Name: Izolacja i multipleksowanie jądra o niskim poziomie wejściowym z przeciwciałami kodowymi zwojów współczulnych myszy do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Poznaj metodę izolacji jąder z neuronów współczulnych serca myszy przy użyciu sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra. Protokół obejmuje barcoding hashtag oligos umożliwiający multipleksowanie próbek o niskim poziomie wejściowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Susan L. Kloet (Department of Human Genetics, LUMC, Leiden, Holandia) za pomoc w projektowaniu eksperymentów i użyteczne dyskusje. Dziękujemy Emile'owi J. de Meijerowi (Zakład Genetyki Człowieka, LUMC, Lejda, Holandia) za pomoc w izolacji jednojądrowego RNA i przygotowaniu biblioteki do sekwencjonowania. Prace te są wspierane przez Holenderską Organizację Badań Naukowych (NWO) [016.196.346 do M.R.M.J.].

Ten protokół opisuje wszystkie kroki wymagane do sekwencji snRNA mysich zwojów szyjnych i/lub szyjno-piersiowych (gwiaździstych). Wykorzystano samice i samce myszy C57BL/6J (w wieku 15 tygodni, n = 2 dla każdej płci). Jeden dodatkowy Wnt1-Cre; Mysz mT/mG została użyta do wizualizacji zwojów w celu sekcji17,18. Ta dodatkowa mysz została wygenerowana przez krzyżowanie B6. Mysz Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J i mysz B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych opublikowanym przez NIH i zatwierdzonym przez Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu w Lejdzie (numer licencji AVD1160020185325, Lejda, Holandia). Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, sprzętu, oprogramowania i zwierząt użytych w protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowania
UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane w komorze przepływu kultur komórkowych.
<ol>
	<li>Wyczyść kleszcze i nożyczki, zanurzając narzędzia w 70% etanolu na 20 minut.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę zwojową składającą się z pożywki neurobazalnej uzupełnionej witaminą B-27 plus (1x), L-glutaminą (2 mM) i 1% antybiotykiem-antybiotykiem. Podgrzej pożywkę ganglinową w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj roztwór wytrawiający: 0,25% trypsyny-EDTA (1:1) i 1,400 U/ml kolagenazy typu 2 rozpuszczonych w pożywce ganglionowej.</li>
	<li>Przygotować świeży, zimny (4 °C) bufor do przemywania komórek (0,4% albuminy surowicy bydlęcej [BSA]) i bufor do lizy (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 i 0,1% detergentu niejonowego, 40 U/ml RNAzy w wodzie wolnej od nukleaz) do izolacji jądra.</li>
	<li>Przygotować bufor do przemywania jądra (1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami [PBS] z 2,0% BSA i 0,2U/μL inhibitorem RNazy).</li>
	<li>Przygotować bufor do barwienia ST (ST-SB) (10 mM Tris-HCl, 146 mM NaCl, 21 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 2% BSA, 0,02% Tween-20 w wodzie wolnej od nukleaz).</li>
</ol>
2. Analiza górnych zwojów szyjnych dorosłej myszy (SCG)
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji i trzymaj je na lodzie. 
	UWAGA: W obecnym badaniu łącznie 4 myszy C57BL6 / J zostały uśpione przez uduszenie CO2. Alternatywnie można zastosować izofluran, a następnie wykrwawienie, gdy konieczne jest pobranie dużej ilości krwi do innych celów badawczych.</li>
	<li>Przymocuj mysz do deski preparacyjnej za pomocą szpilek i oblej ją 70% etanolem, aby zminimalizować rozproszenie futra (golenie nie jest konieczne).</li>
	<li>Pod mikroskopem stereoskopowym otwórz skórę okolicy szyi, wykonując nożyczkami cięcie linii środkowej, odsuń gruczoły podżuchwowe na bok i usuń mięsień mostkowo-sutkowy, aby odsłonić i zlokalizować wspólną tętnicę szyjną i jej rozwidlenie (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A, B, patrz strzałka).</li>
	<li>Wypreparuj rozwidlenie prawej i lewej tętnicy szyjnej oraz przyczepioną do niej tkankę. Przenieś każdy wypreparowany fragment tkanki na oddzielną szalkę Petriego o średnicy 3,5 cm, zawierającą zimny PBS.</li>
	<li>Poszukaj SCG przyczepionego do rozwidlenia tętnicy szyjnej. Oczyść SCG dalej, usuwając tętnicę i inną przyczepioną tkankę na szalce Petriego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E).</li>
</ol>
3. Sekcja zwojów gwiaździstych dorosłej myszy (StG)
<ol>
	<li>Aby wypreparować StG, wykonaj nacięcie w linii środkowej brzucha, a następnie otwórz przeponę i brzuszną ścianę klatki piersiowej.</li>
	<li>Usuń serce i płuca, aby odsłonić grzbietową klatkę piersiową. Poszukaj lewego i prawego StG przednio-bocznego do mięśnia długiego wzgórka (MCL) na poziomie pierwszego żebra (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C, D, oznaczony liniami przerywanymi).</li>
	<li>Rozetnij zarówno lewy, jak i prawy StG za pomocą kleszczy i oddzielnie przenieś je na 3,5 cm szalki Petriego zawierające zimny PBS (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F). 
