Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

Ogólnym celem tego protokołu jest ilościowe określenie poziomów białka in situ w mysich zarodkach preimplantacyjnych. Tak więc ta metoda pozwala nam na przeprowadzenie wysokoprzepustowej analizy obrazów mikroskopii konfokalnej z rozdzielczością jednokomórkową w sposób półautomatyczny. Metoda ta może być stosowana do ilościowego określania stężeń białek na obrazach konfokalnych, w których występuje duża gęstość jądrowa i gdy chce się badać niejednorodności w populacjach komórek.

Na początek użyj otwartego ognia na szklanej pipecie Pasteura, aby narysować kapilarny koniec na końcówce. Delikatnie pocieraj drugi koniec pipety o kapilarę, aby ją rozbić, tworząc koniec. Po złożeniu w ofierze ciężarnej samicy myszy w pożądanym dniu rozwoju embrionalnego, należy odsłonić wnętrzności brzuszne zgodnie z protokołem tekstowym i zlokalizować macicę.

Przytrzymaj koniec szyjki macicy, przetnij szyjkę macicy i delikatnie pociągnij do góry, aby rozciągnąć oba rogi macicy. Odetnij z niego tłuszcz, uważając, aby nie przebić ściany macicy. Wytnij nad jajowodami, poniżej jajników, aby uwolnić całą macicę i umieść na szalce Petriego.

Następnie przykryj macicę PBS i oddziel oba rogi macicy, przecinając bliższy koniec po obu stronach szyjki macicy. Następnie oddziel każdy jajowód od macicy, przecinając go poniżej łączącego je przesmyku. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj strzykawki o pojemności jednego ml z igłą podskórną, aby wypłukać blastocysty z macicy do pożywki manipulacyjnej, przetłaczając 0,5-1 ml pożywki przez każdy róg z otworu szyjki macicy.

Odczekaj do jednej do dwóch minut, aż blastocysty opadną na dno naczynia po spłukaniu. Następnie zlokalizuj blastocysty i za pomocą sterowanej ustami szklanej pipety Pasteura z końcówką kapilarną zbierz blastocysty i przenieś do świeżej kropli pożywki. Po wypłukaniu blastocyst usuń osłonkę przejrzystą, używając roztworu Acidic Tyrode's Solution, aby na krótko umyć zarodki.

Gdy tylko strefa przestanie być widoczna, przenieś blastocysty z powrotem do pożywki manipulacyjnej. Umyj blastocysty w PBS o temperaturze pokojowej i utrwal je, przenosząc do 4% PFA w PBS na 10 minut w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu przenieś blastocysty z powrotem do PBS w celu przechowywania w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po przeprowadzeniu imunofluorescencji zgodnie z protokołem tekstowym, za pomocą cienkiej pipety do ust przygotuj mikrokrople PBS lub roztworu barwie jądrowej na szklanej powierzchni naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm i przykryj je olejem mineralnym. Umieść zarodki w mikrokroplach i ułóż w spójny sposób, najlepiej z dostępem do jamy ICM równolegle do powierzchni szkła, a następnie ustaw szalkę na uchwycie mikroskopu. Aby przeprowadzić obrazowanie konfokalne, użyj najniższej mocy lasera, która zapewnia silny stosunek sygnału do szumu bez wybielania fluoroforów.

Dostosuj wzmocnienie i ustawienie offsetu, aby uzyskać najszerszy zakres dynamiki bez prześwietlania próbki. Uchwycenie większości lub całego zakresu skali szarości ułatwi wykrycie niewielkich różnic w intensywności między obrazami. Postępuj zgodnie z dodatkowymi szczegółami opisanymi w protokole tekstowym, aby zobrazować zarodki na całej osi Z.

Postępuj zgodnie z graficznym interfejsem użytkownika narzędzia do segmentacji opartego na MATLAB Modular Interactive Nuclear Segmentation (MINS), aby załadować obraz konfokalny lub cały stos Z surowych danych generowanych przez mikroskop. Aby wyświetlić wynik każdego kroku, kliknij odpowiedni przycisk Widok". Żółty znacznik nad przyciskiem wskazuje operację w toku.

Zielony znacznik oznacza, że operacja została zakończona. Oceń wynik etapu wykrywania przed przystąpieniem do segmentacji. Jeśli nie jest zadowalający, zmodyfikuj parametry wykrywania i uruchom go ponownie.

W trybie wsadowym"uruchom menu, kliknij Dodaj pliki"i załaduj wszystkie pliki do przetworzenia jednocześnie. Kliknij Uruchom tryb wsadowy" i poczekaj, aż oprogramowanie przetworzy pliki. Dane wyjściowe segmentacji zostaną zapisane w tym samym katalogu, co oryginalne pliki.

