Name: Badanie projektowe i wdrożeniowe w celu opracowania i walidacji pacjenta w papierowej diagnostyce przełącznika Toehold (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Poznaj projektowanie i walidację papierowej diagnostyki molekularnej wykorzystującej czujniki toehold switch do wykrywania RNA wirusowego. Ta metoda umożliwia szybką i niedrogą detekcję w zdecentralizowanych warunkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują wszystkim członkom laboratoriów Green, Pardee i Pena, a także wszystkim współautorom poprzednich manuskryptów odnoszących się do pracy ujawnionej w tym manuskrypcie. S.J.R.d.S. był wspierany przez stypendium doktoranckie sponsorowane przez Foundation for Science and Technology of Pernambuco (FACEPE), numer referencyjny IBPG-1321-2.12/18, a obecnie jest wspierany przez stypendium podoktorskie sponsorowane przez University of Toronto, Kanada. P.B. jest wspierany przez Nagrodę Williama Knappa Buckleya przyznawaną przez Wydział Farmacji Uniwersytetu w Toronto. M.K. był wspierany przez Inicjatywę Medycyny Precyzyjnej (PRiME) na Uniwersytecie w Toronto w ramach wewnętrznego stypendium nr PRMF2019-002. Praca ta została wsparta funduszami dla K.P z Canada Research Chairs Program (pliki 950-231075 i 950-233107), Funduszu Zarządzania Głównymi Projektami Badawczymi Uniwersytetu w Toronto, Programu Grantowego Fundacji CIHR (201610FDN-375469) oraz dla L.P, A.A.G. i K.P za pośrednictwem CIHR/IDRC Team Grant: Canada-Latin/America-Caribbean Zika Virus Program (FRN: 149783), a także poprzez środki na rzecz K.P. z Kanadyjskiego Centrum Badań nad Rozwojem Międzynarodowym (grant 109434-001) w ramach kanadyjskiego programu 2019 Novel Coronavirus (COVID-19) Rapid Research Funding Opportunity. Praca ta była również wspierana przez fundusze dla A.A.G. z nagrody Arizona Biomedical Research Commission New Investigator Award (ADHS16-162400), Fundacji Gatesów (OPP1160667), nagrody NIH Director's New Innovator Award (1DP2GM126892), nagrody NIH R21 (1R21AI136571-01A1) dla K.P./A.A.G. oraz stypendium Alfreda P. Sloana (FG-2017-9108). Rysunek 1 został stworzony z Biorender.com na podstawie licencji akademickiej K.P.

<ol><li>Urdea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+high+impact+diagnostics+in+the+developing+world%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Requirements for high impact diagnostics in the developing world.</a> Nature. 444, Suppl 1 73-79 (2006).</li>
<li>Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-care+diagnostics+for+global+health%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Point-of-care diagnostics for global health.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 10, 107-144 (2008).</li>
<li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobile+real-time+surveillance+of+Zika+virus+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mobile real-time surveillance of Zika virus in Brazil.</a> Genome Medicine. 8 (1), 97(2016).</li>
<li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+in+the+Americas%3A+Early+epidemiological+and+genetic+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Zika virus in the Americas: Early epidemiological and genetic findings.</a> Science. 352 (6283), 345-349 (2016).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+synthetic+gene+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Paper-based synthetic gene networks.</a> Cell. 159 (4), 940-954 (2014).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rapid, low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li>
<li>Duyen, T. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+colorimetric+biosensor+for+antibiotics+inhibiting+bacterial+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Paper-based colorimetric biosensor for antibiotics inhibiting bacterial protein synthesis.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 123 (1), 96-100 (2017).</li>
<li>Jung, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+biosensors+for+rapid+detection+of+water+contaminants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free biosensors for rapid detection of water contaminants.</a> Nature Biotechnology. 38 (12), 1451-1459 (2020).</li>
<li>Yang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+Escherichia+coli-based+system+to+screen+for+quorum-sensing+molecules+interacting+with+quorum+receptor+proteins+of+streptomyces+coelicolor%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cell-free Escherichia coli-based system to screen for quorum-sensing molecules interacting with quorum receptor proteins of streptomyces coelicolor.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (19), 6367(2009).</li>
<li>Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost+detection+of+norovirus+using+paper-based+cell-free+systems+and+synbody-based+viral+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment.</a> Synthetic Biology. 3 (1), (2018).</li>
<li>Park, S., Lee, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+coronaviruses+using+RNA+toehold+switch+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Detection of coronaviruses using RNA toehold switch sensors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1-13 (2021).</li>
<li>Amalfitano, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glucose+meter+interface+for+point-of-care+gene+circuit-based+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A glucose meter interface for point-of-care gene circuit-based diagnostics.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).</li>
<li>Nguyen, P. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wearable+materials+with+embedded+synthetic+biology+sensors+for+biomolecule+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Wearable materials with embedded synthetic biology sensors for biomolecule detection.</a> Nature Biotechnology. 39 (11), 1366-1374 (2021).</li>
<li>Pellinen, T., Huovinen, T., Karp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-free+biosensor+for+the+detection+of+transcriptional+inducers+using+firefly+luciferase+as+a+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A cell-free biosensor for the detection of transcriptional inducers using firefly luciferase as a reporter.</a> Analytical Biochemistry. 330 (1), 52-57 (2004).</li>
<li>Salehi, A. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+approach+to+biosensing+hTR%CE%B2-specific+endocrine+disruptors%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTRβ-specific endocrine disruptors.</a> Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).</li>
<li>Salehi, A. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensing+estrogenic+endocrine+disruptors+in+human+blood+and+urine%3A+A+RAPID+cell-free+protein+synthesis+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Biosensing estrogenic endocrine disruptors in human blood and urine: A RAPID cell-free protein synthesis approach.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 345, 19-25 (2018).</li>
<li>Voyvodic, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plug-and-play+metabolic+transducers+expand+the+chemical+detection+space+of+cell-free+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Plug-and-play metabolic transducers expand the chemical detection space of cell-free biosensors.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-8 (2019).</li>
<li>Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplifying+and+streamlining+Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).</li>
<li>Gräwe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paper-based%2C+cell-free+biosensor+system+for+the+detection+of+heavy+metals+and+date+rape+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs.</a> PLOS One. 14 (3), 0210940(2019).</li>
<li>Green, A. A., Silver, P. A., Collins, J. J., Yin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toehold+Switches%3A+De-Novo-Designed+Regulators+of+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Toehold Switches: De-Novo-Designed Regulators of Gene Expression.</a> Cell. 159 (4), 925-939 (2014).</li>
<li>Craw, P., Balachandran, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+nucleic+acid+amplification+technologies+for+point-of-care+diagnostics%3A+a+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care diagnostics: a critical review.</a> Lab on a Chip. 12 (14), 2469-2486 (2012).</li>
<li>Zyrina, N. V., Antipova, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonspecific+Synthesis+in+the+Reactions+of+Isothermal+Nucleic+Acid+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Moscow%29%22%5BJournal%5D)">Nonspecific Synthesis in the Reactions of Isothermal Nucleic Acid Amplification.</a> Biochemistry (Moscow). 86 (7), 887-897 (2021).</li>
<li>Takahashi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low-cost+paper-based+synthetic+biology+platform+for+analyzing+gut+microbiota+and+host+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A low-cost paper-based synthetic biology platform for analyzing gut microbiota and host biomarkers.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-12 (2018).</li>
<li>Karlikow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+validation+of+the+performance+of+paper-based+tests+for+the+detection+of+the+Zika+and+chikungunya+viruses+in+serum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Field validation of the performance of paper-based tests for the detection of the Zika and chikungunya viruses in serum samples.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (3), 246-256 (2022).</li>
<li>Agarwala, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Database+resources+of+the+National+Center+for+Biotechnology+Information%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Database resources of the National Center for Biotechnology Information.</a> Nucleic Acids Research. 44 (1), 7-19 (2016).</li>
<li>BLAST: Basic Local Alignment Search Tool. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> (2022).</li>
<li>Deiman, B., Van Aarle, P., Sillekens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+applications+of+nucleic+acid+sequence-based+amplification+%28NASBA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Characteristics and applications of nucleic acid sequence-based amplification (NASBA).</a> Molecular Biotechnology. 20 (2), 163-179 (2002).</li>
<li>Zadeh, J. N., Wolfe, B. R., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+sequence+design+via+efficient+ensemble+defect+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid sequence design via efficient ensemble defect optimization.</a> Journal of Computational Chemistry. 32 (3), 439-452 (2011).</li>
<li>NUPACK: Nucleic Acid Package. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.nupack.org/">http://www.nupack.org/</a> (2022).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+DNA+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , Cambridge, MA. (2021).</li>
<li>Lanciotti, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+serologic+properties+of+Zika+virus+associated+with+an+epidemic%2C+Yap+State%2C+Micronesia%2C+2007%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007.</a> Emerging Infectious Diseases. 14 (8), 1232(2008).</li>
<li>Walsh, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardizing+automated+DNA+assembly%3A+Best+practices%2C+metrics%2C+and+protocols+using+robots%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Technology%22%5BJournal%5D)">Standardizing automated DNA assembly: Best practices, metrics, and protocols using robots.</a> SLAS Technology. 24 (3), 282(2019).</li>
<li>Silva, S. J. R., de Magalhães, J. J. F., de Pena, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+circulation+of+DENV%2C+CHIKV%2C+ZIKV+and+SARS-CoV-2+in+Brazil%3A+An+inconvenient+truth%5BTitle%5D)+AND+%22One+Health%22%5BJournal%5D)">Simultaneous circulation of DENV, CHIKV, ZIKV and SARS-CoV-2 in Brazil: An inconvenient truth.</a> One Health. 12, 100205(2021).</li>
<li>Kimura, S., Fujinaga, K., Sekiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+machine.+Tanpakushitsu+kakusan+koso%5BTitle%5D)+AND+%22Protein%2C+Nucleic+Acid%2C+Enzyme%22%5BJournal%5D)">PCR machine. Tanpakushitsu kakusan koso.</a> Protein, Nucleic Acid, Enzyme. 41 (5), 514-517 (1996).</li>
<li>Arce, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decentralizing+cell-free+RNA+sensing+with+the+use+of+low-cost+cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Decentralizing cell-free RNA sensing with the use of low-cost cell extracts.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 727584(2021).</li>
<li>Silva, S. J. R., Pardee, K., Balasuriya, U. B. R., Pena, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+one-step+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification+%28RT-LAMP%29+for+rapid+detection+of+ZIKV+in+patient+samples+from+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of ZIKV in patient samples from Brazil.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).</li>
<li>Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li>
<li>Lavickova, B., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+robust%2C+and+low-cost+method+to+produce+the+PURE+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).</li>
</ol>

