Protokoły badania toksyczności nowych środków owadobójczych dla komarów
13 lutego 2019
Protokoły są opisane do oceny toksyczności chemii dla niedojrzałych i dorosłych komarów do rozwoju jako nowe klasy larwobójców, adultycydów i endektocydów. Protokoły umożliwiają wysokoprzepustowe testowanie wielu substancji chemicznych przy dawce jednopunktowej, a następnie ocenę za pomocą testu dawka-odpowiedź w celu określenia toksyczności w kontakcie lub po spożyciu.
Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie odkrywania insektycydów i kontroli wektorów. Na przykład, jak toksyczna jest niesformułowana chemia dla populacji larw komarów lub dorosłych komarów? Czy substancja chemiczna ma potencjał do rozwoju jako larwobójca lub osobnik dorosłego?
A jaka może być najskuteczniejsza trasa dostawy? Głównymi zaletami tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do oceny toksyczności niesformułowanych substancji chemicznych Toksyczność chemii wobec wielu gatunków komarów-wektorów i można ją zwiększyć w celu oceny setek związków o wysokiej przepustowości. Procedurę zademonstruje Jasleen Kaur, technik naukowy z mojego laboratorium.
Na początek oznacz studzienki 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Użyć wagi analitycznej do zważenia badanego związku. Następnie rozpuść związek w sterylnej podwójnie destylowanej wodzie w probówce o pojemności 1,5 ml, uzyskując roztwór podstawowy o pojemności 80 mM.
Następnie należy seryjnie rozcieńczyć roztwór podstawowy za pomocą podwójnie destylowanej wody, aby przygotować robocze roztwory podstawowe o pożądanych stężeniach. Należy pamiętać, że należy zachować ostrożność, larwy są dodawane do studzienek, podczas usuwania nadmiaru wody oraz po dodaniu chemii testowej, aby uniknąć fizycznego uszkodzenia larw. Uraz może zwiększyć śmiertelność, a tym samym dać fałszywie dodatnie wyniki lub unieważnić test.
Użyj plastikowej pipety transferowej o szerokim otworze, aby przenieść pięć larw trzeciego stadium do każdego dołka płytki. Następnie użyj pipety o pojemności jednego ml, aby delikatnie usunąć wodę i zastąp ją żądaną objętością wody podwójnie destylowanej. Uważaj, aby nie dotykać larw podczas usuwania wody, szybko pracuj, aby larwy nie wyschły, i delikatnie dodaj chemię testową, pipetując do przeciwnej strony plastikowej studzienki.
Dodać odpowiednią objętość roztworu testowego do każdego dołka i delikatnie obrócić płytkę, aby zapewnić równomierne wymieszanie. Umieść płytkę w komorze wzrostowej, utrzymując 12-godzinny cykl światła/ciemności w temperaturze 25 stopni Celsjusza przy wilgotności względnej od 75 do 85 procent. Aby sprawdzić ruch larw, delikatnie postukaj w płytkę.
Jeśli nie zaobserwujesz żadnego ruchu, delikatnie dotknij larwy sterylną wykałaczką. Oznacz larwę jako martwą, jeśli nie zauważysz żadnej reakcji, i użyj arkusza punktacji, aby zapisać całkowitą liczbę martwych larw w każdej studzience, w punktach czasowych opisanych w protokole tekstowym. Hodowla trzy- do pięciodniowych dorosłych samic komarów w 20-litrowej plastikowej klatce.
Oznacz dziewięciouncjowe kubki papierowe nazwą i stężeniem badanego związku. Następnie należy przygotować 10 mg/ml roztworu podstawowego badanego związku w acetonie w szklanej fiolce o pojemności 20 ml. Następnie należy seryjnie rozcieńczyć roztwór podstawowy, aby uzyskać pożądane stężenia robocze.
Wyczyść szklaną strzykawkę o pojemności jednego ml acetonem. Następnie napełnij go roztworem testowym o odpowiednim stężeniu. Zabezpiecz strzykawkę w mikroaplikatorze dostosowanym do objętości 0,25 uL.
