Wizualizacja aktywacji kaspazy w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

W komórkach odpornościowych kaspaza-1, kaspaza zapalna, jest kluczowym składnikiem reagującym immunologicznie, który występuje w postaci nieaktywnej. Te nieaktywne formy składają się z domeny pro połączonej z domeną katalityczną i stają się aktywne poprzez dimeryzację indukowaną bliskością.

Aby uwidocznić aktywację kaspazy in vivo, zacznij od hodowli transfekowanych ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów eksprymujących białka czerwonej fluorescencji i pary fluorescencyjnych białek reporterowych komplementacji. Białka reporterowe zawierają prodomenę kaspazy-1 połączoną z niefluorescencyjnymi fragmentami białka Wenus, Wenus-N lub Wenus-C.

Potraktuj komórki pożywką do obrazowania zawierającą lipopolisacharydy - stymulant stanu zapalnego pochodzenia bakteryjnego i jonofory potasu - nigerycynę.

Lipopolisacharydy oddziałują z receptorami rozpoznawania wzorców na makrofagach, inicjując tworzenie kompleksu inflamasomowego.

Cząsteczki nigericyny wnikają do komórki i wiążą się z jonami potasu, powodując ich odpływ do pożywki zewnątrzkomórkowej i zmniejszając wewnątrzkomórkowe stężenie jonów potasu. Prowadzi to do pobudzenia białek czujnikowych inflamasomu białkami adaptorowymi – białkiem pomostowym między białkiem czujnikowym a prokaspazą-1, tworzącym kompleks.

Prodomeny zawierające fragmenty Wenus oddziałują z białkami adaptorowymi kompleksu. To sprawia, że oba fragmenty znajdują się w pobliżu, zmuszając je do ponownego złożenia i fluorescencji.

Wizualizuj komórki pod mikroskopem epifluorescencyjnym.

Transfekowane komórki są czerwone z zielonymi plamkami fluorescencyjnymi, potwierdzającymi aktywację kaspazy.

Weź 1,5-mililitrową sterylną mikroprobówkę na transfekcję i dodaj odpowiedni plazmid reporterowy i plazmidy kaspazy-BiFC do kaptura. Umieść stację pipetową, urządzenie, końcówki, rurki do elektroporacji i pipetę w sterylnym kapturze z przepływem laminarnym. Podłącz i włącz urządzenie nukleofekcyjne.

Wprowadź parametry transfekcji na wyświetlonym ekranie startowym. Naciśnij Voltage, wprowadź 1,000 i naciśnij Gotowe, aby ustawić go na 1000 woltów. Naciśnij Szerokość, wprowadź 40 i naciśnij Gotowe, aby ustawić impuls na 40 milisekund. Na koniec naciśnij # Impulsy, wprowadź dwa i naciśnij Gotowe, aby ustawić liczbę impulsów elektrycznych na 2.

Weź jedną z probówek do elektroporacji i napełnij ją trzema mililitrami buforu elektrolitycznego E o temperaturze pokojowej. Włóż rurkę do elektroporacji do uchwytu na pipetę na stacji pipetowej, upewniając się, że elektroda z boku rurki jest skierowana do wewnątrz, a po włożeniu rurki słychać kliknięcie.

Weź osad komórkowy i dodaj 10 mikrolitrów wstępnie podgrzanego buforu R do reprodukcji zawiesiny na każde 1 do 2 razy 10 do piątych komórek i delikatnie wymieszaj z mikropipetą P20. Dodać 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej probówki do transfekcji i delikatnie wymieszać z mikropipetą P20. Włóż końcówkę do pipety, naciskając przycisk Push do drugiego oporu, upewniając się, że zacisk całkowicie podnosi trzpień mocujący tłoka w końcówce.

Następnie naciśnij przycisk na pipecie do pierwszego oporu i zanurz się w pierwszej probówce zawierającej mieszaninę komórek lub plazmidowego DNA, aby zassać próbkę. Ostrożnie włożyć pipetę z próbką do uchwytu na pipetę, upewniając się, że pipeta zatrzasnęła się i jest odpowiednio umieszczona. Naciśnij Start na ekranie dotykowym i poczekaj, aż zostaną dostarczone impulsy elektryczne.

Powoli wyjmij pipetę ze stacji i natychmiast dodaj zawiesinę transfekowanych komórek do odpowiedniej studzienki z podgrzaną, wolną pożywką, powoli naciskając przycisk do pierwszego oporu. Delikatnie kołysz płytką z transfekowanymi komórkami i inkubuj przez jedną do trzech godzin w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych. Następnie dodaj 200 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej do każdej studzienki.

Umieść naczynie w inkubatorze i odczekaj co najmniej 24 godziny na ekspresję genów. Następnego dnia sprawdź żywotność komórek i wydajność transfekcji za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.

Ostrożnie usuń pożywkę z komórek za pomocą mikropipety P1000 i dodaj 500 mikrolitrów roztworu stymulującego wzdłuż boku studzienki. Aby uruchomić nieoczyszczone studzienki kontrolne, dodaj pożywkę obrazującą bez bodźca.

Aby uwidocznić komórki za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego, włącz mikroskop i fluorescencyjne źródło światła, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Wybierz obiektyw 10 lub 20 razy i umieść naczynie hodowlane na stoliku mikroskopu.

Znajdź komórki pod filtrem 568 nm za pomocą okularu i skup się na komórkach wyrażających czerwone krwinki reporterowe. Policz wszystkie czerwone komórki w polu widzenia. Będąc w tym samym polu widzenia, zmień filtry na 488 lub 512. Policz liczbę czerwonych krwinek, które są również zielone. Policz co najmniej 100 czerwonych komórek z co najmniej trzech pól.