K.P. i A.A.G. są współtwórcami technologii związanych z czujnikami palców na papierze. Y.G., S.C. i K.P. są współzałożycielami LSK Technologies, Inc. i są współtwórcami technologii związanych z PLUM. M.K., K.P. i A.A.G. są współzałożycielami En Carta Diagnostics Ltd. Pozostali autorzy nie pozostają w konflikcie interesów. Patenty: Urządzenie PLUM: Wniosek patentowy Y.G., S.C. i K.P. został złożony przez University of Toronto i przypisany do LSK Technologies Inc. Tymczasowy wniosek patentowy USA nr 62/982,323 złożony 27 lutego 2020 r.; Patent na przełącznik Toehold: A.A.G., P.Y. i J.J. C. "Kompozycje ryboregulatorów i metody użycia", Patent. WO2014074648A3 złożony 6 listopada 2012 r.; Patent diagnostyczny oparty na papierze: K.P. i J.J.C. "Paper-based synthetic gene networks" Patent w USA zgłoszony nr US15/963,831 złożony 6 grudnia 2013 r.; Patent na Zika 1: K.P., A.A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. i J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform", U. S. Provisional Patent Application No. 62/403,778 złożony 4 października 2016 r.; Patent na Zika 2: K.P., A.A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. i J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform", U.S. Provisional Patent Application No. 62/341,221 złożony 25 maja 2016 r.

