Modelowanie miejsca aktywnego enzymu za pomocą darmowego oprogramowania do wizualizacji molekularnej
25 grudnia 2021
Kluczową umiejętnością w modelowaniu biomolekularnym jest wyświetlanie i opisywanie aktywnych miejsc w białkach. Technika ta została zademonstrowana przy użyciu czterech popularnych darmowych programów do wizualizacji makromolekularnej: iCn3D, Jmol, PyMOL i UCSF ChimeraX.
Wizualizacja makrocząsteczek biologicznych jest kluczową umiejętnością dla studentów i profesjonalistów w naukach biologicznych. W tym protokole pokazujemy, jak modelować miejsce aktywne enzymu glukokinazy za pomocą czterech ogólnodostępnych programów do modelowania molekularnego. W tym samouczku przedstawiono kilka kroków protokołu dla każdego programu, który obejmuje wybór związanych ligandów i użycie ligandów do wyświetlania aminokwasów i cząsteczek wody w promieniu pięciu angstremów.
Informacje pomocnicze do tego manuskryptu zawierają dedykowany film wideo dla każdego programu, który szczegółowo opisuje wszystkie kroki protokołu wraz z dalszymi wyjaśnieniami. Struktura będzie modelować PDBID. 3FGU reprezentuje kompleks katalityczny enzymu glukokinazy.
Miejsce aktywne enzymu jest związane z dwoma jego substratami, beta-D-glukozą, która dała identyfikator BGC i jonem magnezu, MG. Dodatkowo ten analog substratu, kwas fosforoaminofosforowy, ester adenylanowy, ANP jest związany z miejscem aktywnym glukokinazy. Ten niehydrolizowalny analog trifosforanu adenozyny, ATP, zapobiega wystąpieniu reakcji fosforylacji, która wychwytuje kompleks miejsca aktywnego przed katalizą. Interfejs programu do modelowania UCSF ChimeraX zawiera menu rozwijane, pasek narzędzi, przeglądarkę konstrukcji i wiersz poleceń.
Rozpoczniemy protokół od kroku 1.4, wybierając pozostałości w obrębie pięciu angstremów, aby zdefiniować miejsce aktywne. Aby wybrać ligandy, naciśnij Control, Shift i kliknij dowolny atom lub wiązanie w każdym z trzech ligandów. Naciskaj strzałki w górę, aż wszystkie trzy ligandy zostaną podświetlone zieloną poświatą.
Zdefiniuj wybór do wykorzystania w przyszłości, klikając w menu rozwijanym, wybierz definiuj selektor, wpisz ligandy jako nazwę wyboru i kliknij OK. Ponownie, korzystając z menu wyboru, wybierz strefę. Przełącz to na pozostałości i upewnij się, że górne pole jest zaznaczone.
Kliknij w porządku. Zauważ, że części kreskówki w promieniu pięciu angstremów od tych ligandów są podświetlone. Aby wyświetlić łańcuchy boczne jako pałeczki i pokazać cząsteczki wody w miejscu aktywnym, użyj menu wiązań atomowych akcji, aby je pokazać.
Lub włącz je za pomocą tych przycisków tutaj. Aby usunąć zaznaczenie, kliknij w dowolnym miejscu pustego miejsca. Końcowym wynikiem tego protokołu powinien być model z miejscem aktywnym białka i ligandami pokazanymi jako pałeczki w kontrastowy sposób.
Kluczowe oddziaływania wiązania biegunowego są pokazane liniami przerywanymi, a niektóre pozostałości tworzące kontakty są oznaczone. Interfejs iCn3D zawiera menu rozwijane, przeglądarkę struktury i dziennik poleceń. W tym widoku są wyświetlane menu podręczne wybierania zestawów i sekwencji oraz adnotacji, które pojawiają się, gdy użytkownik wykonuje polecenia, które ich wymagają.
