Test biologiczny do stosowania miejscowego w celu ilościowego określenia toksyczności insektycydów dla komarów i muszek owocowych

Dzięki bezpośredniemu zastosowaniu środka owadobójczego na owada, a nie poprzez kontakt powierzchniowy, występuje minimalna różnica w ekspozycji na środki owadobójcze, a to pozwala nam dokładniej zmierzyć profil podatności populacji komarów. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam obliczyć zrelatywizowane masowo dawki śmiertelne środka owadobójczego, a nie stężenia śmiertelne, co znacznie poprawia porównania współczynników odporności. Uważaj, aby prawidłowo przechowywać środki owadobójcze, unikać zanieczyszczenia narzędzi i upewnić się, że części strzykawki są w dobrym stanie.

Pomoże Ci to uzyskać spójne wyniki. Aby rozpocząć, usuń potrzebne roztwory owadobójcze z zamrażarki. Natychmiast zmieszaj roztwór lub odwróć pięć razy i umieść go w odpornym na światło pojemniku o temperaturze pokojowej, aby przed użyciem insektycydy mogły ogrzać się do temperatury pokojowej.

Ustaw pięć probówek do mikrowirówek po 0,5 mililitra acetonu każda. Napełnij całkowicie cylinder strzykawki acetonem z pierwszej probówki. Następnie wyrzuć aceton do pojemnika na odpady, szybko naciskając tłok i powtórz jeszcze cztery razy, aby zakończyć w sumie pięć płukań acetonem z tej samej porcji acetonu.

Następnie całkowicie napełnij cylinder strzykawki powietrzem i wyrzuć powietrze oraz potencjalne resztki acetonu do pojemnika na odpady. Powtórz jeszcze dwa razy, aby zakończyć trzy prania powietrzem. Utworzyć kieszeń powietrzną w cylindrze między tłokiem strzykawki a górną częścią igły, pociągając tłok do góry na około pięć milimetrów w głąb cylindra.

Oznacz plastikowe kubki losowym identyfikatorem do oceny śmiertelności w ciemno. Za pomocą aspiratora zasilanego ssaniem z inhalacji odessać żądaną liczbę trzy- do pięciodniowych dorosłych komarów. Umieść końcówkę aspiratora w tubie z bawełną owiniętą wokół końcówki.

Delikatnie zrób wydech i postukaj w aspirator, aby przenieść komary do stożkowej rurki. Użyj bawełny, aby zatkać rurkę po wyjęciu końcówki aspiratora, a następnie nakręć pokrywką. Na krótko powal komary w probówkach, umieszczając je na minimum 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub zakopując je pod lodem w tacce na lód.

Przenieś powalone komary do namiotu do obchodzenia się z owadami. Ostrożnie wysyp komary na plastikową tacę umieszczoną na lodzie i wlej około 50 komarów na raz, aby upewnić się, że każdy z nich dotknie chłodnej tacy pod nią i pozostanie powalony. Posortuj komary według płci, delikatnie podnosząc je za nogi lub skrzydła kleszczami, a następnie umieść każdą płeć w osobnym kubku do trzymania i przestań, gdy zostanie osiągnięta pożądana liczba.

Podczas sortowania usuń wszelkie komary, które są zranione lub są bardzo duże lub małe. Aby zarejestrować wagę kubka na komary, umieść pusty kubek z szalką Petriego jako pokrywkę na wadze i wytaruj wagę. Wlej komary do pojemnika i przykryj pokrywką na wierzchu.

Umieść pojemnik na wadze i zapisz ostateczną wagę wraz z liczbą komarów. Natychmiast umieść kubek z próbkami z powrotem na lodzie, aby utrzymać je unieruchomione do momentu zważenia wszystkich kubków z próbką. Podziel przygotowane komary na pięć do 10 oddzielnych kubków umieszczonych na lodzie, oznaczonych losowymi identyfikatorami.

Użyj pęsety i ręcznego licznika, aby uzyskać od 20 do 25 komarów na filiżankę. Aby posortować muszki owocowe, znieczul je za pomocą dwutlenku węgla przez siedem sekund. Wlej muchy na okład z lodu zawinięty w papier na ławkę.

Za pomocą pędzla z cienką końcówką oddziel i policz samce i samice. Za pomocą pędzla delikatnie zbierz wybrane muchy i umieść je w czystej, pustej butelce bulionowej. Po wybraniu równej liczby samców i samic muszek owocowych, oznacz butelki bulionowe nazwą szczepu i całkowitą liczbą muszek owocowych.

