Protokoły badania toksyczności nowych środków owadobójczych dla komarów
February 13th, 2019
Protokoły są opisane do oceny toksyczności chemii dla niedojrzałych i dorosłych komarów do rozwoju jako nowe klasy larwobójców, adultycydów i endektocydów. Protokoły umożliwiają wysokoprzepustowe testowanie wielu substancji chemicznych przy dawce jednopunktowej, a następnie ocenę za pomocą testu dawka-odpowiedź w celu określenia toksyczności w kontakcie lub po spożyciu.
Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie odkrywania insektycydów i kontroli wektorów. Na przykład, jak toksyczna jest niesformułowana chemia dla populacji larw komarów lub dorosłych komarów? Czy substancja chemiczna ma potencjał do rozwoju jako larwobójca lub osobnik dorosłego?
A jaka może być najskuteczniejsza trasa dostawy? Głównymi zaletami tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do oceny toksyczności niesformułowanych substancji chemicznych Toksyczność chemii wobec wielu gatunków komarów-wektorów i można ją zwiększyć w celu oceny setek związków o wysokiej przepustowości. Procedurę zademonstruje Jasleen Kaur, technik naukowy z mojego laboratorium.
Na początek oznacz studzienki 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Użyć wagi analitycznej do zważenia badanego związku. Następnie rozpuść związek w sterylnej podwójnie destylowanej wodzie w probówce o pojemności 1,5 ml, uzyskując roztwór podstawowy o pojemności 80 mM.
Następnie należy seryjnie rozcieńczyć roztwór podstawowy za pomocą podwójnie destylowanej wody, aby przygotować robocze roztwory podstawowe o pożądanych stężeniach. Należy pamiętać, że należy zachować ostrożność, larwy są dodawane do studzienek, podczas usuwania nadmiaru wody oraz po dodaniu chemii testowej, aby uniknąć fizycznego uszkodzenia larw. Uraz może zwiększyć śmiertelność, a tym samym dać fałszywie dodatnie wyniki lub unieważnić test.
Użyj plastikowej pipety transferowej o szerokim otworze, aby przenieść pięć larw trzeciego stadium do każdego dołka płytki. Następnie użyj pipety o pojemności jednego ml, aby delikatnie usunąć wodę i zastąp ją żądaną objętością wody podwójnie destylowanej. Uważaj, aby nie dotykać larw podczas usuwania wody, szybko pracuj, aby larwy nie wyschły, i delikatnie dodaj chemię testową, pipetując do przeciwnej strony plastikowej studzienki.
Dodać odpowiednią objętość roztworu testowego do każdego dołka i delikatnie obrócić płytkę, aby zapewnić równomierne wymieszanie. Umieść płytkę w komorze wzrostowej, utrzymując 12-godzinny cykl światła/ciemności w temperaturze 25 stopni Celsjusza przy wilgotności względnej od 75 do 85 procent. Aby sprawdzić ruch larw, delikatnie postukaj w płytkę.
Jeśli nie zaobserwujesz żadnego ruchu, delikatnie dotknij larwy sterylną wykałaczką. Oznacz larwę jako martwą, jeśli nie zauważysz żadnej reakcji, i użyj arkusza punktacji, aby zapisać całkowitą liczbę martwych larw w każdej studzience, w punktach czasowych opisanych w protokole tekstowym. Hodowla trzy- do pięciodniowych dorosłych samic komarów w 20-litrowej plastikowej klatce.
Oznacz dziewięciouncjowe kubki papierowe nazwą i stężeniem badanego związku. Następnie należy przygotować 10 mg/ml roztworu podstawowego badanego związku w acetonie w szklanej fiolce o pojemności 20 ml. Następnie należy seryjnie rozcieńczyć roztwór podstawowy, aby uzyskać pożądane stężenia robocze.
Wyczyść szklaną strzykawkę o pojemności jednego ml acetonem. Następnie napełnij go roztworem testowym o odpowiednim stężeniu. Zabezpiecz strzykawkę w mikroaplikatorze dostosowanym do objętości 0,25 uL.
Następnie użyj aspiratora, aby usunąć z klatki 10, trzy do pięciu dni dorosłych samic komarów. Znieczulaj je przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przenieś komary na szalkę Petriego.
Umieść naczynie na lodzie na 10 minut. Aby uniknąć uszkodzenia dorosłego komara, co mogłoby przyczynić się do śmiertelności, upewnij się, że nie są one znieczulone w lodówce na dłużej niż pięć minut lub unieruchomione na lodzie na dłużej niż 10 i zminimalizuj obchodzenie się z komarami. Jeśli masz dostęp do zimnej płyty i mikromanipulatora z ruchomym stolikiem, może to jeszcze bardziej zminimalizować obchodzenie się z komarami.