	</li>
</ol>
4. Izolacja i kriokonserwacja mysich komórek zwojowych
Kroki 4-6 są podsumowane w Rysunek 2.
<ol>
	<li>Ostrożnie przenieś wszystkie pojedyncze SCG i StG do oddzielnych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml za pomocą kleszczy. 
	UWAGA: Nie używaj końcówek do pipet do przenoszenia zwojów nerwowych, ponieważ zwoje mają skłonność do przylegania do ścianek plastikowych końcówek pipet.</li>
	<li>Dodać 500 μl 0,25% roztworu trypsyny-EDTA do każdej probówki mikrowirówki i inkubować w wytrząsającej łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 40 min. 
	UWAGA: Ten etap ma na celu ułatwienie trawienia i uwalniania komórek w roztworze kolagenazy typu 2.</li>
	<li>Przygotować probówkę o pojemności 15 ml zawierającą 5 ml pożywki ganglinowej dla każdej próbki. Pozwól, aby zwoje osiadały się na dnie probówek do mikrowirówek. Zebrać supernatant, który zawiera bardzo mało komórek zwojowych, przenieść supernatant do przygotowanych probówek o pojemności 15 ml i oznaczyć każdą probówkę. Alternatywnie, aby zaoszczędzić trochę czasu, odessać supernatant trypsyny-EDTA bez zbierania, ponieważ można w nim wykryć bardzo niewiele zdysocjowanych komórek. 
	UWAGA: Niewielką ilość roztworu trypsyny-EDTA (~10-30 μL) można pozostawić w probówce mikrowirówki, aby uniknąć usunięcia zwojów. Na tym etapie należy unikać pipetowania, ponieważ może to spowodować uszkodzenie zwojów nerwowych i doprowadzić do obniżenia wydajności komórek zwojowych.</li>
	<li>Dodać 500 μl roztworu kolagenazy typu 2 do każdej probówki mikrowirówki i inkubować w wytrząsającej łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 35-40 minut. Spróbować zawiesić ganglion po 35 minutach; jeśli ganglion jest nadal nienaruszony i nie ulega dysocjacji, należy przedłużyć czas inkubacji lub zwiększyć stężenie roztworu kolagenazy typu 2, jeśli to konieczne. 
	UWAGA: Czas inkubacji może się różnić w zależności od wielkości ganglionu.</li>
	<li>Ponownie zawiesić zwoje w roztworze kolagenazy, pipetując w górę iw dół ~10 razy lub do momentu, gdy grudki tkanek przestaną być wykrywane.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do poprzednio używanej probówki o pojemności 15 ml, która zawiera pożywkę do hodowli zwojów nerwowych i zawiesinę trypsyny-EDTA z tego samego zwoju. Wirować zawiesinę komórek za pomocą wirówki z wirnikiem kubełkowym przez 10 minut, 300 × g w temperaturze pokojowej. Ostrożnie wyrzucić supernatant komórki. 
	UWAGA: Ponieważ komórki zwojowe są oddzielone od pojedynczego zwoju, osad komórki może być zbyt mały, aby można go było wykryć gołym okiem; Niewielką ilość supernatantu można pozostawić w probówce, aby uniknąć przypadkowego usunięcia osadu komórkowego.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki zwojowe w 270 μl płodowej surowicy bydlęcej (FBS, niska endotoksyna) i przenieść każdą zawiesinę FBS komórki do kriowialu o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Aby policzyć komórki, zmieszaj 5 μl zawiesiny komórek zwojowych z 5 μl 0,4% barwnika błękitu trypanowego i załaduj mieszaninę do hemocytometru. Policz całkowitą liczbę komórek i liczbę żywych komórek pod mikroskopem. 
