Name: Test biologiczny do stosowania miejscowego w celu ilościowego określenia toksyczności insektycydów dla komarów i muszek owocowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Poznaj metodę aplikacji miejscowej do ilościowego określania toksyczności insektycydów u komarów i muszek owocowych. Technika ta umożliwia obliczanie dawek śmiertelnych z uwzględnieniem masy ciała, co poprawia precyzję pomiarów oporności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało wsparte nagrodą CAREER przyznaną SH przez National Science Foundation pod numerem 2047572. Dziękujemy Damienowi Riverze za pomoc w hodowli muszek owocowych i przygotowaniu do testu do stosowania miejscowego, dr Ganetzky'emu z University of Wisconsin-Madison za podzielenie się szczepem muszki owocowej Canton-S, Centrom Kontroli i Prewencji Chorób za udostępnienie szczepu Rockefellera oraz Centrum Entomologii Medycznej, Rolniczej i Weterynaryjnej Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych za udostępnienie szczepu izoliny IICC. Rysunek 1 został stworzony za pomocą BioRender.com.

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Komary są odpowiedzialne za ponad 700 000 zgonów rocznie z powodu chorób, które przenoszą na ludzi, przy czym ponad połowa tych zgonów jest spowodowana samą malarią1. Główną metodą zapobiegania przenoszeniu malarii i innych chorób przenoszonych przez wektory jest stosowanie insektycydów, często w postaci długotrwałych siatek owadobójczych lub oprysków resztkowych w pomieszczeniach2. Jednak odporność na insektycydy jest szeroko rozpowszechniona wśród komarów i innych wektorów owadów, a także szkodników rolniczych3,4. Aby skutecznie radzić sobie z odpornością, nadzór ma kluczowe znaczenie5. W tym celu potrzebne są bardzo dokładne i wysokoprzepustowe metody wykrywania odporności. Obecnie najbardziej rozpowszechnionymi narzędziami do monitorowania odporności komarów na insektycydy są test probówkowy WHO6 oraz test biologiczny CDC w butelce7. W przypadku muszek owocowych metoda aplikacji kontaktu resztkowego (podobna do testu biologicznego butelki CDC) jest powszechnie stosowanym testem biologicznym insektycydów8,9,10. Jednak zmienność danych z tych metod jest zazwyczaj wysoka, a pomiary tego samego laboratoryjnego szczepu komara wahają się od ~ 20-70% śmiertelności w testach butelkowych CDC i 0-50% w testach probówkowych WHO po wystawieniu na dawki subletalne 11. Taka zmienność jest zaskakująca, ponieważ oczekuje się, że ograniczona zmienność genetyczna w większości szczepów laboratoryjnych doprowadzi do ograniczonej zmienności wrażliwości na insektycydy w populacji. Niemniej jednak nadal obserwuje się duży poziom zmienności w wynikach testów biologicznych.
Potencjalne źródła tej zmienności mogą wynikać z niejednorodnej ekspozycji na insektycydy między próbkami w teście biologicznym z powodu pośredniej ekspozycji na insektycydy przez powierzchnię, niejednorodnych skutków środowiskowych, normalnej zmienności biologicznej między osobnikami o tym samym genotypie oraz zmienności masy próbek tej samej populacji12. Rzadziej stosowaną metodą o większej powtarzalności jest test biologiczny do stosowania miejscowego. W tym teście środek owadobójczy jest bezpośrednio nakładany na każdy insect13,14, usuwając czynnik niejednorodnej ekspozycji różnych próbek w ramach tego samego testu. Jednak ze względu na powolny przepływ tej metody, nie jest ona rutynowo stosowana jako narzędzie do monitorowania wrażliwości na insektycydy dla populacji komarów. W artykule przedstawiono zmodyfikowany protokół testu biologicznego do stosowania miejscowego, który pozwala na ekspozycję o wyższej przepustowości, jednocześnie korygując zmiany masy owadów, parametr korelujący ze zmianami podatności na insektycydy12. Zmniejszenie hałasu i związanych z masą zmian w danych dotyczących śmiertelności spowodowanych zmiennym narażeniem na insektycydy pozwoliłoby na dokładniejszy nadzór nad odpornością techniczną11,15. Takie dane można wykorzystać do dokładniejszego powiązania oporności fenotypowej z markerami genetycznymi, parametrami dopasowania i/lub kompetencjami wektorowymi. Ponadto pokazujemy, w jaki sposób ten test można łatwo dostosować do innych gatunków owadów, stosując test biologiczny do stosowania miejscowego na muszkach owocowych, mniejszych gatunkach owadów.