Następnie użyj aspiratora, aby usunąć z klatki 10, trzy do pięciu dni dorosłych samic komarów. Znieczulaj je przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przenieś komary na szalkę Petriego.
Umieść naczynie na lodzie na 10 minut. Aby uniknąć uszkodzenia dorosłego komara, co mogłoby przyczynić się do śmiertelności, upewnij się, że nie są one znieczulone w lodówce na dłużej niż pięć minut lub unieruchomione na lodzie na dłużej niż 10 i zminimalizuj obchodzenie się z komarami. Jeśli masz dostęp do zimnej płyty i mikromanipulatora z ruchomym stolikiem, może to jeszcze bardziej zminimalizować obchodzenie się z komarami.
Użyj cienkiej pęsety, aby usunąć każdego komara z naczynia. Za pomocą mikroaplikatora strzykawkowego nałóż 0,25 uL roztworu testowego na grzbietową klatkę piersiową, pod mikroskopem preparacyjnym Następnie przenieś komary do oznaczonego papierowego kubka na lodzie. Uszczelnij kubek kwadratem o wymiarach 10 na 10 cm i gumką Następnie przenieś go do komory wzrostowej i zapisz liczbę martwych komarów zgodnie z wcześniejszym opisem.
Zbierz około 150 cztero- do pięciodniowych dorosłych samic komarów za pomocą aspiratora i przenieś je do osobnej klatki. Usuń źródło cukru od jednej do 24 godzin przed testem karmienia. Przygotować 80 mM roztwór podstawowy badanego związku w wodzie.
Następnie należy go seryjnie rozcieńczyć wodą, aby uzyskać robocze roztwory podstawowe o pożądanych stężeniach. Aby uzyskać pożądane stężenia testowe, dodaj 40 μl każdego rozcieńczenia do 960 μl zdefibrynowanej krwi królika w probówce o pojemności 1,5 ml i wymieszaj przez pipetowanie. Umieść filtr prętowy na jednostce zasilającej i uszczelnij go gumowym pierścieniem.
Następnie za pomocą pipety przenieś jeden ml krwi z roztworem testowym przez port podawania, znajdujący się po odwrotnej stronie jednostki podającej. Podłącz podajnik do urządzenia grzewczego. Następnie delikatnie przetrzyj powierzchnię membrany świeżo przygotowanym 10-procentowym roztworem kwasu mlekowego.
Umieść jednostkę karmiącą w klatce. Przykryj klatkę ciemną szmatką i pozwól komarom żerować przez godzinę. Po nakarmieniu komarów umieść klatkę w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza na pięć minut, aby znieczulić komary.
Następnie policz i zapisz całkowitą liczbę komarów w klatce. Badając jamę brzuszną, policz i zapisz całkowitą liczbę w pełni i częściowo odżywionych samic komarów. W jednej dawce należy pobrać co najmniej 50 komarów karmionych krwią.
Usuń wszelkie komary, które nie karmiły. Następnie przenieś klatkę do komory wzrostowej i użyj arkusza wyników, aby zapisać liczbę martwych komarów w odpowiednich punktach czasowych. Trzeciego dnia po karmieniu krwią umieść kubek na jajka w klatce na 72 godziny.
Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby policzyć całkowitą liczbę jaj wyprodukowanych podczas jednego zabiegu. Przeprowadzono test kontaktu z larwami w celu oceny wpływu amitryptyliny, antagonisty receptora dopaminy, na śmiertelność larw w czasie. Dane ujawniły, że wartość LC 50 zmniejsza się w czasie trwania eksperymentu.
