji wynosiły ponad 90%, jak analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Skuteczność transfekcji S-I-R-N-A przy użyciu fluorescencji potwierdzono również za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Funkcjonalność transfekcji wykazano poprzez genetyczne nokautowanie ekspresji IL 10 RB.

Korzystanie z krótkiego interferującego RNA Po opanowaniu transfekt można wykonać w ciągu jednej do półtorej godziny, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że pożywka hodowlana ma znaczący wpływ na wydajność. Jest to opisane w protokole tekstowym.