Znieczulenie butelki muszek owocowych za pomocą dwutlenku węgla przez siedem sekund. Wylej muszki owocówki na papier wagowy i użyj papieru jako lejka, aby wprowadzić muchy do wytarowanej fiolki oznaczonej losowym identyfikatorem. Po umieszczeniu pokrywki szalki Petriego na wierzchu fiolki z muszkami owocowymi, umieść ją na wadze. Na karcie wyników należy odnotować łączną masę i liczbę próbek.

Natychmiast umieść fiolkę z muszkami owocowymi na tacy z lodem z pokrywką nadal na górze, aby zapobiec ucieczce much. Załadować do strzykawki odpowiednie stężenie środka owadobójczego, zaczynając od najmniej skoncentrowanej dawki i dążyć do najbardziej skoncentrowanej dawki dla każdej grupy organizmów. Przesyp próbki na papier wagowy umieszczony na tacy na lodzie.

Oddziel próbki, które są blisko siebie, za pomocą czystego, wolnego od środków owadobójczych pędzla lub wacika, aby umożliwić łatwy dostęp do każdej próbki w celu dozowania. Za pomocą strzykawki nanieść jedną kroplę roztworu środka owadobójczego na brzuszną część klatki piersiowej i brzucha w przypadku komarów oraz na grzbiet w przypadku muszek owocowych. Natychmiast wlej próbki z powrotem do oznaczonego plastikowego kubka.

Przykryj kubek siatką i gumką. Zwróć uwagę na zaktualizowaną liczbę próbek na kubku, jeśli jakiekolwiek okazy zostały zabite, uszkodzone lub uciekły w tym procesie. Umieść wypełniony kubek na tacy do przechowywania.

W przypadku pierwszej filiżanki należy zanotować czas zakończenia dawkowania. Powtarzaj dozowanie dla każdej filiżanki, aż wszystkie próbki zostaną dozowane z odpowiednimi stężeniami insektycydów i zapisz czas zakończenia, kiedy wszystkie próbki zostały dozowane. Dostarcz 10% roztwór sacharozy do każdej filiżanki za pomocą mokrego wacika i przechowuj komary i muszki owocówki w żądanej temperaturze i wilgotności.

Rejestruj śmiertelność próbki po 24 godzinach od rozpoczęcia ekspozycji na insektycydy. Klasyfikuj komary jako żywe, jeśli potrafią latać i utrzymywać się w pozycji pionowej i martwe, jeśli są nieruchome lub ataksyjne, zgodnie z opisem WHO. Postępuj zgodnie z tą samą oceną śmiertelności dla muszek owocowych.

Po przeprowadzeniu testu biologicznego uzyskano dane dotyczące odpowiedzi na dawkę obejmującą dwa szczepy o genotypie Rockefellera i IICC dla samca i samicy Aedes aegypti. Masowo zrelatywizowana mediana dawki śmiertelnej dla Rockefellera i IICC wynosiła odpowiednio 0,008 i 0,336 nanograma na miligram. Wyniki nie wykazały różnic między krzywymi odpowiedzi na dawkę komarów żeńskich i męskich w obrębie każdego szczepu.

W związku z tym dane dotyczące obu płci połączono w celu obliczenia mediany dawek śmiertelnych. Ponieważ 95-procentowe przedziały ufności dla mediany dawki śmiertelnej tych dwóch szczepów nie pokrywały się, wartości te uznano za znacznie różne. Dodatkowo, przy obliczaniu współczynników odporności, szczep IICC był ponad 40 razy bardziej odporny niż podatny szczep Rockefellera.

Uzyskano również dane dotyczące odpowiedzi na dawkę dla muszki owocowej, Drosophila melanogaster, szczepu Canton-S, i stwierdzono, że masowo zrelatywizowana mediana dawki śmiertelnej wynosi 0,213 nanograma na miligram. Konsekwencja ma kluczowe znaczenie, zwłaszcza podczas przechowywania i stosowania środka owadobójczego oraz oceny śmiertelności. Należy również zachować ostrożność podczas obchodzenia się z próbką, aby uniknąć szkód lub śmierci, które nie zostały wywołane przez środek owadobójczy.

Dzięki tej metodzie możemy teraz dokładnie określić odporność techniczną populacji komarów i to, jak warunki środowiskowe wpływają na odporność lub jak odporność techniczna przewiduje opór praktyczny.