Izolacja i multipleksowanie jądra o niskim poziomie wejściowym z przeciwciałami kodowymi zwojów współczulnych myszy do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

W tym protokole JoVE używamy sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra opartego na kropelkach, aby scharakteryzować biologiczną architekturę neuronów współczulnych serca w zdrowiu i chorobie. Metoda ta umożliwia sekwencjonowanie dużej kolekcji próbek neuronów w określonym czasie. Poprzez wyciąganie jąder oznaczonych kodem kreskowym z hashtagiem oligonukleotydów, metoda ta umożliwia multipleksowanie próbek.

Metoda ta może zostać rozszerzona na sekwencjonowanie neuronów w ludzkich zwojach, co było wyzwaniem ze względu na duży rozmiar komórek i trudne jednoczesne pobieranie próbek. Procedurę zademonstrują Conny van Munsteren, technik badawczy i Lieke van Roon, doktorantki z naszego laboratorium Zacznij od zebrania wszystkich materiałów potrzebnych do sekcji, a następnie przymocuj mysz do deski sekcyjnej. Zwilż mysz 70% etanolem, aby zminimalizować rozproszenie sierści.

Otwórz skórę w okolicy szyi, wykonując nożyczkami cięcie w linii środkowej. Pod mikroskopem stereoskopowym odsuń gruczoły podżuchwowe na bok i usuń mięsień wyrostka sutkowatego mostka, aby odsłonić tętnicę szyjną wspólną i jej rozwidlenie, a także zwoje szyjki macicy górne i usunąć przyczepioną do nich tkankę. Wypreparuj rozwidlenie prawej i lewej tętnicy szyjnej oraz przyczepioną do niej tkankę.

Przenieś każdy wypreparowany fragment tkanki na oddzielną 3,5-centymetrową szalkę Petriego zawierającą zimny PBS. Zlokalizuj górne zwoje szyjne przyczepione do rozwidlenia tętnicy szyjnej. Oczyść górne zwoje szyjne, usuwając tętnicę i przyczepioną tkankę.

Aby wyciąć zwoje gwiaździste, wykonaj nacięcie w linii środkowej brzucha, a następnie otwórz przeponę i brzuszną ścianę klatki piersiowej. Usuń płuca, a następnie serce, aby odsłonić grzbietową część klatki piersiowej. Na poziomie pierwszego żebra zlokalizuj lewe i prawe zwoje gwiaździste przednio-boczne do mięśnia długiego colli.

Wytnij oba zwoje gwiaździste za pomocą kleszczy, usuwając otaczającą tkankę. Przenieś je na 3,5-centymetrowe szalki Petriego zawierające zimny PBS. Za pomocą kleszczy przenieś górne zwoje szyjne i zwoje gwiaździste do oddzielnych 1,5-mililitrowych mikroprobówek wirówek, a następnie dodaj 500 mikrolitrów 0,25% roztworu trypsyny-EDTA do każdej probówki i inkubuj w wstrząsającej łaźni wodnej.

Pozwól, aby zwoje osiadały się na dnie probówek do mikrowirówek. Przenieść supernatant do 15-mililitrowej probówki zawierającej pięć mililitrów pożywki ganglionowej. Do probówek do mikrowirówek dodać 500 mikrolitrów roztworu kolagenazy typu 2 i inkubować w wytrząsającej łaźni wodnej.

Po inkubacji ponownie zawiesić zwoje w roztworze kolagenazy, pipetując, aż grudki tkanek przestaną być wykrywane. Przenieś zawiesinę komórek do poprzednio używanej 15-mililitrowej probówki zawierającej pożywkę do hodowli zwojów nerwowych z zawiesiną trypsyny-EDTA. Odwirować zawiesinę komórkową i odrzucić supernatant komórkowy.

Zawiesić osad w 270 mikrolitrach płodowej surowicy bydlęcej i przenieść go do 1-mililitrowego kriowialu. Aby policzyć komórki, wymieszaj 5 mikrolitrów zawiesiny komórek zwojowych z pięcioma mikrolitrami 0,4% niebieskiego barwnika trypanowego. Załaduj mieszaninę do hemocytometru i policz całkowitą i żywą liczbę komórek pod mikroskopem.

Następnie dodaj 30 mikrolitrów sulfotlenku dimetylu do każdego kriowialu i dobrze wymieszaj. Przenieś kriowiale do pojemnika do zamrażania komórek i umieść go na noc w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Przygotuj 15-mililitrowe probówki z sitkiem o średnicy 30 mikrometrów na wierzchu.