Rozpoczniemy protokół od kroku 2.4, wybierając reszty w obrębie pięciu angstremów, aby zdefiniować miejsce aktywne. Aby wybrać ligandy, użyj menu rozwijanego wyboru i kliknij wybierz w 3D, upewnij się, że pozostałość jest zaznaczona. Przytrzymując przycisk alt na komputerze PC lub przycisk opcji na komputerze Mac, kliknij pierwszy ligand.
Następnie naciśnij Control i kliknij na pozostałe dwa ligany, aby dodać je do zaznaczenia. Zapisz wybór za pomocą menu rozwijanego, kliknij wybierz, zapisz wybór, wprowadź nazwę i kliknij Zapisz. Pojawi się teraz wyskakujące menu wyboru zestawów z wybranymi trzema ligandami.
Teraz wybierz reszty w promieniu pięciu angstremów od ligandów. Skorzystaj z menu rozwijanego, wybierz według odległości. W wyświetlonym menu podręcznym zmień drugi element włóczni o promieniu na pięć angstremów, wpisując w bloku, kliknij display.
A następnie zamknij okno, klikając X w prawym górnym rogu. Zapisz aktywną witrynę z pięcioma angstromami, klikając menu rozwijane, wybierz Zapisz wybór i użyj klawiatury, aby wprowadzić nazwę. Następnie kliknij Zapisz.
Teraz utwórz nowe zaznaczenie, które łączy te dwa zestawy. Można je łączyć w menu kontekstowym wyboru zestawów. Na komputerze PC kliknij dwa zestawy z wciśniętym Control lub kliknij polecenie na komputerze Mac.
Ponownie kliknij menu rozwijane, wybierz opcję Zapisz wybór i wpisz nową nazwę, a następnie kliknij przycisk Zapisz. Aby pokazać interakcje, takie jak wiązania wodorowe, użyj menu analizy i wybierz interakcje. Interesować nas będą tu tylko wiązania wodorowe i mostki solne.
Więc odznaczymy resztę z nich. Wybierzemy trzy ligandy. A dla drugiego zestawu, pozostałości w obrębie pięciu angstremów.
Kliknij opcję Interakcje wyświetlania 3D i zamknij okno. Pokazuje to niektóre pozostałości, które oddziałują ze sobą, ale nie pokazuje całego miejsca aktywnego pięciu angstremów. Aby to wyświetlić, ponownie użyj menu wyboru zestawów.
Kliknij pięć pełnych angstremów, a następnie w menu rozwijanym kliknij styl boczne łańcuchy, drążki. Aby zastosować kolorowanie CPK, kliknij menu rozwijane koloru i kliknij atom. Końcowym wynikiem protokołu powinien być model, który wygląda tak, z miejscem aktywnym białka i ligandem pokazanym jako pałeczki pokolorowane w kontrastowy sposób.
Ważne interakcje wiążące są pokazane liniami przerywanymi, a wszystkie pozostałości w jednym z wyborów, który został utworzony podczas protokołu, są oznaczone. Interfejs Jmol zawiera menu rozwijane, pasek narzędzi, przeglądarkę struktury, menu kontekstowe oraz konsolę Jmol zawierającą wiersz poleceń. Protokół Jmol rozpoczynamy od kroku 3.4, wybierając reszty w obrębie pięciu angstremów, aby zdefiniować miejsce aktywne.
Konsola Jmol to najlepszy sposób na wybór pozostałości w promieniu pięciu angstremów. Wpisz to polecenie, aby wybrać reszty w promieniu pięciu angstremów od trzech ligandów. Wybierane są 193 atomy, ale nie reprezentują one pełnych reszt aminokwasowych.
Aby je wybrać, użyj wpisanego polecenia, wybierz w ciągu (grupa, wybrane) i naciśnij enter. Zwróć uwagę, że pojawiają się dodatkowe otoczki zaznaczenia. Aby pokazać te pozostałości jako patyki, kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wyświetlić menu podręczne, najedź kursorem na styl, schemat, a następnie kliknij patyczki.
Zauważ, że jest tu jeszcze kilka pustych aureoli. Są to cząsteczki wody w miejscu aktywnym. Aby wybrać tylko cząsteczki wody, możemy ponownie wykonać to polecenie, a następnie je zmodyfikować.