Głównym ograniczeniem wyżej wymienionych zastosowań kontaktu resztkowego jest to, że ekspozycja na insektycydy może się różnić w zależności od próbki w ramach tego samego testu. W przypadku testów biologicznych CDC w butelkach i metody kontaktowej narażenie na insektycydy może się różnić w zależności od powtórzeń tego samego testu. Owady są wystawione na działanie środka owadobójczego, który jest rozprowadzany po wewnętrznej stronie szklanej butelki (metoda biologiczna i kontaktowa CDC) lub na impregnowanych papierach (test probówkowy WHO). Stężenie insektycydu na obu powierzchniach (szkle i papierze) jest znane i z góry określone na podstawie badań przesiewowych różnych gatunków o znanych genotypach. Jednak ilość, która może zostać potencjalnie wchłonięta przez owada, może się znacznie różnić w zależności od użytej powierzchni, składników mieszaniny insektycydów oraz tego, jak jednorodnie środek owadobójczy jest rozprowadzany na materiale powierzchniowym16,17. W teście biologicznym CDC powłoka owadobójcza po wewnętrznej stronie butelki zależy od procedur zastosowanych przez każde laboratorium i użytkownika. W teście probówkowym WHO bibułki nasączone środkami owadobójczymi są produkowane centralnie, a zatem najprawdopodobniej są dość jednorodne we wszystkich laboratoriach. Jednak w teście probówkowym WHO rurka ekspozycyjna pozwala próbkom wylądować i spocząć na metalowej siatce, która nie jest narażona na działanie środków owadobójczych, co prowadzi do potencjalnej niejednorodnej ekspozycji na insektycydy wśród próbek w każdym teście. Rzeczywista ilość środka owadobójczego pobranego i wchłoniętego przez próbki za pomocą każdej metody wymaga dalszego zbadania18.
Dodatkowo, test biologiczny z butelki CDC, test probówkowy WHO i metoda kontaktowa są najczęściej używane jako testy progowe testujące tylko jedno z góry określone stężenie insektycydu. Takie podejście może dokładnie wykryć obecność oporności i jest cenne dla nadzoru oporności (zwłaszcza gdy oporność się rozprzestrzenia). Jednak testy progowe nie mogą określić ilościowo siły oporności, co może być bardziej predykcyjne dla skuteczności narzędzi interwencyjnych. Jeśli w tych metodach stosuje się wiele stężeń insektycydów, można je wykorzystać jako testy intensywności. Testy intensywności dla testu biologicznego w butelce CDC i testu probówkowego WHO zostały wprowadzone poprzez testowanie 5 i 10 razy wcześniej ustalonych dawek dyskryminujących, aby wypełnić tę lukę w nadzorze6,19. Zapewniając większą zdolność do różnicowania między opornymi populacjami, 3-5 (z góry określonych) dawek zapewnia ograniczoną rozdzielczość do obliczenia stężeń śmiertelnych. Dodatkowo w takich testach wykorzystuje się komary o różnych rozmiarach. Jednak masa jest ważna do zmierzenia, ponieważ większe próbki mogą wymagać większej dawki do zabicia, ponieważ efektywna dawka na jednostkę masy będzie znacznie niższa niż w przypadku mniejszego organizmu12. Obliczenie zrelatywizowanej dawki śmiertelnej (ilość środka owadobójczego na masę owada) byłoby bardziej użytecznym wskaźnikiem niż bardziej powszechne stężenie śmiertelne (np. ilość środka owadobójczego na powierzchnię), ponieważ uwzględnia zmienność masy owadów między płciami, populacjami i genotypami. Takie dane pomogłyby wypełnić lukę między odpornością genotypową i fenotypową w laboratorium i w terenie, a także mogłyby zapewnić łatwy sposób obliczania wymaganego stężenia aplikacyjnego w celu leczenia populacji owadów o znanej średniej masie.
Użycie masowo zrelatywizowanych dawek śmiertelnych, które zabijają 50% okazów (LD50) zawiera również kilka innych korzyści. Ocena toksyczności określonego związku w mg/kg (= ng/mg) jest standardem w toksykologii ludzkiej i weterynaryjnej14, a wartości LD50 znajdują się w kartach charakterystyki materiału. Dawki śmiertelne pozwalają również na bezpośrednie porównanie toksyczności między różnymi substancjami chemicznymi w stosunku do danego gatunku lub tą samą substancją chemiczną w stosunku do różnych gatunków20, a także na ocenę wysokiej jakości nowych insektycydów i chemikaliów13. Ponadto LD50 może zapewnić bardziej znaczące i dokładne współczynniki oporności niż te uzyskane na podstawie wyników śmiertelności po podaniu diagnostycznym, co może skutkować przeszacowaniem poziomu oporności występującej w populacji. W związku z tym test ten byłby odpowiedni dla rutynowych programów nadzoru, zapewniając bardziej rygorystyczne monitorowanie oporności w oparciu o masowo relatywizowane dawki śmiertelne pochodzące z większej liczby próbek niż jest to zalecane dla innych testów biologicznych21.
Metoda miejscowego stosowania została wykorzystana w nadzorze nad wrażliwością komarów i much na insektycydy jako alternatywa dla standardowych testów biologicznych wrażliwości na insektycydy, gdy odporność jest już znana lub podejrzewana22,23, a także do nadzoru nad niektórymi szkodnikami24 w celu dokładniejszej oceny profili odporności i wewnętrznej toksyczności insektycydów21. W testach biologicznych do stosowania miejscowego insektycyd nakłada się na każdy organizm, co powoduje minimalną różnicę w ekspozycji na insektycydy. W artykule przedstawiono nieco zmodyfikowaną i ulepszoną metodę, która pozwala na zastosowanie środków owadobójczych do dużej liczby owadów w krótkim czasie, przy jednoczesnej kontroli masy owadów22. Ta metoda o wyższej przepustowości i dobrym poziomie odtwarzalności może być użytecznym dodatkowym narzędziem do rutynowego monitorowania wrażliwości na insektycydy.