Opisany tutaj połączony system oparty na dokumentach papierowych może doprowadzić do klinicznie istotnej diagnostyki molekularnej, z wydajnością funkcjonalnie porównywalną z RT-qPCR, do punktu potrzebnego6. Co ważne, w przypadku ustawień zdalnych dostępność diagnostyki na miejscu może skrócić czas oczekiwania na wyniki z dni do godzin. Podkreślając programowalność tego podejścia, opisany potok może być wykorzystany do wykrywania praktycznie każdego celu patogenu. Połączyliśmy narzędzia molekularne ze specjalnie zaprojektowanym przenośnym czytnikiem płytek, który jest kompaktowy i kompatybilny z zasilaniem bateryjnym (8–9 godzin) oraz zapewnia wbudowaną analizę danych w celu umożliwienia aplikacji rozproszonych. W ramach innych prac przeprowadziliśmy walidację połączonego sprzętu i platformy diagnostycznej wirusa Zika z 268 próbkami pacjentów, równolegle z RT-qPCR, i uzyskaliśmy dokładność diagnostyczną na poziomie 98,5%24. Podsumowując, naszym celem jest umożliwienie transferu technologii tej platformy do naukowców, tak aby mogła ona zostać ponownie wykorzystana i ulepszona przez społeczność w celu zaspokojenia niezaspokojonych potrzeb diagnostycznych.
Proces projektowania przełącznika in silico toehold został zintegrowany i zautomatyzowany w potok, który można podzielić na trzy etapy. Pierwszy etap generuje pulę projektów przełączników toehold, które hybrydyzują z sekwencją docelową w jednym przyrostu nukleotydowym. Drugi etap bada strukturę wtórną i dostępność przełącznika podtrzymania palcowego oraz eliminuje czujniki z przedwczesnymi kodonami stop w ramie. Funkcja punktacji, która uwzględnia wiele czynników (np. poziom defektu przełącznika toehold, dostępność przełącznika toehold i dostępność miejsca docelowego), jest następnie implementowana w celu wyboru projektów przełączników górnego zaczepu na podstawie ogólnych wyników. W ostatnim etapie generowana jest lista sekwencji dla projektów przełączników górnego uchwytu palcowego i odpowiadających im docelowych wyzwalaczy. Sekwencje najlepszych czujników powinny być badane pod kątem swoistości wobec ludzkiego transkryptomu i blisko spokrewnionych genomów wirusowych przy użyciu NCBI/Primer-BLAST25. Najlepszą praktyką jest również badanie przesiewowe miejsc docelowych czujników pod kątem zachowania sekwencji w genomie wirusa Zika, aby zapewnić, że czujniki zapewnią szeroką i niezawodną detekcję. Opracowano kilka wersji oprogramowania do projektowania przełączników toehold, a algorytm projektowania pozwala użytkownikom na wygenerowanie dwóch wersji, przełączników toehold serii A6 lub serii B6. W tym artykule skupiono się na konstrukcji przełącznika palcowego serii B.
Po komercyjnej syntezie DNA, przełączniki palcowe mogą być szybko złożone, a następnie przetestowane, wykonując wstępne badanie przesiewowe pod kątem syntetycznej sekwencji wyzwalającej celu, która odpowiada krótkim regionom (200-300 nt) docelowego genomu. W celu sprawdzenia wydajności czujników opartych na przełączniku toehold idealnie jest dodać sekwencję docelową w postaci RNA. W tym artykule przedstawiono kroki wymagane do dodania transkrybowanego wyzwalającego RNA in vitro . Jeśli jednak są dostępne, można zastosować pełnowymiarowe matryce genomu, takie jak ilościowe ekstrakty wirusowego RNA lub komercyjne syntetyczne genomy lub standardy RNA. Wykorzystanie genomów RNA o pełnej długości do początkowego badania przesiewowego przełącznika palca u nogi jest korzystne, ponieważ może informować, czy dodatkowe czynniki, takie jak struktura drugorzędowa RNA, wpłyną na działanie czujnika. Aby zoptymalizować stosunek ON/OFF potencjalnych przełączników, DNA przełącznika palcowego można miareczkować do reakcji bezkomórkowej. Ten krok może również służyć do identyfikacji wysokowydajnych przełączników typu toehold (wzmocnienie fałdowe lub wysoki współczynnik ON/OFF) i pominięcia nieszczelnych przełączników toehold (wysoki sygnał przy braku docelowego RNA) na dalszych etapach charakteryzacji.
Aby poprawić granicę wykrywalności najskuteczniejszych kandydatów na przełączniki typu toehold, NASBA stosuje się w celu zwiększenia klinicznie istotnych stężeń docelowego RNA wirusa Zika do poziomu, który może być wykryty przez przełączniki toehold6. Różne kombinacje zestawów starterów do przodu i do tyłu są badane w celu określenia najlepszych kombinacji startera NASBA i przełącznika palcowego, aby umożliwić wykrywanie w klinicznie istotnych stężeniach. Po zidentyfikowaniu idealnej kombinacji zestawu starterów i przełącznika palcowego, test jest przekazywany do walidacji klinicznej. Ważne jest, aby pamiętać, że etapy przełącznika toehold i badań przesiewowych NASBA mogą być pracochłonne i zasobożerne, dlatego opracowywanie testów najlepiej nadaje się do dobrze wyposażonych ośrodków badawczych. Chociaż nie zastosowaliśmy automatyzacji procesów, jest prawdopodobne, że może to przyspieszyć iteracyjny cykl projektowania, budowania i testowania32. Na szczęście czas realizacji od zaprojektowania i przetestowania czujnika do wdrożenia może być niezwykle krótki (mniej niż tydzień), co czyni tę strategię idealną w sytuacjach krytycznych czasowo, takich jak wybuchy epidemii6.
Nawet po opracowaniu biosensora o klinicznie istotnej czułości istnieją wyzwania techniczne, którymi należy się zająć. Ponieważ protokół ten obejmuje obsługę ręczną i jest procedurą wieloetapową, istnieje ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami. Dokładamy wszelkich starań, aby zmniejszyć to ryzyko poprzez staranną praktykę laboratoryjną. W niedawnym badaniu klinicznym obejmującym 268 próbek pobranych od pacjentów nie napotkaliśmy żadnych problemów związanych z zanieczyszczeniem; Jest to jednak istotna kwestia24. Mając to na uwadze, protokół pozostaje testem laboratoryjnym i wymaga wykwalifikowanego użytkownika posiadającego wiedzę na temat odpowiednich technik biologii molekularnej. Dodatkowym czynnikiem branym pod uwagę przy wdrażaniu jest izolacja RNA od próbek pobranych od pacjentów. Tutaj opisujemy izolację RNA przy użyciu zestawów do ekstrakcji kwasów nukleinowych opartych na kolumnach. Jednak w innych pracach zademonstrowaliśmy skuteczną i prostą metodę lizy wrzenia (95 °C przez 2 minuty) do przetwarzania próbek od pacjentów o niskim obciążeniu6. Strategia ta prawie eliminuje koszty związane z ekstrakcją RNA i pozwala uniknąć stosowania zestawów do ekstrakcji kwasów nukleinowych opartych na kolumnach, co może stanowić wyzwanie logistyczne w warunkach niskich zasobów lub problemów z łańcuchem dostaw podczas kryzysów, takich jak pandemia COVID-1933.
Jak widzieliśmy podczas pandemii COVID-19, instrumenty używane do przeprowadzania RT-qPCR mogą same w sobie służyć jako wąskie gardło i ograniczać dostęp pacjentów do testów. Ten czynnik, który jest również w dużej mierze finansowy, prowadzi do scentralizowanego trybu testowania, który może ograniczyć dostęp diagnostyczny. Na przykład podczas wybuchu epidemii wirusa Zika w latach 2015/2016 w Brazylii dostępnych było tylko pięć krajowych laboratoriów referencyjnych, co spowodowało opóźnienia w testowaniu pacjentów. Nie biorąc pod uwagę potencjalnych korzyści wynikających z ekonomii skali, obecny koszt towarów dla przenośnego czytnika płytek wynosi ~500 USD, co nawet jeśli wzrosło pięciokrotnie w celu uwzględnienia marży pracy i handlowej, nadal zapewnia przystępne cenowo narzędzie. Wypada to dobrze w porównaniu z instrumentami RT-qPCR, których koszt waha się od 15 000 do 90 000 USD34. Co więcej, szacowany koszt testu bezkomórkowego w Ameryce Łacińskiej wynosi około 5,48 USD, podczas gdy koszt testu RT-qPCR w Brazylii wynosił ~10-11 USD w momencie wybuchu epidemii Zika36. Poza kosztem sprzętu, przenośny czytnik płytek ma niewielkie rozmiary (20 cm3), automatyczną analizę, przesyłanie danych do chmury przez Internet i może być zasilany bateryjnie. Funkcje te znacznie rozszerzają potencjalne ustawienia, w których można wdrożyć testy, a jednocześnie rozszerzają populację pacjentów, którzy mogą być obsługiwani.
Do tej pory najpopularniejszymi komercyjnymi platformami CFPS dla E. coli są systemy S30 i PURE37; Jednak kluczowym czynnikiem wpływającym na poprawę dostępu do diagnostyki w krajach o niskich i średnich dochodach jest ograniczona krajowa dostępność tych odczynników. Ważnym krokiem w kierunku rozwiązania tego problemu jest rozwój lokalnej produkcji CFPS. Laboratorium Federici poczyniło ostatnio znaczne postępy w kierunku opracowania niekomercyjnej platformy do wdrażania czujników opartych na przełącznikach toehold w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie, osiągając poziom 2,7 fM LOD z RNA14 wirusa Zika. Osiągnięcie to nie tylko pozwala na wytwarzanie odczynników w kraju użytkowania, unikając ceł importowych i opóźnień, ale koszty pracy można również skalować do stawek lokalnych, a tym samym można znacznie obniżyć całkowity koszt. W pracach przedstawionych przez grupę Federici koszt wytworzenia reakcji ekspresji CFPS (5 μl) w Chile wyniósł 6,9 centa (USD)35,38, co stanowi podwójną zachętę (poprawa logistyki i kosztów) do wdrożenia systemów opartych na lizacie 35,38.
Umieszczenie testów porównywalnych z RT-qPCR w rozproszonych sieciach diagnostycznych może przynieść znaczące korzyści w porównaniu z obecnymi praktykami, które są zależne od transportu próbek do scentralizowanych obiektów RT-qPCR. W warunkach podmiejskich, gdzie skoncentrowane były przypadki wirusa Zika, fizyczna odległość między pacjentem a placówką diagnostyczną spowalnia diagnozę i zwiększa ryzyko, że wyniki nie dotrą do pacjenta w klinicznie istotnym czasie. Mamy nadzieję, że zaprezentowane tu prace mogą przyczynić się do umożliwienia społeczności naukowej, poprzez transfer wiedzy, tworzenia zdecentralizowanych biotechnologii i przenośnego sprzętu do monitorowania zdrowia ludzkiego, rolnictwa i środowiska.

