Name: Wysoce wydajna transfekcja ludzkich makrofagów THP-1 metodą nukleofekcji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Poznaj wysokowydajną transfekcję makrofagów THP-1 metodą nukleofekcji. Technika zapewnia ponad 90% wydajność przy zachowaniu żywotności komórek i funkcjonalności makrofagów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Lonza Group Ltd. za sponsorowanie tej publikacji poprzez pokrycie kosztów publikacji. Dziękujemy Deutsche Infarktforschungshilfe, Wilhelm-Vaillant-Stiftung, Ernest-Solvay-Stiftung oraz Thüringer Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Kultur za wsparcie finansowe dla SL.

1. Predyferencjacja makrofagów THP-1
<ol>
	<li>Hodować komórki THP-1 w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej 10% (v/v) płodowej surowicy cielęcej (FCS) i 1% (v/v) penicyliny/streptomycyny/L-glutaminy (PSG) w inkubatorze CO2 (5%) w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przed transfekcją podziel komórki i przenieś je na świeżą pożywkę RPMI, tak jak poprzednio. Hoduj komórki przez 24 godziny.</li>
	<li>Wysiewać 1,0-1,5 x 107 komórek do kolby do hodowli tkankowych o powierzchni 75 cm² lub 2,5 x 107 komórek do kolby do hodowli tkankowych o powierzchni 150 cm² w pożywce RPMI-1640 i dodać 10% (v/v) FCS, 1% (v/v) PSG, 1% (v/v) pirogronianu sodu, 1% (v/v) aminokwasów endogennych, 10 ng/ml PMA, i 50 μM β-merkaptoetanolu przez 48 godzin.</li>
</ol>
2. Przygotowanie Nucleofekcji
<ol>
	<li>Umieścić Accutase I i wszystkie podłoża w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną z kolby i zastąpić 6 ml (kolba 75 cm²) lub 12 ml (kolba 150 cm²) Accutase I i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C do całkowitego oderwania komórek. Należy obserwować morfologię komórek po leczeniu Accutazą I, aby upewnić się, że komórki mają okrągły wygląd. Jeśli niektóre komórki nadal wydają się być przyczepione, ostrożnie przepłukać kolbę mikropipetą lub delikatnie postukać, aby całkowicie oderwać się. Nie używaj skrobaków do komórek, ponieważ będzie to miało negatywny wpływ na witalność komórek. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Podczas leczenia Accutase I należy przygotować następujące podłoża:
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę do transfekcji: uzupełnić pożywkę do hodowli komórkowych 1% (v/v) PSG, 1% (v/v) aminokwasów endogennych, 1% (v/v) pirogronianu sodu i 5% (v/v) surowicy ludzkiej (dla siRNA) lub 20% (v/v) surowicy ludzkiej (dla plazmidowego DNA); przygotować końcową objętość 3 ml/próbkę dla jednej płytki 6-dołkowej lub 4 ml/próbkę dla dwóch płytek 12-dołkowych.</li>
		<li>Przygotować pożywkę hodowlaną: uzupełnić pożywkę hodowlaną 1% (v/v) PSG, 1% (v/v) aminokwasów endogennych, 1% (v/v) pirogronianu sodu i 5% (v/v) surowicy ludzkiej (dla siRNA) lub 20% (v/v) surowicy ludzkiej (dla plazmidu), 2,5 ng/ml PMA i 50 μM β-merkaptoetanolu; przygotować końcową objętość 3 ml/próbkę dla jednej płytki 6-dołkowej lub 4 ml/próbkę dla dwóch płytek 12-dołkowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zawiesinę komórek wirować przez 5 minut przy 300 x g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać Accutazę I i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki RPMI podgrzanej do temperatury 37 °C; policzyć komórki, aby określić liczbę komórek. 
	UWAGA: W przypadku stosowania szybkich procedur automatycznego zliczania komórek, kroki 2.4 i 2.5 mogą zostać pominięte, a komórki mogą być zliczane natychmiast po odłączeniu, pod warunkiem że unika się długotrwałego narażenia na Accutase I.</li>
	<li>Dla każdej próbki transfekcyjnej należy przygotować porcje w probówkach wirówkowych zawierających 2,0-2,5 x 106 komórek.</li>
</ol>
3. Nucleofekcja makrofagów THP-1
<ol>
	<li>Odwirować wszystkie podwielokrotności przez 10 minut przy 250 x g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć plazmidowy DNA lub siRNA w wodzie wolnej od nukleaz lub odpowiednim buforze. Utrzymuj wymaganą objętość plazmidowego DNA lub siRNA tak małą, jak to możliwe.</li>
	<li>Przygotuj jedną kuwetę Nucleofector z 1 μg siRNA lub 0,5 μg plazmidowego DNA dla każdej transfekcji.</li>
	<li>Wykonuj jedną transfekcję na raz. Odessać supernatant z podwielokrotności komórki.</li>
	<li>Zawiesić granulowane komórki w roztworze nukleofektora, aby uzyskać całkowitą objętość 100 μl roztworu DNA/siRNA i nukleofektora. Ograniczyć czas ekspozycji na czysty roztwór Nucleofector do minimum i zapewnić, że czas ekspozycji nie przekracza 15 minut.</li>
	<li>Wymieszaj zawieszone komórki i DNA/siRNA w kuwecie Nucleofector przez delikatne stukanie.</li>
	<li>Transfekcja komórek poprzez wykonanie programu Y-001 w urządzeniu Nucleofector 2b.</li>
	<li>Przenieść transfekowane komórki do fiolki reakcyjnej za pomocą jednorazowych plastikowych pipet Pasteura.</li>
	<li>Natychmiast dodać 500 μl przygotowanego podłoża do transfekcji.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 3.4-3.9 dla każdej próbki transfekcyjnej.</li>
</ol>
4. Opieka po nukleofekcji
<ol>
	<li>Przygotować płytki 6-dołkowe lub 12-dołkowe dla transfekowanych komórek. Pobrać pipetą 2,5 ml pożywki do transfekcji do każdego dołka na płytce 6-dołkowej (1 dołek/transfekcja) lub 1,75 ml pożywki do transfekcji do każdego dołka na płytce 12-dołkowej (2 dołki/transfekcja).</li>
	<li>Zawiesiny komórek dokładnie wymieszać za pomocą mikropipety.</li>
	<li>Przenieść transfekowane komórki do przygotowanych dołków (albo jeden dołek w płytce 6-dołkowej, albo dwie w 12-dołkowej płytce).</li>
	<li>Inkubować płytki przez 4 godziny w nawilżanym inkubatorze (5% CO2, 37 °C).</li>
	<li>Sprawdź ponowne przyczepienie komórek pod mikroskopem. 
	UWAGA: Większość komórek powinna ponownie przylegać. Czasami wydłużenie okresu inkubacji o 1 godzinę zwiększa liczbę przylegających komórek w przypadku niewystarczającego ponownego przyłączenia.</li>
	<li>Ostrożnie odessać pożywkę do transfekcji za pomocą mikropipety i zastąpić równą ilością podłoża uprawowego. Zasysaj tylko jedną studzienkę na raz.</li>
	<li>Inkubuj komórki przez wymagany okres czasu, aby uzyskać maksymalny efekt plazmidu lub siRNA (24-72 godziny). Jeśli okres inkubacji przekracza 48 godzin, należy wymienić pożywkę po 48 godzinach.</li>
	<li>Do dodatkowego leczenia efektorami (np. cytokinami, agonistami, antagonistami i inhibitorami) należy stosować pożywkę wolną od surowicy bez PMA i β-merkaptoetanolu. Zmierz koniec okresu inkubacji efektora z czasem maksymalnego działania plazmidu lub siRNA i odpowiednio zaplanuj zmianę pożywki i dodanie efektora. Nie należy utrzymywać komórek w warunkach wolnych od surowicy dłużej niż 24 godziny.</li>
</ol>

