Name: Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Poznaj metody izolacji i charakteryzacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z sinic, w tym ultrafiltrację i ultrawirówkę z gradientem gęstości. Techniki te umożliwiają analizę próbek kulturowych i środowiskowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie Platform Naukowych i3S "Biointerfejsy i Nanotechnologia" oraz "Histologia i Mikroskopia Elektronowa", członka krajowej infrastruktury Portugalskiej Platformy Bioobrazowania (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122). Dziękujemy również prof. J. A. Gonzalez-Reyesowi (Uniwersytet w Kordobie, Hiszpania) za pomoc w optymalizacji protokołu barwienia ultracienkich przekrojów dla TEM oraz dr Cecílii Durães i dr Anie Ricie Pinto (Uniwersytet w Porto, Portugalia) za analizę śledzenia nanocząstek.
Ta praca została sfinansowana przez amerykańską Narodową Fundację Nauki (OCE-2049004 do SJB), przez Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) za pośrednictwem COMPETE 2020 Operacional Programme for Competitiveness and Internationalisation (POCI), Portugalia, 2020, oraz przez fundusze portugalskie przez Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior w ramach projektu POCI-01-0145-FEDER-029540 (PTDC/BIA-OUT/29540/2017 do PO). Fundação para a Ciência e a Tecnologia jest również bardzo ceniona za stypendium doktoranckie SFRH/BD/130478/2017 (SL) oraz grant dla badaczy FCT IF/00256/2015 (PO). M.C.M.-M. był wspierany przez indywidualne stypendium działania "Maria Skłodowska-Curie" (panel ds. reintegracji) w ramach programu ramowego "Horyzont 2020" (H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891).

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to kuliste struktury o średnicy od ~20 do 400 nm, uwalniane przez praktycznie wszystkie organizmy do otaczającego je środowiska1,2,3. Pęcherzyki są ograniczone dwuwarstwą lipidową i nie mogą się replikować. Uważa się, że u bakterii Gram-ujemnych struktury te powstają głównie w wyniku "pęcherzenia" małych porcji z błony zewnętrznej. Jeszcze inne procesy, w tym ruch wici, liza komórek i wydzielanie zarówno wewnętrznego, jak i zewnętrznego materiału błony, mogą również wytwarzać pęcherzyki4,5. EV mogą zawierać różne biomolekuły, w tym lipidy, białka rozpuszczalne i błonowe, kwasy nukleinowe i metabolity, i mogą transportować ten materiał między komórkami4,5,6. Biorąc pod uwagę te cechy, EV są badane w celu zrozumienia ich możliwych ról w szerokim zakresie procesów biologicznych, w tym komunikacji komórkowej, tworzeniu biofilmu, horyzontalnym transferze genów, dynamice gospodarz-i wymianie składników odżywczych4,6.
Cyjanobakterie to duża i zróżnicowana grupa bakterii Gram-ujemnych, w tym organizmy jednokomórkowe i nitkowate. Są one interesujące z wielu perspektyw, w tym ze względu na zrozumienie ich fizjologii i różnorodności7,8, krytyczne funkcje ekosystemu, którym służą9,10, oraz ich użyteczność dla biotechnologii11,12. Sinice występują w wielu różnych siedliskach, zarówno jako organizmy wolno żyjące w środowisku morskim, słodkowodnym i lądowym, jak i w symbiotycznych związkach z mchami, paprociami, roślinami lub w porostach i gąbkach13. Służą jako kluczowi pierwotni producenci w ekosystemach wodnych, produkując tlen i węgiel organiczny w procesie fotosyntezy tlenowej9,10, a niektóre są również zdolne do wiązania azotu atmosferycznego7. Sinice morskie i słodkowodne, w tym Prochlorococcus, Synechococcus i Synechocystis, wytwarzają EV w warunkach laboratoryjnych14,15,16, a pęcherzyki sinic można również znaleźć w naturalnym środowisku14,17. Biologiczne i ekologiczne funkcje pęcherzyków sinic nie są znane, ale dalsze badania w tej dziedzinie prawdopodobnie dostarczą nowych informacji na pytania dotyczące fizjologii sinic, różnicowania, strategii komunikacyjnych, ewolucji i interakcji troficznych. Ponadto zdolność sinicowych EV do przenoszenia różnych kategorii biomolekuł może mieć zastosowania komercyjne18,19.
Obecny protokół opisuje metody izolowania i charakteryzowania pęcherzyków z kultur cyjanobakterii i próbek terenowych, aby umożliwić i zachęcić do szerszego badania biologii pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic. Chociaż opisany tutaj przepływ pracy jest analogiczny do protokołów izolowania i charakteryzowania EV od innych bakterii, kultury cyjanobakterii i próbki terenowe zazwyczaj zawierają niższe stężenia komórek i pęcherzyków niż są powszechnie obserwowane w systemach modeli związanych z gospodarzem lub patogennych20,21,22. W związku z tym badania EV sinic wymagają specjalnych rozważań i optymalizacji w zakresie uprawy i izolacji pęcherzyków, które różnią się jeszcze bardziej w zależności od szczepu i podłoża. Ponieważ żaden pojedynczy protokół nie będzie działał równie dobrze dla wszystkich szczepów, warunków wzrostu i dalszych zastosowań, przedstawiamy wiele opcji i omawiamy związane z tym kompromisy, aby badacze mogli określić podejścia najbardziej odpowiednie do odpowiedzi na ich pytania eksperymentalne.

