Name: Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy ekspresji białek w zarodkach myszy przed implantacją z rozdzielczością pojedynczych komórek. Technika ta umożliwia badanie specyfikacji linii komórkowych w rozwoju embrionalnym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan i Panagiotis Xenopoulos, za wkład w przetwarzanie, analizę i reprezentację danych, Berenice Plusa za pomoc w projektowaniu protokołu immunofluorescencji i testowania przeciwciał oraz członkom laboratorium Hadjantonakis za komentarze na temat manuskryptu i rozwoju tego protokołu. Prace w naszym laboratorium są wspierane przez National Institutes of Health R01-HD052115 i R01-DK084391 oraz przez NYSTEM N13G-236.

<ol><li>Saiz, N., Plusa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cell+fate+decisions+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Early cell fate decisions in the mouse embryo.</a> Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).</li>
<li>Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+a+blastocyst%3A+cell+behaviors+driving+cell+fate+choice+and+morphogenesis+in+the+early+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and morphogenesis in the early mouse embryo.</a> Genesis. 51 (4), 219-233 (2013).</li>
<li>Saiz, N., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cells+get+together%3A+High-resolution+approaches+to+study+the+dynamics+of+early+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Single cells get together: High-resolution approaches to study the dynamics of early mouse development.</a> Seminars in cell & developmental biology. , (2015).</li>
<li>Lou, X., Kang, M., Xenopoulos, P., Muñoz-Descalzo, S., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+and+Efficient+2D%2F3D+Nuclear+Segmentation+Method+for+Analysis+of+Early+Mouse+Embryo+and+Stem+Cell+Image+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Rapid and Efficient 2D/3D Nuclear Segmentation Method for Analysis of Early Mouse Embryo and Stem Cell Image Data.</a> Stem Cell Reports. 2 (3), 382-397 (2014).</li>
<li>Le Bin, G. C., Muñoz-Descalzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oct4+is+required+for+lineage+priming+in+the+developing+inner+cell+mass+of+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Oct4 is required for lineage priming in the developing inner cell mass of the mouse blastocyst.</a> Development. 141 (5), 1001-1010 (2014).</li>
<li>Schrode, N., Saiz, N., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA6+Levels+Modulate+Primitive+Endoderm+Cell+Fate+Choice+and+Timing+in+the+Mouse+Blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">GATA6 Levels Modulate Primitive Endoderm Cell Fate Choice and Timing in the Mouse Blastocyst.</a> Developmental Cell. 29 (4), 454-467 (2014).</li>
<li>Xenopoulos, P., Kang, M., Puliafito, A., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneities+in+Nanog+Expression+Drive+Stable+Commitment+to+Pluripotency+in+the+Mouse+Blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Heterogeneities in Nanog Expression Drive Stable Commitment to Pluripotency in the Mouse Blastocyst.</a> Cell Reports. 10 (9), 1508-1520 (2015).</li>
<li>Saiz, N., Kang, M., et al. Quantitative analyses for elucidating mechanisms of cell fate commitment in the mouse blastocyst. Proceedings of SPIE. Optical Methods in Developmental Biology III, 9334, (2015).</li>
<li>Fleming, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+cell+allocation+to+trophectoderm+and+inner+cell+mass+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of cell allocation to trophectoderm and inner cell mass in the mouse blastocyst.</a> Developmental biology. 119 (2), 520-531 (1987).</li>
<li>Dietrich, J. -E., Hiiragi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+patterning+in+the+mouse+pre-implantation+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stochastic patterning in the mouse pre-implantation embryo.</a> Development. 134 (23), 4219-4231 (2007).</li>
<li>Plusa, B., Piliszek, A., Frankenberg, S., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+sequential+cell+behaviours+direct+primitive+endoderm+formation+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct sequential cell behaviours direct primitive endoderm formation in the mouse blastocyst.</a> Development. 135 (18), 3081-3091 (2008).</li>
<li>Gerbe, F., Cox, B., Rossant, J., Chazaud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+Lrp2+pathway+members+reveals+progressive+epithelial+differentiation+of+primitive+endoderm+in+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of Lrp2 pathway members reveals progressive epithelial differentiation of primitive endoderm in mouse blastocyst.</a> Developmental biology. 313 (2), 594-602 (2008).</li>