<ol><li>Ricardo, S. D., van Goor, H., Eddy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+diversity+in+renal+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophage diversity in renal injury and repair.</a> J Clin Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
<li>Morille, M., Passirani, C., Vonarbourg, A., Clavreul, A., Benoit, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+developing+cationic+vectors+for+non-viral+systemic+gene+therapy+against+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Progress in developing cationic vectors for non-viral systemic gene therapy against cancer.</a> Biomaterials. (24-25), 3477-3496 (2008).</li>
<li>Schnoor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+non-viral+transfection+of+THP-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient non-viral transfection of THP-1 cells.</a> J Immunol Methods. 344 (2), 109-115 (2009).</li>
<li>Maeß, M. B., Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+protocol+for+efficient+nonviral+transfection+of+premature+THP-1+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Improved protocol for efficient nonviral transfection of premature THP-1 macrophages.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (5), (2011).</li>
<li>Ma, W., Liu, Y., Ellison, N., Shen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+C-X-C+chemokine+receptor+type+7+%28CXCR7%29+switches+stromal+cell-derived+factor-1+%28SDF-1%29+signaling+and+phagocytic+activity+in+macrophages+linked+to+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Induction of C-X-C chemokine receptor type 7 (CXCR7) switches stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling and phagocytic activity in macrophages linked to atherosclerosis.</a> J Biol Chem. 288 (22), 15481-15494 (2013).</li>
<li>Xie, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+localization+of+ABCG1+does+not+require+LXR+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell surface localization of ABCG1 does not require LXR activation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (11), 143-144 (2006).</li>
<li>Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S., Nitschke, Y., Severs, N. J., Hofnagel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIP47%2C+a+lipid+cargo+protein+involved+in+macrophage+triglyceride+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">TIP47, a lipid cargo protein involved in macrophage triglyceride metabolism.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (5), 767-773 (2009).</li>
<li>Robenek, H., Buers, I., Hofnagel, O., Lorkowski, S., Severs, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-tagged+proteins+visualized+by+freeze-fracture+immuno-electron+microscopy%3A+A+new+tool+in+cellular+and+molecular+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">GFP-tagged proteins visualized by freeze-fracture immuno-electron microscopy: A new tool in cellular and molecular medicine.</a> J Cell Mol Med. 13 (7), 1381-1390 (2009).</li>
<li>Guh, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+novel+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+activators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Development of novel adenosine monophosphate-activated protein kinase activators.</a> J Med Chem. 53 (6), 2552-2561 (2010).</li>
<li>Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+THP-1+differentiation+is+required+for+the+detection+of+responses+to+weak+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli.</a> Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).</li>
<li>Maeß, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+PMA+enhances+the+responsiveness+of+transfected+THP-1+macrophages+to+polarizing+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli.</a> J Immunol Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).</li>
<li>Angosto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+inflammasome+functions+in+vertebrates%3A+Inflammasome+and+caspase-1+trigger+fish+macrophage+cell+death+but+are+dispensable+for+the+processing+of+IL-1b%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Evolution of inflammasome functions in vertebrates: Inflammasome and caspase-1 trigger fish macrophage cell death but are dispensable for the processing of IL-1b.</a> Innate Immun. 18 (6), 815-824 (2012).</li>
<li>Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+regulation+of+the+inflammasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activation and regulation of the inflammasomes.</a> Nat Rev Immunol. 13 (6), 397-411 (2013).</li>
<li>Muruve, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasome+recognizes+cytosolic+microbial+and+host+DNA+and+triggers+an+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response.</a> Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).</li>
</ol>

Koszty publikacji tego artykułu są sponsorowane przez Lonza Group Ltd.