RT-qPCR pozostaje złotym standardem w diagnostyce klinicznej ze względu na doskonałą czułość i swoistość. Mimo że metoda ta jest wysoce niezawodna, opiera się na kosztownym, specjalistycznym sprzęcie i odczynnikach, które wymagają dystrybucji i przechowywania w kontrolowanej temperaturze. Stanowi to znaczną barierę w powszechnym dostępie do wysokiej jakości diagnostyki, szczególnie w czasie wybuchów epidemii oraz w regionach z ograniczonym dostępem do dobrze wyposażonych laboratoriów1,2. Zaobserwowano to podczas epidemii wirusa Zika w Brazylii w latach 2015/2016. Dostępność zaledwie pięciu scentralizowanych laboratoriów wykonujących testy RT-qPCR doprowadziła do powstania znacznych wąskich gardeł, ograniczając dostęp do diagnostyki. Było to szczególnie uciążliwe dla osób z obszarów podmiejskich, które zostały dotknięte epidemią w najsilniejszym stopniu3,4. W celu poprawy dostępu do diagnostyki, w niniejszym protokole przedstawiono platformę opracowaną z myślą o zdecentralizowanej, niskokosztowej i wysokowydajnej diagnostyce w warunkach ograniczenia zasobów. W ramach tego przedsięwzięcia ustanowiono proces odkrywania narzędzi diagnostycznych, łącząc amplifikację izotermiczną i syntetyczne sensory oparte na przełącznikach RNA z bezkomórkowymi systemami ekspresyjnymi na podłożu papierowym5,6.
Systemy bezkomórkowej syntezy białek (CFPS), a w szczególności systemy bezkomórkowe oparte na E. coli, stanowią atrakcyjną platformę dla szerokiego zakresu zastosowań w biosensingu – od monitorowania środowiska7,8 po diagnostykę patogenów5,6,9,10,11,12. Zawierając komponenty niezbędne do transkrypcji i translacji, systemy CFPS oferują znaczące zalety w porównaniu z biosensorami opartymi na całych komórkach. W szczególności detekcja nie jest ograniczona przez ścianę komórkową, a systemy te są zazwyczaj modułowe, bezpieczne biologicznie, niedrogie i mogą być liofilizowane w celu zastosowań przenośnych. Możliwość liofilizacji reakcji opartych na obwodach genowych na podłożach takich jak papier czy tekstylia umożliwia transport, długoterminowe przechowywanie w temperaturze pokojowej5, a nawet integrację z technologiami ubieralnymi (wearables)13.
Wcześniejsze prace wykazały, że bezkomórkowe systemy E. coli mogą być wykorzystywane do wykrywania licznych analitów, na przykład metali toksycznych takich jak rtęć, antybiotyków takich jak tetracyklina7,14, substancji zaburzających gospodarkę hormonalną15,16, biomarkerów takich jak kwas hipurowy17, cząsteczek quorum sensing związanych z patogenami9,18 oraz substancji nielegalnych, takich jak kokaina17 i kwas gamma-hydroksymasłowy (GHB)19. W przypadku specyficznego sekwencyjnie wykrywania kwasów nukleinowych strategie opierały się w przeważającej mierze na zastosowaniu biosensorów opartych na przełącznikach sprzężonych z technikami amplifikacji izotermicznej. Przełączniki typu toehold są syntetycznymi riboregulatorami (w dalszej części tekstu nazywanymi po prostu „przełącznikami”), które zawierają strukturę spinki do włosów blokującą dalszą translację poprzez sekwestrację miejsca wiązania rybosomu (RBS) i kodonu startowego. Po wejściu w interakcję z docelowym RNA wyzwalającym struktura spinki zostaje zniesiona, co umożliwia późniejszą translację reporterowej otwartej ramki odczytu20.
Amplifikacja izotermiczna może być również wykorzystywana w diagnostyce molekularnej21; jednak metody te są podatne na niespecyficzną amplifikację, co może obniżyć swoistość, a tym samym dokładność testu poniżej poziomu uzyskiwanego w RT-qPCR 22. W pracy opisanej w niniejszym opracowaniu amplifikację izotermiczną przed czujnikami opartymi na przełącznikach wykorzystano w celu zapewnienia połączonej amplifikacji sygnału, która umożliwia wykrywanie kwasów nukleotowych na poziomach istotnych klinicznie (od femtomolarnego do attomolarnego). Połączenie tych dwóch metod zapewnia również dwa punkty kontrolne specyficzne dla sekwencji, które łącznie gwarantują wysoki poziom swoistości. Stosując to podejście, w poprzednich pracach wykazano możliwość wykrywania wirusów takich jak Zika6, Ebola5, Norowirus10, a także bakterii patogennych, takich jak C. difficile23 oraz antybiotykoopornego szczepu duru brzusznego12. Niedawno opracowano bezkomórkowe przełączniki toehold do wykrywania SARS-CoV-2 w ramach wysiłków mających na celu zapewnienie dostępnej diagnostyki w czasie pandemii COVID-1911,12,13.
Poniższy protokół opisuje opracowanie i walidację bezkomórkowego, papierowego testu opartego na syntetycznym przełączniku toehold do wykrywania wirusa Zika, od projektowania biosensora in silico, przez etapy montażu i optymalizacji, aż po walidację w terenie z wykorzystaniem próbek od pacjentów. Protokół rozpoczyna się od projektu in silico czujników opartych na przełączniku toehold RNA oraz starterów do amplifikacji izotermicznej specyficznych dla RNA wirusa Zika. Chociaż istnieje wiele metod amplifikacji izotermicznej, tutaj zademonstrowano zastosowanie amplifikacji opartej na sekwencji kwasów nukleinowych (NASBA) w celu zwiększenia stężenia docelowego RNA wirusa obecnego w reakcji, co pozwoliło na osiągnięcie istotnej klinicznie czułości. W praktyce metody amplifikacji izotermicznej mają tę zaletę, że działają w stałej temperaturze, co eliminuje potrzebę stosowania specjalistycznego sprzętu, takiego jak termocyklery, które zazwyczaj są dostępne jedynie w ośrodkach centralnych.
Następnie opisano proces składania syntetycznych sensorów przełącznikowych typu toehold z sekwencjami kodującymi białka raportowe za pomocą PCR z przedłużeniem nakładającym (overlap extension PCR) oraz przesiewanie syntetycznych sensorów przełącznikowych w celu uzyskania optymalnej wydajności w systemach bezkomórkowych z wykorzystaniem syntetycznego RNA. Dla tego zestawu sensorów wirusa Zika wybrano gen lacZ kodujący enzym β-galaktozydazę, który jest w stanie rozszczepić kolorymetryczny substrat, chlorofenolowy czerwony-β-D-galaktopiranozyd (CPRG), wywołując zmianę barwy z żółtej na purpurową, którą można wykryć wzrokowo lub za pomocą czytnika płytek. Po zidentyfikowaniu najlepiej działających syntetycznych przełączników opisano proces przesiewania starterów do izotermicznej amplifikacji kwasów nukleinowych odpowiadającej sekwencji docelowej z wykorzystaniem syntetycznego RNA w celu znalezienia zestawów zapewniających najlepszą czułość.
Wreszcie, działanie platformy diagnostycznej zostaje zwalidowane w warunkach terenowych w Ameryce Łacińskiej (Rysunek 1). Aby określić dokładność diagnostyki klinicznej, przeprowadzono bezkomórkowy test na podłożu papierowym z wykorzystaniem próbek wirusa Zika pobranych od pacjentów; równolegle, w celu porównania, wykonano złotym standardem test RT-qPCR. Aby monitorować kolorymetryczne testy bezkomórkowe, umożliwiamy ilościowe określanie wyników w regionach, w których nie ma dostępu do termocyklerów. Przedstawiono również montowany ręcznie czytnik płytek o nazwie Portable, Low-Cost, User-friendly, Multimodal (PLUM; dalej określany jako przenośny czytnik płytek)24. Przenośny czytnik płytek, opracowany początkowo jako urządzenie towarzyszące diagnostyce opartej na bezkomórkowych syntetycznych przełącznikach typu toehold, oferuje przystępny sposób inkubacji i odczytu wyników w sposób wysokoprzepustowy, zapewniając użytkownikom zintegrowaną analizę oprogramowania opartą na komputerowym przetwarzaniu obrazu.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig1v9.jpg" /> 
Rycina 1: Schemat postępowania podczas testowania próbek pacjentów z wykorzystaniem papierowych reakcji przełącznika toehold bezkomórkowego.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig1v8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>Pokrywy płytek 384-dołkowych -</td><td>aluminiowe Sarstedt</td><td>95.1995</td><td>Służą do zakrywania płytek 384-dołkowych przed ich włożeniem do czytnika PLUM</td></tr><tr><td>Pokrywy płytek 384-dołkowych - przezroczyste</td><td>Sarstedt</td><td>95.1994</td><td>Służą do zakrywania płytek 384-dołkowych przed ich włożeniem do czytnika płytek BioTek</td></tr><tr><td>Płytki 384-dołkowe</td><td>VWR</td><td>CA11006-180</td><td>Diagnostyka papierowa o średnicy 2 mm jest umieszczana w studzienkach tych płytek w celu ilościowego określenia</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioShop Canada</td><td>AGA001.500</td><td>Elektroforeza żelowa</td></tr><tr><td>BSA</td><td>BioShop Canada</td><td>ALB001.500</td><td>Środek blokujący do bibuły filtracyjnej Whatman</td></tr><tr><td>Reakcje bezkomórkowe</td><td>New England Biolabs</td><td>E6800L</td><td>PURExpress</td></tr><tr><td>CPRG</td><td>Roche</td><td>10884308001</td><td>Chlorofenol red-b-D-galaktopiranozyd</td></tr><tr><td>Jednorazowe sterylne stemple do biopsji</td><td>Integra Miltex</td><td>23233-31</td><td>Służy do tworzenia 2 mm krążków papierowych, które mieszczą się w 384-dołkowej płytce</td></tr><tr><td>DNAza I</td><td>Thermo Scientific</td><td>K2981</td><td>Trawi matrycę DNA po inkubacji reakcji transkrypcji in vitro</td></tr><tr><td>Zestaw DNAse I</td><td>Thermo Scientific</td><td>74104</td><td>DNase I Kit Do usuwania matrycowego DNA z RNA IVT</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td>Używany do</td></tr><tr><td>systemu elektroforezy</td> PCR <td>Bio-Rad</td><td>1704487</td><td>Służy do uruchamiania żeli agarozowych</td></tr><tr><td>Stacja obrazowania</td><td>żeli Bio-Rad</td><td>1708265</td><td>ChemiDoc XRS+ Zestaw do obrazowania</td></tr><tr><td>IVT</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td>Używany do transkrypcji in vitro matrycy (wyzwalacza) RNA do przesiewania przełącznika</td></tr><tr><td>Nanodrop One</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td>Służy do oznaczania stężeń kwasów nukleinowych</td></tr><tr><td>Zestaw NASBA</td><td>Nauki przyrodnicze Zaawansowane technologie</td><td>NWK-1</td><td>Składniki reakcji amplifikacji izotermicznej</td></tr><tr><td>Invitrogen</td><td>H20 bez nukleaz</td><td></td><td>10977015 Dodawany do mieszanin reakcyjnych</td></tr><tr><td>System elektroforezy PAGE</td><td>Biorad</td><td>1658001FC</td><td>Służy do odlewania i uruchamiania żeli poliakrylamidowych</td></tr><tr><td>pCOLADuet-LacZ DNA</td><td>Addgene</td><td>75006</td><td>https://www.addgene.org/75006/</td></tr> <tr><td>Bufor polimerazy/reaktioiny Phusion</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td>Używany do PCR</td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>BioTek</td><td>BioTek NEO2</td><td>Multi Mode Plate, Synergy</td></tr><tr><td>Neo2 Primers</td><td>Zintegrowane technologie</td><td></td> DNA <td>Niestandardowa synteza oligo</td></tr><tr><td>Polimeraza Q5/ Bufor reakcyjny</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491L</td><td>Używany do PCR</td></tr><tr><td>Qiagen PCR Puriifcation Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td>QIAprep Spin Miniprep</td></tr><tr><td>Kit Barwnik ładujący RNA</td><td>New England Biolabs</td><td>B0363S</td><td>2X Barwnik ładujący RNA</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania RNA</td><td>QIAGEN</td><td>EN0521</td><td>QIAamp Zestaw do ekstrakcji wirusowego</td></tr><tr><td>RNA Inhibitor RNazy</td><td>New England Biolabs</td><td>M0314S</td><td>Służy do zapobiegania zanieczyszczeniu RNaz A, B i C</td></tr><tr><td>Zestaw RT-qPCR</td><td>QIAGEN</td><td>208352</td><td>Sonda QuantiNova Zestaw RT-PCR</td></tr><tr><td>SYBR Gold</td><td>Invitrogen S11494</td><td>S11494</td><td>PAGE barwnik żelowy do kwasów nukleinowych</td></tr><tr><td>TAE</td><td>Buffer Kanada</td><td>TAE222.4</td><td>Żelowy bufor do elektroforezy</td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>4484073</td><td>Służy do cyklicznych zmian temperatury i reakcji inkubacyjnych</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman 42</td><td>GE Healthcare</td><td>1442-042</td><td>Służy do osadzania komponentów molekularnych do diagnostyki papierowej</td></tr></tbody></table>