	UWAGA: Żywotność komórek (liczba żywych komórek/całkowita liczba komórek = żywotność%) wynosi zwykle powyżej 90% w tym protokole dysocjacji. Liczba żywych komórek w pojedynczym ganglionie (SCG lub StG) zwykle mieści się w zakresie 9 000-60 000 komórek, gdy ganglion jest izolowany od myszy w wieku od 12 do 16 tygodni.</li>
	<li>Dodać 30 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do każdej zawiesiny FBS w kriowialach, dobrze wymieszać i przenieść kriowiale do pojemnika do zamrażania komórek, który jest przechowywany w temperaturze pokojowej. Pojemnik z ładunkiem kriowialnym należy przechowywać w temperaturze -80 °C przez noc, a następnego dnia przenieść kriowialne do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania przed sekwencjonowaniem.</li>
</ol>
5. Izolacja jądra
UWAGA: Lewy i prawy SCG wyizolowany z czterech myszy (w sumie 8 próbek) zostały użyte jako przykład w poniższym przygotowaniu do izolacji jądra i sekwencjonowania. Trzymaj wszystko na lodzie podczas całej procedury. Ze względu na niewidoczność małych osadów jądrowych, zdecydowanie zaleca się wirówkę z wahadłowymi wiadrami, aby ułatwić usuwanie supernatantu podczas całej procedury.
<ol>
	<li>Przygotować probówki o pojemności 15 ml z sitkiem (30 μm) na wierzchu i wstępnie przepłukać sitko 1 ml pożywki ganglionowej.</li>
	<li>Wyjąć kriowiale z ciekłego azotu i natychmiast rozmrozić je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Gdy w kriowiale pozostanie niewielka osadka lodu, wyjmij kriowiale z łaźni wodnej.</li>
	<li>Odzyskaj komórki zwojowe, wrzucając 1 ml pożywki zwojowej do każdego kriowialu, ostrożnie potrząsając ręką. Opcjonalnie: Aby ocenić regenerację komórek, wymieszaj zawiesinę komórek po odzyskaniu i wyjmij 5 μl zawiesiny komórek w celu zliczenia żywych komórek, jak opisano w kroku 4.8.</li>
	<li>Załadować każdą zawiesinę komórek zwojowych na osobne sitko (przygotowane w kroku 5.1) i przepłukać każde sitko 4-5 ml pożywki ganglionowej.</li>
	<li>Odwirować odcedzoną zawiesinę komórek przez 5 minut w temperaturze 300 × g, ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 50 μl buforu do przemywania komórek.</li>
	<li>Przenieś zawiesinę komórkową do nisko wiążącej probówki mikrowirówkowej DNA/RNA o pojemności 0,5 ml.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć 45 μl supernatantu, nie dotykając dna probówki, aby uniknąć przemieszczenia się osadu komórkowego.</li>
	<li>Dodaj 45 μl schłodzonego buforu do lizy i delikatnie pipetuj w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 8 minut na lodzie.</li>
	<li>Do każdej probówki dodać 50 μl zimnego buforu do przemywania jąder. Nie mieszać.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę jądra w temperaturze 600 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć 95 μl supernatantu bez naruszania osadu jądrowego.</li>
	<li>Dodać 45 μl schłodzonego buforu do przemywania jądra do osadu. Opcjonalnie: Weź 5 μl zawiesiny jądra, wymieszaj z 5 μl 0,4% błękitu trypanowego, aby policzyć i sprawdź jakość jąder pod mikroskopem za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę jądra w temperaturze 600 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant bez dotykania dna probówki, aby uniknąć przemieszczenia się osadu jądra.</li>
</ol>
6. Kodowanie kreskowe jądra z hashtagiem oligos (HTOs) i multipleksowanie
UWAGA: Etapy barwienia HTO zostały zmodyfikowane i zoptymalizowane pod kątem znakowania jądrowego bardzo małych ilości jąder (zwojowych) zgodnie z poprzednim zastosowaniem w tkance korowej przez Gaublomme et al.15.