Przedstawiony tutaj protokół przedstawia niezawodny i skuteczny sposób transfekcji makrofagów THP-1, które zwykle są dość trudne do transfekcji. Transfekcję można osiągnąć przy skuteczności transfekcji powyżej 90% dla siRNA bez znacznego zmniejszenia żywotności komórek. Wydajność plazmidów może być mniejsza ze względu na ich rozmiar, ale zwykle można osiągnąć wydajność transfekcji około 70%. Skuteczność knockdownu za pośrednictwem siRNA może sięgać od 80 do 90% w zależności od zastosowanego siRNA. Główną zaletą tego protokołu jest to, że nie zakłóca różnicowania komórek. Po transfekcji komórki nadal normalnie reagują na czynnik różnicujący PMA (ryc. 1A do 1B i ryc. 4)12. Ponadto polaryzacja komórkowa przez bodźce cytokinowe, takie jak IL10 lub LPS/IFNγ, pozostajeniezakłócona 12, chociaż zależy to również w dużym stopniu od pożywki wybranej do hodowli po transfekcji, jak pokazano na rysunku 4.
W ramach procedury istnieje kilka opcji, które mogą być modyfikowane w celu dostosowania protokołu do konkretnych wymagań. Jak pokazano na rysunku 4 , komórki reagują różnie na ten sam bodziec IL10 w zależności od pożywki wybranej po transfekcji. Wskazuje to, że skład pożywki ma silny wpływ na zachowanie komórek. Ponieważ efekt narzucony przez pożywkę może być różny dla różnych bodźców eksperymentalnych, możliwe jest, że optymalna pożywka może ulec zmianie i dlatego istnieje potrzeba niezależnego sprawdzenia przydatności pożywki do różnych eksperymentów. Jednak pożywka RPMI-1640, która jest domyślną pożywką używaną do hodowli komórek THP-1, okazała się nieodpowiednia do hodowli po transfekcji, ponieważ zaobserwowano znaczną utratę żywotności komórek. Co więcej, protokół może być również stosowany do monocytów THP-1 bez wcześniejszego różnicowania wywołanego przez PMA, co oczywiście eliminuje potrzebę odłączania komórek podczas zabiegu, ale wszystkie pozostałe etapy nie muszą być dostosowywane. W razie potrzeby monocyty THP-1 można później różnicować.
Najbardziej krytycznymi elementami protokołu są, po pierwsze, oderwanie, a po drugie, czas potrzebny na transfekcję. Odklejanie należy wykonać tak delikatnie, jak to możliwe, aby utrzymać wysoką żywotność komórek. Dlatego zalecamy stosunkowo łagodne enzymatyczne oderwanie za pomocą Accutase I zamiast dość agresywnych metod, takich jak trypsynizacja. Dalsze metody odklejania, takie jak leczenie lidokainą lub skrobanie, okazały się raczej szkodliwe i nie powinny być stosowane. W przypadku, gdy 30 minut leczenia Accutase I nie powinno wystarczyć do prawidłowego odłączenia wszystkich komórek, jest to zwykle oznaką nieprawidłowo przechowywanego lub przeterminowanego roztworu Accutase I lub zbyt wielu cykli zamrażania i rozmrażania. Uzyskaliśmy dobre wyniki, przechowując małe porcje Accutase I w temperaturze -20 °C w celu zmniejszenia liczby cykli zamrażania i rozmrażania. Jednakże, gdy odklejenie jest niewystarczające, należy zastąpić Accutazę I świeżą Accutazą lub wydłużyć czas inkubacji do 1 godziny. Ponadto delikatne stukanie lub płukanie kolby lub płytki może pomóc w oderwaniu. Jeśli chodzi o wymagany czas transfekcji, czas ekspozycji komórek na czysty roztwór nukleofektora ma duży wpływ na przeżycie komórek i dlatego powinien być jak najkrótszy. Najlepszym sposobem na osiągnięcie tego celu jest wykonywanie każdej transfekcji na raz (kroki od 2.10 do 2.15), a nie wykonywanie wielu transfekcji równolegle.
Jeśli skuteczność knockdown jest niska, zwykle nie jest to spowodowane niską wydajnością transfekcji, ale można to łatwo zweryfikować za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii fluorescencyjnej i fluorescencyjnie znakowanego siRNA lub plazmidu kodującego GFP. Najczęściej przyczyną jest nieefektywne siRNA lub plazmidowe DNA. W tych okolicznościach należy rozważyć zwiększenie ilości siRNA (do 2-3 μg) lub plazmidowego DNA (do 1-2 μg) lub użycie innego siRNA lub wektora ekspresyjnego, jeśli jest dostępny. Alternatywnie, zadowalające wyniki można również osiągnąć, stosując pulę kilku różnych siRNA skierowanych przeciwko temu samemu celowi. Ponadto mogą być wymagane eksperymenty w czasie, aby dokładnie określić okres maksymalnego efektu, który zwykle osiąga się po 24 do 72 godzinach od transfekcji.
Oprócz transfekcji za pomocą elektroporacji istnieją inne dobrze znane techniki transfekcji komórek ssaków. Często stosowanymi systemami są chemiczne środki transfekcyjne, które mogą tworzyć kompleksy z kwasem nukleinowym ładunku, a następnie ułatwiać transport do komórek. Najczęściej stosowane odczynniki są oparte na różnych gatunkach lipidów lub mogą być wybierane spośród wielu polimerów kationowych3. Dla obu podejść na rynku dostępny jest różnorodny wybór. Te odczynniki do transfekcji mają tę zaletę, że są zwykle łatwe w użyciu, nie wymagają dużo czasu i działają również z przylegającymi komórkami, eliminując w ten sposób konieczność odłączania. Niestety, makrofagi są raczej trudne do transfekcji tymi metodami, ponieważ nie namnażają się znacząco in vitro i posiadają mechanizmy obronne skierowane przeciwko obcemu cytozolowemu DNA13-15. W związku z tym metody transfekcji chemicznej często prowadzą do poważnego zmniejszenia żywotności komórek. Jednak, jak pokazano na rysunku 2 , istnieją chemiczne środki transfekcyjne, które mogą z powodzeniem przenosić siRNA do makrofagów, ale jak wskazują analizy cytometryczne przepływowe (Figura 2A) i mikroskopy fluorescencyjne (Rysunek 2B), nie są one w stanie osiągnąć takiej samej jednorodnej dystrybucji siRNA w komórkach, jak uzyskano za pomocą nukleofekcji. W rzeczywistości dane z cytometrii przepływowej wskazują, że występują dwie różne populacje transfekowanych komórek, po pierwsze populacja o podobnej fluorescencji jak komórki po wykryciu nukleofekcji, a po drugie istnieje populacja o bardziej intensywnej fluorescencji. Ostateczne potwierdzenie jest nadal wymagane, ale przypuszczamy, że pierwsza populacja jest w mikroskopii fluorescencyjnej identyczna z tymi komórkami, które wykazują jednorodny rozkład fluorescencyjnego siRNA w cytozolu, podczas gdy druga populacja prawdopodobnie odpowiada komórkom z bardzo jasnymi aglomeratami. Dane cytometryczne przepływowe pokazane na rysunku 2A sugerują, że nukleofekcja powoduje mniej siRNA na komórkę niż alternatywne podejście lipofekcji. Jednak dane na rycinie 3 pokazują, że nawet stosunkowo niewielka ilość siRNA włączonego przez Nucleofection jest już wystarczająca do 80 do 90% knockdownu docelowego genu. W związku z tym dodatkowa ilość siRNA włączona do drugiej populacji po transfekcji chemicznej jest najprawdopodobniej nadwyżką, a zatem bardziej prawdopodobne jest, że spowoduje niepożądane skutki uboczne niż jeszcze bardziej zwiększy skuteczność knockdownu. Poza tym tworzenie się aglomeratów wewnątrzkomórkowych jest już samo w sobie niepożądane, ponieważ te cząsteczki siRNA prawdopodobnie nie działają lub przynajmniej są mniej wydajne niż wolne cząsteczki siRNA i mogą powodować efekty niepożądane. Co więcej, prawdziwa natura tych aglomeratów nie jest jeszcze jasna. Możliwe, że te jasne plamy reprezentują endosomy wskazujące, że siRNA zostało zinternalizowane przez komórki, ale następnie uwolnienie z endosomów nie powiodło się, a siRNA pozostaje uwięzione, a zatem nieskuteczne. Alternatywnie plamki mogą być aglomeratami, które powstają wewnątrzkomórkowo. Oceny funkcjonalne transfekcji chemicznej są w toku, dlatego nie można jeszcze wydać ostatecznych stwierdzeń na temat skuteczności knockdownu, nadal istnienie dwóch odrębnych populacji jest już niekorzystne, ponieważ oznacza to, że wszystkie wyniki opisują średnią obu populacji, a zatem nie odpowiada żadnej z populacji. Z tego powodu Nucleofekcja jest lepszym podejściem.
Niemniej jednak istnieją również ograniczenia dotyczące opisanej tutaj procedury transfekcji. Ponieważ komórki muszą być w zawieszeniu dla Nucleofekcji, przylegające komórki muszą zostać odłączone, co stanowi dodatkowy czynnik stresujący dla komórek. Co więcej, cały protokół jest dość czasochłonny. Ponieważ transfekcje nie mogą być wykonywane jednocześnie, ale muszą być wykonywane szybko, aby uniknąć uszkodzenia komórek, liczba próbek jest ograniczona do około 8 - 10 na eksperyment. W związku z tym protokół ten nie nadaje się do projektów przesiewowych o wysokiej przepustowości. Do zastosowań o wysokiej przepustowości dostępne są różne systemy Nucleofector. Po pierwsze, istnieje system 4D-Nucleofector, który oferuje 16-dołkowy format paska. Aby uzyskać jeszcze większą przepustowość, dostępny jest 96-dołkowy system Shuttle i 384-dołkowy system HT Nucleofector . Ponieważ jednak te nowsze systemy działają z przewodzącymi elektrodami polimerowymi zamiast aluminium, a zatem warunki elektryczne, tj. programy i skład roztworu Nucleofectora, uległy odpowiednim zmianom, należy ustalić, czy nasz protokół można przenieść do tych systemów.
Jednak pomimo tych ograniczeń przedstawiony tutaj protokół zapewnia niezawodną i skuteczną transfekcję komórek THP-1, która jest lepsza niż wszystkie inne podejścia niewirusowe. Protokół ten umożliwia badanie skutków zmienionej ekspresji genów w komórkach THP-1, które we wszystkich innych aspektach różnicują się i polaryzują normalnie, a tym samym wykazują jak najmniej skutków ubocznych transfekcji.