<table><tbody><tr><td>1x Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4</td><td>Domowy bufor</td> <td>---</td> <td>standardowy bufor do mycia/przechowywania, który może być stosowany z pęcherzykami; może być wykonany w laboratorium lub zakupiony komercyjnie</td></tr><tr><td>2% roztwór octanu uranylu</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>22400-2</td><td>Barwienie ujemne - TEM</td></tr><tr><td>4x Bufor do próbek Laemmli</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0747</td><td>Denaturacja próbki pęcherzyków przed proteolizą, wymagana do barwienia lipopolisacharydami (LPS)</td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra (100 kDa)</td><td>Merck</td><td>UFC9100XX</td><td>Alternatywna opcja dla ultrafiltracji odśrodkowej</td></tr><tr><td>Podłoże BG11 Domowe</td><td>podłoże</td><td>---</td><td>Podłoże do uprawy Synechocystis sp. PCC 6803</td></tr><tr><td>Carbon Support Film 200 Mesh, miedź. CF200-Cu</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>71150</td><td>Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)</td></tr><tr><td>siatka easiGlow System czyszczenia wyładowań jarzeniowych</td><td>Ted Pella</td><td>91000</td><td>Komercyjna siatka TEM wyładowcza żarowa</td></tr> żywica <tr><td>epoksydowa EMbed 812</td><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>Sciences 14120</td><td>Ultracienkie przekroje - TEM</td></tr><tr><td>Uchwyt filtra do systemu próżniowego</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>300-4000</td><td>Jednostki wielokrotnego użytku z płytami nośnymi membrany filtracyjnej</td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy&nbsp; Klasa I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882-10X1ml</td><td>Ultracienkie przekroje - TEM</td></tr><tr><td>HEPES [sól sodowa N-(2-hydroksyetylo)piperazyno-N&prime;-(kwasu 2-etanosulfonowego)]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006</td><td>Środek buforujący do pożywek wzrostowych sinic</td></tr><tr><td>Cytrynian ołowiu, trójwodzian</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>17800</td><td>Barwnik do stosowania w mikroskopii elektronowej</td></tr><tr><td>Urządzenia odśrodkowe Macrosep Advance z Membrana Omega 100K</td><td>Pall</td><td>MAP100C36</td><td>Do ultrafiltracji odśrodkowej próbek o małej objętości</td></tr><tr><td>Moduł Millipore Pellicon 3 TFF EMD</td><td>Millipore</td><td>XX42P0060 lub XX42P0080</td><td>Alternatywna opcja TFF do zagęszczania próbek o dużej objętości</td></tr><tr><td>Referencyjny system oczyszczania wody Milli-Q</td> System oczyszczania wody <td>Merck</td><td>Z00QSV0WW</td><td>do uzyskiwania ultraczystej wody typu I</td></tr><tr><td>NanoSight</td><td>Malvern Panalytical</td><td>LM14 lub NS300</td><td>Analiza śledzenia nanocząstek</td></tr><tr><td>Ultrawirówka Optima L80 XP Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>L80 XP</td><td>(lub podobny model)</td></tr><tr><td>OptiPrep / Iodixanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>Media gradientu gęstości</td></tr><tr><td>Odczynnik do tetratlenku osmu Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201030</td><td>Ultracienkie sekcje - TEM</td></tr><tr><td>Pall Centramate Uchwyt PE TFF Moduł</td><td>Pall Corporation</td><td>FS002K10</td><td>TFF dobry do zagęszczania 10s-100s L próbki; wymaga dodatkowych modułów filtrujących 30 lub 100 kDa do skalowania z szacowanymi objętościami</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna Masterflex L/S</td><td>Cole-Parmer</td><td>07559-07</td><td>Pompa do napędzania wielkogabarytowych modułów TFF</td></tr><tr><td>Frakcjonator tłokowy z gradientem</td><td>tłokowym Biocomp