<ol>
	<li>Dodać 50 μl buforu ST-SB do osadu jądra, delikatnie pipetować 8-10 razy, aż jądra zostaną całkowicie zawieszone.</li>
	<li>Dodać 5 μl odczynnika blokującego Fc na 50 μl mieszanki ST-SB/jądra i inkubować przez 10 minut na lodzie.</li>
	<li>Dodać 1 μl (0,5 μg) jednojądrowego przeciwciała hashtag na probówkę mieszanki ST-SB/jądra i inkubować przez 30 minut na lodzie. 
	UWAGA: Krótszy czas inkubacji prowadzi do mniejszej skuteczności etykietowania hashtagów, jak wykazano w reprezentatywnych wynikach.</li>
	<li>Dodać 100 μl ST-SB do każdej probówki. Nie mieszać.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę jądra przez 5 minut, 600 × g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć 145 μl supernatantu bez naruszania osadu jądrowego.</li>
	<li>Powtórz kroki 6.4 i 6.5. Usunąć supernatant tak bardzo, jak to możliwe, nie dotykając dna probówki, aby uniknąć przemieszczenia się osadu jądra komórkowego.</li>
	<li>Zawiesić osad jądra w 50 μl ST-SB i delikatnie wymieszać jądra.</li>
	<li>Weź 5 μl zawiesiny jądra i wymieszaj ją z 5 μl 0,4% błękitu trypanowego, aby policzyć jądra pod mikroskopem. Zobacz Rysunek 3A dla reprezentatywnego obrazu jąder zmieszanych z błękitem trypanowym i załadowanych do hemocytometru.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę jądra przez 5 minut w temperaturze 600 × g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić jądra w ST-SB, aby osiągnąć docelowe stężenie jądra 1 000-3 000 jąder / μl dla każdej próbki zgodnie z odpowiednią liczbą jąder.</li>
	<li>Zebrać próbki, aby uzyskać żądaną liczbę komórek. 
	UWAGA: Na przykład w tym eksperymencie 8 próbek zostało równo połączonych, aby uzyskać łącznie 25 000 jąder, aby natychmiast przejść do 10x Genomics Chromium i snRNA-seq. Liczba jąder zwykle mieści się w zakresie 6 000-40 000 komórek, gdy ganglion jest izolowany od myszy w wieku od 12 do 16 tygodni. Tylko około połowa całkowitych załadowanych jąder może zostać przechwycona przez sekwencję snRNA opartą na kropelkach. Na przykład przygotowano mieszaninę 25 000 jąder, aby zapewnić wychwycenie 10 000 jąder, które są potrzebne do dalszego przygotowania biblioteki i sekwencjonowania.</li>
</ol>

<ol><li>McCorry, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+the+autonomic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pharmaceutical+Education%22%5BJournal%5D)">Physiology of the autonomic nervous system.</a> American Journal of Pharmaceutical Education. 71 (4), 78(2007).</li>
<li>Li, C. -Y., Li, Y. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sympathetic+nerve+sprouting+and+susceptibility+to+ventricular+arrhythmias+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiology+Research+and+Practice%22%5BJournal%5D)">Cardiac sympathetic nerve sprouting and susceptibility to ventricular arrhythmias after myocardial infarction.</a> Cardiology Research and Practice. 2015, 698368(2015).</li>
<li>Ajijola, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracardiac+neural+remodeling+in+humans+with+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Arrhythmia+and+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Extracardiac neural remodeling in humans with cardiomyopathy.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 5 (5), 1010(2012).</li>
<li>Nguyen, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myocardial+infarction+induces+bilateral+stellate+ganglia+neural+remodeling+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Acute myocardial infarction induces bilateral stellate ganglia neural remodeling in rabbits.</a> Cardiovascular Pathology. 21 (3), 143-148 (2012).</li>
<li>Ajijola, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+stellate+ganglion+neurons+after+spatially+targeted+myocardial+infarction%3A+Neuropeptide+and+morphologic+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes.</a> Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).</li>
<li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroanatomic+remodeling+of+the+left+stellate+ganglion+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Electroanatomic remodeling of the left stellate ganglion after myocardial infarction.</a> Journals of the American College of Cardiology. 59 (10), 954-961 (2012).</li>
<li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+mouse+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the mouse nervous system.</a> Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).</li>
<li>Svensson, V., Vento-Tormo, R., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exponential+scaling+of+single-cell+RNA-seq+in+the+past+decade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Exponential scaling of single-cell RNA-seq in the past decade.</a> Nature Protocols. 13 (4), 599-604 (2018).</li>
<li>Li, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatosensory+neuron+types+identified+by+high-coverage+single-cell+RNA-sequencing+and+functional+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity.</a> Cell Research. 26 (8), 967(2016).</li>