Wśród składników komórkowych ludzkiego układu odpornościowego, makrofagi mają ogromne znaczenie dla wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Ich zadania są różnorodne; Biorą udział w fagocytozie patogenów i materiału martwiczego, odgrywają ważną rolę w homeostazie tkanek oraz wytwarzają i wydzielają dużą liczbę cytokin regulujących i koordynujących odpowiedź immunologiczną1. Dlatego makrofagi są integralnie zaangażowane w wiele procesów fizjologicznych i stanów patofizjologicznych. Ze względu na różnorodność ich zadań makrofagi są bardzo niejednorodnym i wieloaspektowym typem komórek. Osiąga się to dzięki różnym polaryzacjom; W zależności od bodźców zewnętrznych makrofagi mogą rozwijać się w różne fenotypy2. Zmienność makrofagów i ich wpływ na odpowiedź immunologiczną sprawiają, że są one bardzo interesującym obiektem badań. Aby wyjaśnić ich złożone funkcje metaboliczne i regulacyjne, potrzebne są odpowiednie modele makrofagów in vitro, które prawidłowo odzwierciedlają niejednorodność i zmienność makrofagów.
Transfekcja komórek z plazmidowymi wektorami DNA lub małymi interferującymi RNA (siRNA) w celu zmiany ekspresji genów komórkowych stała się szeroko stosowanym i potężnym narzędziem w biologii komórki do badania zarówno regulacji genów, jak i funkcji genów. Obecnie dostępny jest duży wybór różnych narzędzi do transfekcji komórek eukariotycznych. Narzędzia te obejmują zastosowanie wektorów wirusowych, metody mechaniczne (takie jak pistolety genowe), podejścia chemiczne (które opierają się na polimerach lub lipidach, które mogą tworzyć kompleksy z kwasami nukleinowymi) oraz elektroporację komórek3. Wszystkie te podejścia mają swoje zalety i wady, a wybór najlepiej dopasowanego z tej szerokiej gamy do określonego typu ogniwa i zastosowania może być trudnym i czasochłonnym procesem.
Makrofagi są niezwykle trudne do transfekcji, ponieważ prawie wszystkie sprawdzone metody transfekcji drastycznie zmniejszają żywotność makrofagów lub zakłócają ich zachowanie, tj. różnicowanie, a w szczególności polaryzację. Dlatego przedstawiamy tutaj skuteczny, niewirusowy protokół transfekcji ludzkich makrofagów THP-1 przy użyciu technologii Nucleofector opartej na elektroporacji, która reprezentuje zoptymalizowane podejście do elektroporacji wymagające zmniejszonej ilości DNA. Nukleofekcja doskonale nadaje się do wrażliwych komórek, takich jak monocyty i makrofagi. Protokół ten jest adaptacją wcześniej opublikowanych wersji4,5.
W skrócie, 12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA) jest używany do różnicowania ludzkich monocytów THP-1 przez 48 godzin na przedwczesne makrofagi przed transfekcją siRNA lub plazmidowym DNA. W celu transfekcji wstępnie zróżnicowane makrofagi są odłączane enzymatycznie przez obróbkę Accutase I. Transfekcja odbywa się za pomocą urządzenia Nucleofector 2b do elektroporacji komórek. Po transfekcji różnicowanie jest kontynuowane przez kolejne 24 do 48 godzin, w zależności od potrzeb. Na koniec dojrzałe transfekowane makrofagi są inkubowane z różnymi rodzajami związków do badań funkcjonalnych.
To podejście pozwala na transfekcję linii komórkowych, takich jak ludzkie monocyty THP-1 i makrofagi, i było z powodzeniem stosowane w ciągu ostatnich6-10 lat. W przeciwieństwie do większości podejść do transfekcji chemicznej, nasza zmodyfikowana procedura Nucleofekcji z wykorzystaniem przedwczesnych makrofagów zapewnia wysoką wydajność transfekcji w połączeniu z niezaburzoną żywotnością komórek, bez konieczności stosowania wektorów wirusowych lub dodawania dalszych związków nośnikowych o nieznanych skutkach ubocznych. Ponadto makrofagi zachowują swój pełny potencjał różnicowania, a także polaryzacji, umożliwiając w ten sposób niezakłócone badania funkcjonalne po transfekcji11.
Ponadto, pożywka do hodowli komórkowej zastosowana po Nucleofekcji silnie wpływa na badania funkcjonalne po transfekcji; w szczególności, zdolność makrofagów do polaryzacji może być zmieniona w zależności od zastosowanej pożywki. Tutaj przetestowano cztery różne typy pożywek do hodowli komórkowych (IMDM, X-VIVO 20, LGM3 i pożywkę dla mysich komórek T Nucleofector Nucleofector Cube) w warunkach dezaktywacji przy użyciu interleukiny (IL) 10. Używając makrofagów THP-1, zaobserwowaliśmy, że reakcja komórek na IL10 jest najsilniejsza, gdy stosuje się pożywkę Nucleofector z mysich komórek T w porównaniu z innymi pożywkami hodowlanymi wymienionymi powyżej. Wyniki te pokazują, że odpowiednia optymalizacja wszystkich warunków hodowli komórkowej jest niezbędna do udanej transfekcji i późniejszych badań funkcjonalnych, ponieważ mogą one znacznie poprawić wyniki eksperymentalne.
Ponieważ makrofagi są zaangażowane w różne choroby ludzkie, wiele badań koncentruje się na wyjaśnieniu zachowania makrofagów, jak również mechanizmów regulacyjnych wpływających na makrofagi lub z kolei kontrolowanych przez makrofagi. Dlatego protokół ten ma znaczenie w wielu różnych obszarach badawczych.

