Badanie projektowe i wdrożeniowe w celu opracowania i walidacji pacjenta w papierowej diagnostyce przełącznika Toehold

Nasz protokół opisuje projektowanie, montaż i walidację diagnostyki opartej na obwodach genowych. Ta papierowa diagnostyka molekularna jest tania i czuła, jest w stanie wykryć klinicznie istotne stężenia kwasów nukleinowych i może być zaprojektowana do wykrywania praktycznie dowolnej sekwencji. Jest to technologia platformy, która może być zaprojektowana przez użytkowników zgodnie z ich potrzebami i ma potencjał, aby wprowadzić diagnostykę klasy klinicznej do bardziej zdecentralizowanych zasobów stomatologicznych.

Bezkomórkowy czujnik przełącznika palcowego może być zaprojektowany dla praktycznie każdego celu opartego na kwasach nukleinowych. Ostatnie prace wykazały bezkomórkową diagnostykę wirusa Ebola, norowirusa, SARS-CoV-2, C.difficile i bakterii wywołujących dur brzuszny. Procedurę zademonstrują Severino Jefferson Rivero da Silva, doktor habilitowany, oraz Pouriya Bayat, doktorant z mojego laboratorium.

Aby zaprojektować przełącznik toehold, zidentyfikuj sekwencje docelowe z genomu wirusa Zika i wybierz sekwencje docelowe wirusa Zika z amplikonów zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Pobierz pakiet oprogramowania do projektowania przełączników toehold. Otwórz MATLAB i przejdź do folderu oprogramowania do projektowania.

Wprowadź sekwencje docelowe do pliku csv pliku wejściowego projektu znajdującego się w podfolderze wejściowym. Wybierz parametry, które mają być używane dla funkcji obliczeniowej. Uruchom funkcję projektowania, aby wygenerować projekty przełączników zaczepu dla interesujących Cię celów.

Po zakończeniu przejdź do folderu final_designs i znajdź sekwencje projektowe przełącznika górnego uchwytu u nogi oraz odpowiadające im sekwencje docelowe w arkuszach kalkulacyjnych w formacie csv. Upewnij się, że sekwencje DNA przełącznika palca wygenerowane przez algorytm zawierają sekwencje promotora T7 na pięciu głównych końcach i konserwatywną sekwencję łącznika 21 nukleotydów na trzech głównych końcach. Użyj NCBI BLAST, aby przeskanować sekwencje konstrukcyjne przełącznika górnego palca pod kątem innych popularnych wirusów, sprawdzając homologię sekwencji.

Akceptuj sekwencje z hemologią mniejszą niż 40%. Przygotować roztwory oligonukleotydów DNA przełącznika do włosów i starterów do odwróconej amplifikacji o stężeniu 10 mikromolów w wodzie wolnej od nukleaz. Zebrać reakcje w probówkach PCR na lodzie zgodnie z tą tabelą.

Umieść probówki reakcyjne w termocyklerze, postępując zgodnie z warunkami cykliczności wymienionymi w tej tabeli. Przeanalizuj produkty PCR na żelu agarozowym. Oczyść produkty PCR i eluuj DNA w minimalnej objętości wody wolnej od nukleaz, aby zapewnić wystarczająco wysokie stężenie.

Określić ilościowo DNA za pomocą spektrofotometru. Przygotować roztwór podstawowy CPRG, rozpuszczając 25 miligramów proszku w jednym mililitrze wody wolnej od nukleaz. Przygotuj mieszankę wzorcową na lodzie zgodnie ze standardowym protokołem przedstawionym tutaj.

Dozuj bezkomórkową mieszankę wzorcową do probówek PCR. W przypadku kontroli bezkomórkowej i sterowania z samymi przełącznikami, dodaj wodę wolną od nukleaz do objętości 5.94 mikrolitrów. A do reakcji dodaj oczyszczone DNA przełącznika PCR, aby uzyskać końcowe stężenie 33 nanomolowców.

Aby przetestować kombinację przełącznika palcowego i docelowego RNA, dodaj transkrybowany in vitro docelowy RNA do końcowego stężenia jednego mikromola. Dokładnie wymieszać wszystkie reakcje, pipetując i krótko odwirowując. Na czarnej, przezroczystej płytce 384-dołkowej z przezroczystym dnem dodaj 30 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do studzienek otaczających dołki reakcyjne.

Następnie za pomocą dwumilimetrowego stemple biopsyjnego i pęsety przeciąć zablokowane krążki z bibuły filtracyjnej BSA i umieścić je w studzienkach reakcyjnych. Dozować 1,8 mikrolitra z każdej probówki reakcyjnej na krążki z bibuły filtracyjnej w 384-dołkowej płytce w trzech egzemplarzach. Przykryj płytkę przezroczystą folią PCR i umieść ją w czytniku płytek.