<li>Kokubun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+TRPV1+and+TRPV2+in+the+human+stellate+ganglion+and+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Distribution of TRPV1 and TRPV2 in the human stellate ganglion and spinal cord.</a> Neuroscience Letters. 590, 6-11 (2015).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-nucleus+RNA-sequencing+pipeline+to+decipher+the+molecular+anatomy+and+pathophysiology+of+human+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys.</a> Nature Communication. 10 (1), 2832(2019).</li>
<li>Petrany, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+RNA-seq+identifies+transcriptional+heterogeneity+in+multinucleated+skeletal+myofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus RNA-seq identifies transcriptional heterogeneity in multinucleated skeletal myofibers.</a> Nature Communication. 11 (1), 6374(2020).</li>
<li>Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+single-nucleus+over+single-cell+RNA+sequencing+of+adult+kidney%3A+rare+cell+types+and+novel+cell+states+revealed+in+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PLoS One. 13 (12), 0209648(2018).</li>
<li>Gaublomme, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+multiplexing+with+barcoded+antibodies+for+single-nucleus+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics.</a> Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).</li>
<li>Zandstra, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetry+and+heterogeneity%3A+part+and+parcel+in+cardiac+autonomic+innervation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Asymmetry and heterogeneity: part and parcel in cardiac autonomic innervation and function.</a> Frontiers in Physiology. 12, 665298(2021).</li>
<li>Lewis, A. E., Vasudevan, H. N., O'Neill, A. K., Soriano, P., Bush, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+widely+used+Wnt1-Cre+transgene+causes+developmental+phenotypes+by+ectopic+activation+of+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The widely used Wnt1-Cre transgene causes developmental phenotypes by ectopic activation of Wnt signaling.</a> Developmental Biology. 379 (2), 229-234 (2013).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+integration+of+single+cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Comprehensive integration of single cell data.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
<li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+glial+cells+promote+regenerative+growth+in+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons.</a> Nature Communications. 11 (1), 4891(2020).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Hashing+with+barcoded+antibodies+enables+multiplexing+and+doublet+detection+for+single+cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics.</a> Genome Biology. 19 (1), 224(2018).</li>
<li>Lacar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+RNA-seq+of+single+neurons+reveals+molecular+signatures+of+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation.</a> Nature Communications. 7 (1), 11022(2016).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6031(2017).</li>
<li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-sequencing+from+single+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W tym miejscu opisano szczegółowy protokół, który koncentruje się na i) rozbiorze górnych zwojów współczulnych szyjki macicy i gwiaździstej myszy, ii) izolacji i kriokonserwacji komórek zwojowych, iii) izolacji jądra oraz iv) kodowaniu jądra za pomocą znakowania HTO w celu multipleksowania i sekwencjonowania snRNA.
Dzięki temu protokołowi współczulne komórki zwojowe można łatwo uzyskać poprzez dysocjację poszczególnych zwojów za pomocą powszechnie stosowanej trypsyny i kolagenazy. Długotrwałe ...

Autonomiczny układ nerwowy (ANS) jest kluczową częścią obwodowego układu nerwowego, który utrzymuje homeostazę organizmu, w tym adaptację do warunków środowiskowych i patologii1. Bierze udział w regulacji wielu układów narządowych w całym ciele, takich jak układ sercowo-naczyniowy, oddechowy, pokarmowy i hormonalny. ANS jest podzielony na gałęzie współczulne i przywspółczulne. Gałęzie rdzeniowe współczulnego układu nerwowego synapsa w zwojach łańcucha współczulnego, usytuowane obustronnie w pozycji przykręgowej. Obustronne zwoje szyjne i piersiowe, zwłaszcza StG, są ważnymi elementami uczestniczącymi w unerwieniu współczulnym serca. W stanach chorobowych, takich jak niedokrwienie serca, może dojść do przebudowy neuronów, co skutkuje nadbiegiem współczulnym2. Przebudowa neuronów została wykazana w wielu badaniach histologicznych na ludziach i kilku innych gatunkach zwierząt3,4,5,6. Obecnie brakuje szczegółowej charakterystyki biologicznej przebudowy neuronów wywołanej niedokrwieniem serca w zwojach współczulnych serca, a podstawowe cechy biologiczne wyspecjalizowanych typów lub podtypów komórek nerwowych w sercowym współczulnym układzie nerwowym (SNS) nie są jeszcze w pełni określone w zdrowiu i chorobie7.