<table><tbody><tr><td>Accutase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy, nieistotne</td><td>PAA</td><td>M11-003</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe (15 ml)</td><td>TPP</td><td>TPP91015</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (złoto FCS)</td><td>PAA</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw nukleofektorów ludzkich monocytów</td><td>Lonza</td><td>VPA-1007</td><td>Zawiera roztwór nukleofektora, kuwety i Pasteura pipety</td></tr><tr><td>Surowica ludzka ze skrzepu</td><td>Lonza</td><td>C11-020</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka Dulbecco firmy Isove (IMDM) z 25 mM HEPES i 25 mM L-glutaminą</td> Pożywka dla limfocytów <td>Lonza</td><td>12-722F</td><td></td></tr><tr><td>3 (LGM3)</td><td>Lonza</td><td>CC-3211</td><td></td></tr><tr><td>Mysi nukleofektor komórkowy</td><td>Lonza</td><td>VZB-1001</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector 2b</td><td>Lonza</td><td>AAD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina / streptomycyna / L-glutamina (100x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1146</td><td></td></tr><tr><td>12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP685</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640)</td><td>PAA</td><td>E15-840</td><td></td></tr><tr><td>siRNA / plazmid Pirogronian</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodu (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 monocyty ludzkiej białaczki</td><td>CLS</td><td>300356</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli tkankowych (75 cm&sup2;; 150 cm&sup2;)</td><td>TPP</td><td>TPP90076/TPP90151</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych (6-dołkowe; 12-dołkowe)</td><td>Probówki TPP</td><td>TPP92406/TPP92012</td><td></td></tr><tr><td>(1,5 ml)</td><td>StarLab</td><td>S 1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Woda (bez nukleaz) lub odpowiedni bufor siRNA/plazmidowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Vivo 20 z gentamycyną</td><td>Lonza</td><td>BE04-448Q</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

wysoce wydajna transfekcja ludzkich makrofagów thp-1 metodą nukleofekcji

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Makrofagi, jako kluczowi gracze wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, są przedmiotem badań dotyczących homeostazy tkanek lub różnych patologii. Transfekcja za pomocą siRNA i plazmidowego DNA jest skutecznym narzędziem do badania ich funkcji, ale transfekcja makrofagów nie jest sprawą trywialną. Chociaż dostępnych jest wiele różnych podejść do transfekcji komórek eukariotycznych, tylko kilka z nich pozwala na niezawodną i wydajną transfekcję makrofagów, ale często obserwuje się zmniejszoną żywotność komórek i poważnie zmienione zachowanie komórek, takie jak zmniejszona zdolność do różnicowania lub polaryzacji. Dlatego wymagany jest protokół transfekcji, który jest w stanie przenieść siRNA i plazmidowe DNA do makrofagów bez powodowania poważnych skutków ubocznych, umożliwiając w ten sposób badanie działania siRNA lub plazmidu w kontekście normalnego zachowania komórki. Przedstawiony tutaj protokół zapewnia metodę niezawodnej i wydajnej transfekcji ludzkich makrofagów i monocytów THP-1 o wysokiej żywotności komórek, wysokiej wydajności transfekcji i minimalnym wpływie na zachowanie komórek. Podejście to opiera się na Nucleofekcji, a protokół został zoptymalizowany w celu utrzymania maksymalnej zdolności do aktywacji komórek po transfekcji. Protokół jest odpowiedni dla komórek przylegających po oderwaniu, a także komórek w zawiesinie i może być stosowany w przypadku małych i średnich próbek. W związku z tym przedstawiona metoda jest przydatna do badania efektów regulacji genów podczas różnicowania i polaryzacji makrofagów. Oprócz przedstawienia wyników charakteryzujących makrofagi transfekowane zgodnie z tym protokołem w porównaniu z alternatywną metodą chemiczną, omówiono również wpływ selekcji pożywki do hodowli komórkowych po transfekcji na zachowanie komórek. Przedstawione dane wskazują na znaczenie walidacji wyboru dla różnych ustawień eksperymentalnych.