<table><tbody><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Thomas Scientific</td><td>20A00L068</td><td>Przechowywanie podwielokrotności acetonu</td></tr><tr><td>1,5 ml probówki z nakrętką</td><td>Thomas Scientific</td><td>1182K23</td><td>Zbiornik na rozcieńczalniki do insektycydów</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>VWR</td><td>339651</td><td>Przechowywanie rozcieńczalników owadobójczych</td></tr><tr><td>20 ml szklane fiolki scyntylacyjne</td><td>Fisher Scientific</td><td>0334125D</td><td>Ważenie muszek owocowych</td></tr><tr><td>25 &mu; Strzykawka L</td><td>Fisher Scientific</td><td>14815288</td><td>Aplikator do stosowania miejscowego</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC423240040</td><td>ACS 99,6%, 4 L</td></tr><tr><td>Aedes aegypti (szczep ICC)</td><td>USDA CMAVE</td><td>NA</td><td>Odporny na insektycydy</td></tr><tr><td>Aedes aegypti (szczep Rockefellera)</td><td>CDC</td><td>NA</td><td>Podatny na insektycydy</td></tr><tr><td>Skala analityczna</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-557-409</td><td>Precyzja do 0,1 mg</td></tr><tr><td>Aspirator</td><td>Amazon</td><td>6.49986E+11</td><td>Urządzenie do zbierania komarów</td></tr><tr><td>Papier stołowy</td><td>VWR</td><td>89126-794</td><td>Miejsce pod przestrzenią roboczą</td></tr><tr><td>Waciki bawełniane</td><td>Amazon</td><td>B092S8JVQN</td><td>Służy do sortowania owadów</td></tr><tr><td>Kulki z waty</td><td>Amazon</td><td>B0769MKZWT</td><td>Użyj do roztworu</td></tr> <tr>sacharozy<td>Dozownik</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482225</td><td>Repeater pipettor</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster (szczep Canton-S)</td><td>University of Wisconsin-Madison</td><td>NA</td><td>Podatny na insektycydy</td></tr><tr><td>Pędzle malarskie z cienką końcówką</td><td>Amazon</td><td>B07KT2X1BK</td><td>Służy do sortowania owadów</td></tr><tr><td>Butelki na muchy owocowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS355</td><td>Zastosowanie do hodowli i sortowania muszki owocowe</td></tr><tr><td>Ręczny dozownik CO2</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1710679</td><td>Służy do powalania owadów</td></tr><tr><td>Kubki do trzymania Amazon</td><td></td><td>B08DXG7V1S</td><td>Przezroczysty plastikowy</td></tr><tr><td>okład z lodu</td><td>Amazon</td><td>B08QDWMMW5</td><td>Służy do powalania muszek owocowych</td></tr><tr><td>Tacki na lód</td><td>Amazon</td><td>9301085269</td><td>Służy do powalania owadów</td></tr><tr><td>Owad </td><td>kleszcze Amazon</td><td>B07B4767WR</td><td>Kleszcze do owadów</td></tr><tr><td>Środek owadobójczy</td><td>Sigma-Aldrich Inc</td><td>45423-250MG</td><td>Deltametryna</td></tr><tr><td>Etykietowanie Naklejki</td><td>Amazon</td><td>B07Q4X9GWX</td><td>3/4" Kolorowe kropki</td></tr><tr><td>Taśma do etykietowania</td><td>Amazon</td><td>B00X6A1GYK</td><td>Biała taśma</td></tr><tr><td>Siatka</td><td>Amazon</td><td>B07F2PHHWV</td><td>Służy do zakrywania kubków i owadów Namiot manipulacyjny</td></tr><tr><td>szalki Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712H371</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>PVC Rura</td><td>Lowe' s</td><td>23971</td><td>Materiały namiotowe do obchodzenia się z owadami</td></tr><tr><td>Gumki</td><td>Amazon</td><td>B00006IBRU</td><td>Służy do zabezpieczania siatki/siatki na kubkach</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Amazon</td><td>B01J78INO0</td><td>Granulowany biały cukier</td></tr><tr><td>Papier wagowy</td><td>VWR</td><td>12578-165</td><td>4" x 4"</td></tr></tbody></table>

