Wydajna i ekonomiczna metoda elektroporacji do badania pierwotnych szlaków sygnałowych zależnych od rzęsek w prekursorze komórek ziarnistych
30 listopada 2021
Tutaj prezentujemy powtarzalny protokół elektroporacji in vitro do manipulacji genetycznej pierwotnych prekursorów komórek ziarnistych móżdżku (GCP), który jest opłacalny, wydajny i opłacalny. Co więcej, protokół ten demonstruje również prostą metodę badania molekularnego pierwotnych szlaków sygnałowych Hedgehog zależnych od rzęsek w pierwotnych komórkach GCP.
Protokół ten demonstruje prostą metodę modyfikacji genetycznej in vitro do badania molekularnego pierwotnego szlaku sygnałowego zależnego od rzęsek w pierwotnych kulturach prekursorowych komórek ziarnistych. Ze względu na koszty, niską żywotność i słabą skuteczność obecnej metody transfekcji, wprowadzamy prostą, opłacalną i wydajną technikę elektroporacji do badania szlaku sygnałowego zależnego od rzęsek w pierwotnych kulturach GCP. Na początek dodaj 0,5 mililitra pożywki hodowlanej do każdego dołka 24-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej powlekane szkiełka nakrywkowe i utrzymuj ją w cieple w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla.
Odpipetować wymaganą liczbę komórek do sterylnej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki i wirować z prędkością 200x G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w 200 mikrolitrach Opti-MEM. Powtórz tę procedurę dwukrotnie, aby upewnić się, że w probówce nie ma resztek pożywki hodowlanej.
Ustaw parametry elektroporacji zgodnie z listą. Delikatnie odpipetuj reakcję elektroporacji, aby dobrze wymieszać, i użyj długiej końcówki pipety P200, aby przenieść dokładną objętość 100 mikrolitrów mieszaniny do kuwety o odstępie dwóch milimetrów. Gdy kuweta znajdzie się w komorze kuwety, naciśnij przycisk omega elektroporatora i zanotuj wartość impedancji, przestrzegając dokładnej objętości 100 mikrolitrów.
Zakres wartości impedancji powinien wynosić około 30 i 35. Naciśnij przycisk start, aby zainicjować impuls. Zapisz zmierzone wartości prądu w dżulach pokazanych na ramce odczytu.
Wyjmij kuwetę z komory. Natychmiast dodaj 100 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej do kuwety i ponownie ją zawiesij, pipetując w górę iw dół dwa do trzech razy. Natychmiast przenieść zawiesinę komórek na wcześniej przygotowaną płytkę 24-dołkową.
Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla. Następnego dnia obserwuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym. W niniejszym badaniu wydajność elektroporacji w grupach leczonych DMSO i SAG wydawała się porównywalna.
Barwienie immunologiczne pierwotnego markera rzęskowego Arl13b pokazuje, że szybkość rzęskowania GCP w div-2 hodowli zarówno w grupie leczonej podłożem, jak i SAG. Szybkość rzęskowania ilustruje procent ekspresji Pax6 GCP z rzęską pierwotną na powierzchni komórki w momencie div-2 po elektroporacji. Rysunek pokazuje znaczny wzrost wygładzonej lokalizacji EGFP na pierwotnym aksonomie rzęskowym komórek GCP o ekspresji Pax6 w ciągu 24 godzin po leczeniu SAG, co wskazuje na głęboką aktywację pierwotnego szlaku sygnałowego hedgehog zależnego od rzęsek.
W celu uzyskania wyższej wydajności elektroporacji należy zadbać o wysoką czystość zastosowanego plazmidu, a w mieszaninie do elektroporacji plazmidu nie ma pozostałości pożywki. Protokół ten powinien mieć bezpośrednie zastosowanie i być korzystny dla eksperymentów modyfikacji genetycznej in vitro na kulturach pierwotnych i typach komórek, które są trudne do transfekcji, w tym neuronach i pluripotencjalnych komórkach macierzystych indukowanych przez człowieka.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie prezentuje powtarzalny protokół elektroporacji in vitro zaprojektowany do manipulacji genetycznych pierwotnych komórek przodujących ziarnistości móżdżku (GCPs). Skupia się na metodzie, która jest zarówno opłacalna, jak i wydajna w badaniu zależnych od wici pierwotnych szlaków sygnalizacyjnych Hedgehog.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Manipulacja genetyczna
- Sygnalizowanie komórkowe
Tło
- Pierwotne komórki przodujące ziarnistości móżdżku (GCPs) są kluczowe dla badań nad rozwojem neuronowym.