Instruments</td><td>152-001</td><td>Automatyczne frakcjonowanie w gradinie gęstości</td></tr><tr><td>Rurki poliwęglanowe do rotora 70 Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>355618</td><td>Probówki aluminiowe z poliwęglanu wielokrotnego użytku do ultrawirówek z zespołem nasadki</td></tr><tr><td>Pro99 medium Domowe</td><td>podłoże</td><td>---</td><td>Podłoże do uprawy Prochlorococcus</td></tr><tr><td>Pro-Q Szmaragdowy zestaw do barwienia żelowego LPS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P20495</td><td>Barwienie LPS</td></tr><tr><td>SN średnie</td><td>Podłoże domowej roboty</td><td>---</td><td>Podłoże do hodowli sinicowych szczepów morskich, takich jak Synechococcus</td></tr><tr><td>Trójwodny kakodylan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250-100G</td><td>Środek buforujący w przygotowaniu próbek pęcherzyków do</td></tr><tr><td>rotora kubełkowego wahliwego TEM SW32Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td>Wirnik ultrawirówkowy, mieści 6x probówki ~40 ml; dobry do granulowania materiałów sypkich</td></tr><tr><td>SW60Ti wahadłowy wirnik kubełkowy</td><td>Beckman Coulter</td><td>335650</td><td>Wirnik ultrawirówki, mieści 6x ~4,5 ml probówek; Dobry do oczyszczania gradientowego i końcowego płukania pęcherzyków</td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml Luer</td><td>BD Plastipak</td><td>303172</td><td>Do izolacji pęcherzyków i ładowania próbek do sprzętu do analizy śledzenia cząstek (NTA)</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy 0,2 i mikro; m</td><td>Pall Corporation</td><td>4602</td><td>Do izolacji pęcherzyków z kultur</td></tr><tr><td>TAPS [Kwas N-[tris(hydroksymetylo)metylo]-3-aminopropanosulfonowy]]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5130</td><td>Środek buforujący do pożywek wzrostowych sinic</td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>JEOL</td><td>JEM-1400</td><td>Lub podobny mikroskop</td></tr><tr><td>Typ 70 Ti Tytanowy wirnik o stałym kącie</td><td>Beckman Coulter</td><td>337922</td><td>Wirnik ultrawirówki, mieści 8x ~39 ml probówek; dobry do granulowania materiałów sypkich</td></tr><tr><td>Proteaza typu XIV z Streptomyces griseus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td>Enzym do proteolizy białek EVs, wymagany do barwienia LPS</td></tr><tr><td>Probówki UltraClear do rotora SW32Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td>Probówki do ultrawirówek jednorazowego użytku</td></tr><tr><td>Probówki UltraClear do rotora SW60Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>344062</td><td>Jednorazowego użytku Probówki ultrawirówkowe</td></tr><tr><td>Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC</td><td>RMC Produkty,&nbsp; Boeckeler Instruments</td><td>75501</td><td>Mikrotom do ultracienkich przekrojów - TEM</td></tr><tr><td>Uniwersalna wirówka 320 R</td><td>Hettich</td><td>Z654736</td><td>Ta lub inna podobna wirówka stołowa/stojąca ogólnego przeznaczenia może być używana do komórek granulujących</td></tr><tr><td>Aparat próżniowy</td><td>KNF Neuberger</td><td>N026.3 AT.18</td><td>Lub dowolna podobna pompa próżniowa i pułapka</td></tr><tr><td>Vivaflow 200 100 000 MWCO PES</td><td>Sartorius</td><td>VF20P4</td><td>Moduł TFF, dobry na 2-3L. Możesz podłączyć różne moduły, aby uzyskać większą głośność (rysunek 1).</td></tr><tr><td>Filtr kapsułkowy Whatman Polycap TC (0,2/0,2 i mikro; m)</td> <td>Cytiva</td><td>6717-9502</td><td>Filtr kapsułkowy do filtrowania dużych objętości cieczy</td></tr><tr><td>Zetasizer</td><td>Malvern Panalytical</td><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Przyrząd do dynamicznego rozpraszania światła (DLS)</td></tr></tbody></table>

izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Cyjanobakterie to zróżnicowana grupa fotosyntetycznych, Gram-ujemnych bakterii, które odgrywają kluczową rolę w globalnych ekosystemach i służą jako podstawowe modele biotechnologiczne. Niedawne prace wykazały, że zarówno morskie, jak i słodkowodne sinice wytwarzają pęcherzyki zewnątrzkomórkowe - małe struktury związane z błoną uwalniane z zewnętrznej powierzchni drobnoustrojów. Podczas gdy pęcherzyki prawdopodobnie przyczyniają się do różnych procesów biologicznych, ich specyficzne role funkcjonalne w biologii sinic pozostają w dużej mierze nieznane. Aby zachęcić do badań w tej dziedzinie i posunąć je naprzód, przedstawiono szczegółowy protokół izolacji, koncentracji i oczyszczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic. W obecnej pracy omówiono metodologie, które z powodzeniem wyizolowały pęcherzyki z dużych kultur Prochlorococcus, Synechococcus i Synechocystis. Przedstawiono metody ilościowego oznaczania i charakterystyki próbek pęcherzyków z tych szczepów. Opisano również metody izolowania pęcherzyków z próbek z pola wodnego. Na koniec omówiono również typowe wyzwania związane z oczyszczaniem pęcherzyków sinicowych, względy metodologiczne dla różnych dalszych zastosowań oraz kompromisy między podejściami.