badanie projektowe i wdrożeniowe w celu opracowania i walidacji pacjenta w papierowej diagnostyce przełącznika toehold

Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics

Dostęp do niskoobciążającej diagnostyki molekularnej, która może być wykorzystana w społeczności do testowania, jest coraz ważniejszy i ma znaczące, szersze implikacje dla dobrobytu społeczeństw i stabilności ekonomicznej. W ostatnich latach pojawiło się kilka nowych izotermicznych metod diagnostycznych, które zaspokajają zapotrzebowanie na szybką i tanią diagnostykę molekularną. Przyczyniliśmy się do tego wysiłku poprzez opracowanie i walidację przez pacjentów diagnostyki opartej na przełączniku toehold, w tym diagnostyki wirusów Zika i chikungunya przenoszonych przez komary, które zapewniły wydajność porównywalną ze złotym standardem testów opartych na ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR). Te diagnostyki są niedrogie w opracowywaniu i produkcji, a także mają potencjał, aby zapewnić możliwości diagnostyczne w środowiskach o niskich zasobach. W tym przypadku protokół zapewnia wszystkie kroki niezbędne do opracowania testu opartego na przełącznikach do wykrywania wirusa Zika. Artykuł przeprowadza czytelnika przez etapowy proces rozwoju diagnostyki. Po pierwsze, sekwencje genomowe wirusa Zika służą jako dane wejściowe do projektowania obliczeniowego potencjalnych przełączników przy użyciu oprogramowania typu open source. Następnie przedstawiono montaż czujników do badań empirycznych z syntetycznymi sekwencjami RNA oraz optymalizację czułości diagnostycznej. Po zakończeniu walidacji przeprowadza się na próbkach od pacjentów równolegle z RT-qPCR i specjalnie zaprojektowanym czytnikiem optycznym PLUM. Prace te stanowią techniczną mapę drogową dla naukowców w zakresie opracowania tanich czujników opartych na przełącznikach do zastosowań w zdrowiu ludzkim, rolnictwie i monitorowaniu środowiska.