Wpływ amitryptyliny na śmiertelność dorosłych samic komarów porównano z bifentryną i dwiema negatywnymi kontrolami. W porównaniu z kontrolami ujemnymi traktowanymi acetonem i nieleczonymi, zarówno amitryptylina, jak i bifentryna powodowały znaczną śmiertelność w każdym eksperymentalnym punkcie czasowym. Przeprowadzono ilościowy test żywieniowy w celu oceny wpływu trzech różnych dawek amitryptyliny na płodność i procentową śmiertelność dorosłych samic komarów.
Dane nie wykazały statystycznie istotnej różnicy w płodności komarów karmionych amitryptyliną w najwyższej dawce w porównaniu z grupą kontrolną karmioną wyłącznie krwią. Po opanowaniu, każdy z opisanych tutaj testów może zostać wykonany w ciągu około dwóch godzin przez jedną osobę, jeśli zostanie prawidłowo wykonany. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o delikatnym obchodzeniu się z organizmem, a podczas stosowania miejscowego oraz podczas oceniania larw lub dorosłych osobników powinna być spójna.
Zgodnie z tą procedurą, można przeprowadzić inne metody, takie jak testy biologiczne do oceny toksyczności poprzez wchłanianie, przez tarsi komarów, test butelkowy CDC i test probówkowy WHO, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące skuteczności niesformułowanej chemii lub preparatu produktu oraz potencjału do opracowania jako insektycyd kontaktowy lub spray kosmiczny.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokoły oceny toksyczności różnych substancji chemicznych wobec niedojrzałych i dorosłych komarów, mające na celu opracowanie nowych larwicydów i adultycydów. Metody te umożliwiają prowadzenie testów wysokoprzepustowych oraz oceny zależności dawka-odpowiedź w celu określenia toksyczności poprzez kontakt lub spożycie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Odkrywanie insektycydów
- Kontrola wektorów
- Toksykologia
Wstęp
- Zrozumienie toksyczności nieformułowanych substancji chemicznych jest kluczowe dla zwalczania komarów.
- Badania wysokoprzepustowe pozwalają na efektywną ocenę wielu związków.
- Protokoły są opracowane w taki sposób, aby zminimalizować uszkodzenia fizyczne obiektów badawczych.
- Badane są różne drogi podania substancji chemicznych w testach.
Cel badania
- Ocena toksyczności różnych substancji chemicznych dla populacji komarów.
- Identyfikacja potencjalnych larwobójczych i owadobójczych środków zwalczających osobniki dorosłe.
- Określenie najskuteczniejszych metod aplikacji tych substancji.
Zastosowane metody
- Przygotowanie roztworów zapasowych i rozcieńczeń seryjnych związków testowych.
- Zastosowanie 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych w testach z larwami.
- Aplikacja roztworów testowych dorosłym komarom przy użyciu mikroaplikatorów.
- Testy żerowania z wykorzystaniem defibrynowanej krwi królika zmieszanej z roztworami testowymi.
Główne wyniki
- Protokoły wykazały skuteczność w ocenie śmiertelności larw i dorosłych osobników komarów.
- Dane wskazały na zmienne poziomy toksyczności testowanych związków w czasie.
- Porównanie amitryptyliny i bifentryny wykazało istotne różnice w wskaźnikach śmiertelności.
- Wysoka przepustowość umożliwiła ocenę licznych związków.
Wnioski
- Opracowane protokoły są cenne w badaniach nad odkrywaniem insektycydów i kontrolą wektorów.
- Wyniki mogą pomóc w opracowaniu nowych strategii zwalczania komarów.
- Konieczne są dalsze badania w celu zbadania długoterminowych efektów stosowania tych związków chemicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia wczesną ocenę nowych związków owadobójczych przeciwko kluczowym wektorom komarów, wspierając walidację celów oraz identyfikację wiodących związków w programach kontroli wektorów. Dzięki zastosowaniu zestandaryzowanych testów wysokoprzepustowych toksyczności dla larw i osobników dorosłych, przeprowadzanych drogą kontaktu i spożycia, metoda ta ułatwia analizę mechanistyczną i zwiększa pewność predykcyjną w priorytetyzacji związków. Podejście to pomaga w selekcji substancji do dalszego rozwoju jako larwicydy lub adultycydy, ograniczając odrzuty na późnych etapach procesów odkrywania pestycydów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez toksykologicznych i wyjaśnienie szlaków przekazywania sygnałów dla nowych związków chemicznych skierowanych przeciwko komarom będącym wektorami chorób.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez testy śmiertelności zależnej od dawki u Aedes aegypti, Anopheles gambiae oraz Culex quinquefasciatus.