Rycina 1 przedstawia ogólny schemat procesu izolacji pęcherzyków sinicowych, wyróżniając kluczowe aspekty opisanego tutaj protokołu. Szczególną uwagę należy zwrócić na etapy szczegółowo opisujące oddzielanie biomasy sinic od frakcji drobnych cząstek (pęcherzyków), zagęszczanie próbki pęcherzyków oraz izolację i oczyszczanie pęcherzyków (Rycina 1, kroki 2–4), które są krytyczne dla uzyskania powtarzalnych preparatów pęcherzyków. Rycina 2 przedstawia reprezentatywne wyniki izolacji i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z sinicy Synechocystis sp. PCC 6803. Wykazano, że błona zewnętrzna tej sinicy zawiera karotenoidy31, które nadają charakterystyczny pomarańczowy kolor próbkom pęcherzyków zebranym poprzez bezpośrednie wirowanie w ultrawirowarce (Rycina 2A). Po resuspensji osadu pęcherzyków można je badać za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), albo poprzez negatywne barwienie próbek octanem uranylu (Rycina 2B), albo poprzez obserwację ultracienkich przekrojów (Rycina 2C). Rozkład wielkości i stężenie pęcherzyków można ocenić za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS) (Rycina 2D) oraz analizy śledzenia nanocząsteczek (NTA) (Rycina 2E). Stosując opisany protokół, w kulturze Synechocystis sp. PCC 6803 w fazie wzrostu wykładniczego przy OD730 wynoszącej 1,0, uzyskano zazwyczaj ~3,5 ± 1,0 x 108 nanocząsteczek na mL. W celu uzupełnienia fizycznej charakterystyki wyizolowanych pęcherzyków można przeprowadzić analizy biochemiczne wyizolowanych EV. Przykładowo, oczyszczone pęcherzyki Synechocystis sp. PCC 6803 rozdzielono na żelu SDS-poliakrylamidowym i zabarwiono pod kątem obecności lipopolisacharydów (LPS; Rycina 2F). Ponieważ LPS są specyficzne dla błony zewnętrznej32, ich detekcja może potwierdzić obecność pęcherzyków związanych z błoną i służyć jako marker do analizy względnej zawartości pęcherzyków pomiędzy preparatami z tego samego szczepu33. Analiza względnej liczności LPS o niskiej i wysokiej masie cząsteczkowej może wskazywać na zmiany w składzie pęcherzyków pomiędzy próbkami34,35.
<img alt="Schemat procesu hodowli sinic i izolacji pęcherzyków; kroki obejmują wirowanie, filtrację oraz charakterystykę za pomocą DLS, TEM i NTA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Procedury eksperymentalne stosowane do izolacji i charakterystyki EV sinic. Schematyczne przedstawienie hodowli kultur (1) oraz oddzielania biomasy sinic od medium wzrostowego (2). Próbki wolne od komórek zawierające pęcherzyki są zagęszczane (3), a następnie EV są izolowane i oczyszczane (4). W zależności od zastosowania, preparaty pęcherzyków mogą być charakteryzowane przy użyciu jednej lub kombinacji metod: transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), analizy śledzenia nanocząstek (NTA), dynamicznego rozpraszania światła (DLS) oraz profilowania lipopolisacharydów (LPS) (5). RT, temperatura pokojowa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig01largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs): barwienie TEM, ultrascienkie przekroje, wykresy DLS i NTA; wyniki żelu LPS, schemat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2Reprezentatywne wyniki izolacji i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych dla sinic Synechocystis sp. PCC 6803. (A) Zdjęcie osadu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (osad EV) otrzymanego po ultrawirowaniu skoncentrowanego, wolnego od komórek medium zewnątrzkomórkowego z objętości 600 ml Synechocystis kultura szczepu PCC 6803 wyhodowana do wartości OD730 wynoszącej 1,0-1,5. Należy zwrócić uwagę na typową pomarańczową barwę osadu pęcherzyków, wynikającą z obecności karotenoidów w błonie zewnętrznej.B,C) Fotografie z transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) po barwieniu negatywowym (B) i ultracienkie przekroje (C) z Synechocystis próbki pęcherzyków sp. PCC 6803. Skala: odpowiednio 200 nm i 50 nm. Próbki zobrazowano za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego pracującego przy napięciu 80 kV. (D) Typowy wykres dynamicznego rozpraszania światła (DLS) przedstawiający rozkład objętości pęcherzyków w funkcji ich średnicy (w nm). Kolorowe linie oznaczają dane z trzech technicznych pomiarów powtórzonych tej samej próbki. (E) Reprezentatywne dane z analizy śledzenia nanocząsteczek (NTA) dla Synechocystis rozkład wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (w nm). Czarna linia oznacza średnią z trzech powtórzeń technicznych, a czerwone linie reprezentują standardowy błąd średniej. (F) Profil lipopolisacharydów (LPS) wykryto po rozdziale preparatu pęcherzyków metodą elektroforezy na żelu poliakrylamidowym z SDS o stężeniu 16% (w/v) i barwieniu przy użyciu komercyjnego zestawu do barwienia LPS. Wykrywalne są LPS o niskiej i wysokiej masie cząsteczkowej, odpowiadające odpowiednio formom LPS szorstkiego (rough-LPS) i gładkiego (smooth-LPS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Plik uzupełniający 1: Równanie do obliczenia r. Za pomocą tego równania wyznacza się liczbę pęcherzyków wytwarzanych przez komórkę w jednym pokoleniu pomiędzy dwoma punktami w fazie wzrostu wykładniczego (zazwyczaj na początku i na końcu przebiegu czasowego). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Obecny protokół zawiera szczegółowe opisy izolacji, koncentracji i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z kultur sinic. Omówiono również podejścia do oczyszczania pęcherzyków z kultur w różnych skalach, kompromisy między metodologiami oraz rozważania dotyczące pracy z próbkami terenowymi.

Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ nie tylko demonstruje podejścia do oczyszczania pęcherzyków z hodowli w różnych skalach, kompromisy, różnice między metodologiami, a także rozważania dotyczące pracy z próbkami terenowymi. Sinice stanowią wyjątkowe wyzwanie w zakresie pobierania próbek i analizy pęcherzyków. Techniki te z powodzeniem wyizolowały i skoncentrowały pęcherzyki z hodowli i próbek środowiskowych.Aby zagęścić próbki o pojemności mniejszej niż 500 mililitrów, należy rozpocząć od przepłukania koncentratorów odśrodkowych ultrafiltracji o pojemności od 15 do 20 mililitrów ultraczystą wodą typu 1. Załaduj koncentratory do wirówki i wiruj z prędkością 4 400 x g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzuć przebieg i powtórz ten krok co najmniej dwa razy.Załadować próbkę sklarowanego osadu do koncentratora przepłukanego wodą i odwirować w tych samych warunkach. Powtarzaj ten krok, aż próbka zostanie zagęszczona do końcowej objętości od 15 do 30 mililitrów. Aby skoncentrować objętość większą niż 500 mililitrów, należy przeprowadzić filtrację z przepływem stycznym, ustawiając aparaturę zgodnie z opisem w rękopisie.Podłącz pompę perystaltyczną do przewodu dolotowego i umieść regulowane zaciski na przewodzie retentatu. Zdezynfekuj filtrację o przepływie stycznym zgodnie z opisem w manuskrypcie, a następnie przepłucz urządzenie jednym litrem ultraczystej wody typu 1. Dodać filtrat o wielkości mniejszej niż 0,2 mikrona do zbiornika próbki.Powoli zwiększaj prędkość pompy i poziomy ciśnienia wstecznego na przewodzie retentatu, aby zwiększyć wydajność przewodów filtratu. Kontynuuj przeprowadzanie filtracji o przepływie stycznym i napełniaj zbiornik supernatantem do hodowli w miarę usuwania materiału. Przerwać zagęszczanie próbki, gdy objętość w zbiorniku osiągnie najniższą możliwą ilość potrzebną do utrzymania przepływu do przewodu dolotowego bez wprowadzania pęcherzyków powietrza.Zamknij przewód odpływowy za pomocą zacisku. Usunąć ciśnienie wsteczne na linii retentatu. Recyrkuluj skoncentrowany supernatant przez filtr przez 10 minut, zmniejszając szybkość recyrkulacji z 20 do 40 mililitrów na minutę, aby zmaksymalizować odzysk.Przenieść przewód retentatu do czystego naczynia, usunąć przewód dolotowy z próbki i zebrać skoncentrowany materiał. Odzyskaj pozostały materiał w zbiorniku na próbkę za pomocą pipety. Przefiltrować skoncentrowany supernatant przez filtr strzykawkowy o wielkości 0,2 mikrona.W razie potrzeby przechowuj końcowy koncentrat w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez około trzy tygodnie przed przejściem do oczyszczania pęcherzyków. Aby zagnieździć zagęszczoną próbkę hodowli, umieść ją w czystej probówce ultrawirówki i dodaj czystą pożywkę lub bufor, aby upewnić się, że probówka jest napełniona. Po odwirowaniu usunąć supernatant za pomocą pipety.Ponownie przemyć granulowany materiał świeżą pożywką hodowlaną lub buforem do płukania, takim jak sól fizjologiczna buforowana 1X fosforanem i powtórzyć wirowanie. Zawiesić końcowe osady w świeżej kulturze, delikatnie pipetując pipetą o pojemności jednego mililitra, a następnie przenieść je do czystego naczynia. Aby przeprowadzić ultrawirowanie w gradiencie gęstości, należy przygotować wywar z jodiksanolu zgodnie z opisem w manuskrypcie.Wymieszaj jedną część buforu 4X z trzema częściami 60% joniksanalu, aby uzyskać 45% roztwór jodu. Rozcieńczyć 45% jodiksanol buforem 1X, aby utworzyć zapasy pożywek gradientowych o stężeniach 40, 35, 30, 25, 20, 15 i 10% końcowych stężeń