Nowatorskie technologie, takie jak scRNA-seq, otworzyły bramy do genetycznej charakterystyki małych tkanek na poziomie pojedynczej komórki8,9. Jednak stosunkowo duży rozmiar neuronów może utrudniać optymalne wykorzystanie tych technik jednokomórkowych u ludzi10. Ponadto sekwencjonowanie pojedynczych komórek wymaga dużej przepustowości komórek w celu odzyskania wystarczającej liczby komórek ze względu na duże straty w procesie sekwencjonowania. Może to okazać się wyzwaniem podczas badania małych tkanek, które są trudne do uchwycenia podczas jednej sesji i wymagają wielu próbek, aby wprowadzić wystarczającą liczbę pojedynczych komórek do sekwencjonowania. Niedawno opracowana technologia sekwencyjna snRNA-seq oparta na kropelkach (tj. platforma 10x Chromium) pozwala na badanie różnic biologicznych między pojedynczymi jądrami11,12. snRNA-seq ma przewagę nad scRNA-seq dla dużych komórek (>30 μm), które mogą nie zostać wychwycone w Gel Bead in Emulsions (GEMs), a także lepszą kompatybilność z rozległą dysocjacją i/lub przedłużoną konserwacją13,14,15.
Heterogeniczność, liczba komórek neuronalnych i innych komórek wzbogaconych w SNS serca są ważnymi aspektami dla charakterystyki ANS w stanach zdrowia i choroby. Ponadto unerwienie specyficzne dla narządu lub regionu przez każdy zwój współczulny przyczynia się do złożoności SNS. Ponadto wykazano, że zwoje szyjne, gwiaździste i piersiowe łańcucha współczulnego unerwiają różne obszary serca16. W związku z tym konieczne jest wykonanie analizy jednojądrowej komórek zwojowych pochodzących z pojedynczych zwojów w celu zbadania ich architektury biologicznej.
Sekwencja snRNA oparta na kropelkach umożliwia profilowanie ekspresji w całym transkryptomie dla puli tysięcy komórek z wielu próbek naraz przy niższych kosztach niż platformy sekwencjonowania na płytkach. Podejście to sprawia, że sekwencjonowanie snRNA oparte na kropelkach jest bardziej odpowiednie do klasyfikacji fenotypów komórkowych i identyfikacji nowej subpopulacji komórek w obrębie SCG i StG. Warto zauważyć, że protokół ten zapewnia zwięzłe, krokowe podejście do identyfikacji, izolacji i sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra współczulnych zewnętrznych zwojów serca, metody, która ma potencjał do szerokiego zastosowania w badaniach nad charakterystyką zwojów unerwiających inne powiązane narządy i tkanki w zdrowie i choroba.