test biologiczny do stosowania miejscowego w celu ilościowego określenia toksyczności insektycydów dla komarów i muszek owocowych

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

Ciągłe stosowanie środków owadobójczych dla zdrowia publicznego i rolnictwa doprowadziło do powszechnej odporności na insektycydy i utrudnienia metod kontroli. Nadzór nad odpornością na insektycydy populacji komarów jest zwykle przeprowadzany za pomocą testów biologicznych butelek Centrów Kontroli i Prewencji Chorób (CDC) lub testów probówkowych Światowej Organizacji Zdrowia (WHO). Jednak metody te mogą skutkować wysokim stopniem zmienności danych dotyczących śmiertelności ze względu na zmienny kontakt insektycydów z owadami, stosunkowo niewielką liczbę badanych organizmów, duże różnice w masie między populacjami oraz stale zmieniające się warunki środowiskowe, prowadzące do zmiennych wyników. W artykule przedstawiono test biologiczny do stosowania miejscowego, zaadaptowany jako wysokoprzepustowy fenotypowy test biologiczny zarówno dla komarów, jak i muszek owocowych, do testowania dużej liczby owadów w zakresie stężeń insektycydów.
Ten test 1) zapewnia konsekwentne leczenie i kontakt insektycydów z każdym organizmem, 2) tworzy wysoce specyficzne krzywe dawka-odpowiedź, które uwzględniają różnice w średniej masie między szczepami i płciami (co jest szczególnie ważne dla organizmów zebranych w terenie), oraz 3) pozwala na obliczenie statystycznie rygorystycznej mediany dawek śmiertelnych (LD50), które są niezbędne do porównań współczynników oporności – alternatywnego podejścia do nadzoru w stosunku do śmiertelności po podaniu dawki diagnostycznej, które jest również stosowane do nadzoru nad opornością na larwobójcze. Test ten będzie narzędziem uzupełniającym do dokładnego fenotypowania populacji komarów i, jak pokazano na przykładzie muszek owocowych, można go łatwo przystosować do stosowania z innymi owadami. Twierdzimy, że ten test pomoże wypełnić lukę między genotypową i fenotypową odpornością na insektycydy u wielu gatunków owadów.