<li>Nichols, J., Silva, J., Roode, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Erk+signalling+promotes+ground+state+pluripotency+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo.</a> Development. 136 (19), 3215-3222 (2009).</li>
<li>Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signal-dependent+segregation+of+primitive+endoderm+and+epiblast+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst.</a> Development. 137 (5), 715-724 (2010).</li>
<li>Morris, S. A., Teo, R. T. Y., Li, H., Robson, P., Glover, D. M., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+formation+of+the+first+two+distinct+cell+types+of+the+inner+cell+mass+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Origin and formation of the first two distinct cell types of the inner cell mass in the mouse embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6364-6369 (2010).</li>
<li>Artus, J., Panthier, J. -J., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+PDGF+signaling+in+expansion+of+the+extra-embryonic+endoderm+lineage+of+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for PDGF signaling in expansion of the extra-embryonic endoderm lineage of the mouse blastocyst.</a> Development. 137 (20), 3361-3372 (2010).</li>
<li>Artus, J., Piliszek, A., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primitive+endoderm+lineage+of+the+mouse+blastocyst%3A+Sequential+transcription+factor+activation+and+regulation+of+differentiation+by+Sox17%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">The primitive endoderm lineage of the mouse blastocyst: Sequential transcription factor activation and regulation of differentiation by Sox17.</a> Developmental biology. 350 (2), 393-404 (2011).</li>
<li>Kang, M., Piliszek, A., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF4+is+required+for+lineage+restriction+and+salt-and-pepper+distribution+of+primitive+endoderm+factors+but+not+their+initial+expression+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse.</a> Development. 140 (2), 267-279 (2013).</li>
<li>Bessonnard, S., De Mot, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata6%2C+Nanog+and+Erk+signaling+control+cell+fate+in+the+inner+cell+mass+through+a+tristable+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gata6, Nanog and Erk signaling control cell fate in the inner cell mass through a tristable regulatory network.</a> Development. 141 (19), 3637-3648 (2014).</li>
<li>Behringer, R. R., Gertsenstein, M., Vintersten Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+RR+%22Manipulating+the+mouse+embryo%3A+a+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).</li>
<li>Czechanski, A., Byers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).</li>
<li>Frankenberg, S., Shaw, G., Freyer, C., Pask, A. J., Renfree, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cell+lineage+specification+in+a+marsupial%3A+a+case+for+diverse+mechanisms+among+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Early cell lineage specification in a marsupial: a case for diverse mechanisms among mammals.</a> Development. 140, 965-975 (2013).</li>
<li>Artus, J., Vandormael-Pournin, S., Frödin, M., Nacerddine, K., Babinet, C., Cohen-Tannoudji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+mitotic+progression+and+preimplantation+lethality+in+mice+lacking+OMCG1%2C+a+new+evolutionarily+conserved+nuclear+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Impaired mitotic progression and preimplantation lethality in mice lacking OMCG1, a new evolutionarily conserved nuclear protein.</a> Molecular and cellular biology. 25 (14), 6289-6302 (2005).</li>
<li>Saiz, N., Grabarek, J. B., Sabherwal, N., Papalopulu, N., Plusa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+protein+kinase+C+couples+cell+sorting+with+primitive+endoderm+maturation+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Atypical protein kinase C couples cell sorting with primitive endoderm maturation in the mouse blastocyst.</a> Development. 140 (21), 4311-4322 (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Niniejszy protokół opisuje metodę przeprowadzania analizy ilościowej immunofluorescencji w całości na zarodkach myszy w stadium preimplantacyjnym. Po solidnym protokole immunofluorescencji 22 następuje obrazowanie konfokalne o wysokiej rozdzielczości i całej rozdzielczości oraz segmentacja obrazu za pomocą dostosowanego do potrzeb oprogramowania 4. Chociaż wybór protokołu immunofluorescencji nie jest krytyczny, uważamy, że ten przedstawiony tutaj 22 jest szybki, niezawodny i zapewnia soli...

