Izolacja i charakterystyka nienaruszonego fikobilisomu u cyjanobakterii

Jest to prosty i szybki protokół, który pozwala osobom niezaznajomionym z sinicami na łatwe wyizolowanie fikobilisomu. Zaletą tej techniki jest to, że jest dostosowana do małej skali i jest łatwa do wykonania. Jest to prosta, niezawodna i wydajna metoda izolowania nienaruszonych fikobilisomów cynobakterii modelowych i niemodelowych.

Zacznij od przeniesienia kultury komórkowej o stężeniu 0,8 OD o długości 750 nanometrów do kolby o pojemności jednego litra i rozcieńcz ją w 500 mililitrach pożywki B-HEPES, aby osiągnąć OD 0,2 przy 750 nanometrach. Hoduj kulturę, stale mieszając w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż OD osiągnie 0,8 do 1, co wskazuje na późną fazę wzrostu wykładniczego. Odwirować kulturę z prędkością 10 000 razy g przez 20 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant.

Zawiesić osady komórkowe i dwukrotnie przepłukać 0,75 molowym buforem fosforanu potasu, pH siedem. Osadzaj komórki w 50-mililitrowej probówce wirówkowej przez odcentrowanie w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki 0,75 molowym buforem fosforanu potasu.

Zmierzyć mokrą masę granulatu za pomocą wagi elektronicznej i ponownie zawiesić jeden gram mokrej masy osadu w pięciu mililitrach bufora. Dodaj jeden mililitr zawiesiny komórkowej i 0,4 do 0,6 grama szklanych kulek o średnicy 0,1 milimetra do dwumililitrowej fiolki z zakrętką. Rozbijaj komórki na 30 sekund za pomocą ubijaka do koralików.

Pozostaw probówki do ostygnięcia w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Po lizie odwirować fiolki przez 10 sekund w temperaturze pokojowej z prędkością 500 razy g. Zebrać supernatant za pomocą pipety do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.

Umyj kulki 0,5 mililitra 0,75-molowego buforu fosforanu potasu jeden raz, a następnie przenieś do tej samej probówki wirówkowej. Dodać Triton X-100 do zawiesiny komórek zlizowanych i inkubować na wytrząsarce na kołyszącym się wytrząsarce w temperaturze pokojowej i 40 obr./min przez 20 minut lub do momentu, gdy roztwór stanie się jednorodny. Odwirować probówki przez 20 minut w temperaturze 17, 210 razy g i przechowywać supernatant bez górnej warstwy miceli Triton w temperaturze pokojowej przez okres do jednej godziny.

Przygotować cztery stężenia sacharozy w 0,75 molowym buforze fosforanu potasu przy pH siódmym. Umieścić 2,8 mililitra dwóch molowych sacharozy na dnie 40-mililitrowej probówki wirówkowej i nałożyć na nią trzy warstwy roztworów sacharozy. Na koniec dodać trzy mililitry PBS zawierającego frakcję supernatantu i odwirować powstałe gradienty.

Po ultracentracji skondensuj frakcjonowany PBS i fikobiliproteiny między warstwami i obserwuj niebieskie pasma w Syn6803 i interfejsach. Usunąć sacharozę poprzez wielokrotne zagęszczanie i rozcieńczanie frakcji 0,75 molowym buforem fosforanu potasu i membraną odśrodkowych jednostek filtrujących. Do pomiaru fluorescencji PBS rozcieńczyć zagęszczoną próbkę PBS 0,75 molowym buforem fosforanu potasu, aby uzyskać objętość do 500 mikrolitrów.

Dodać rozcieńczoną próbkę PBS do przezroczystej szklanej probówki i zamrozić probówkę w ciekłym azocie aż do całkowitego zamrożenia. Przenieś zamrożoną rurkę do przezroczystego pojemnika Dewara wstępnie napełnionego ciekłym azotem. Całkowita liza komórek pokazuje supernatant i ciemnoniebiesko-zielony kolor przed centryfikacją.

Separacja w gradiencie gęstości sacharozy izolowanego PBS pokazuje kilka frakcji zdysocjowanych fikobiliprotein, a najniższa frakcja reprezentuje nienaruszony PBS. Widma absorpcyjne ze zdysocjowanego i nienaruszonego PBS JSC one i Syn6803 mają ten sam pik przy 622 nanometrach, co odpowiada fikocyjaninowi. Co więcej, absorpcja fikoerytryny osiąga szczyt na 571 nanometrach zarówno w zdysocjowanym, jak i nienaruszonym PBS JSC-1.

Widma emisyjne zdysocjowanego PBS mają jeden silny pik o długości około 650 nanometrów w Syn6803 i JSC-1, reprezentujący emisję fikocyjaniny. Maksymalne piki emisji fluorescencji na 651 nanometrach i 684 nanometrach pokazują, że energia zebrana przez fikocyjaninę została efektywnie przekazana do allofikocyjaniny i końcowych emiterów, którymi są ApcD i ApcE, w rdzeniu. Rysunek przedstawia zabarwioną SDS-PAGE pod wpływem promieniowania UV, gdzie podjednostki fikobiliproteiny są silnie fluorescencyjne, a ApcE wykazywały słabą fluorescencję, oznaczoną strzałką.

Niebieskie barwienie Kumasi pokazuje, że górne frakcje zawierają inne białka rozpuszczalne w wodzie niebędące PBS, a nienaruszone PBS i Syn6803 wykazują wyraźne pasmo ApcE, oznaczone strzałką, pozbawione zdysocjowanych frakcji PBS. Ultrawirowanie wykazuje, że gradient sacharozy przygotowany w stosunku 1:3 wykazuje szersze pasma niż gradient wykonany w stosunku 1:10. Ważne jest, aby całkowicie zdać komórkę i solwenolizę supernatantów, aby uzyskać więcej fikobilisomów.

Inne metody, takie jak krio-EM lub spektrometria mieszana, mogą być stosowane do badania struktury białek lub składu białkowego fikobilisomów.