Te reprezentatywne wyniki przedstawiają dwa różne szczepy Ae. aegypti: Rockefeller (ROCK) oraz wyizolowany szczep polowy z Florydy o znanych mutacjach odporności na knockdown F1534C i V1016I (genotyp IICC). Dodatkowo zaprezentowano Drosophila melanogaster (szczep Canton: S).
Rysunek 2 oraz Rysunek 3 przedstawiają odpowiedź na dawkę każdego z organizmów z podziałem na badane szczepy i płeć zgodnie z powyższym protokołem. Ponieważ nie zaobserwowano różnic między krzywymi odpowiedź-dawka dla samców i samic komarów w obrębie każdego szczepu (t = 1.70, p = 0.098 dla ROCK i t = 0.64, p = 0.527 dla IICC), dane dla obu płci w ramach każdego szczepu komarów zostały połączone. Relatywna względem masy LD50 dla ROCK i IICC wynosi odpowiednio 0.008 ng/mg (95% CI: 0-0.104) oraz 0.336 ng/mg (95% CI: 0.235-0.438). Przedziały ufności 95% dla tych wartości nie nakładają się, co wskazuje na istotnie różne odpowiedzi na dawkę w badanych szczepach. RR szczepu IICC (w stosunku do szczepu ROCK) wynosi 41.7, co według WHO jest uznawane za wysoką oporność5. Dla muszek owocówek Canton-S relatywna względem masy LD50 wynosi 0.213 ng/mg (95% CI: 0-0.490).
<img alt="Rycina 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig02.jpg" /> 
Rycina 2: Reprezentatywne dane dotyczące komarów uzyskane za pomocą bioanalizy z zastosowaniem aplikacji miejscowej. Reprezentatywne dane zależności dawka-odpowiedź z bioanalizy z zastosowaniem aplikacji miejscowej zgodnie z powyższym protokołem z użyciem deltametryny i komarów: (A) samice szczepów Ae. aegypti ROCK (n = 880) i IICC (n = 550), (B) samce szczepów Ae. aegypti ROCK (n = 880) i IICC (n = 569). Stężenia testowe deltametryny wynosiły od 0.00075 ng/µL do 9.68705 ng/µL, a dawka zastosowanej deltametryny (ng) w przeliczeniu na średnią masę komara (mg) jest przedstawiona na osi x. Śmiertelność pokazano jako proporcję na osi y. Czarna linia przechodząca przez każdy zbiór punktów danych reprezentuje regresję liniową specyficzną dla szczepu i płci. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig03.jpg" /> 
Rysunek 3: Reprezentatywne dane dotyczące muszek owocówek z zastosowaniem bioanalizy aplikacji miejscowej. Reprezentatywne dane zależności efektu od dawki z bioanalizy aplikacji miejscowej przeprowadzonej zgodnie z powyższym protokołem z użyciem deltametryny i muszek owocówek: szczep Canton-S D. melanogaster (n = 1014). Stężenia testowe deltametryny wynosiły od 0,00499 do 5,02876 ng/µL, a na osi x naniesiono dawkę podanej deltametryny (ng) w przeliczeniu na średnią masę muszki owocówki (mg). Śmiertelność przedstawiono jako proporcję na osi y. Czarna linia reprezentuje regresję liniową. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Rycina uzupełniająca S1: Blatowy namiot do obsługi owadów. Blatowy namiot do obsługi owadów jest używany w celu łatwiejszego chwytania uciekających komarów lub much podczas testu aplikacji miejscowej. Konstrukcja jest zamknięta na zdjęciu A i otwarta na zdjęciu B. Konstrukcja ta została wykonana z rur PVC i tkaniny z gęstej siatki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure1.Final.V1.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca S2: Strzykawka i aplikator powtarzalny. Strzykawka i aplikator powtarzalny używane do dawkowania substancji owadom. Główne elementy obejmują: 1) igłę, 2) cylinder strzykawki, 3) tłok, 4) aplikator powtarzalny oraz 5) przycisk aplikatora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure2.Final.V1.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 1: Skrypt randomizacji: Skrypt randomizacji służący do tworzenia bezstronnych etykiet dla wszystkich kubków w każdym eksperymencie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File1_Randomization.Script.Final.V1.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Arkusz oceny śmiertelności: Arkusz oceny śmiertelności ułatwiający ocenę śmiertelności. Arkusz zawiera również miejsca na zapisanie wszystkich innych istotnych informacji, o których wspomniano w protokole, takich jak godziny rozpoczęcia i zakończenia aplikacji insektycydu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File2_Mortality.Score.Sheet.Final.V1 (1).docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 3: Przykładowe dane dotyczące śmiertelności: Przykładowy plik z danymi użyty do stworzenia Rysunku 2. Opisy nagłówków kolumn są następujące: &#34;id&#34; = kod identyfikacyjny każdego punktu danych; &#34;species&#34; = nazwa gatunku (np. Aedes aegypti); &#34;insecticide&#34; = nazwa insektycydu zastosowanego miejscowo (np. deltametryna); &#34;strain&#34; = nazwa szczepu komarów (np. ROCK); &#34;date&#34; = data rozpoczęcia aplikacji miejscowej; &#34;sex&#34; = płeć komarów; &#34;age&#34; = wiek komarów (młode = 3-5 dni; stare = 4 tygodnie); &#34;total.mosq&#34; = całkowita liczba komarów zważonych w partii; &#34;weight&#34; = masa (mg) wszystkich komarów w partii; &#34;concentration&#34; = stężenie insektycydu (µg/mL); &#34;syringe&#34; = objętość kropli (mL) z strzykawki; &#34;dose&#34; = ilość substancji czynnej insektycydu zastosowana dla każdego komara (ng); &#34;total&#34; = liczba komarów w każdym kubku; &#34;dead&#34; = liczba martwych komarów w każdym kubku. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File3_Example.Data.Final.V1 (1).txt" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 4: Kod analizy w programie R: Przykładowy kod R, który można wykorzystać do przeprowadzenia analizy probitowej (zgodnie z opisem w kroku 8 protokołu). Reprezentatywne wyniki (dostępne w uzupełniającym pliku z przykładowymi danymi) można przetworzyć za pomocą tego kodu R. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File4.Final.V3 (1).R" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Opisujemy metodologię i znaczenie testu biologicznego do stosowania miejscowego do pomiaru podatności na insektycydy u komarów i muszek owocowych. Prezentowany test jest wysokoprzepustowy, wykorzystuje masę owadów - co pozwala na obliczenie zrelatywizowanej dawki śmiertelnej zamiast stężenia - i prawdopodobnie ma mniejszą zmienność niż inne podobne metody.