Embrion myszy przed implantacją jest paradygmatem do badania powstawania i utrzymywania pluripotencji in vivo, a także modelem do badania specyfikacji losu komórki i nabłonkowania de novo u ssaków. Etapy preimplantacyjne rozwoju ssaków poświęcone są ustaleniu trzech linii komórkowych tworzących blastocystę, a mianowicie pluripotencjalnego epiblastu - który daje początek większości tkanek somatycznych i komórek rozrodczych - oraz dwóch linii pozaembrionalnych, trofektodermy (TE) i pierwotnej endodermy (PrE) (ryc. 1A) 1,2. Protokół ten opisuje procedury (1) pobierania i utrwalania zarodków myszy w fazie preimplantacji, (2) przeprowadzania immunofluorescencji w celu znakowania białek będących przedmiotem zainteresowania, (3) przeprowadzania obrazowania całościowego przy użyciu mikroskopu konfokalnego z możliwością przekroju z oraz (4) wykonywania segmentacji jądrowej obrazów konfokalnych i późniejszych ilościowych analiz obrazu. Potok ten umożliwia bezstronny pomiar poziomów białek w celu przypisania tożsamości komórek w celu scharakteryzowania subpopulacji komórek in situ. Protokół ten można przeprowadzić w ciągu zaledwie 3-4 dni dla pojedynczego miotu (zwykle do 10 zarodków myszy), od pobrania zarodka do analizy danych (ryc. 1B). Jednoczesna analiza kilku miotów zwiększyłaby obciążenie czasowe związane z obrazowaniem i analizą danych, wydłużając w ten sposób ogólną długość protokołu.
Embrion myszy w stadium preimplantacyjnym jest eksperymentalnie łatwym do opanowania systemem, który, biorąc pod uwagę jego mały rozmiar i stereotypową morfologię 3, dobrze nadaje się do obrazowania procesów komórkowych w całości z rozdzielczością pojedynczej komórki. Aby przeprowadzić bezstronną, systemową analizę statystycznie istotnej liczby zarodków, pożądany jest zautomatyzowany proces analizy ilościowej. Jednak ze względu na wysoką gęstość jądrową wewnętrznej masy komórkowej (ICM) blastocysty (Figura 1A, 2D), konwencjonalne platformy segmentacji obrazu nie zapewniają wystarczającej dokładności, aby ustanowić zautomatyzowany lub półautomatyczny przepływ pracy. Z drugiej strony, ręczna segmentacja, choć dokładna, nie pozwala na przetwarzanie dużych kohort komórek i zarodków, ani nie nadaje się do powtarzalnego, bezstronnego określania tożsamości komórek - co jest szczególnie ważne podczas badania etapów rozwojowych, w których wzorce ekspresji markerów nie zostały w pełni rozwiązane (np. nie wykazują binarnego rozkładu w populacji). Niedawno opracowaliśmy i przeprowadziliśmy walidację metody segmentacji obrazu dostosowanej do zarodków myszy w fazie preimplantacji oraz do embrionalnych komórek macierzystych myszy (ESC), która osiąga wysoką dokładność, wymagając przy tym minimalnego wkładu użytkownika 4-8.
Przedstawiony tutaj potok analizy obraca się wokół narzędzia do segmentacji obrazów opartego na MATLAB, Modular Interactive Nuclear Segmentation (MINS) 4. MINS przeprowadza nienadzorowaną segmentację jądrową na dużych partiach konfokalnych stosów Z po ustaleniu przez użytkownika minimalnej liczby właściwości obrazu, przy użyciu graficznego interfejsu użytkownika (GUI) (Tabela 1) 4. Linia ta okazała się skuteczna w generowaniu wysokoprzepustowych danych dotyczących ekspresji białek i lokalizacji komórek zarówno w zarodkach typu dzikiego, eksperymentalnie leczonych i modyfikowanych genetycznie oraz w EKM 5-7. W niniejszym protokole opisano zastosowanie MINS do segmentacji obrazów zarodków w fazie preimplantacyjnej. Przykłady działania MINS na ESC znajdują się w 4,7. Zautomatyzowany etap segmentacji jądrowej znacznie zmniejsza obciążenie czasowe procesu identyfikacji komórki, podczas gdy pomiary przestrzenne i intensywności fluorescencji pozwalają na bezstronne określenie tożsamości komórek i wygenerowanie trójwymiarowych map domen ekspresji genów i pozycji komórki w zarodku (ryc. 1C). Co więcej, skalowalność tego przepływu pracy sprawia, że ma on zastosowanie do analizy poszczególnych miotów przez duże kohorty zarodków poddanych obliczeniu eksperymentalnie lub zarodków o różnym pochodzeniu genetycznym 5,6. MINS jest dostępny bezpłatnie pod adresem http://katlab-tools.org (oprogramowanie wymaga licencji MATLAB).
Żadne podejście opracowane do tej pory nie pozwala na generowanie tak szczegółowych danych na temat ekspresji białek i lokalizacji komórek w mysich zarodkach preimplantacyjnych. Wszystkie dotychczasowe próby ilościowego określenia tego typu danych ograniczały się do ręcznego określania i ilościowego określania liczby komórek dla różnych populacji w zarodku (całkowicie ręcznie lub wspomaganie programowe) 9-19. Podejście to (z wykorzystaniem oprogramowania MINS) zostało dostosowane i przetestowane na mysich zarodkach przedimplantacyjnych i ESC; Niemniej jednak oczekuje się, że jego wydajność w innych systemach o dużej gęstości jądrowej, choć jeszcze nieprzetestowana, będzie równoważna.