<table><tbody><tr><td>Chemikalia i odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>0,4% barwnik błękit trypanowy</td><td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy</td><td>Gibco</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typ 2</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>użyć 1,400 U/ml</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenku</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67685</td><td></td></tr> Absolut etanolu <tr><td>&ge; 99,5%</td><td>VWR</td><td>VWRC83813.360</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (niska endotoksyna)</td><td>Biowest</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1595-50ML</td><td>Bufor do płukania komórek</td></tr><tr><td>DPBS (Ca2+, Mg2+free)</td><td>Gibco</td><td>14190-169</td><td>Bufor do płukania komórek</td></tr><tr><td>Roztwór chlorku magnezu, 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>Bufor do lizy jądra</td></tr><tr><td>Substytut Nonidet P40 (detergent niejonowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td>Bufor do lizy jądra</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz (nie poddawana działaniu DEPC)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9937</td><td>Bufor</td></tr> <tr><td>do lizy jądraInhibitor RNazy ochronnej, 40 U/&mikro; L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3335399001</td><td>Bufor do lizy jądra</td></tr><tr><td>Roztwór chlorku sodu, 5 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59222C</td><td>Bufor do lizy jądra</td></tr><tr><td>Roztwór chlorowodorku Trizma, 1 M, pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2194</td><td>Bufor do lizy jądra</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej 10%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A1595-50ML</td><td>Mycie</td></tr><tr><td>jądra DPBS (Ca2+, Mg2+free)</td><td>Gibco</td><td>14190-169</td><td>Nucleus wash</td></tr><tr><td>Protector Inhibitor RNazy,40 U/&micro; L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3335399001</td><td>Nucleus</td></tr><tr><td>wash Albumina surowicy bydlęcej 10%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A1595-50ML</td><td>ST bufor barwiący (ST-SB)</td></tr><tr><td>Roztwór chlorku wapnia, 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115-100ML</td><td>ST bufor barwiący (ST-SB)</td></tr><tr><td>Roztwór chlorku magnezu, 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>ST bufor barwiący (ST-SB)</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz (nie DEPC leczony)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9937</td><td>ST bufor barwiący (ST-SB)</td></tr><tr><td>Roztwór chlorku sodu, 5M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59222C</td><td>ST bufor barwiący ST (ST-SB)</td></tr><tr><td>Roztwór chlorowodorku trizma, 1M, pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2194</td><td>ST bufor barwiący (ST-SB)</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck Millipore</td><td>822184</td><td>bufor do barwienia ST (ST-SB)</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0451 przeciwciała antyjądrowe z kompleksem porów Hashtag 1 Przeciwciało</td><td>Biolegend</td><td>682205</td><td>Hashtag</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0452 przeciwciało antyjądrowe białka kompleksu porów Hashtag 2 Przeciwciało</td><td>Biolegend</td><td>682207</td><td>Hashtag</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0453 Białka przeciwjądrowe Hashtag 3 Przeciwciało</td><td>Biolegend</td><td>682209</td><td>Przeciwciało Hashtag</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0461 Przeciwciało antyjądrowe Białka kompleksu porów Hashtag 11 Przeciwciało</td><td>Biolegend</td><td>682225</td><td>Hashtag</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0462 Przeciwciało przeciwjądrowe Białka kompleksu porów Hashtag 12 Przeciwciało</td><td>Biolegend</td><td>682227</td><td>Hashtag</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0463 Białka przeciwjądrowe Białko kompleksu porów Hashtag 13 Przeciwciało</td><td>Biolegend</td><td>682229</td><td>Przeciwciało Hashtag</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0464 Przeciwciało przeciwjądrowe Białka z kompleksem porów Hashtag 14 Przeciwciało</td><td>Biolegend</td><td>682231</td><td>Hashtag</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0465 Przeciwciało przeciwjądrowe Białka z kompleksem porów Hashtag 15 Przeciwciało</td><td>Biolegend</td><td>682233</td><td>Hashtag</td></tr><tr><td>TruStain FcX (człowiek)</td><td>Biolegend</td><td>422302</td><td>Roztwór blokujący receptor FC</td></tr><tr><td><silny>Sprzęt i materiały eksploatacyjne</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jasna linia&nbsp; Hemacytometr</td><td>Merck</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5702/R A-4-38</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp; </td><td></td>EP022629905</tr><tr><td>Pojemnik do zamrażania komórek CoolCell LX</td><td>Corning</td><td>CLS432003-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>Thermo Scientific</td><td>479-6840</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind 0,5 ml probówka Eppendorf</td><td></td><td>EP0030108035-250EA</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf Safe-Lock 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30121872</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 