Stosując niniejszy protokół transfekcji makrofagów THP-1 za pomocą siRNA, zazwyczaj osiągamy wydajność transfekcji powyżej 90% bez istotnego obniżenia żywotności komórek. Rycina 1 przedstawia reprezentatywne dane charakteryzujące stan komórek 24 h po transfekcji siRNA znakowanym fluorescencyjnie w porównaniu z kontrolą nietransfekowaną, która nie była traktowana odczynnikami do nukleofekcji ani impulsem elektrycznym czy siRNA, lecz poddawana była wszystkim zmianom pożywek hodowlanych, co miało miejsce w próbkach transfekowanych. Na Rycini 1A przedstawiono morfologię komórkową na podstawie pomiarów cytometrycznych. Obrazy mikroskopowe pokazano na Rycini 1B. Ryciny 1C i 1D reprezentują niskie wskaźniki apoptozy (kontrola: 1,5%; nukleofekcja: 5,4%) i nekrozy (kontrola: 2,0%; nukleofekcja: 3,2%), co wskazuje na niezakłóconą żywotność komórek. Poziom nekrozy i apoptozy jest nieco wyższy w próbce transfekowanej, ponieważ transfekowane makrofagi THP-1 trudniej odczepić niż komórki nietransfekowane, co zwiększa prawdopodobieństwo uszkodzenia komórek podczas odczepiania. Na koniec, wydajność transfekcji przedstawiono na Rycini 1E. Ponieważ cała populacja transfekowana jest przesunięta względem kontroli, wskazuje to, że wszystkie komórki zostały transfekowane, co potwierdzają obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej (Rycina 2B). Zarówno dane z cytometrii przepływowej, jak i obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej wskazują, że wszystkie komórki są spójnie transfekowane, z jednorodnym rozkładem siRNA pomiędzy komórkami, jak i wewnątrz nich. Kontrastuje to z działaniem wielu chemicznych odczynników do transfekcji; dla porównania Ryciny 2A i 2B przedstawiają odpowiednio dane z cytometrii przepływowej i obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej dla chemicznego czynnika transfekcyjnego opartego na lipidach. Ryciny te pokazują, że można wykryć dwie odrębne populacje komórek transfekowanych. Pierwsza populacja jest podobna do komórek po nukleofekcji. Charakteryzują się one niską ogólną fluorescencją i jednorodnym rozkładem siRNA wewnątrz komórek. Druga populacja wyróżnia się bardziej intensywną fluorescencją, która pochodzi z bardzo jasnych wewnątrzkomórkowych aglomeratów siRNA. Morfologia komórkowa pozostaje niezmieniona dla obu metod transfekcji, co pokazano za pomocą kontrastu interferencyjnego na Rycini 2C. Transfekcje z użyciem plazmidowego DNA dają efekty zbliżone; w celach przykładowych należy odnieść się do Robenek et al. (2009)9 lub Xie et al. (2006)7.
Wybór pożywki do hodowli komórkowej po transfekcji ma ogromne znaczenie, dlatego w badaniu porównawczym przetestowano różne pożywki. Wszystkie wybrane media nadają się do hodowli komórek THP-1 i zostały dobrane zgodnie z zaleceniami firmy Lonza jako pożywki odpowiednie do hodowli po nukleofekcji. Rysunek 3 przedstawia wydajność wyciszania siRNA z wykorzystaniem siRNA skierowanego przeciwko mRNA IL10RB (łańcuch β receptora interleukiny 10). W przypadku wszystkich testowanych pożywek ekspresja IL10RB została znacząco zredukowana do około 10–20% poziomu kontrolnego (Rysunek 3). Jednakże transfektowane komórki różnią się w zależności od pożywki w zakresie ich potencjału do polaryzacji. Makrofagi THP-1 transfektowane nieswoistym kontrolnym siRNA lub siRNA specyficznym dla IL10RB hodowano w różnych pożywkach po transfekcji i poddano działaniu IL10. Następnie poziomy ekspresji indukowanego przez IL10 genu SOCS3 (supresor sygnalizacji cytokin 3) na poziomie mRNA zmierzono metodą RT-qPCR. Różnice między pożywkami wystąpiły w odniesieniu do stopnia indukcji ekspresji mRNA SOCS3 (Rysunek 4); indukcja dla poszczególnych testowanych pożywek: Mouse T Cell Nucleofector Medium, LGM3, X-VIVO 20 oraz IMDM wyniosła odpowiednio 19,5 [17,7–21,5], 11,5 [8,5–15,7], 8,0 [4,6–14,2] oraz 7,2 [5,6–9,5] razy. Zatem zastosowanie pożywki Mouse T Cell Nucleofector jest kluczowe. Dodatkowo zaobserwowano różnice w wpływie wyciszenia IL10RB na ekspresję SOCS3 po traktowaniu IL10; poziomy ekspresji mRNA SOCS3 zostały zredukowane odpowiednio 9,5 [8,8–10,3] razy w pożywce Mouse T Cell Nucleofector, 2,1 [1,1–4,1] razy w LGM3, 4,8 [3,2–7,2] razy w X-VIVO 20 i 3,3 [2,7–3,9] razy w IMDM. Wartości te odpowiadają redukcjom ekspresji SOCS3 w różnych pożywkach odpowiednio do 49%, 18%, 60% i 45%. Redukcja indukowanej przez IL-10 ekspresji SOCS3 po transfekcji siRNA IL10RB potwierdza skuteczną downregulację IL10RB w wyniku transfekcji.
<img alt="Dane z cytometrii przepływowej; analiza apoptozy i nekrozy za pomocą Alexa Fluor; porównanie w kontraście fazowym." fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig1highres.jpg" width="300" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Charakterystyka transfekowanych makrofagów THP-1. Charakterystyczny stan komórek pozostaje niezmieniony, co wykazano w analizach mikroskopii świetlnej i cytometrii przepływowej nie transfekowanych komórek kontrolnych w porównaniu z makrofagami THP-1 transfekowanymi zgodnie z przedstawionym protokołem. Makrofagi THP-1 różnicowano przy użyciu 10 ng/ml PMA przez 48 hr i transfekowano nieswoistym kontrolnym siRNA znakowanym fluorescencyjnie (Alexa 488). 24 hr po transfekcji wykonano zdjęcia żywych komórek (B) lub odłączono komórki za pomocą Accutase I i przeanalizowano je metodą cytometrii przepływowej (A). Barwienie na apoptozę i nekrozę przeprowadzono z użyciem Annexin V-phycoerythrin (PE) (C) oraz 7-aminoactinomycin (7-AAD) (D). Wydajność transfekcji (E) określono za pomocą cytometrii przepływowej, wykorzystując znacznik fluorescencyjny przyłączony do siRNA. Sygnał fluorescencji komórek transfekowanych (czarny) przedstawiono w zestawieniu z sygnałem kontrolnym (szary).<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig1highres.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Dane dotyczące nukleofekcji w porównaniu z lipofekcją; cytometria przepływowa, mikroskopia fluorescencyjna; analiza Alexa Fluor 488." fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig2highres.jpg" width="400" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Porównanie wewnątrzkomórkowej dystrybucji siRNA po nukleofekcji i lipofekcji. Komórki THP-1 różnicowano przez 48 hr zgodnie z niniejszym protokołem, a następnie transfekowano za pomocą nukleofekcji lub lipofekcji. Przedstawione wyniki lipofekcji uzyskano przy użyciu zestawu Xtremegene siRNA zgodnie z zaleceniami producenta, przy stosunku odczynnika do siRNA wynoszącym 4:1. 24 hr po transfekcji komórki oddzielono za pomocą Accutase I do analizy cytometrycznej lub oceniano mikroskopowo jako żywe komórki. (A) Efektywność transfekcji oraz dystrybucję siRNA na komórkę w obrębie populacji określono za pomocą cytometrii przepływowej, wykorzystując znacznik fluorescencyjny dołączony do siRNA; kontrolne próbki transfekowane bez siRNA przedstawiono w kolorze szarym, a próbki transfekowane siRNA w kolorze czarnym. (B) Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiające wewnątrzkomórkową dystrybucję znakowanego fluorescencyjnie siRNA (Alexa Fluor 488); pasek skali reprezentuje 40 µm. (C) Obraz w kontraście interferencyjnym odpowiadający obrazowi fluorescencyjnemu; pasek skali reprezentuje 40 µm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig2highres.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="IL10RB expression comparison; bar charts; mouse T cells; nucleofector media; gene expression analysis." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Rycina 3. siRNA-zależne wyciszenie ekspresji IL10RB w transfekowanych makrofagach THP-1. Makrofagi THP-1 poddano transfekcji zgodnie z opisanym protokołem. Po transfekcji komórki hodowano w czterech różnych pożywkach, mianowicie w pożywce Mouse T Cell Nucleofector (A), IMDM (B), LGM3 (C), oraz X-VIVO 20 (D), uzupełnione zgodnie z opisem w sekcji Protokół. Komórki poddano transfekcji nieswoistym kontrolnym siRNA (Ctrl) lub siRNA specyficznym dla IL10RB (IL10RB). Jako dodatkowe kontrole uwzględniono następujące próbki: kontrolę impulsu (Pulse control), t. j.komórek poddanych transfekcji w obecności siRNA (Pulse) oraz kontroli ośrodka, t.j.komórki, które poddano jedynie wymianie pożywki hodowlanej, a poza tym pozostały nieleczone. 24 h po transfekcji komórki inkubowano w pożywce bezsurowiczej z dodatkiem lub bez dodatku 50 ng/ml IL10 przez kolejne 24 h. Ekspresję IL10RB zmierzono za pomocą RT-qPCR; na wykresach przedstawiono średnią z trzech niezależnych eksperymentów, słupki błędu oznaczają błąd standardowy średniej; * p &lt;0.05; ** p &lt;0.01; *** p &lt;0,001 vs. Ctrl.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig3highres.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Expression levels of SOCS3/RPL37A in mouse T cells; bar graph for different culture media." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Rysunek 4. Zależna od IL10 regulacja SOCS3 po wyciszeniu ekspresji IL10RB w transfektowanych makrofagach THP-1. Makrofagi THP-1 poddano transfekcji zgodnie z opisanym protokołem. Po transfekcji komórki hodowano w czterech różnych mediach hodowlanych: Mouse T Cell Nucleofector medium (A), IMDM (B), LGM3 (C) oraz X-VIVO 20 (D) uzupełnione zgodnie z opisem w sekcji Protokół. Komórki poddano transfekcji niespecyficznym kontrolnym siRNA (Ctrl) lub siRNA specyficznym dla IL10RB (IL10RB). Jako dodatkowe kontrole włączono następujące próbki: kontrolę impulsu, t. j. komórki poddane transfekcji w obecności siNRA (Pulse) oraz kontrolę ośrodka, t. j.komórki, którym jedynie wymieniano pożywkę hodowlaną, a które poza tym nie były poddane żadnym zabiegom. 24 godziny po transfekcji komórki inkubowano w medium bezsurowiczym z dodatkiem lub bez dodatku 50 ng/ml IL10 przez kolejne 24 godziny. Ekspresję SOCS3 zmierzono za pomocą RT-qPCR; wykresy przedstawiają średnią z trzech niezależnych eksperymentów, słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej; *, # p &lt;0.05; **, ## p &lt;0.01; ***, ### p &lt;0,001 vs. Ctrl oraz vs. Ctrl + IL-10, odpowiednio.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig4highres.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół przedstawia efektywną i niezawodną metodę transfekcji ludzkich makrofagów THP-1 za pomocą siRNA lub plazmidowego DNA za pomocą elektroporacji z wysoką wydajnością transfekcji, przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej żywotności komórek i pełnej zdolności makrofagów do różnicowania i polaryzacji.