- Obecne metody transfekcji są często nieefektywne i kosztowne.
- Wić pierwotna jest niezbędna dla różnych szlaków sygnalizacyjnych, w tym sygnalizowania Hedgehog.
- Elektroporacja oferuje potencjalne rozwiązanie dla tych wyzwań.
Cel badania
- Wprowadzić efektywną technikę elektroporacji do hodowli GCP.
- Ułatwić badanie sygnalizowania zależnego od wici pierwotnych.
- Poprawić wyniki manipulacji genetycznej w trudnych do transfekcji typach komórek.
Zastosowane metody
- Ekperyment wykorzystał hodowle in vitro pierwotnych GCP.
- Protokół elektroporacji zawierał specyficzne parametry dla efektywnej modyfikacji genetycznej.
- W badaniu nie wspomniano o podejściu multiomics.
- Kluczowe kroki obejmowały resuspendowanie komórek i sekwencję elektroporacji.
- Zastosowano immunobarwienie do oceny wskaźników uciałowienia i aktywacji szlaków sygnałowych.
Główne wyniki
- Protokół wykazał znaczny wzrost aktywacji szlaku sygnalizacyjnego Hedgehog w leczonych GCP.
- Immunobarwienie ujawniło znaczny wzrost wskaźnika uciałowienia w GCP po elektroporacji.
- Badanie dostarczyło wglądu w efektywność elektroporacji w porównaniu z tradycyjnymi metodami.
- Wynika z niego, że wysoka czystość plazmidu jest kluczowa dla sukcesu elektroporacji.
Wnioski
- To badanie prezentuje wartościowy protokół do manipulacji genetycznych w pierwotnych GCP.
- Wyniki zwiększają zrozumienie mechanizmów sygnalizowania zależnego od wici pierwotnej.
- Przyszłymi zastosowaniami mogą być różne typy komórek, które są trudne do manipulacji genetycznej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Efficient genetic manipulation of primary granule cell precursors (GCPs) is essential for elucidating cilium-dependent signaling mechanisms that underpin neurodevelopmental and disease pathways. This electroporation protocol delivers high transfection efficiency and cell viability, enabling robust interrogation of Hedgehog pathway dynamics in disease-relevant systems. The method supports predictive confidence in early discovery and target validation for signaling pathway modulators.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional genetic interrogation of cilium-dependent Hedgehog signaling in primary GCPs.
- Supports mechanistic de-risking by allowing direct visualization of pathway component localization.
- Facilitates target validation through reproducible manipulation of signaling nodes in disease-relevant cells.
Screening & Assay Development
- Prepares validated primary cell systems for downstream screening of pathway modulators.
- Delivers high transfection efficiency (~80-90%) and reproducibility for quantitative assay outputs.
- Enables scalable and cost-effective assay development for difficult-to-transfect neuronal models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant cellular phenotypes for translational continuity.
- Supports biomarker discovery by enabling dynamic tracking of signaling protein localization.
- Reduces biological risk in preclinical advancement by providing robust mechanistic data.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the early discovery and target validation stages, bridging genetic manipulation with quantitative pathway analysis in primary neuronal systems.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification in primary GCPs.
- Screening: Provides reproducible, high-efficiency transfection for assay readiness and quantitative readouts.
- Analytics: Enables measurement of ciliation rates and pathway activation via immunostaining and fluorescence microscopy.
- Translational Research: Connects in vitro mechanistic insights to disease-relevant cellular contexts.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable platform for genetic modification in challenging primary cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in pathway studies.
- Operational Value: Standardizes genetic manipulation with high reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of signaling pathway targets and modulators.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary neuronal culture and electroporation techniques.
- Needs access to electroporation instrumentation and fluorescence microscopy for analysis.
- Demands cross-team standardization of plasmid purity and media removal protocols.
- Adaptable to other difficult-to-transfect primary cell types with protocol optimization.
- Efficiency depends on precise control of electroporation parameters and sample preparation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
Day In Vitro (DIV) 0: Electroporation for Overexpression of Hedgehog Receptor: pEGFP-Smo
2:28
Results: Assessment of Overexpression Efficiency and the Effects of SAG Treatment on Primary Cilium-Dependent Hedgehog Signaling Pathway
3:23
Conclusion