<table><tbody><tr><td>Pobieranie zarodków</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sonda do sprawdzania zatyczek</td><td>Kleszcze Roboz</td><td>RS-9580</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Roboz</td><td>RS-4978</td> Szklane pipety Pasteura Roboz RS-5910 <td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Wstępnie zmontowana rurka aspiratora i <td></td></tr><tr><td> ustnik</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Dłuższa gumowa rurka</td><td>Fisher</td><td>14-178-2AA&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>M2</td><td>Millipore</td><td>MR-015-D FHM</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Millipore</td><td>MR-024-D</td><td></td></tr><tr><td>Kwaśny roztwór Tyrode'a</td><td>Milipora</td><td>MR-004-D</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 4-dołkowe</td><td>Nunc/Thermo-Fisher</td><td>12-566-300&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><silna>Immunofluorescencja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa U-dolna płytka</td><td>Fisher</td><td>14-245-73</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>Surowica konia</td><td>Sigma</td><td>H0146</td><td></td></tr><tr><td><silna>Przeciwciała pierwotne</silne></td><td></td><td></td><td><silny>Stężenie</silny></td></tr><tr><td>CDX2</td><td>Biogenex</td><td>AM392-5M</td><td>1:200</td></tr><tr><td>GATA6</td><td>R& D</td><td>AF1700</td><td>1:100</td></tr><tr><td>GATA4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9053</td><td>1:100, 10 min utrwalenie</td></tr><tr><td>GATA4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-1237</td><td>1:100, Utrwalenie O/N</td></tr><tr><td>SOX17</td><td>R& D</td><td>AF1924</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Nanog</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0002P-F</td><td>1:500</td></tr><tr><td>OCT4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1:100, 10 min do utrwalenia O/N</td></tr><tr><td>DAB2</td><td>BD</td><td>BD-610464</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Przeciwciała drugorzędowe</td><td>Life Technologies</td><td>Różne</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Obrazowanie</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm naczynia ze szklanym dnem</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Segmentacja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komputer z 64-bitowym systemem operacyjnym</td><td></td> Windows <td>nie dotyczy</td><td>Sprawdź minimalne wymagania systemowe na http://katlab-tools.org i w Lou et al., (2014) Stem Cell Reports</td></tr><tr><td>MATLAB (oprogramowanie)</td><td>Mathworks</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>MINS (oprogramowanie)</td><td>Darmowy</td><td>nie dotyczy</td><td>http://katlab-tools.org</td></tr></tbody></table>

analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowych, jednokomórkowych analiz in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobrania zarodków, immunofluorescencji, obrazowania pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji i analizy obrazu. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie ekspresji wielu markerów jądrowych i współrzędnych przestrzennych (XYZ) wszystkich komórek w zarodku. Wykorzystuje on MINS, oprogramowanie do segmentacji obrazów opracowane specjalnie do analizy obrazów konfokalnych zarodków preimplantacyjnych i kolonii embrionalnych komórek macierzystych (ESC). MINS przeprowadza nienadzorowaną segmentację jądrową w wymiarach X, Y i Z i generuje informacje o położeniu komórki w przestrzeni trójwymiarowej, a także o poziomach fluorescencji jądrowej dla wszystkich kanałów przy minimalnym udziale użytkownika. Chociaż protokół ten został zoptymalizowany pod kątem analizy obrazów zarodków myszy w stadium preimplantacji, można go łatwo dostosować do analizy dowolnych innych próbek wykazujących dobry stosunek sygnału do szumu i tam, gdzie wysoka gęstość jądrowa stanowi przeszkodę dla segmentacji obrazu (np. analiza ekspresji kolonii embrionalnych komórek macierzystych (ESC), różnicowanie komórek w hodowli, zarodki innych gatunków lub stadiów itd.).

Aby ułatwić interpretację i prezentację danych, należy zadbać o to, by nie uszkodzić embrionów podczas ich pobierania i manipulacji, tak aby możliwe było przeanalizowanie wszystkich komórek oraz ich wzajemnego położenia. Rycina 2A - D przedstawia przykłady nienaruszonych blastocyst na różnych etapach rozwoju z poszerzoną jamą. W przypadku wystąpienia uszkodzeń należy zachować szczególną ostrożność podczas analizy i interpretacji wyników.
<p class="jove_content" fo:kee...

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowej, jednokomórkowej analizy in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobierania blastocyst, wykrywania białek metodą immunofluorescencyjną w całości montowanej, obrazowania próbek pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji jądrowej i analizy obrazu.

Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Ogólnym celem tego protokołu jest ilościowe określenie poziomów białka in situ w mysich zarodkach preimplantacyjnych. Tak więc ta metoda pozwala nam na przeprowadzenie wysokoprzepustowej analizy obrazów mikroskopii konfokalnej z rozdzielczością jednokomórkową w sposób półautomatyczny. Metoda ta może być stosowana do ilościowego określania stężeń białek na obrazach konfokalnych, w których występuje duża gęstość jądrowa i gdy chce się badać niejednorodności w populacjach komórek.Na początek użyj otwartego ognia na szklanej pipecie Pasteura, aby narysować kapilarny koniec na końcówce. Delikatnie pocieraj drugi koniec pipety o kapilarę, aby ją rozbić, tworząc koniec. Po złożeniu w ofierze ciężarnej samicy myszy w pożądanym dniu rozwoju embrionalnego, należy odsłonić wnętrzności brzuszne zgodnie z protokołem tekstowym i zlokalizować macicę.Przytrzymaj koniec szyjki macicy, przetnij szyjkę macicy i delikatnie pociągnij do góry, aby rozciągnąć oba rogi macicy. Odetnij z niego tłuszcz, uważając, aby nie przebić ściany macicy. Wytnij nad jajowodami, poniżej jajników, aby uwolnić całą macicę i umieść na szalce Petriego.Następnie przykryj macicę PBS i oddziel oba rogi macicy, przecinając bliższy koniec po obu stronach szyjki macicy. Następnie oddziel każdy jajowód od macicy, przecinając go poniżej łączącego je przesmyku. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj strzykawki o pojemności jednego ml z igłą podskórną, aby wypłukać blastocysty z macicy do pożywki manipulacyjnej, przetłaczając 0,5-1 ml pożywki przez każdy róg z otworu szyjki macicy.Odczekaj do jednej do dwóch minut, aż blastocysty opadną na dno naczynia po spłukaniu. Następnie zlokalizuj blastocysty i za pomocą sterowanej ustami szklanej pipety Pasteura z końcówką kapilarną zbierz blastocysty i przenieś do świeżej kropli pożywki. Po wypłukaniu blastocyst usuń osłonkę przejrzystą, używając roztworu Acidic Tyrode's Solution, aby na krótko umyć zarodki.Gdy tylko strefa przestanie być widoczna, przenieś blastocysty z powrotem do pożywki manipulacyjnej. Umyj blastocysty w PBS o temperaturze pokojowej i utrwal je, przenosząc do 4% PFA w PBS na 10 minut w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu przenieś blastocysty z powrotem do PBS w celu przechowywania w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po przeprowadzeniu imunofluorescencji zgodnie z protokołem tekstowym, za pomocą cienkiej pipety do ust przygotuj mikrokrople PBS lub roztworu barwie jądrowej na szklanej powierzchni naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm i przykryj je olejem mineralnym. Umieść zarodki w mikrokroplach i ułóż w spójny sposób, najlepiej z dostępem do jamy ICM równolegle do powierzchni szkła, a następnie ustaw szalkę na uchwycie mikroskopu. Aby przeprowadzić obrazowanie konfokalne, użyj najniższej mocy lasera, która zapewnia silny stosunek sygnału do szumu bez wybielania fluoroforów.Dostosuj wzmocnienie i ustawienie offsetu, aby uzyskać najszerszy zakres dynamiki bez prześwietlania próbki. Uchwycenie większości lub całego zakresu skali szarości ułatwi wykrycie niewielkich różnic w intensywności między obrazami. Postępuj zgodnie z dodatkowymi szczegółami opisanymi w protokole tekstowym, aby zobrazować zarodki na całej osi Z.Postępuj zgodnie z graficznym interfejsem użytkownika narzędzia do segmentacji opartego na MATLAB Modular Interactive Nuclear Segmentation (MINS), aby załadować obraz konfokalny lub cały stos Z surowych danych generowanych przez mikroskop. Aby wyświetlić wynik każdego kroku, kliknij odpowiedni przycisk Widok". Żółty znacznik nad przyciskiem wskazuje operację w toku.Zielony znacznik oznacza, że operacja została zakończona. Oceń wynik etapu wykrywania przed przystąpieniem do segmentacji. Jeśli nie jest zadowalający, zmodyfikuj parametry wykrywania i uruchom go ponownie.W trybie wsadowym"uruchom menu, kliknij Dodaj pliki"i załaduj wszystkie pliki do przetworzenia jednocześnie. Kliknij Uruchom tryb wsadowy" i poczekaj, aż oprogramowanie przetworzy pliki. Dane