- Wartość strategiczna: Zapewnia pewność prognostyczną w ramach selekcji portfela poprzez wczesne identyfikowanie związków o potencjale larwicydowym lub adultycydowym na etapie odkrywania.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych badań przesiewowych poprzez ustalenie powtarzalnych punktów końcowych toksyczności.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację i skalowalność testów, pozwalając na ocenę setek związków w formacie wysokoprzepustowym.
- Wartość strategiczna: Zwiększa gotowość do badań przesiewowych i możliwość ponownego wykorzystania platformy do iteracyjnego testowania związków w różnych drogach podania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera testowanie systemów istotnych dla chorób z wykorzystaniem głównych gatunków wektorów wirusa Zika, dengi, żółtej febry i malarii.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość translacyjną od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną dzięki spójnym odczytom śmiertelności i płodności.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji do podejmowania decyzji o dalszym rozwoju z uwzględnieniem ryzyka poprzez ilościowe określanie toksyczności oraz efektów subletalnych, takich jak zmniejszenie płodności.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkrywania leków, od wczesnej oceny trafień po optymalizację wiodących związków, w szczególności w programach kontroli wektorów poszukujących nowych mechanizmów działania.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i redukcję ryzyka biologicznego poprzez ilościowe określanie toksyczności w różnych gatunkach i drogach ekspozycji.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość testów oraz dane ilościowe (LC50, wskaźniki śmiertelności) dla wiarygodnej oceny związków w formatach 24-dołkowych oraz w testach karmienia.
- Analityka: Generuje dane dotyczące zależności dawka-odpowiedź oraz profile śmiertelności w czasie, co umożliwia porównywanie różnych związków i inicjowanie analiz zależności struktura-aktywność.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez standaryzowane testy karmienia osobników dorosłych oraz oceny płodności w modelach komarów istotnych dla danych jednostek chorobowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia możliwość wielokrotnego wykorzystania do iteracyjnego testowania nieformulowanych substancji chemicznych w wielu projektach i gatunkach wektorów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Przewidywalna pewność w walidacji celu, ograniczenie dwuznaczności mechanistycznej w profilowaniu toksyczności.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność w testach kontaktu z larwami, aplikacjach miejscowych u dorosłych osobników oraz testach żerowania na krwi.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zmniejszone ryzyko biologiczne na późnych etapach opracowywania insektycydów.
- Wpływ na portfolio: Usprawnienie priorytetyzacji i decyzji o dalszym rozwoju z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o toksyczność specyficzną dla gatunków oraz skuteczność drogi podania.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza z zakresu hodowli, obchodzenia się z komarami oraz technik przeprowadzania testów, aby uniknąć artefaktów wynikających z uszkodzeń mechanicznych.
- Konieczne są wagi analityczne, mikroaplikatory, komory wzrostowe z kontrolowaną temperaturą i wilgotnością oraz sprzęt dozujący do precyzyjnego podawania związków.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie wyznaczania stadiów larwalnych, synchronizacji wieku osobników dorosłych oraz kryteriów oceny w celu zapewnienia porównywalności danych.
- Należy uwzględnić kwestie adaptacyjne przy rozszerzaniu protokołów na inne gatunki komarów lub inne warunki środowiskowe.
- Uwzględniono ograniczenia praktyczne, takie jak kompatybilność rozpuszczalników (np. aceton w przypadku aplikacji miejscowych) oraz potrzeba minimalizowania stresu organizmów podczas manipulacji.