jodiksanolu. Następnie ostrożnie nałóż równe ilości wszystkich tych gradientowych zapasów jodu do probówki ultrawirówkowej, wykorzystując całą objętość probówki.Po odwirowaniu zebrać frakcje po 0,5 mililitra każda, aby uzyskać gradient około 4,5 mililitra, ostrożnie pipetując lub używając kolektora frakcji. Określ gęstość każdej frakcji w gramach na mililitr za pomocą wagi analitycznej i skalibrowanej pipety. Wyjmij próbkę z probówki, określ masę i włóż próbkę z powrotem do probówki.Rozcieńczyć poszczególne frakcje czystym buforem w nowej probówce, a następnie przepłukać czystą pożywką lub roztworem buforowym. Ostrożnie nałóż pięć mikrolitrów pęcherzyka i pozostaw na pięć minut. Usunąć próbkę, dotykając krawędzią siatki kawałka czystej bibuły filtracyjnej.Odpipetować od 20 do 50 mikrolitrów 2% octanu uranylu na płaską powierzchnię pokrytą folią z tworzywa sztucznego. Następnie umieść na nim unoszącą się na nim siatkę na dwie minuty. Usuń octan uranylu za pomocą bibuły filtracyjnej i unieś się na krótko na kropli ultraczystej wody do umycia.Napełnij komorę ultraczystą wodą za pomocą czystej strzykawki i upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Kliknij uruchom kamerę" i zwizualizuj optymalny obszar komory wokół odcisku kciuka. Przesuń suwaki wzmocnienia ekranu i poziomu kamery w kierunku maksimum, a następnie zmniejsz do najniższego poziomu, aby zobaczyć najciemniejsze cząstki.Dostosuj ostrość w razie potrzeby, aby upewnić się, że cząstki są mniej więcej równomiernie widoczne w całym polu view i kontynuuj mycie ultra czystą wodą, aż komora będzie czysta. Dodaj próbkę pęcherzyka do komory za pomocą jednomililitrowej strzykawki i potwierdź ustawienia pobierania. Wybierz standardowy pomiar" z listy rozwijanej SOP i zmień ustawienia, aby zebrać co najmniej trzy techniczne powtórzenia po 60 sekund każdy.Naciśnij utwórz"i uruchom skrypt" i postępuj zgodnie z instrukcjami i wepchnij około 100 mikrolitrów próbki do komory między powtórzeniami. Określ parametry cząstek, klikając analizę"i otwórz eksperyment" i załaduj plik próbki. Wybierz opcję "przetwarzaj wybrane pliki" i poczekaj na zakończenie analizy.Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z sinicy Synechocystis sp. PCC6803 wykazała, że błona zewnętrzna zawiera karotenoidy, które nadają charakterystyczne pomarańczowe zabarwienie próbkom pęcherzyków pobranym przez bezpośrednie granulowanie przez ultrawirowanie. Zawieszony osad pęcherzyka badano za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej poprzez ujemne barwienie próbek octanem uranylu lub obserwację ultracienkich skrawków.Rozkład wielkości i stężenie pęcherzyków oceniano za pomocą analiz dynamicznego rozpraszania światła i śledzenia nanocząstek. Oczyszczone pęcherzyki Synechocystis sp. PCC6803 oddzielono na żelu poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodu i wybarwiono na obecność lipopolisacharydów.Próbki należy pobierać przed i po zagęszczonej próbce pęcherzyków, aby upewnić się, że filtracja z przepływem stycznym działa, a pęcherzyki ulegają zagęszczeniu. Następnie należy zmierzyć obie próbki za pomocą analizy śledzenia nanocząstek. Konieczne są dalsze wysiłki w celu połączenia tej metody z innymi podejściami, takimi jak chromatografia wykluczająca wielkość lub asymetryczne frakcjonowanie w polu przepływowym, w celu poprawy dyskryminacji i izolacji małych cząstek z kultur i próbek środowiskowych.Technika ta jest pomocna w badaniu pęcherzyków sinic i specyficznych ról funkcjonalnych tych pęcherzyków w biologii sinic.