Kliknij w konsoli, a następnie użyj strzałek w górę, aby znaleźć to polecenie i kliknij Enter, aby je ponownie wykonać. Aby wyświetlić cząsteczki wody jako atomy, chcemy usunąć wybór liganda i białka. W tym celu wpiszemy dwa polecenia.
Nasze ligany są uważane za grupy hetero, ale woda jest również uważana za jedną z nich. Tak więc w tym poleceniu musimy zdefiniować, że nie usuwamy wody. Naciśnij enter, a teraz wybrane są tylko cząsteczki wody.
Kliknij rozwijane menu wyświetlania, najedź kursorem na atom i kliknij 20%promienia van der Waalsa. Zielony jon magnezu jest nadal pokazany w postaci patyczków. Częściej jony są przedstawiane jako kule.
Kliknij w konsoli Jmol, a następnie wpisz wybierz MG, a następnie wypełnij spację 50%Ligandy wewnątrz łańcuchów są pokolorowane identycznie. Aby odróżnić je od siebie, warto ponownie pokolorować ligandy. W konsoli wykonam polecenie wielowierszowe, które skopiowałem i wkleiłem ze ściągawki, którą rozwijam w dodatkowym filmie Jmol.
Wynikiem tego protokołu powinien być model, który wygląda tak, z miejscem aktywnym białka pokazanym jako pałeczki. A ligandy pokazały nam patyczki w łagodniejszej kolorystyce. Żółte linie wskazują interakcje wiążące, a poszczególne pozostałości są oznaczone zgodnie z potrzebami.
Interfejs PyMOL zawiera menu rozwijane, przeglądarkę struktury, panel nazw obiektów i menu sterowania myszą. Główny wiersz poleceń jest również oznaczony na tym rysunku. Rozpoczynamy protokół pierwotny w kroku 4.4, wybierając reszty w obrębie pięciu angstremów, aby zdefiniować miejsce aktywne.
Aby wybrać ligandy, kliknij na każdy z nich. Pojawi się nowy wybór, którego nazwę można zmienić, klikając przycisk A. Za pomocą klawiatury usuń litery sele i wpisz w ich miejsce ligans.
Naciśnij Enter. Możemy użyć tego zaznaczenia, aby zdefiniować obszar wokół niego. Zacznij od kliknięcia przycisku A i wybierz duplikat pozycji menu.
W tym nowym zaznaczeniu, sel01, kliknij A i wybierz pozycję menu zmiany nazwy. Za pomocą klawiatury usuń istniejące litery i wpisz active. To wciąż wybieranie naszych trzech ligandów, więc będziemy musieli je ponownie zmodyfikować, używając przycisku akcji A.
Kliknij przycisk, wybierz modyfikuj i rozwiń zaznaczenie o pięć kątów. Teraz udało nam się uchwycić ligandy i reszty w promieniu pięciu angstremów. Litera S na przycisku S oznacza pokaz.
Kliknij na to, aby wyświetlić białko na różne sposoby. Pokażemy tę lukrecję w postaci patyczków. Kliknij puste miejsce, aby wyczyścić zaznaczenie.
W ten sposób udało się uchwycić aminokwasy w promieniu pięciu angstremów, ale nie wodę. Możemy ponownie zduplikować zaznaczenie, a teraz zmodyfikować je tak, aby wybrało tylko wodę. W akcjach Przycisk A zduplikuj.
Pojawi się wybór 2. Zmieńmy to na aktywną wodę. Tym razem użyjemy przycisku A do modyfikacji, dookoła, aby wybrać atomy wokół naszego wyboru.
Atomy w obrębie czterech angstremów. W ten sposób wyselekcjonowano wodę, ale także niektóre atomy łańcuchów bocznych. Aby to jeszcze bardziej zmodyfikować, użyj przycisku A, aby zmodyfikować i ograniczyć do rozpuszczalnika.