wyjściowe segmentacji zostaną zapisane w tym samym katalogu, co oryginalne pliki.Zidentyfikuj wyniki fałszywie dodatnie, takie jak pęcherzyki apoptotyczne lub inne elementy, które nie są nienaruszonymi jądrami, ale które mogły zostać zidentyfikowane jako takie przez MINS. Usuń odpowiednie rekordy dla wyników fałszywie dodatnich z gwiazdy. Plik csv.Zachowaj oryginalny plik starstatistics. csv do wykorzystania w przyszłości i edytuj tylko jego kopię. Jeśli jądro zostało nadmiernie podzielone na segmenty i przedstawione jako dwa lub więcej jąder, albo połącz zapisy, uśredniając ich poziom intensywności, albo zachowaj jeden z zapisów dla tej komórki i odrzuć resztę.Aby rozwiązać problem segmentacji, należy zidentyfikować zdarzenia, w których MINS nie wykrył granicy między dwoma lub więcej jądrami i podzielił je na segmenty jako pojedyncze, lub w których nie udało się wykryć jądra w ogóle. Użyj narzędzia ImageJ, aby zmierzyć średni poziom szarości dla każdego kanału w komórkach poniżej lub niepodzielonych na segmenty. Następnie znajdź przyśrodkowy odcinek jądra pod lub niesegmentowanego na kanale DNA, za pomocą narzędzia do wyboru odręcznego nakreśl obwód jądra podzielonego lub niesegmentowanego.Następnie naciśnij Control M"lub przejdź do Analizuj"menu i wybierz Zmierz"To zarejestruje średnią wartość szarości dla zarysowanego obszaru i wyświetli ją w nowym oknie. Używając tego samego zarysowanego obszaru, który właśnie został wybrany w kanale DNA, powtórz pomiar każdego z interesujących kanałów fluorescencyjnych. Wyniki zostaną przywrócone do poprzedniego w oknie wyników pomiarów.Następnie użyj uzyskanych pomiarów, aby zastąpić błędne rekordy w pliku starstatistics. csv. Jeśli jądro zostało podsegmentowane, zduplikuj jego wiersz, przypisz różne identyfikatory komórek do każdej nowej komórki i wprowadź wartości uzyskane w ImageJ pod odpowiednią kolumną.W takim przypadku obie komórki będą miały wspólne współrzędne przestrzenne. Jeżeli jądra mitotyczne mają być rozpatrywane oddzielnie w analizie, należy je ręcznie ocenić i dodać informacje do pliku danych. Zapoznaj się z protokołem tekstowym, aby uzyskać dodatkowe instrukcje dotyczące przetwarzania obrazu.Rysunek ten przedstawia przykłady nienaruszonych blastocyst w różnych stadiach z rozszerzoną jamą. Pokazano tutaj przykłady dobrych przeciwciał dla wielu białek jądrowych, w tym CDX2, GATA4, GATA6, NANOG i OCT4. Próbka ta została znakowana cytoplazmatycznym białkiem DAB2, które daje wysoki stosunek sygnału do szumu.W tym panelu pokazano przykłady złego barwienia dla GATA4 z niskim stosunkiem sygnału do szumu, gdzie próbki były utrwalane tylko przez 10 minut. To konkretne przeciwciało anty-GATA4 wymaga utrwalenia przez noc, aby zapewnić silny sygnał. Zarodki te zostały zobrazowane za pomocą 40-krotnego obiektywu immersyjnego z olejkiem o NA 1,30 i odległości roboczej 0,21 mm Środkowe panele pokazują powiększenia ICM lub poszczególnych jąder i można rozróżnić granicę między nimi.Dolne panele ilustrują, że im bardziej zaawansowany zarodek, tym większa gęstość jądrowa, a co za tym idzie, większa szansa na błędy segmentacji. Obrazy te pokazują błędy, które może popełnić MINS, takie jak wykrywanie jąder apoptotycznych jako żywych komórek, nadmierna segmentacja lub niedostateczna segmentacja. Ta sekwencja wycinków Z ujawnia zdarzenie niedostatecznej segmentacji, w którym dwie komórki zostały zidentyfikowane jako jedna.Po opanowaniu protokół ten można przeprowadzić w ciągu trzech do czterech dni od początku do końca, przy obciążeniu czasowym od dwóch do czterech godzin dziennie. Wykonując ten zabieg należy pamiętać o zachowaniu pełnej spójności z warunkami eksperymentu, czyli protokołami immunofluorescencyjnymi i parametrami obrazowania. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią rozwoju myszy do przeprowadzania analizy ilościowej in situ ekspresji genów i białek w pojedynczych komórkach.Po obejrzeniu tego filmu będziesz dobrze rozumiał, w jaki sposób pozyskiwać dane obrazu, które są odpowiednie do ilościowej analizy ekspresji in situ.