Zgodnie z potokiem projektowania komputerowego, konstrukcja trzech przełączników typu toehold została przeprowadzona za pomocą PCR. Produkty PCR przeanalizowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (Rycina 2). Obecność wyraźnego prążka w okolicach 3 000 bp, co odpowiada mniej więcej wielkości genu lacZ sprzęgniętego z przełącznikiem toehold, zazwyczaj wskazuje na prawidłowy przebieg reakcji. Z kolei brak prążka w ścieżce, obecność wielu prążków lub prążka o niewłaściwej wielkości świadczy o niepowodzeniu reakcji PCR. W przypadku nieudanego PCR należy zoptymalizować warunki reakcji i/lub sekwencje starterów.
Zmontowane przełączniki typu toehold poddano przesiewowi, aby ocenić każdy sensor względem odpowiadającego mu transkrybowanego in vitro trigger RNA (Rycyna 3). Choć wszystkie trzy sensory wykazały zwiększoną absorbancję OD570, przełącznik&#160;27B (Rycina 3A) charakteryzował się najszybszą szybkością aktywacji. Przełączniki 33B oraz, w mniejszym stopniu, 47B wykazały zwiększoną absorbancję OD570 w przypadku braku docelowego trigger RNA, co wskazuje, że przełączniki te posiadają pewną aktywność tła lub nieszczelność (Rycina 3B,C) – cechę niepożądaną w potencjalnym sensorze, ponieważ może ona obniżyć specyficzność. Aby dokładniej zidentyfikować sensor o najwyższym stosunku sygnału ON/OFF, obliczono krotność zmiany absorbancji OD570 (patrz sekcja 5 informacji uzupełniających) i przedstawiono ją na wykresie (Rycina 4). Z tej analizy jasno wynika, że przełącznik 27B jest sensorem o najlepszych parametrach, ze stosunkiem ON/OFF&#160;wynoszącym około 60.
Następnie oceniono czułość najlepiej działającego przełącznika toehold (27B), wyznaczając najniższe stężenie RNA wymagane do aktywacji przełącznika toehold&#160;w połączeniu z reakcją NASBA. Wykres pokazuje, że najskuteczniejsze sensory Zika mogą wykrywać RNA przy stężeniach tak niskich jak 1,24 cząsteczki na µL (co odpowiada ok. 2 aM; Rycina 5).
Po zidentyfikowaniu i walidacji przełącznika 27B, materiały sensorowe zostały przekazane członkom zespołu w Recife w stanie Pernambuco w Brazylii. W Brazylii oceniono kliniczną dokładność diagnostyczną platformy diagnostycznej wirusa Zika z wykorzystaniem próbek pobranych od pacjentów zakażonych wirusem Zika, równolegle z testem RT-qPCR w celu porównania wyników. Aby zwalidować papierową platformę diagnostyczną wirusa Zika, zastosowano przenośny czytnik płytek, który umożliwia inkubację oraz odczyt sygnału kolorymetrycznego sensorów papierowych. Zmiana barwy z żółtej na purpurową służy do identyfikacji próbki dodatniej, podczas gdy próbka ujemna pozostaje żółta (Rysunek 6). Dodatkową opcją wizualizacji wyników generowanych przez przenośny czytnik płytek (Rysunek 8) jest wykreślenie odpowiedzi kolorymetrycznej dla każdej reakcji na podłożu papierowym w funkcji czasu. Próbki badano w trzech powtórzeniach; te, które przekroczyły próg (czerwona linia ustawiona na 1), uznano za dodatnie, natomiast próbki poniżej progu uznano za ujemne (Rysunek 6 oraz Rysunek 7).
Na koniec, aby ocenić i porównać wydajność kliniczną sensora opartego na przełączniku toehold dla wirusa Zika z obecną złotą normą diagnostyki zakażeń tym wirusem, wszystkie próbki pacjentów przebadano równolegle metodą RT-qPCR. Wykres amplifikacji dwóch reprezentatywnych próbek pacjentów został wykonany w trzech powtórzeniach w celu wykrycia wirusa Zika za pomocą RT-qPCR (Rysunek 9). Próbki uznaje się za pozytywne, gdy wartość progu cyklu (Ct) wynosi ≤38; czerwona linia oznacza próbkę pozytywną, a niebieska linia próbkę negatywną pod kątem obecności wirusa Zika.
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig2v6.jpg" /> 
Rysunek 2: Elektroforeza w żelu agarozowym w celu oceny jakości produktów PCR. Produkty PCR są analizowane w 1% żelu agarozowym w 1X TAE, przy napięciu 80 V przez 90 min. Pojedynczy wyraźny prążek zazwyczaj wskazuje na prawidłowy przebieg reakcji. Ścieżka 1: drabina DNA 1 kb; ścieżki 2-4: odpowiednio DNA przełącznika 27B, DNA wyzwalacza 33B i DNA wyzwalacza 47B. Liczby po lewej stronie reprezentują wielkość prążka w bp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6.jpg" /> 
Rysunek 3: Prototypowanie trzech przełączników typu toehold dla papierowych czujników wirusa Zika. Wydajność trzech papierowych czujników opartych na RNA toehold switch mierzono w 37 °C przez ponad 130 min. Każny wykres zawiera dwa ślady: jeden reprezentuje kontrolę z samym przełącznikiem, a drugi przełącznik wraz z wyzwalaczem. Trzy wykresy przedstawiają dane uzyskane przy użyciu czujników toehold switch 27B (A), 33B (B) oraz 47B (C). Słupki błędów reprezentują standardowy błąd średniej (SEM) z trzech powtórzeń. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig04v7.jpg" /> 
Rysunek 4: Najskuteczniejsze sensory zostają zidentyfikowane poprzez obliczenie krotności zmiany absorbancji przy 570 nm. Krotność zmiany (lub maksymalny stosunek ON/OFF) jest obliczana poprzez pomiar stosunku absorbancji (OD570) w 130 min między kontrolą zawierającą tylko przełącznik a testem CFPS z przełącznikiem i wyzwalaczem. Słupki błędu reprezentują SEM z trzech powtórzeń. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig4v8large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig05v7.jpg" /> 
Rysunek 5: Ocena czułości najlepiej działającego przełącznika. In vitro transkrybowane RNA wirusa Zika jest miareczkowane do reakcji NASBA. Po 1 h inkubacji reakcje dodano do bezkomórkowych reakcji PURExpress na dyskach papierowych w stosunku 1:7. Wykreślono krotność zmiany po 130 min w 37 °C. Rysunek ten został powielony&#160;z24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig05v4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig6v9.jpg" /> 
Rysunek 6: Strona przechwytywania danych przenośnego czytnika płytek z załadowanym obrazem danych. Na tym rysunku przedstawiono przykładowy obraz końcowy zarejestrowany przez przenośny czytnik płytek podczas serii gromadzenia danych. Oryginalna sygnatura daty i godziny jest widoczna w górnej części obrazu. Kolor żółty oznacza reakcje kontrolne lub negatywne, a kolor fioletowy oznacza reakcję pozytywną. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig6v8large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig7v9.jpg" /> 
Rysunek 7: Tryb analizy danych. Po lewej stronie użytkownicy wybierają zestawy danych, które chcą wykreślić; następnie po prawej stronie wyświetlane są wykresy z unikalnymi kolorami dla każdej próbki lub zestawu kontrolnego. Czerwona przerywana linia służy jako próg wyznaczania próbek pozytywnych i negatywnych. Próbki badane w trzech powtórzeniach, które przekraczają próg, uznaje się za pozytywne, natomiast próbki poniżej progu uznaje się za negatywne. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe (SD) z trzech powtórzeń. Ctrl 1 do Ctrl 5 oznacza kontrole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig7v8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8.jpg" /> 
Rysunek 8. PLUM, przenośny czytnik płytek. Ten&#160;przenośny czytnik płytek pełni funkcję przenośnego laboratorium i służy jako czytnik płytek z kontrolą temperatury do inkubacji i monitorowania reakcji kolorymetrycznych. To przenośne urządzenie umożliwia ilościowe i wysokoprzepustowe pomiary papierowych sensorów wirusa Zika bezpośrednio w miejscu badania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig9v9.jpg" /> 
Rysunek 9: Wykres RT-qPCR amplifikacji dwóch próbek pacjentów przebadanych w trzech powtórzeniach w celu wykrycia wirusa Zika. Próbki uznaje się za dodatnie, gdy wartość progu cyklu (Ct) wynosi ≤38. Czerwona przerywana linia służy jako próg wyznaczania próbek dodatnich i ujemnych. Czerwka krzywa oznacza próbkę dodatnią, a niebieska krzywa oznacza próbkę ujemną. Wartość ΔRn (delta Rn) reprezentuje znormalizowaną wielkość sygnału fluorescencji wykrytego przez urządzenie RT-qPCR dla wszystkich badanych próbek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig9v8large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Uzupełniający plik z protokołem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplementary_protocol_R2_RE_KJ.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Ryciny uzupełniające.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplemental_Figures.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać te&#160;ryciny.</a>

Dostęp do zdecentralizowanej, taniej i wydajnej diagnostyki, która może być wdrożona w społeczności do zdecentralizowanych testów, jest kluczowy dla walki z globalnymi kryzysami zdrowotnymi. W tym manuskrypcie opisano, jak zbudować papierową diagnostykę sekwencji wirusowego RNA, które można wykryć za pomocą przenośnego czytnika optycznego.