Test biologiczny do stosowania miejscowego w celu ilościowego określenia toksyczności insektycydów dla komarów i muszek owocowych

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

Dzięki bezpośredniemu zastosowaniu środka owadobójczego na owada, a nie poprzez kontakt powierzchniowy, występuje minimalna różnica w ekspozycji na środki owadobójcze, a to pozwala nam dokładniej zmierzyć profil podatności populacji komarów. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam obliczyć zrelatywizowane masowo dawki śmiertelne środka owadobójczego, a nie stężenia śmiertelne, co znacznie poprawia porównania współczynników odporności. Uważaj, aby prawidłowo przechowywać środki owadobójcze, unikać zanieczyszczenia narzędzi i upewnić się, że części strzykawki są w dobrym stanie.Pomoże Ci to uzyskać spójne wyniki. Aby rozpocząć, usuń potrzebne roztwory owadobójcze z zamrażarki. Natychmiast zmieszaj roztwór lub odwróć pięć razy i umieść go w odpornym na światło pojemniku o temperaturze pokojowej, aby przed użyciem insektycydy mogły ogrzać się do temperatury pokojowej.Ustaw pięć probówek do mikrowirówek po 0,5 mililitra acetonu każda. Napełnij całkowicie cylinder strzykawki acetonem z pierwszej probówki. Następnie wyrzuć aceton do pojemnika na odpady, szybko naciskając tłok i powtórz jeszcze cztery razy, aby zakończyć w sumie pięć płukań acetonem z tej samej porcji acetonu.Następnie całkowicie napełnij cylinder strzykawki powietrzem i wyrzuć powietrze oraz potencjalne resztki acetonu do pojemnika na odpady. Powtórz jeszcze dwa razy, aby zakończyć trzy prania powietrzem. Utworzyć kieszeń powietrzną w cylindrze między tłokiem strzykawki a górną częścią igły, pociągając tłok do góry na około pięć milimetrów w głąb cylindra.Oznacz plastikowe kubki losowym identyfikatorem do oceny śmiertelności w ciemno. Za pomocą aspiratora zasilanego ssaniem z inhalacji odessać żądaną liczbę trzy- do pięciodniowych dorosłych komarów. Umieść końcówkę aspiratora w tubie z bawełną owiniętą wokół końcówki.Delikatnie zrób wydech i postukaj w aspirator, aby przenieść komary do stożkowej rurki. Użyj bawełny, aby zatkać rurkę po wyjęciu końcówki aspiratora, a następnie nakręć pokrywką. Na krótko powal komary w probówkach, umieszczając je na minimum 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub zakopując je pod lodem w tacce na lód.Przenieś powalone komary do namiotu do obchodzenia się z owadami. Ostrożnie wysyp komary na plastikową tacę umieszczoną na lodzie i wlej około 50 komarów na raz, aby upewnić się, że każdy z nich dotknie chłodnej tacy pod nią i pozostanie powalony. Posortuj komary według płci, delikatnie podnosząc je za nogi lub skrzydła kleszczami, a następnie umieść każdą płeć w osobnym kubku do trzymania i przestań, gdy zostanie osiągnięta pożądana liczba.Podczas sortowania usuń wszelkie komary, które są zranione lub są bardzo duże lub małe. Aby zarejestrować wagę kubka na komary, umieść pusty kubek z szalką Petriego jako pokrywkę na wadze i wytaruj wagę. Wlej komary do pojemnika i przykryj pokrywką na wierzchu.Umieść pojemnik na wadze i zapisz ostateczną wagę wraz z liczbą komarów. Natychmiast umieść kubek z próbkami z powrotem na lodzie, aby utrzymać je unieruchomione do momentu zważenia wszystkich kubków z próbką. Podziel przygotowane komary na pięć do 10 oddzielnych kubków umieszczonych na lodzie, oznaczonych losowymi identyfikatorami.Użyj pęsety i ręcznego licznika, aby uzyskać od 20 do 25 komarów na filiżankę. Aby posortować muszki owocowe, znieczul je za pomocą dwutlenku węgla przez siedem sekund. Wlej muchy na okład z lodu zawinięty w papier na ławkę.Za pomocą pędzla z cienką końcówką oddziel i policz samce i samice. Za pomocą pędzla delikatnie zbierz wybrane muchy i umieść je w czystej, pustej butelce