quantitative-analysis-protein-expression-to-study-lineage

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Przedstawiamy metodę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) służącą do identyfikacji oddziaływań czynników przy genach specyficznych tkankowo podczas lub po rozpoczęciu ekspresji genów specyficznych tkankowo w tkance embrionalnej myszy. Protokół ten powinien znaleźć szerokie zastosowanie w badaniach nad aktywacją genów specyficznych tkankowo zachodzącą podczas prawidłowego rozwoju embrionalnego.

Analiza immunoprecypitacji chromatyny dla genów specyficznych tkankowo z wykorzystaniem embrionów myszy we wczesnym stadium rozwoju

Analiza ekspresji białek w młodych embrionalnych zastawkach myszy została utrudniona przez ograniczoną dostępną tkankę. Manuskrypt ten zawiera protokół przygotowania białka z rozwijających się embrionalnych obszarów zastawki myszy do analizy western blot.

Izolacja białka z rozwijającego się zarodkowego regionu zastawki serca myszy

Celem tego protokołu jest opisanie metody funkcji utraty i zysku, która ma zastosowanie do identyfikacji neogeniny jako specyficznego dla etapu receptora, który prowadzi do trofektodermy i różnicowania wewnętrznej masy komórkowej w preimplantacyjnych zarodkach myszy.

Podejście oparte na utracie i wzmocnieniu funkcji w celu zbadania determinantów wczesnego losu komórek w preimplantacyjnych zarodkach myszy

Zegar segmentacyjny napędza oscylacyjną ekspresję genów w mezodermie presomitycznej (PSM). Dynamiczna aktywność Notch jest kluczem do tego procesu. Wykorzystujemy obrazowanie i analizy obliczeniowe, aby wyodrębnić dynamikę czasową z danych wyrażeń przestrzennych, aby wykazać, że ekspresja liganda Delta i receptora Notch oscyluje w PSM kręgowców.

Porządkowanie czasowe danych wyrażeń dynamicznych na podstawie szczegółowych map wyrażeń przestrzennych

Ta metoda opisuje solidne i powtarzalne podejście do porównywania poziomów białek w różnych tkankach i w różnych punktach czasowych rozwoju przy użyciu standaryzowanego ilościowego podejścia western blotting.

Solidne porównanie poziomów białka w tkankach i podczas całego rozwoju przy użyciu standaryzowanego ilościowego Western blotting

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

Opisujemy technikę profilowania mikroRNA we wczesnych zarodkach myszy. Protokół ten pozwala przezwyciężyć wyzwanie związane z niskim wkładem komórek i wzbogaceniem małego RNA. Test ten można wykorzystać do analizy zmian w ekspresji miRNA w czasie w różnych liniach komórkowych wczesnego zarodka myszy.

Przygotowanie małych bibliotek RNA do sekwencjonowania z wczesnych zarodków myszy

Tutaj opisujemy opartą na spektrometrii mas proteomiczną charakterystykę linii komórkowych ze znanymi losami tkanek u zarodka kręgowca Xenopus laevis.

Proteomika spektrometrii mas sterowana linią komórkową w rozwijającym się zarodku (żaby)

Ten artykuł ustanawia linię produkcyjną dla wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek i jąder zarodków myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek i jąder.

Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA zmutowanych całych zarodków myszy: od epiblastu do końca gastrulacji

Protokół ten zapewnia uproszczony proces obliczeniowy do ilościowej identyfikacji początkujących transkrypcji wzmacniaczy. Integrując dostępność chromatyny, cechy chromatyny oraz dane transkrypcyjne, umożliwia dokładne wykrywanie i analizę aktywności wzmacniacza specyficzną dla nici w złożonych regionach intragenowych, pozostając jednocześnie dostępnym dla badaczy bez rozległego szkolenia bioinformatycznego.

Tok obliczeniowy do ilościowej identyfikacji RNA intergenowego/wewnątrzgenowego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Poznaj metodę ilościowej analizy ekspresji białek w zarodkach myszy przed implantacją z rozdzielczością pojedynczych komórek. Technika ta umożliwia badanie specyfikacji linii komórkowych w rozwoju embrionalnym.

Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

Przeglądaj więcej filmów