Wstępnie przepłukać sitko 1 mililitrem pożywki ganglionowej. Wyjmij kriowiale z ciekłego azotu i natychmiast rozmroź je w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż w kriowiale pozostanie niewielka granulka lodu. Dodaj 1 mililitr pożywki ganglionowej do każdego kriowiala, ostrożnie potrząsając fiolką, aby odzyskać komórki zwojowe.

Załaduj zawiesinę komórek zwojowych na sitko i spłucz 4 do 5 mililitrami pożywki ganglionowej. Odwirować odkształconą zawiesinę komórkową. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 50 mikrolitrach buforu do przemywania komórek.

Przenieś zawiesinę komórkową do 0,5-mililitrowej probówki mikrowirówki o niskim stopniu wiązania. Odwirować zawiesinę komórkową. Od teraz niezbędna jest wirówka z wahliwym wirnikiem kubełkowym.

Po odwirowaniu usunąć 45 mikrolitrów supernatantu bez usuwania osadu komórkowego. Dodać 45 mikrolitrów schłodzonego buforu do lizy, delikatnie wymieszanego przez pipetowanie i inkubować komórki przez 8 minut na lodzie, a następnie dodać 50 mikrolitrów zimnego buforu do przemywania jąder do każdej probówki. Odwirować zawiesinę jąder i usunąć 95 mikrolitrów supernatantu bez rozbijania osadu jądrowego.

Dodać 45 mikrolitrów schłodzonego buforu do przemywania jąder do osadu, powtórzyć wirowanie i usunąć supernatant. Do osadu jądra dodać 50 mikrolitrów ST-SB i delikatnie pipetować, aż jądra zostaną całkowicie ponownie zawieszone, następnie dodać 5 mikrolitrów odczynnika blokującego FC i inkubować przez 10 minut na lodzie. Następnie dodaj 1 mikrolitr jednojądrowego przeciwciała hashtagowego i inkubuj przez 30 minut na lodzie.

Po inkubacji dodaj 100 mikrolitrów ST-SB do każdej probówki. Odwirować zawiesinę i usunąć 145 mikrolitrów supernatantu bez rozbijania osadu jądrowego. Powtórzyć wirowanie i usunąć supernatant.

Zawiesić osad jąder w 50 mikrolitrach ST-SB i delikatnie wymieszać. Weź 5 mikrolitrów zawiesiny jąder i wymieszaj je z 5 mikrolitrami 0,4% błękitu trypanowego, aby policzyć jądra pod mikroskopem. Ponownie odwirować zawiesinę jąder i ponownie zawiesić osad jąder w ST-SB, aby osiągnąć docelowe stężenie jąder od 1 000 do 3 000 jąder na mikrolitr.

Przeciągnij próbki, aby uzyskać żądaną liczbę komórek. Analiza kontroli jakości w celu przygotowania biblioteki wykazała, że cDNA pochodzące z oligonukleoterapii są mniejsze niż 180 par zasad. Szeroki pik od 300 do 1000 par zasad reprezentował wysokiej jakości bibliotekę ekspresji genów, podczas gdy specyficzny pik 194 par zasad pokazywał bibliotekę oligo hashtagów.

Analiza sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra ujawniła, że 12 klastrów, które zostały zwizualizowane przez UMAP i przeciwciała hashtagowe, zostały rozmieszczone we wszystkich klastrach. Specyficzne oznaczanie za pomocą hashtagów oligonukleotydów zostało potwierdzone przez wyrażenie Xist. Hashtagi od 1 do 4 oznaczają kobiety, a od 5 do 8 oznaczają próbki męskie.

Jakość i rozdzielczość danych sekwencjonowania zweryfikowano za pomocą kluczowych transkryptów, takich jak TH, DBH i SNAP25 w klastrach 5 i 7 dla neuronów współczulnych, S100B w klastrach od 0 do 3 dla satelitarnych komórek glejowych, PECAM 1 w klastrze 4 dla komórek śródbłonka i ACTA2 w klastrze 8 dla komórek zrębu. Próbując tej metody, należy pamiętać o odpowiednim przygotowaniu i odpowiednim sprzęcie, takim jak drobne nożyczki preparacyjne, ostra pęseta i wirówka z wahadłowym wirnikiem kubełkowym. Stopniowe podejście do sekwencjonowania jednojądrowego RNA współczulnych zewnętrznych zwojów serca ma potencjał do szerokiego zastosowania w charakterystyce zwojów unerwiających inne powiązane narządy i tkanki w zdrowiu i chorobie.