Wysoce wydajna transfekcja ludzkich makrofagów THP-1 metodą nukleofekcji

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Ogólnym celem tej procedury jest niezawodna transfekcja ludzkich makrofagów THP one o wysokiej żywotności komórek i braku aktywacji komórek. Osiąga się to poprzez wstępne różnicowanie monocytów THP przez 48 godzin. Drugim etapem zabiegu jest odłączenie przedwczesnych makrofagów TP one.Trzecim krokiem jest transfekcja komórek za pomocą IRNA lub plazmidowego DNA przy użyciu technologii czynnika nukleokowego lonzy. Ostatnim krokiem jest ponowne zasianie i dalsze różnicowanie komórek. Ostatecznie, udane knockdown lub nadekspresja genu można wykazać poprzez ilościowy PCR w czasie rzeczywistym, Western blot wsteczny i tak dalej.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi podejściami do transfekcji, takimi jak lipofekcja, jest to, że możemy osiągnąć wysoką wydajność transfekcji wraz z wysoką żywotnością komórek oraz że nie zmieniamy funkcji i zachowania mikrofagów. Niestety, ta technika nie nadaje się do zastosowań o dużej mocy, ponieważ nie można wykonać bardziej intensywnego transfektu na raz dla tego protokołu. Hoduj komórki THP one w RPMI 1640 z 10% FCS i 1% paciorkowcową L glutaminą na 24 godziny przed transfekcją podziel komórki i dostarcz im świeże podłoże.Następnego dnia. Wstępnie różnicuj komórki, wysiewając od 10 do 15 milionów komórek w kolbie tkankowej o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych z następującymi dodatkami do uzupełnionej pożywki RPMI, 1% aminokwasów endogennych, 1% pirogronianu sodu, 10 nanogramów na mililitr, PMA i 50 mikromolowych beta merkaptoetanolu po 48 godzinach, odessać pożywkę i zastąpić ją sześcioma mililitrami Accutane. Jeden z nich rozgrzał się do 37 stopni Celsjusza, aby odłączyć ogniwa.Inkubuj je przez 30 minut podczas inkubacji. Przygotuj wystarczającą ilość pożywki do transfekcji i pożywki hodowlanej do pielęgnacji komórek po chorobie jądrowej. Po 30 minutach sprawdź, czy komórki są odłączone i rozejrzyj się dookoła.Jeśli niektóre ogniwa są nadal podłączone, delikatnie przepompuj kolbę za pomocą mikropipety lub użyj prostego mieszania, aby je odłączyć. Nie używaj skrobaka. Przenieść zawiesinę do 15-mililitrowej probówki i odwirować ją przez pięć minut w temperaturze 300 G i w temperaturze pokojowej, usunąć supernatant przez aspirację i ponownie zawiesić osad komórkowy.W jednym mililitrze RPMI, podgrzanym do 37 stopni Celsjusza, policz komórki i utwórz porcje mikroprobówek zawierających od dwóch do dwóch i pół miliona komórek do natychmiastowej transfekcji. Szybkie wykonanie tego protokołu jest niezbędne. Aby uniknąć utraty śmiertelności komórek, upewnij się, że wszystkie materiały są przygotowane z wyprzedzeniem Pierwsza wirówka, wszystkie porcje transfekcji przez 10 minut w 250 GS i w temperaturze pokojowej podczas wirowania, załaduj wszystkie weterynarze efektorów nukleograficznych pół mikrograma plazmidowego DNA lub jeden mikrogram SI RNA Użyj wysoce skoncentrowanego rozcieńczenia, aby zajmowały minimalną objętość weterynarza.Teraz odessać supernatant tylko z jednego z podwielokrotności komórek. Zawieś komórki do 100 mikrolitrów w roztworze czynnika nukleograficznego. Nie pozwól, aby komórki pozostały wystawione na działanie roztworu dłużej niż 15 minut.Przenieś komórki do weterynarza Q i wymieszaj je, delikatnie stukając. Następnie przetransfekuj komórki za pomocą programu Y 0 0 1 na modelu dwóch czynników nukleosowych B. Za pomocą jednorazowej pipety przenieś elektroporowane ogniwa do fiolki reakcyjnej i natychmiast dodaj pół mililitra wstępnie ostrzeżonej pożywki transfekcyjnej do komórek.Teraz powtarzaj proces z każdą podwielokrotnością komórek jedna po drugiej, aż wszystkie zostaną transfekowane. Po zakończeniu afekcji nukleologicznej przenieś każdą transfekcję komórek do studzienki sześciodołkowej płytki z 2,5 mililitra ciepłej pożywki do transfekcji. Dokładnie wymieszaj każdą studzienkę za pomocą mikropipety.Po pozostawieniu wszystkich załadowanych płytek do inkubacji przez cztery godziny, sprawdź stan komórek pod mikroskopem. Po czterech godzinach większość komórek należy w razie potrzeby przykleić do płytki. Góra.Kolejna godzina inkubacji zapewni wystarczającą ilość sahe, która działa dobrze pojedynczo. Odessać pożywkę do transfekcji z przylegających komórek i zastąpić ją równą objętością ciepłej pożywki hodowlanej. Uważaj, aby uniknąć odłączenia komórek na tym etapie.Teraz inkubuj komórki tak długo, jak to konieczne. W razie potrzeby wymieniaj pożywkę co 48 godzin, zaplanuj stosowanie zabiegów tak, aby zakończyły się, gdy transfekowane DNA lub RNA osiągnie szczytowy efekt. Podczas traktowania komórek efektorami należy użyć pożywki wolnej od surowicy bez PMA i bez beta merkaptoetanolu.Uważaj, aby nie dopuścić do inkubacji komórek dłużej niż 24 godziny bez surowicy. Protokół zastosowano do transfekcji, oceniono THP jeden makrofag z morfologią komórkową IRNA. Zgodnie z pomiarem cytometrii przepływowej.Szybkość apoptozy i nekrozy w komórkach była niska zarówno w hodowlach transfekowanych, jak i kontrolnych. Jednak dokładne liczenie wykazało, że zarówno apoptoza, jak i nekroza były nieco wyższe w przypadku transfekowanych próbek. Może to wynikać z faktu, że transfekowane makrofagi THP one były trudniejsze do oderwania od płytek niż komórki transfekowane UNT.Ogólnie rzecz biorąc, wskaźniki transfekcji wynosiły ponad 90%, jak analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Skuteczność transfekcji S-I-R-N-A przy użyciu fluorescencji potwierdzono również za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Funkcjonalność transfekcji wykazano poprzez genetyczne nokautowanie ekspresji IL 10 RB.Korzystanie z krótkiego interferującego RNA Po opanowaniu transfekt można wykonać w ciągu jednej do półtorej godziny, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że pożywka hodowlana ma znaczący wpływ na wydajność. Jest to opisane w protokole tekstowym.