Mierz absorbancję przy 570 nanometrach w temperaturze 37 stopni Celsjusza co minutę przez 130 minut. Przygotuj 25-mikromolowy roztwór podstawowy wszystkich zestawów starterów do przodu i do tyłu w wodzie wolnej od nukleaz. Ustaw reakcję o pojemności pięciu mikrolitrów, używając pokazanej tutaj mieszanki głównej.

Mieszać pipetując, aż biały osad się rozpuszczony, a następnie przelać do probówek do PCR. Dodaj startery do przodu i do tyłu do odpowiednich probówek, a następnie dodaj jeden mikrolitr wody wolnej od nukleaz lub dwa picomolar docelowego RNA wyzwalającego. Wymieszać delikatnie pipetując i krótko odwirować probówki.

Ustaw protokół inkubacji na termocyklerze, jak pokazano tutaj. Po 12 minutach wyjmij probówki i dodaj 1,25 mikrolitra mieszanki enzymów do każdej probówki, a następnie wymieszaj i odwiruj. Zwróć probówki do termocyklera po pominięciu kroku utrzymywania 41 stopni Celsjusza, aby rozpocząć jednogodzinną inkubację reakcji.

Następnie, aby ocenić wydajność startera, zmontuj papierowe, bezkomórkowe reakcje przełącznika palcowego i przeanalizuj dane. W celu analizy wrażliwości zidentyfikuj kandydujące pary starterów i przygotuj seryjne rozcieńczenia docelowego RNA w wodzie wolnej od nukleaz. Powtórzyć reakcje NASBA i bezkomórkowe z wybranymi zestawami starterów w biologicznych trzech egzemplarzach.

Używając jednego mikrolitra wyekstrahowanego RNA pacjenta, przeprowadź amplifikację NASBA i reakcje bezkomórkowe na papierze, jak pokazano w sekcji piątej. Po reakcjach przygotuj 384-dołkową płytkę reakcyjną i uruchom test w przenośnym czytniku płytek w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie zmontuj komponenty RT-qPCR i dodaj odczynniki do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej zgodnie z tą tabelą.

Wymieszać reakcję przez pipetowanie. Dozować 6,5 mikrolitra do każdej studzienki 96-dołkowej lub 384-dołkowej płytki PCR, a następnie 3,5 mikrolitra każdej matrycy RNA w trzech egzemplarzach. Umieść folię PCR na wierzchu płytki.

Odwirować 384-dołkową płytkę o temperaturze 600 razy G przez dwie minuty. Umieść płytkę w maszynie RT-qPCR i uruchom warunki cykliczne, jak pokazano tutaj. Zgodnie z projektem obliczeniowym skonstruowano trzy przełączniki palcowe i przeanalizowano je za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.

Pasma około 3 000 par zasad wskazywała na udaną reakcję. Przełączniki palcowe oceniano pod kątem ich odpowiednich RNA wyzwalającego transkrybowanego in vitro. Podczas gdy wszystkie trzy czujniki wykazywały wzrost absorbancji, czujnik 27B miał najszybszą szybkość włączania, podczas gdy przełączniki 33B i 47B miały niższy współczynnik włączania/wyłączania, wskazujący na aktywność tła i zmniejszoną swoistość.

Krotna zmiana absorbancji przy 570 nanometrach wykazała, że przełącznik 27B ma najlepszą wydajność przy stosunku sygnału włącz/wyłącz. Co więcej, w połączeniu z NASBA może wykrywać RNA w stężeniach tak niskich, jak 124 cząsteczki na mikrolitr, co wskazuje na wysoką czułość. Próbki pobrane od pacjentów z wirusem Zika z Brazylii zostały przetestowane w celu oceny klinicznej dokładności diagnostycznej czujników za pomocą przenośnego czytnika płytek.

Zmiana koloru z żółtego na fioletowy zidentyfikowała pozytywną próbkę. Odpowiedź kolorymetryczna dla każdej reakcji na papierze została wykreślona w czasie przez zintegrowane oprogramowanie na przenośnym czytniku płytek PLUM. Próbki, które przekroczyły próg, zostały uznane za pozytywne.

Skuteczność kliniczną czujnika ustalono w porównaniu z RT-qPCR. Próbki uznano za dodatnie, gdy wartość progowa cyklu była równa lub mniejsza niż 38. Ważne jest, aby upewnić się, że wyniki z ekranów przełącznika toehold i czułości startera NASBA są powtarzalne i zoptymalizowane przed przystąpieniem do badań z udziałem pacjentów.

Ze względu na swoją prostotę i możliwości adaptacji, opisana tutaj platforma diagnostyczna utorowała drogę do opracowania nowych narzędzi przyłóżkowych, które mogą przynieść korzyści systemowi opieki zdrowotnej, zwłaszcza krajom o niskich dochodach.