bulionowej. Po wybraniu równej liczby samców i samic muszek owocowych, oznacz butelki bulionowe nazwą szczepu i całkowitą liczbą muszek owocowych.Znieczulenie butelki muszek owocowych za pomocą dwutlenku węgla przez siedem sekund. Wylej muszki owocówki na papier wagowy i użyj papieru jako lejka, aby wprowadzić muchy do wytarowanej fiolki oznaczonej losowym identyfikatorem. Po umieszczeniu pokrywki szalki Petriego na wierzchu fiolki z muszkami owocowymi, umieść ją na wadze. Na karcie wyników należy odnotować łączną masę i liczbę próbek.Natychmiast umieść fiolkę z muszkami owocowymi na tacy z lodem z pokrywką nadal na górze, aby zapobiec ucieczce much. Załadować do strzykawki odpowiednie stężenie środka owadobójczego, zaczynając od najmniej skoncentrowanej dawki i dążyć do najbardziej skoncentrowanej dawki dla każdej grupy organizmów. Przesyp próbki na papier wagowy umieszczony na tacy na lodzie.Oddziel próbki, które są blisko siebie, za pomocą czystego, wolnego od środków owadobójczych pędzla lub wacika, aby umożliwić łatwy dostęp do każdej próbki w celu dozowania. Za pomocą strzykawki nanieść jedną kroplę roztworu środka owadobójczego na brzuszną część klatki piersiowej i brzucha w przypadku komarów oraz na grzbiet w przypadku muszek owocowych. Natychmiast wlej próbki z powrotem do oznaczonego plastikowego kubka.Przykryj kubek siatką i gumką. Zwróć uwagę na zaktualizowaną liczbę próbek na kubku, jeśli jakiekolwiek okazy zostały zabite, uszkodzone lub uciekły w tym procesie. Umieść wypełniony kubek na tacy do przechowywania.W przypadku pierwszej filiżanki należy zanotować czas zakończenia dawkowania. Powtarzaj dozowanie dla każdej filiżanki, aż wszystkie próbki zostaną dozowane z odpowiednimi stężeniami insektycydów i zapisz czas zakończenia, kiedy wszystkie próbki zostały dozowane. Dostarcz 10% roztwór sacharozy do każdej filiżanki za pomocą mokrego wacika i przechowuj komary i muszki owocówki w żądanej temperaturze i wilgotności.Rejestruj śmiertelność próbki po 24 godzinach od rozpoczęcia ekspozycji na insektycydy. Klasyfikuj komary jako żywe, jeśli potrafią latać i utrzymywać się w pozycji pionowej i martwe, jeśli są nieruchome lub ataksyjne, zgodnie z opisem WHO. Postępuj zgodnie z tą samą oceną śmiertelności dla muszek owocowych.Po przeprowadzeniu testu biologicznego uzyskano dane dotyczące odpowiedzi na dawkę obejmującą dwa szczepy o genotypie Rockefellera i IICC dla samca i samicy Aedes aegypti. Masowo zrelatywizowana mediana dawki śmiertelnej dla Rockefellera i IICC wynosiła odpowiednio 0,008 i 0,336 nanograma na miligram. Wyniki nie wykazały różnic między krzywymi odpowiedzi na dawkę komarów żeńskich i męskich w obrębie każdego szczepu.W związku z tym dane dotyczące obu płci połączono w celu obliczenia mediany dawek śmiertelnych. Ponieważ 95-procentowe przedziały ufności dla mediany dawki śmiertelnej tych dwóch szczepów nie pokrywały się, wartości te uznano za znacznie różne. Dodatkowo, przy obliczaniu współczynników odporności, szczep IICC był ponad 40 razy bardziej odporny niż podatny szczep Rockefellera.Uzyskano również dane dotyczące odpowiedzi na dawkę dla muszki owocowej, Drosophila melanogaster, szczepu Canton-S, i stwierdzono, że masowo zrelatywizowana mediana dawki śmiertelnej wynosi 0,213 nanograma na miligram. Konsekwencja ma kluczowe znaczenie, zwłaszcza podczas przechowywania i stosowania środka owadobójczego oraz oceny śmiertelności. Należy również zachować ostrożność podczas obchodzenia się z próbką, aby uniknąć szkód lub śmierci, które nie zostały wywołane przez środek owadobójczy.Dzięki tej metodzie możemy teraz dokładnie określić odporność techniczną populacji komarów i to, jak warunki środowiskowe wpływają na odporność lub jak odporność techniczna przewiduje opór praktyczny.