Zidentyfikuj wyniki fałszywie dodatnie, takie jak pęcherzyki apoptotyczne lub inne elementy, które nie są nienaruszonymi jądrami, ale które mogły zostać zidentyfikowane jako takie przez MINS. Usuń odpowiednie rekordy dla wyników fałszywie dodatnich z gwiazdy. Plik csv.

Zachowaj oryginalny plik starstatistics. csv do wykorzystania w przyszłości i edytuj tylko jego kopię. Jeśli jądro zostało nadmiernie podzielone na segmenty i przedstawione jako dwa lub więcej jąder, albo połącz zapisy, uśredniając ich poziom intensywności, albo zachowaj jeden z zapisów dla tej komórki i odrzuć resztę.

Aby rozwiązać problem segmentacji, należy zidentyfikować zdarzenia, w których MINS nie wykrył granicy między dwoma lub więcej jądrami i podzielił je na segmenty jako pojedyncze, lub w których nie udało się wykryć jądra w ogóle. Użyj narzędzia ImageJ, aby zmierzyć średni poziom szarości dla każdego kanału w komórkach poniżej lub niepodzielonych na segmenty. Następnie znajdź przyśrodkowy odcinek jądra pod lub niesegmentowanego na kanale DNA, za pomocą narzędzia do wyboru odręcznego nakreśl obwód jądra podzielonego lub niesegmentowanego.

Następnie naciśnij Control M"lub przejdź do Analizuj"menu i wybierz Zmierz"To zarejestruje średnią wartość szarości dla zarysowanego obszaru i wyświetli ją w nowym oknie. Używając tego samego zarysowanego obszaru, który właśnie został wybrany w kanale DNA, powtórz pomiar każdego z interesujących kanałów fluorescencyjnych. Wyniki zostaną przywrócone do poprzedniego w oknie wyników pomiarów.

Następnie użyj uzyskanych pomiarów, aby zastąpić błędne rekordy w pliku starstatistics. csv. Jeśli jądro zostało podsegmentowane, zduplikuj jego wiersz, przypisz różne identyfikatory komórek do każdej nowej komórki i wprowadź wartości uzyskane w ImageJ pod odpowiednią kolumną.

W takim przypadku obie komórki będą miały wspólne współrzędne przestrzenne. Jeżeli jądra mitotyczne mają być rozpatrywane oddzielnie w analizie, należy je ręcznie ocenić i dodać informacje do pliku danych. Zapoznaj się z protokołem tekstowym, aby uzyskać dodatkowe instrukcje dotyczące przetwarzania obrazu.

Rysunek ten przedstawia przykłady nienaruszonych blastocyst w różnych stadiach z rozszerzoną jamą. Pokazano tutaj przykłady dobrych przeciwciał dla wielu białek jądrowych, w tym CDX2, GATA4, GATA6, NANOG i OCT4. Próbka ta została znakowana cytoplazmatycznym białkiem DAB2, które daje wysoki stosunek sygnału do szumu.

W tym panelu pokazano przykłady złego barwienia dla GATA4 z niskim stosunkiem sygnału do szumu, gdzie próbki były utrwalane tylko przez 10 minut. To konkretne przeciwciało anty-GATA4 wymaga utrwalenia przez noc, aby zapewnić silny sygnał. Zarodki te zostały zobrazowane za pomocą 40-krotnego obiektywu immersyjnego z olejkiem o NA 1,30 i odległości roboczej 0,21 mm Środkowe panele pokazują powiększenia ICM lub poszczególnych jąder i można rozróżnić granicę między nimi.

Dolne panele ilustrują, że im bardziej zaawansowany zarodek, tym większa gęstość jądrowa, a co za tym idzie, większa szansa na błędy segmentacji. Obrazy te pokazują błędy, które może popełnić MINS, takie jak wykrywanie jąder apoptotycznych jako żywych komórek, nadmierna segmentacja lub niedostateczna segmentacja. Ta sekwencja wycinków Z ujawnia zdarzenie niedostatecznej segmentacji, w którym dwie komórki zostały zidentyfikowane jako jedna.

Po opanowaniu protokół ten można przeprowadzić w ciągu trzech do czterech dni od początku do końca, przy obciążeniu czasowym od dwóch do czterech godzin dziennie. Wykonując ten zabieg należy pamiętać o zachowaniu pełnej spójności z warunkami eksperymentu, czyli protokołami immunofluorescencyjnymi i parametrami obrazowania. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią rozwoju myszy do przeprowadzania analizy ilościowej in situ ekspresji genów i białek w pojedynczych komórkach.

Po obejrzeniu tego filmu będziesz dobrze rozumiał, w jaki sposób pozyskiwać dane obrazu, które są odpowiednie do ilościowej analizy ekspresji in situ.