highly-efficient-transfection-human-thp-1-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wprowadzenie interesującego genu do komórki jest potężną metodą wyjaśniania jego funkcji in vivo. Niniejszy protokół opisuje wydajną metodę transfekcji hodowli ludzkich neuralnych komórek macierzystych/prekursorowych (hNSPCs) przy użyciu aparatu do elektroporacji Nucleofector firmy Amaxa.

Transfekcja ludzkich neuralnych komórek macierzystych za pomocą nukleofektora Amaxa

Przedstawiamy nasz zoptymalizowany protokół wysokoprzepustowej nukleofekcji jako wydajny sposób transfekcji pierwotnych ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą plazmidowego DNA lub siRNA, bez wywoływania dojrzewania komórek. Dostarczamy ponadto dowodów na skuteczne wyciszenie siRNA docelowego genu RIG-I zarówno na poziomie mRNA, jak i białka.

Zoptymalizowany protokół wydajnej transfekcji komórek dendrytycznych bez dojrzewania komórek

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Ten film pokazuje proces transfekcji pierwotnych makrofagów zmodyfikowanym mRNA kodującym zielone białko fluorescencyjne. Te zmodyfikowane mRNA, zaprojektowane w celu zmniejszenia immunogenności i poprawy jej stabilności, zapewniają udaną transfekcję, a następnie ekspresję białek zielonej fluorescencji, co potwierdza mikroskopia fluorescencyjna.

Transfekcja pierwszorzędowych makrofagów zmodyfikowanym mRNA

W tym protokole opisujemy metody efektywnej transfekcji linii komórkowych mysich makrofagów za pomocą siRNA za pomocą 96-dołkowego systemu Amaxa Nucleofector Shuttle System, stymulacji makrofagów lipopolisacharydem i monitorowania wpływu na produkcję cytokin zapalnych.

Wykorzystanie interferencji RNA do zbadania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej u makrofagów myszy

Transfekcja do linii komórkowej makrofagów, RAW264.7, jest trudna ze względu na naturalną reakcję komórki na obce materiały. Opisaliśmy tutaj delikatną, ale solidną procedurę transfekcji genów reporterowych lucyferazy do komórek RAW264.7.

Transfekcja komórek RAW264.7 z genem reporterowym lucyferazy

Elektroporacja nowej generacji to skuteczna metoda transfekcji ludzkich komórek Th17 z małymi RNA w celu zmiany ekspresji genów i zachowania komórek.

Transfekcja małego RNA w pierwotnych ludzkich komórkach Th17 za pomocą elektroporacji nowej generacji

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół ekspresji białek fuzyjnych fluorescencyjnych w komórkach dendrytycznych i makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Metoda opiera się na transdukcji komórek progenitorowych szpiku kostnego za pomocą konstruktów retrowirusowych, a następnie różnicowaniu do makrofagów i komórek dendrytycznych in vitro.

Ekspresja fluorescencyjnych białek fuzyjnych w mysich komórkach dendrytycznych i makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego

Makrofagi, zwłaszcza makrofagi pierwotne, są trudne do transfekcji, ponieważ specjalizują się w wykrywaniu cząsteczek pochodzenia niewłasnego. Opisujemy protokół, który umożliwia wysoce wydajną transfekcję pierwotnych makrofagów za pomocą mRNA generowanego z matryc DNA, takich jak plazmidy.

Wysoce wydajna transfekcja pierwotnych makrofagów za pomocą mRNA transkrybowanego in vitro

Linia komórkowa THP-1 jest szeroko stosowana jako model do badania funkcji ludzkich monocytów/makrofagów w różnych obszarach badawczych związanych z biologią. W tym artykule opisano protokół wydajnej inżynierii opartej na CRISPR-Cas9 i izolacji klonów pojedynczych komórek, umożliwiający uzyskanie solidnych i powtarzalnych danych fenotypowych.

Nokaut genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 oparty na elektroporacji w komórkach THP-1 i izolacja klonów pojedynczych komórek

Szczegółowy protokół jest dostępny dla użycia technologii CRISPR/Cas9 w celu osiągnięcia wysoce efektywnego docelowego wkręcania dużych, multicistronicznych konstruktów w pierwotnych ludzkich limfocytach T za pośrednictwem homologii (HMEJ) szlaku naprawy DNA. Limfocyty T zmodyfikowane za pomocą tego protokołu adaptowalnego do cGMP utrzymują doskonałą ekspansję komórek, cytotoksyczność i produkcję cytokin.

Inżynieria niewirusowa pierwotnych ludzkich limfocytów T poprzez ukierunkowaną integrację dużych matryc DNA za pośrednictwem homologii

Poznaj wysokowydajną transfekcję makrofagów THP-1 metodą nukleofekcji. Technika zapewnia ponad 90% wydajność przy zachowaniu żywotności komórek i funkcjonalności makrofagów.

Wysoce wydajna transfekcja ludzkich makrofagów THP-1 metodą nukleofekcji

Przeglądaj więcej filmów