Użyj cienkiej pęsety, aby usunąć każdego komara z naczynia. Za pomocą mikroaplikatora strzykawkowego nałóż 0,25 uL roztworu testowego na grzbietową klatkę piersiową, pod mikroskopem preparacyjnym Następnie przenieś komary do oznaczonego papierowego kubka na lodzie. Uszczelnij kubek kwadratem o wymiarach 10 na 10 cm i gumką Następnie przenieś go do komory wzrostowej i zapisz liczbę martwych komarów zgodnie z wcześniejszym opisem.
Zbierz około 150 cztero- do pięciodniowych dorosłych samic komarów za pomocą aspiratora i przenieś je do osobnej klatki. Usuń źródło cukru od jednej do 24 godzin przed testem karmienia. Przygotować 80 mM roztwór podstawowy badanego związku w wodzie.
Następnie należy go seryjnie rozcieńczyć wodą, aby uzyskać robocze roztwory podstawowe o pożądanych stężeniach. Aby uzyskać pożądane stężenia testowe, dodaj 40 μl każdego rozcieńczenia do 960 μl zdefibrynowanej krwi królika w probówce o pojemności 1,5 ml i wymieszaj przez pipetowanie. Umieść filtr prętowy na jednostce zasilającej i uszczelnij go gumowym pierścieniem.
Następnie za pomocą pipety przenieś jeden ml krwi z roztworem testowym przez port podawania, znajdujący się po odwrotnej stronie jednostki podającej. Podłącz podajnik do urządzenia grzewczego. Następnie delikatnie przetrzyj powierzchnię membrany świeżo przygotowanym 10-procentowym roztworem kwasu mlekowego.
Umieść jednostkę karmiącą w klatce. Przykryj klatkę ciemną szmatką i pozwól komarom żerować przez godzinę. Po nakarmieniu komarów umieść klatkę w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza na pięć minut, aby znieczulić komary.
Następnie policz i zapisz całkowitą liczbę komarów w klatce. Badając jamę brzuszną, policz i zapisz całkowitą liczbę w pełni i częściowo odżywionych samic komarów. W jednej dawce należy pobrać co najmniej 50 komarów karmionych krwią.
Usuń wszelkie komary, które nie karmiły. Następnie przenieś klatkę do komory wzrostowej i użyj arkusza wyników, aby zapisać liczbę martwych komarów w odpowiednich punktach czasowych. Trzeciego dnia po karmieniu krwią umieść kubek na jajka w klatce na 72 godziny.
Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby policzyć całkowitą liczbę jaj wyprodukowanych podczas jednego zabiegu. Przeprowadzono test kontaktu z larwami w celu oceny wpływu amitryptyliny, antagonisty receptora dopaminy, na śmiertelność larw w czasie. Dane ujawniły, że wartość LC 50 zmniejsza się w czasie trwania eksperymentu.
Wpływ amitryptyliny na śmiertelność dorosłych samic komarów porównano z bifentryną i dwiema negatywnymi kontrolami. W porównaniu z kontrolami ujemnymi traktowanymi acetonem i nieleczonymi, zarówno amitryptylina, jak i bifentryna powodowały znaczną śmiertelność w każdym eksperymentalnym punkcie czasowym. Przeprowadzono ilościowy test żywieniowy w celu oceny wpływu trzech różnych dawek amitryptyliny na płodność i procentową śmiertelność dorosłych samic komarów.
Dane nie wykazały statystycznie istotnej różnicy w płodności komarów karmionych amitryptyliną w najwyższej dawce w porównaniu z grupą kontrolną karmioną wyłącznie krwią. Po opanowaniu, każdy z opisanych tutaj testów może zostać wykonany w ciągu około dwóch godzin przez jedną osobę, jeśli zostanie prawidłowo wykonany. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o delikatnym obchodzeniu się z organizmem, a podczas stosowania miejscowego oraz podczas oceniania larw lub dorosłych osobników powinna być spójna.
Zgodnie z tą procedurą, można przeprowadzić inne metody, takie jak testy biologiczne do oceny toksyczności poprzez wchłanianie, przez tarsi komarów, test butelkowy CDC i test probówkowy WHO, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące skuteczności niesformułowanej chemii lub preparatu produktu oraz potencjału do opracowania jako insektycyd kontaktowy lub spray kosmiczny.