topical-application-bioassay-to-quantify-insecticide-toxicity-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł demonstruje i omawia techniki stosowane do badania wrażliwości na pestycydy oraz wykrywania oporności na pestycydy kontaktowe i systemiczne u szkodników z grupy stawonogów.

Bioanalizy w monitorowaniu oporności na insektycydy

W tym filmie opisujemy test kontaktu z larwami w celu oceny toksyczności antagonisty receptora dopaminy, amitryptyliny, na larwach komarów w trzecim stadium rozwojowym, znanych wektorach kilku chorób zakaźnych u ludzi. Ocena śmiertelności larw podczas inkubacji z różnymi stężeniami amitryptyliny w różnych odstępach czasu pomaga określić jej stężenie śmiertelne 50.

Test kontaktu z larwami: procedura oceny śmiertelności larw komarów po bezpośrednim kontakcie z badanym związkiem larwobójczym

W tym filmie pokazujemy miejscowy test testowy w celu określenia toksyczności potencjalnego środka owadobójczego na dorosłe samice komarów. Wykorzystując antagonistę receptora dopaminy, który powoduje śmiertelne hamowanie neuroprzekaźnictwa u komarów, metoda ta opisuje sposób oceny toksycznego działania insektycydów po miejscowym stosowaniu.

Test do badań miejscowych: technika oceny potencjału owadobójczego antagonistów receptora dopaminy u dorosłych samic komarów poprzez zastosowanie miejscowe

Ten film demonstruje test odżywiania krwią w celu oceny śmiertelności i płodności badanych związków o nowych sposobach działania na samice komarów. Technika ta pomaga w badaniach przesiewowych nowych klas insektycydów w celu zabicia opornej populacji komarów i kontrolowania rozprzestrzeniania się choroby.

Test żerowania komarów: metoda oceny wpływu badanego związku na śmiertelność i płodność dorosłych samic komarów

Protokoły są opisane do oceny toksyczności chemii dla niedojrzałych i dorosłych komarów do rozwoju jako nowe klasy larwobójców, adultycydów i endektocydów. Protokoły umożliwiają wysokoprzepustowe testowanie wielu substancji chemicznych przy dawce jednopunktowej, a następnie ocenę za pomocą testu dawka-odpowiedź w celu określenia toksyczności w kontakcie lub po spożyciu.

Protokoły badania toksyczności nowych środków owadobójczych dla komarów

Skuteczność pestycydów zdrowia publicznego przeciwko uciążliwym owadom i wektorom chorób nie jest jednakowa w różnych strefach ekologicznych. W tym miejscu przedstawiamy system technik wykorzystujących owady wektory żyjące w niewoli jako strażników skuteczności pestycydów w celu uzyskania elektronicznych map wspierających standardową ocenę pestycydów w wielu środowiskach.

Wizualizacja skuteczności pestycydów przeciwko komarom wektorom chorób w terenie

Ten protokół opisuje metodologię mikroiniekcji, którą ustandaryzowaliśmy i stosowaliśmy przez kilka lat, aby dostarczyć określone ilości kwasów nukleinowych bezpośrednio do hemolimfy komarów i much domowych. Protokół ten skutkuje minimalną śmiertelnością po wstrzyknięciach i umożliwia pomiary płodności skorelowane z dawką.

Powtarzalny test biologiczny mikroiniekcji dsRNA i składania jaj u komarów i much domowych

Agresja jest wrodzonym zachowaniem, które wyewoluowało w ramach obrony lub zdobywania zasobów. To złożone zachowanie społeczne jest kształtowane przez...

Badanie agresji u Drosophila (muszek owocówek)

W tym filmie Nijole Jasinskiene prezentuje metodologię wykorzystywaną do tworzenia transgenicznych komarów Aedes aegypti, które są wektorami gorączki Denga. Przedstawione zostają techniki prawidłowego przygotowania igieł do mikroiniekcji, wysuszania embrionów oraz przeprowadzania mikroiniekcji.

Mikroiniekcja zarodków A. aegypti w celu uzyskania transgenicznych komarów

Fopius arisanus jest parasitoidem jaj i larw muszek owocówek z rodziny Tephritidae, który jest z sukcesem wykorzystywany w biologicznej kontroli tych istotnych tropikalnych szkodników. Opisujemy tutaj zoptymalizowany protokół hodowli F. arisanus na małą skalę z wykorzystaniem łatwo dostępnych materiałów.

Zoptymalizowany protokół hodowli Fopius arisanus, parasytoida much owocówek z rodziny Tephritidae

Poznaj metodę aplikacji miejscowej do ilościowego określania toksyczności insektycydów u komarów i muszek owocowych. Technika ta umożliwia obliczanie dawek śmiertelnych z uwzględnieniem masy ciała, co poprawia precyzję pomiarów oporności.

Test biologiczny do stosowania miejscowego w celu ilościowego określenia toksyczności insektycydów dla komarów i muszek owocowych (Wideo) | JoVE Journal

Test biologiczny do stosowania miejscowego w celu ilościowego określenia toksyczności insektycydów dla komarów i muszek owocowych

Przeglądaj więcej filmów