Badanie projektowe i wdrożeniowe w celu opracowania i walidacji pacjenta w papierowej diagnostyce przełącznika Toehold

Access to low-burden molecular diagnostics that can be deployed into the community for testing is increasingly important and has meaningful wider ...

Nasz protokół opisuje projektowanie, montaż i walidację diagnostyki opartej na obwodach genowych. Ta papierowa diagnostyka molekularna jest tania i czuła, jest w stanie wykryć klinicznie istotne stężenia kwasów nukleinowych i może być zaprojektowana do wykrywania praktycznie dowolnej sekwencji. Jest to technologia platformy, która może być zaprojektowana przez użytkowników zgodnie z ich potrzebami i ma potencjał, aby wprowadzić diagnostykę klasy klinicznej do bardziej zdecentralizowanych zasobów stomatologicznych.Bezkomórkowy czujnik przełącznika palcowego może być zaprojektowany dla praktycznie każdego celu opartego na kwasach nukleinowych. Ostatnie prace wykazały bezkomórkową diagnostykę wirusa Ebola, norowirusa, SARS-CoV-2, C.difficile i bakterii wywołujących dur brzuszny. Procedurę zademonstrują Severino Jefferson Rivero da Silva, doktor habilitowany, oraz Pouriya Bayat, doktorant z mojego laboratorium.Aby zaprojektować przełącznik toehold, zidentyfikuj sekwencje docelowe z genomu wirusa Zika i wybierz sekwencje docelowe wirusa Zika z amplikonów zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Pobierz pakiet oprogramowania do projektowania przełączników toehold. Otwórz MATLAB i przejdź do folderu oprogramowania do projektowania.Wprowadź sekwencje docelowe do pliku csv pliku wejściowego projektu znajdującego się w podfolderze wejściowym. Wybierz parametry, które mają być używane dla funkcji obliczeniowej. Uruchom funkcję projektowania, aby wygenerować projekty przełączników zaczepu dla interesujących Cię celów.Po zakończeniu przejdź do folderu final_designs i znajdź sekwencje projektowe przełącznika górnego uchwytu u nogi oraz odpowiadające im sekwencje docelowe w arkuszach kalkulacyjnych w formacie csv. Upewnij się, że sekwencje DNA przełącznika palca wygenerowane przez algorytm zawierają sekwencje promotora T7 na pięciu głównych końcach i konserwatywną sekwencję łącznika 21 nukleotydów na trzech głównych końcach. Użyj NCBI BLAST, aby przeskanować sekwencje konstrukcyjne przełącznika górnego palca pod kątem innych popularnych wirusów, sprawdzając homologię sekwencji.Akceptuj sekwencje z hemologią mniejszą niż 40%. Przygotować roztwory oligonukleotydów DNA przełącznika do włosów i starterów do odwróconej amplifikacji o stężeniu 10 mikromolów w wodzie wolnej od nukleaz. Zebrać reakcje w probówkach PCR na lodzie zgodnie z tą tabelą.Umieść probówki reakcyjne w termocyklerze, postępując zgodnie z warunkami cykliczności wymienionymi w tej tabeli. Przeanalizuj produkty PCR na żelu agarozowym. Oczyść produkty PCR i eluuj DNA w minimalnej objętości wody wolnej od nukleaz, aby zapewnić wystarczająco wysokie stężenie.Określić ilościowo DNA za pomocą spektrofotometru. Przygotować roztwór podstawowy CPRG, rozpuszczając 25 miligramów proszku w jednym mililitrze wody wolnej od nukleaz. Przygotuj mieszankę wzorcową na lodzie zgodnie ze standardowym protokołem przedstawionym tutaj.Dozuj bezkomórkową mieszankę wzorcową do probówek PCR. W przypadku kontroli bezkomórkowej i sterowania z samymi przełącznikami, dodaj wodę wolną od nukleaz do objętości 5.94 mikrolitrów. A do reakcji dodaj oczyszczone DNA przełącznika PCR, aby uzyskać końcowe stężenie 33 nanomolowców.Aby przetestować kombinację przełącznika palcowego i docelowego RNA, dodaj transkrybowany in vitro docelowy RNA do końcowego stężenia jednego mikromola. Dokładnie wymieszać wszystkie reakcje, pipetując i krótko odwirowując. Na czarnej, przezroczystej płytce 384-dołkowej z przezroczystym dnem dodaj 30 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do studzienek otaczających dołki reakcyjne.Następnie za pomocą dwumilimetrowego stemple biopsyjnego i pęsety przeciąć zablokowane krążki z bibuły filtracyjnej BSA i umieścić je w studzienkach reakcyjnych. Dozować 1,8 mikrolitra z każdej probówki reakcyjnej na krążki z bibuły filtracyjnej w 384-dołkowej płytce w trzech egzemplarzach. Przykryj płytkę przezroczystą folią PCR i umieść ją w czytniku płytek.Mierz absorbancję przy 570 nanometrach w temperaturze 37 stopni Celsjusza co minutę przez 130 minut. Przygotuj 25-mikromolowy roztwór podstawowy wszystkich zestawów starterów do przodu i do tyłu w wodzie wolnej od nukleaz. Ustaw reakcję o pojemności pięciu mikrolitrów, używając pokazanej tutaj mieszanki głównej.Mieszać pipetując, aż biały osad się rozpuszczony, a następnie przelać do probówek do PCR. Dodaj startery do przodu i do tyłu do odpowiednich probówek, a następnie dodaj jeden mikrolitr wody wolnej od nukleaz lub dwa picomolar docelowego RNA wyzwalającego. Wymieszać delikatnie pipetując i krótko odwirować probówki.Ustaw protokół inkubacji na termocyklerze, jak pokazano tutaj. Po 12 minutach wyjmij probówki i dodaj 1,25 mikrolitra mieszanki enzymów do każdej probówki, a następnie wymieszaj i odwiruj. Zwróć probówki do termocyklera po pominięciu kroku utrzymywania 41 stopni Celsjusza, aby rozpocząć jednogodzinną inkubację reakcji.Następnie, aby ocenić wydajność startera, zmontuj papierowe, bezkomórkowe reakcje przełącznika palcowego i przeanalizuj dane. W celu analizy wrażliwości zidentyfikuj kandydujące pary starterów i przygotuj seryjne rozcieńczenia docelowego RNA w wodzie wolnej od nukleaz. Powtórzyć reakcje NASBA i bezkomórkowe z wybranymi zestawami starterów w biologicznych trzech egzemplarzach.Używając jednego mikrolitra wyekstrahowanego RNA pacjenta, przeprowadź amplifikację NASBA i reakcje bezkomórkowe na papierze, jak pokazano w sekcji piątej. Po reakcjach przygotuj 384-dołkową płytkę reakcyjną i uruchom test w przenośnym czytniku płytek w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie zmontuj komponenty RT-qPCR i dodaj odczynniki do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej zgodnie z tą tabelą.Wymieszać reakcję przez pipetowanie. Dozować 6,5 mikrolitra do każdej studzienki 96-dołkowej lub 384-dołkowej płytki PCR, a następnie 3,5 mikrolitra każdej matrycy RNA w trzech egzemplarzach. Umieść folię PCR na wierzchu płytki.Odwirować 384-dołkową płytkę o temperaturze 600 razy G przez dwie minuty. Umieść płytkę w maszynie RT-qPCR i uruchom warunki cykliczne, jak pokazano tutaj. Zgodnie z projektem obliczeniowym skonstruowano trzy przełączniki palcowe i przeanalizowano je za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.Pasma około 3 000 par zasad wskazywała na udaną reakcję. Przełączniki palcowe oceniano pod kątem ich odpowiednich RNA wyzwalającego transkrybowanego in vitro. Podczas gdy wszystkie trzy czujniki wykazywały wzrost absorbancji, czujnik 27B miał najszybszą szybkość włączania, podczas gdy przełączniki 33B i 47B miały niższy współczynnik włączania/wyłączania, wskazujący na aktywność tła i zmniejszoną swoistość.Krotna zmiana absorbancji przy 570 nanometrach wykazała, że przełącznik 27B ma najlepszą wydajność przy stosunku sygnału włącz/wyłącz. Co więcej, w połączeniu z NASBA może wykrywać RNA w stężeniach tak niskich, jak 124 cząsteczki na mikrolitr, co wskazuje na wysoką czułość. Próbki pobrane od pacjentów z wirusem Zika z Brazylii zostały przetestowane w celu oceny klinicznej dokładności diagnostycznej czujników za pomocą przenośnego czytnika płytek.Zmiana koloru z żółtego na fioletowy zidentyfikowała pozytywną próbkę. Odpowiedź kolorymetryczna dla każdej reakcji na papierze została wykreślona w czasie przez zintegrowane oprogramowanie na przenośnym czytniku płytek PLUM. Próbki, które przekroczyły próg, zostały uznane za pozytywne.Skuteczność kliniczną czujnika ustalono w porównaniu z RT-qPCR. Próbki uznano za dodatnie, gdy wartość progowa cyklu była równa lub mniejsza niż 38. Ważne jest, aby upewnić się, że wyniki z ekranów przełącznika toehold i czułości startera NASBA są powtarzalne i zoptymalizowane przed przystąpieniem do badań z udziałem pacjentów.Ze względu na swoją prostotę i możliwości adaptacji, opisana tutaj platforma diagnostyczna utorowała drogę do opracowania nowych narzędzi przyłóżkowych, które mogą przynieść korzyści systemowi opieki zdrowotnej, zwłaszcza krajom o niskich dochodach.