Teraz widzimy, że tylko cząsteczki wody są oświetlone. Ponownie w przycisku A możemy zastosować ustawienie wstępne. Wybierz ustawienie wstępne, piłkę i kij, a teraz cząsteczki wody są wyświetlane jako kule.
Efektem końcowym protokołu jest model, który wygląda tak, z miejscem aktywnym w ligandach pokazanym jako pałeczki pokolorowane w kontrastowy sposób. Żółte linie przerywane pokazują interakcje wiązania biegunowego, a poszczególne pozostałości są oznaczane za pomocą wyborów utworzonych w panelu nazw obiektów. Błędy w wykonaniu protokołu mogą prowadzić do nieoptymalnych wyników.
Na przykład całe białko jest wyświetlane w postaci patyczków. Aby rozwiązać problem, użytkownik będzie musiał najpierw ukryć reprezentację drążka dla całej konstrukcji. A następnie ponownie wyświetl reprezentację drążka tylko dla obiektu o nazwie aktywny za pomocą przycisku S.
Tutaj modele wygenerowane za pomocą każdego programu są pokazane obok siebie. Chociaż istnieją różnice w wyświetlaniu enzymu, te same kluczowe cechy i interakcje można zaobserwować w każdym z czterech modeli. Użytkownik zainteresowany opanowaniem jednego z programów zawierających wiersz poleceń chce nauczyć się stosować i modyfikować wpisane polecenia.
Jak wspomniałem w protokole Jmol, przydatnym narzędziem jest ściągawka z poleceniami. Zwykły plik tekstowy zawierający często używane kody, do których można się odwoływać. Aby stać się zaawansowanym użytkownikiem, warto zrozumieć, które części protokołu można dostosowywać i modyfikować.
Przy odrobinie wprawy protokoły te można zastosować do modelowania dowolnego miejsca aktywnego enzymu, które jest przedmiotem zainteresowania.
Przegląd
Niniejszy artykuł demonstruje umiejętność modelowania biomolekularnego poprzez wizualizację centrum aktywnego enzymu glukokinazy z wykorzystaniem czterech bezpłatnych programów: iCn3D, Jmol, PyMOL oraz UCSF ChimeraX. Poradnik zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące modelowania i adnotowania centrum aktywnego z przyłączonymi ligandami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Modelowanie biomolekularne
- Wizualizacja białek
- Analiza centrum aktywnego enzymu
Wstęp
- Zrozumienie struktur białek jest kluczowe w naukach biologicznych.
- Centra aktywne są niezbędne dla funkcjonowania enzymów i ich oddziaływań z substratami.
- Do wizualizacji makrocząsteczek dostępnych jest wiele narzędzi programistycznych.
- Niniejsze badanie koncentruje się na glukokinazie, enzymie biorącym udział w metabolizmie glukozy.
Cel badania
- Przeszkolenie badaczy w zakresie efektywnego modelowania centrów aktywnych enzymów.
- Porównanie różnych narzędzi do wizualizacji molekularnej.
- Przedstawienie kompleksowego przewodnika po wyborze i wyświetlaniu ligandów oraz reszt aminokwasowych.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie programów iCn3D, Jmol, PyMOL oraz UCSF ChimeraX do modelowania.
- Krok po kroku: protokół wyboru reszt znajdujących się w odległości pięciu angstremów od ligandów.
- Wizualizacja aminokwasów i cząsteczek wody w bezpośrednim sąsiedztwie ligandów.
- Adnotacja kluczowych oddziaływań i cech strukturalnych.
Główne wyniki
- Skuteczne modelowanie centrum aktywnego glukokinazy z przyłączonymi ligandami.
- Przejrzysta wizualizacja oddziaływań między enzymem a substratami.
- Prezentacja możliwości każdego z narzędzi programowych.
- Utworzenie szczegółowego filmu instruktażowego dla każdego programu.
Wnioski
- Badanie dostarcza cennych informacji na temat technik modelowania biomolekularnego.
- Podkreśla ono znaczenie narzędzi programistycznych w biologii strukturalnej.
