Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic

Protokół ten jest istotny, ponieważ nie tylko demonstruje podejścia do oczyszczania pęcherzyków z hodowli w różnych skalach, kompromisy, różnice między metodologiami, a także rozważania dotyczące pracy z próbkami terenowymi. Sinice stanowią wyjątkowe wyzwanie w zakresie pobierania próbek i analizy pęcherzyków. Techniki te z powodzeniem wyizolowały i skoncentrowały pęcherzyki z hodowli i próbek środowiskowych.

Aby zagęścić próbki o pojemności mniejszej niż 500 mililitrów, należy rozpocząć od przepłukania koncentratorów odśrodkowych ultrafiltracji o pojemności od 15 do 20 mililitrów ultraczystą wodą typu 1. Załaduj koncentratory do wirówki i wiruj z prędkością 4 400 x g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzuć przebieg i powtórz ten krok co najmniej dwa razy.

Załadować próbkę sklarowanego osadu do koncentratora przepłukanego wodą i odwirować w tych samych warunkach. Powtarzaj ten krok, aż próbka zostanie zagęszczona do końcowej objętości od 15 do 30 mililitrów. Aby skoncentrować objętość większą niż 500 mililitrów, należy przeprowadzić filtrację z przepływem stycznym, ustawiając aparaturę zgodnie z opisem w rękopisie.

Podłącz pompę perystaltyczną do przewodu dolotowego i umieść regulowane zaciski na przewodzie retentatu. Zdezynfekuj filtrację o przepływie stycznym zgodnie z opisem w manuskrypcie, a następnie przepłucz urządzenie jednym litrem ultraczystej wody typu 1. Dodać filtrat o wielkości mniejszej niż 0,2 mikrona do zbiornika próbki.

Powoli zwiększaj prędkość pompy i poziomy ciśnienia wstecznego na przewodzie retentatu, aby zwiększyć wydajność przewodów filtratu. Kontynuuj przeprowadzanie filtracji o przepływie stycznym i napełniaj zbiornik supernatantem do hodowli w miarę usuwania materiału. Przerwać zagęszczanie próbki, gdy objętość w zbiorniku osiągnie najniższą możliwą ilość potrzebną do utrzymania przepływu do przewodu dolotowego bez wprowadzania pęcherzyków powietrza.

Zamknij przewód odpływowy za pomocą zacisku. Usunąć ciśnienie wsteczne na linii retentatu. Recyrkuluj skoncentrowany supernatant przez filtr przez 10 minut, zmniejszając szybkość recyrkulacji z 20 do 40 mililitrów na minutę, aby zmaksymalizować odzysk.

Przenieść przewód retentatu do czystego naczynia, usunąć przewód dolotowy z próbki i zebrać skoncentrowany materiał. Odzyskaj pozostały materiał w zbiorniku na próbkę za pomocą pipety. Przefiltrować skoncentrowany supernatant przez filtr strzykawkowy o wielkości 0,2 mikrona.

W razie potrzeby przechowuj końcowy koncentrat w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez około trzy tygodnie przed przejściem do oczyszczania pęcherzyków. Aby zagnieździć zagęszczoną próbkę hodowli, umieść ją w czystej probówce ultrawirówki i dodaj czystą pożywkę lub bufor, aby upewnić się, że probówka jest napełniona. Po odwirowaniu usunąć supernatant za pomocą pipety.

Ponownie przemyć granulowany materiał świeżą pożywką hodowlaną lub buforem do płukania, takim jak sól fizjologiczna buforowana 1X fosforanem i powtórzyć wirowanie. Zawiesić końcowe osady w świeżej kulturze, delikatnie pipetując pipetą o pojemności jednego mililitra, a następnie przenieść je do czystego naczynia. Aby przeprowadzić ultrawirowanie w gradiencie gęstości, należy przygotować wywar z jodiksanolu zgodnie z opisem w manuskrypcie.

Wymieszaj jedną część buforu 4X z trzema częściami 60% joniksanalu, aby uzyskać 45% roztwór jodu. Rozcieńczyć 45% jodiksanol buforem 1X, aby utworzyć zapasy pożywek gradientowych o stężeniach 40, 35, 30, 25, 20, 15 i 10% końcowych stężeń jodiksanolu. Następnie ostrożnie nałóż równe ilości wszystkich tych gradientowych zapasów jodu do probówki ultrawirówkowej, wykorzystując całą objętość probówki.