design-to-implementation-study-for-development-patient-validation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy sterowane komputerowo urządzenie do badania zmysłu dotyku: Tactile Automated Passive-finger Stimulator (TAPS). Przedstawiamy komponenty TAPS oraz pokazujemy, w jaki sposób urządzenie TAPS jest wykorzystywane do przeprowadzania testu orientacji kratki dotykowej w metodzie wymuszonego wyboru z dwóch interwałów.

Taktylny automatyczny stymulator palców pasywnych (TAPS)

Platforma mikroprzepływowego biosensoru została zaprojektowana i wykonana przy użyciu taniej technologii fotorezystu z suchą folią do szybkiej i czułej kwantyfikacji różnych analitów. Ten jednorazowy system pozwala na elektrochemiczny odczyt testów enzymatycznych immobilizowanych na chipie za pomocą techniki stop-flow.

Elektrochemiczna platforma biosensorów mikroprzepływowych oparta na suchym filmie fotorezystu: produkcja urządzenia, przygotowanie testu na chipie i obsługa systemu

Tutaj prezentujemy protokół do opracowania skomputeryzowanego adaptacyjnego systemu testowania funkcjonalnej oceny udaru mózgu (CAT-FAS). CAT-FAS może jednocześnie oceniać cztery funkcje (dwie funkcje motoryczne [kończyny górne i dolne], kontrolę postawy i podstawowe czynności życia codziennego) z wystarczającą niezawodnością i wydajnością administracyjną.

Komputerowy System Testowania Adaptacyjnego Oceny Funkcjonalnej Udaru Mózgu

Celem tego badania jest ustalenie pozycji internetowej edukacji komputerowej jako narzędzia do przygotowania pacjenta przed kolonoskopią. Edukacja komputerowa jest porównywana ze standardem opieki, poradnictwem pielęgniarskim, oceną endoskopowych wskaźników jakości i miarami wyników związanych z pacjentem.

E-Patient Counseling Trial (E-PACO): Edukacja komputerowa a poradnictwo pielęgniarskie dla pacjentów w celu przygotowania się do kolonoskopii

Prezentowany protokół integruje różne metody oceny i demonstruje metodę oceny projektu klawiatury na smartfonach. Pary dopasowane znakami angielskimi są proponowane jako materiał wejściowy, a czas przejścia między dwoma kluczami jest używany jako zmienna zależna.

Metoda oceny i zestaw narzędzi do oceny projektu klawiatury w smartfonach

Naszym celem było dostarczenie zaktualizowanego, łatwego do zrozumienia przewodnika na temat produkcji i testowania elektrod do elektromiografii epimysalnej. W tym celu udostępniamy instrukcje dotyczące pozyskiwania materiałów oraz szczegółowy przewodnik po procesie produkcji i testowania.

Opracowanie taniej elektrody do elektromiografii epimysjalnej: uproszczony przepływ pracy przy produkcji i testowaniu

Zaprojektowano cykliczny bioreaktor ciśnieniowy, który umożliwia poddawanie tkanki zastawek serca fizjologicznym oraz patologicznym warunkom ciśnieniowym. Program LabVIEW pozwala użytkownikom na kontrolowanie wartości, amplitudy oraz częstotliwości ciśnienia. Urządzenie to może być wykorzystywane do badania mechanobiologii tkanki zastawek serca lub izolowanych komórek.

Projekt cyklicznego bioreaktora ciśnieniowego do badań ex vivo zastawek tętniczych serca

Opisujemy podejście do projektowania eksperymentów, które może być użyte do określenia i modelowania wpływu elementów regulatorowych transgenu, parametrów wzrostu i rozwoju roślin oraz warunków inkubacji na przejściową ekspresję przeciwciał monoklonalnych i białek reporterowych w roślinach.

Charakterystyka układów złożonych z wykorzystaniem podejścia Design of Experiments: przejściowa ekspresja białek w tytoniu jako studium przypadku

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV), małych błoniastych cząsteczek uwalnianych z komórek, z zaledwie 10 μl próbek surowicy. Takie podejście pozwala obejść potrzebę ultrawirowania, wymaga tylko kilku minut czasu na oznaczenie i umożliwia izolację EV od próbek o ograniczonej objętości.

Papierowe urządzenia do izolacji i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Tutaj prezentowany jest zautomatyzowany przepływ pracy do wykonywania modułowego montażu "urządzenia" DNA przy użyciu modułowej metody klonowania DNA na robotach obsługujących ciecze. Protokół wykorzystuje intuicyjne narzędzie programowe do generowania list wyboru osób zajmujących się cieczami do kombinatorycznego generowania biblioteki urządzeń DNA, które demonstrujemy za pomocą dwóch platform do obsługi cieczy.

Zautomatyzowany zrobotyzowany montaż modułowych urządzeń DNA do obsługi cieczy

Poznaj projektowanie i walidację papierowej diagnostyki molekularnej wykorzystującej czujniki toehold switch do wykrywania RNA wirusowego. Ta metoda umożliwia szybką i niedrogą detekcję w zdecentralizowanych warunkach.

Badanie projektowe i wdrożeniowe w celu opracowania i walidacji pacjenta w papierowej diagnostyce przełącznika Toehold

Przeglądaj więcej filmów