Przegląd
W tym artykule przedstawiono protokoły oceny toksyczności różnych chemikaliów dla niedojrzałych i dorosłych komarów, mające na celu opracowanie nowych larwicydów i adultycydów. Metody te umożliwiają testowanie wysokoprzepustowe i oceny zależności dawka-odpowiedź w celu określenia toksyczności poprzez kontakt lub spożycie.
Kluczowe Elementy Badania
Obszar Nauki
- Odkrywanie insektycydów
- Kontrola wektorów
- Toksykologia
Tło
- Zrozumienie toksyczności nieformułowanych chemikaliów jest kluczowe dla kontroli populacji komarów.
- Testowanie wysokoprzepustowe może sprawnie ocenić wiele związków.
- Protokoły zostały zaprojektowane w celu zminimalizowania uszkodzeń fizycznych u badanych osobników.
- Przedstawiono różne drogi podawania chemikaliów do testów.
Cel Badania
- Ocena toksyczności różnych chemikaliów na populacje komarów.
- Identyfikacja potencjalnych larwicydów i adultycydów.
- Określenie najbardziej skutecznych metod podawania tych chemikaliów.
Wykorzystane Metody
- Przygotowanie roztworów zapasowych i rozcieńczeń szeregowych związków testowych.
- Wykorzystanie płytek tkankowych o 24 dołkach do badań larwalnych.
- Nakładanie roztworów testowych na dorosłe komary za pomocą mikroaplikatorów.
- Badania żywieniowe z użyciem odtłuszczonej krwi królika wymieszanej z roztworami testowymi.
Główne Wyniki
- Protokoły wykazały skuteczną ocenę śmiertelności larw i dorosłych komarów.
- Dane wskazywały na zróżnicowane poziomy toksyczności testowanych związków w czasie.
- Porównanie amitryptyliny i bifentryny wykazało istotne różnice w wskaźnikach śmiertelności.
- Możliwości wysokoprzepustowe pozwoliły na ocenę licznych związków.
Wnioski
- Opracowane protokoły są cenne dla odkrywania insektycydów i badań nad kontrolą wektorów.
- Wyniki mogą pomóc w opracowaniu nowych strategii kontroli populacji komarów.
- Konieczne są dalsze badania, aby zbadać długoterminowe skutki tych chemikaliów.
Najczęściej Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables early-stage evaluation of novel insecticidal chemistries against key mosquito vectors, supporting target validation and lead identification in vector control programs. By providing standardized, high-throughput assays for larval and adult toxicity via contact and ingestion routes, it facilitates mechanistic de-risking and predictive confidence in compound prioritization. The approach aids in triaging compounds for further development as larvicides or adulticides, reducing late-stage attrition in pesticide discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of toxicological hypotheses and pathway clarification for novel chemistries against mosquito vectors.
- Operational Value: Supports functional target validation through dose-response mortality assays in Aedes aegypti, Anopheles gambiae, and Culex quinquefasciatus.
- Strategic Value: Provides predictive confidence for portfolio triage by identifying compounds with larvicidal or adulticidal potential early in discovery.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing reproducible toxicity endpoints.
- Operational Value: Enables assay standardization and scalability, allowing evaluation of hundreds of compounds in high-throughput format.
- Strategic Value: Enhances screening readiness and platform reuse for iterative compound testing across delivery routes.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system testing using primary vector species of Zika, dengue, yellow fever, and malaria.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through preclinical validation via consistent mortality and fecundity readouts.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by quantifying toxicity and sublethal effects such as fecundity reduction.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early hit evaluation to lead optimization, particularly for vector control programs seeking novel modes of action.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by quantifying toxicity across species and exposure routes.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs (LC50, mortality rates) for reliable compound evaluation in 24-well and feeding assay formats.
- Analytics: Generates dose-response data and time-course mortality profiles that enable cross-compound comparison and structure-activity relationship initiation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through standardized adult feeding assays and fecundity assessments in disease-relevant mosquito models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for iterative testing of unformulated chemistries across multiple projects and vector species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in toxicity profiling.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across larval contact, adult topical, and blood-feeding assays.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in insecticide development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on species-specific toxicity and delivery route efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito rearing, handling, and assay techniques to avoid artifacts from physical damage.
- Needs analytical balances, micro-applicators, growth chambers with controlled temperature/humidity, and dosing equipment for precise compound delivery.
- Demands cross-team standardization in larval staging, adult age synchronization, and scoring criteria to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when extending protocols to alternative mosquito species or environmental conditions.
- Includes practical limitations such as solvent compatibility (e.g., acetone for topical applications) and the need to minimize organism stress during handling.