Po odwirowaniu zebrać frakcje po 0,5 mililitra każda, aby uzyskać gradient około 4,5 mililitra, ostrożnie pipetując lub używając kolektora frakcji. Określ gęstość każdej frakcji w gramach na mililitr za pomocą wagi analitycznej i skalibrowanej pipety. Wyjmij próbkę z probówki, określ masę i włóż próbkę z powrotem do probówki.

Rozcieńczyć poszczególne frakcje czystym buforem w nowej probówce, a następnie przepłukać czystą pożywką lub roztworem buforowym. Ostrożnie nałóż pięć mikrolitrów pęcherzyka i pozostaw na pięć minut. Usunąć próbkę, dotykając krawędzią siatki kawałka czystej bibuły filtracyjnej.

Odpipetować od 20 do 50 mikrolitrów 2% octanu uranylu na płaską powierzchnię pokrytą folią z tworzywa sztucznego. Następnie umieść na nim unoszącą się na nim siatkę na dwie minuty. Usuń octan uranylu za pomocą bibuły filtracyjnej i unieś się na krótko na kropli ultraczystej wody do umycia.

Napełnij komorę ultraczystą wodą za pomocą czystej strzykawki i upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Kliknij uruchom kamerę" i zwizualizuj optymalny obszar komory wokół odcisku kciuka. Przesuń suwaki wzmocnienia ekranu i poziomu kamery w kierunku maksimum, a następnie zmniejsz do najniższego poziomu, aby zobaczyć najciemniejsze cząstki.

Dostosuj ostrość w razie potrzeby, aby upewnić się, że cząstki są mniej więcej równomiernie widoczne w całym polu view i kontynuuj mycie ultra czystą wodą, aż komora będzie czysta. Dodaj próbkę pęcherzyka do komory za pomocą jednomililitrowej strzykawki i potwierdź ustawienia pobierania. Wybierz standardowy pomiar" z listy rozwijanej SOP i zmień ustawienia, aby zebrać co najmniej trzy techniczne powtórzenia po 60 sekund każdy.

Naciśnij utwórz"i uruchom skrypt" i postępuj zgodnie z instrukcjami i wepchnij około 100 mikrolitrów próbki do komory między powtórzeniami. Określ parametry cząstek, klikając analizę"i otwórz eksperyment" i załaduj plik próbki. Wybierz opcję "przetwarzaj wybrane pliki" i poczekaj na zakończenie analizy.

Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z sinicy Synechocystis sp. PCC6803 wykazała, że błona zewnętrzna zawiera karotenoidy, które nadają charakterystyczne pomarańczowe zabarwienie próbkom pęcherzyków pobranym przez bezpośrednie granulowanie przez ultrawirowanie. Zawieszony osad pęcherzyka badano za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej poprzez ujemne barwienie próbek octanem uranylu lub obserwację ultracienkich skrawków.

Rozkład wielkości i stężenie pęcherzyków oceniano za pomocą analiz dynamicznego rozpraszania światła i śledzenia nanocząstek. Oczyszczone pęcherzyki Synechocystis sp. PCC6803 oddzielono na żelu poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodu i wybarwiono na obecność lipopolisacharydów.

Próbki należy pobierać przed i po zagęszczonej próbce pęcherzyków, aby upewnić się, że filtracja z przepływem stycznym działa, a pęcherzyki ulegają zagęszczeniu. Następnie należy zmierzyć obie próbki za pomocą analizy śledzenia nanocząstek. Konieczne są dalsze wysiłki w celu połączenia tej metody z innymi podejściami, takimi jak chromatografia wykluczająca wielkość lub asymetryczne frakcjonowanie w polu przepływowym, w celu poprawy dyskryminacji i izolacji małych cząstek z kultur i próbek środowiskowych.

Technika ta jest pomocna w badaniu pęcherzyków sinic i specyficznych ról funkcjonalnych tych pęcherzyków w biologii sinic.