isolation-characterization-cyanobacterial-extracellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Biller, S. J., et al. Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic. J. Vis. Exp. (2022)Ten film przedstawia przygotowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic do transmisyjnej mikroskopii elektronowej za pomocą barwienia ujemnego, umożliwiając wizualizację morfologii, wielkości i czystości pęcherzyków w wysokiej rozdzielczości do analiz strukturalnych i porównawczych.

Wizualizacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Źródło: Watson, D. C., et.al. Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje izolację i koncentrację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z zewnętrznej błony genetycznie zmodyfikowanych bakterii. Proces ten obejmuje hodowlę bakterii w celu uwolnienia EV, a następnie sekwencyjne etapy wirowania i filtracji w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń. Wreszcie, ultrafiltracja jest stosowana...

Izolacja i wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z błony zewnętrznej od bakterii

Źródło: Watson, D. C., et al. Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje zastosowanie chromatografii wykluczania wielkości z porowatymi kulkami żywicy do izolowania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z filtratu kultury bakteryjnej. Większe EV eluują się wcześnie, omijając pory żywicy, podczas gdy mniejsze białka dostają się do porów i wymywają później.

Izolacja bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość 

Ten film demonstruje technikę chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC) do oczyszczania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z filtratu hodowlanego Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Technika ta wykorzystuje porowatą kolumnę wypełnioną żywicą w celu uzyskania oczyszczonych frakcji EV. Porowate cząsteczki selektywnie pozwalają mniejszym białkom wnikać do porów, co skutkuje wolniejszą elucją. Jednocześnie pojazdy elektryczne są wykluczone z wnikania do porów ze względu na ich większy...

Technika chromatografii wykluczającej wielkość do oczyszczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków

Tutaj opisane są protokoły izolacji cyjanobakteryjnych polimerów węglowodanowych uwalnianych i izolacji ich egzoproteomów. Obie procedury obejmują kluczowe etapy uzyskiwania polimerów lub białek o wysokim stopniu czystości, które można wykorzystać do dalszej analizy lub zastosowań. Można je również łatwo dostosować do konkretnych potrzeb użytkownika.

Patrząc na zewnątrz: izolacja polimerów i białek węglowodanowych uwalnianych przez sinice

Niniejszy raport podkreśla chronologiczne wymagania dotyczące izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) od mikrogleju lub makrofagów krwi. EV pochodzące z mikrogleju oceniano jako regulatory wzrostu neurytów, podczas gdy EV pochodzące z makrofagów krwi badano w kontroli inwazji komórek glejaka C6 w testach in vitro. Celem jest lepsze zrozumienie tych funkcji EV jako mediatorów immunologicznych w określonych mikrośrodowiskach.

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek odpornościowych i badanie funkcjonalnego wpływu na środowisko komórkowe

Pęcherzyki bakteryjne odgrywają ważną rolę w patogenezie i mają obiecujące zastosowania biotechnologiczne. Niejednorodność pęcherzyków komplikuje analizę i użytkowanie; Dlatego konieczna jest prosta, powtarzalna metoda oddzielania pęcherzyków o różnych rozmiarach. Tutaj pokazujemy zastosowanie chromatografii wykluczania wielkości do oddzielania heterogenicznych pęcherzyków wytwarzanych przez Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Chromatografia wykluczania wielkości do analizy niejednorodności pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii

Bakterie wydzielają nanometrowe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przenoszące bioaktywne cząsteczki biologiczne. Badania nad EV koncentrują się na zrozumieniu ich biogenezy, roli w interakcjach i chorobach między drobnoustrojami a gospodarzem-mikroorganizmem, a także na ich potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych. Przedstawiono proces pracy do skalowalnej izolacji pojazdów elektrycznych od różnych bakterii, aby ułatwić standaryzację badań nad pojazdami elektrycznymi.

Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii

Obecny protokół szczegółowo opisuje izolację fikobilisomów z cyjanobakterii poprzez wirowanie przez nieciągły gradient gęstości sacharozy. Frakcje nienaruszonych fikobilisomów potwierdza widmo emisji fluorescencji 77K i analiza SDS-PAGE. Otrzymane frakcje fikobilisomów nadają się do barwienia ujemnego TEM i analizy spektrometrii mas.

Izolacja i charakterystyka nienaruszonego fikobilisomu u cyjanobakterii

Najnowsza generacja narzędzi do charakteryzacji EV jest w stanie przeprowadzić pojedynczą analizę EV dla wielu parametrów jednocześnie. Cytometria nanoprzepływowa mierzy wszystkie cząstki biologiczne większe niż 45 nm bez znakowania i identyfikuje specyficzne cechy subpopulacji za pomocą różnych technik znakowania fluorescencyjnego.

Charakterystyka białka transbłonowego pojedynczego pęcherzyka zewnątrzkomórkowego za pomocą cytometrii nanoprzepływowej

Tutaj demonstrujemy metodę charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pobranych z płynów biologicznych, takich jak łzy i ślina, ludzi. Skaner stosowany w tej metodzie jest w stanie wykryć fenotyp, wielkość i całkowitą liczbę cząstek EV z 1 μl próbki.

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z płynów biologicznych

Poznaj metody izolacji i charakteryzacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z sinic, w tym ultrafiltrację i ultrawirówkę z gradientem gęstości. Techniki te umożliwiają analizę próbek kulturowych i środowiskowych.

Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic

Przeglądaj więcej filmów