- Badacze mogą skutecznie wizualizować i analizować centra aktywne enzymów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wizualizacja biomolekularna umożliwia walidację celu poprzez ujawnienie determinant strukturalnych wiązania ligandu oraz funkcji enzymu. Modelowanie centrów aktywnych wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków poprzez wyjaśnienie zależności struktura-funkcja. Umiejętność ta zwiększa pewność predykcyjną w procesach identyfikacji związków wiodących oraz w przepływach pracy nad opracowywaniem testów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrycia i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację oddziaływań wiązania ligandów w centrum aktywnym glukokinazy.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez identyfikację kluczowych reszt aminokwasowych i cząsteczek wody zaangażowanych w rozpoznawanie substratu.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfolio, dostarczając informacji strukturalnych, które pozwalają ocenić pewność wyboru celu oraz jego podatność na modyfikację farmakologiczną.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych modeli biologicznych do dalszego screeningu poprzez zdefiniowanie reszt centrum aktywnego w odległości pięciu angstremów od związanych ligandów.
- Wartość operacyjna: Wspieranie standaryzacji i powtarzalności testów dzięki spójnej wizualizacji oddziaływań wiążących w programach iCn3D, Jmol, PyMOL i UCSF ChimeraX.
- Skalowalność: Umożliwienie ponownego wykorzystania platformy w kampaniach screeningowych poprzez dostarczenie przenośnych protokołów modelowania dowolnego centrum aktywnego enzymu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy wglądy strukturalne z etapu odkrywania z walidacją przedkliniczną poprzez zachowanie spójności w modelowaniu miejsca aktywnego w obrębie wszystkich przepływów pracy.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Wskazuje polarne oddziaływania wiążące oraz etykietowanie reszt aminokwasowych w celu wsparcia projektowania opartego na strukturze i optymalizacji wiodących związków.
- Znaczenie dla chorób: Modeluje ludzką glukokinazę, kluczowy enzym w metabolizmie glukozy, istotny dla programów celowanych w cukrzycę i zaburzenia metaboliczne.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, umożliwiając analizę strukturalną kompleksów enzym-ligand.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez wizualizację sposobu wiązania ligandów w centrum aktywnym glukokinazy.
- Screening: Zapewnia gotowość testu poprzez standaryzowany wybór i prezentację reszt oraz cząsteczek wody znajdujących się w bliskim sąsiedztwie ligandów.
- Analityka: Generuje ilościowe wyniki strukturalne, takie jak wizualizacja wiązań wodorowych i znakowanie reszt, co ułatwia porównywanie trybów wiązania ligandów.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez dostarczenie wielokrotnego wykorzystania ram modelowania centrów aktywnych enzymów w układach istotnych dla danej choroby.
- Wykorzystanie korporacyjne: Ustanawia skalowalną możliwość modelowania dowolnego centrum aktywnego enzymu, co redukuje nadmiarowe szkolenia i zwiększa spójność między zespołami.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w oddziaływaniach enzym-ligand.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i spójność międzyplatformowa w wizualizacji biomolekularnej.
- Wartość strategiczna: Ulepszone decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa we wczesnej fazie odkrywania oraz zredukowane ryzyko biologiczne w optymalizacji wiodących związków.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja celów skorygowana o ryzyko w oparciu o pewność strukturalną i dostępność miejsca wiązania.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga podstawowej wiedzy z zakresu biologii strukturalnej oraz oddziaływań białko-ligand.
- Wymaga dostępu do infrastruktury obliczeniowej umożliwiającej uruchomienie programów iCn3D, Jmol, PyMOL lub UCSF ChimeraX.
- Wymaga standaryzacji protokołów wizualizacji pomiędzy zespołami w celu zapewnienia spójnej interpretacji modeli centrów aktywnych.
- Wymaga uwzględnienia modyfikacji przy stosowaniu protokołu w odniesieniu do różnych układów enzymatycznych lub typów ligandów.
- Ograniczone biegłością użytkownika w obsłudze interfejsów wiersza poleceń oraz narzędzi selekcji w czterech wspomnianych platformach programistycznych.