mm Bez powłoki TC szalka Petriego</td><td>Corning</td><td></td><td></td>351008</tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 15 ml</td><td>Fisher scientific</td><td>10773501</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5</td><td>Narzędzia do nauki</td> precyzyjnej <td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Hartowane drobne nożyczki</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Patelnia do lodu, prostokątna 4 L Pomarańczowy</td><td>Corning</td><td>CLS432106-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Leica MS5</td><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Moria MC50</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>15370-50</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Noyes</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>15012-12</td><td></td></tr><tr><td>Olympus CK2 ULWCD</td><td>Mikroskop Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P10</td><td>Gilson</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>P1000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Filtry do wstępnej separacji (30 &mikro; m)</td> <td>Miltenyi biotec</td><td>Miltenyi biotec130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsająca łaźnia wodna</td><td>GFL</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>Płyta silikonowa</td><td>RubberBV</td><td>3530</td><td>Deska prosektoryjna</td></tr><tr><td><mocna>Oprogramowanie i pakiety</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell ranger</td><td>V4.0.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Programowanie R</td><td>V4.1.1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R sudio</td><td>V1.3.1073</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seurat</td><td>V4.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tydiverse</td><td>V1.3.1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6. Mysz Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J</td><td></td><td>Kolba Jackson Laboratory JAX #022501</td><td></td></tr><tr><td>B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Mysz Luo/J</td><td>Kolba</td><td>Jackson Laboratory JAX #007576</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J myszy</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Code do analizy danych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE</tr></tbody></table>

izolacja i multipleksowanie jądra o niskim poziomie wejściowym z przeciwciałami kodowymi zwojów współczulnych myszy do sekwencjonowania rna pojedynczego jądra

Low-input Nucleus Isolation and Multiplexing with Barcoded Antibodies of Mouse Sympathetic Ganglia for Single-nucleus RNA Sequencing

Autonomiczny układ nerwowy serca jest kluczowy w kontrolowaniu funkcji serca, takich jak tętno i kurczliwość serca, i dzieli się na gałęzie współczulne i przywspółczulne. Zwykle istnieje równowaga między tymi dwiema gałęziami, aby utrzymać homeostazę. Jednak stany chorobowe serca, takie jak zawał mięśnia sercowego, niewydolność serca i nadciśnienie, mogą indukować przebudowę komórek zaangażowanych w unerwienie serca, co wiąże się z niekorzystnym wynikiem klinicznym.
Chociaż istnieje ogromna ilość danych na temat struktury histologicznej i funkcji autonomicznego układu nerwowego serca, jego molekularna architektura biologiczna w zdrowiu i chorobie jest nadal enigmatyczna w wielu aspektach. Nowatorskie technologie, takie jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq), dają nadzieję na genetyczną charakterystykę tkanek w rozdzielczości pojedynczej komórki. Jednak stosunkowo duży rozmiar neuronów może utrudniać standardowe stosowanie tych technik. W tym przypadku protokół ten wykorzystuje sekwencjonowanie jednojądrowego RNA oparte na kropelkach (snRNA-seq), metodę charakteryzowania biologicznej architektury neuronów współczulnych serca w zdrowiu i chorobie. Wykazano podejście krokowe w celu wykonania sekwencji snRNA obustronnych górnych zwojów szyjnych (SCG) i gwiaździstych (StG) wypreparowanych od dorosłych myszy.
Ta metoda umożliwia długoterminową konserwację próbek, utrzymując odpowiednią jakość RNA, gdy próbki od wielu osób/eksperymentów nie mogą być zebrane wszystkie naraz w krótkim okresie czasu. Kodowanie kreskowe jąder za pomocą oligonukleotydów hasztagowych (HTO) umożliwia demultipleksację i śledzenie wstecz odrębnych próbek zwojowych po sekwencjonowaniu. Późniejsze analizy wykazały udane wychwytywanie jąder komórek neuronalnych, gleju satelitarnego i śródbłonka zwojów współczulnych, co zostało potwierdzone za pomocą snRNA-seq. Podsumowując, protokół ten zapewnia stopniowe podejście do sekwencjonowania snRNA współczulnych zewnętrznych zwojów sercowych, metoda, która ma potencjał do szerszego zastosowania w badaniach unerwienia innych narządów i tkanek.

Analiza kontroli jakości przygotowania biblioteki cDNA z pojedynczych jąder oraz sekwencjonowania snRNA-seq 
Reprezentatywne wyniki przedstawiają wyniki sekwencjonowania 10 000 wyizolowanych jąder w pojedynczej puli, przy zastosowaniu biblioteki ekspresji genów o głębokości 25 000 odczytów na jądro oraz biblioteki hashtagów o głębokości 5 000 odczytów na jądro. Rycina 3B ilustruje wyniki kontroli jakości dla 1st nić cDNA, bibliotekę ekspresji genów (GEX) oraz b...

Ten protokół opisuje szczegółowe, niskonakładowe przygotowanie próbki do sekwencjonowania pojedynczego jądra, w tym sekcję górnych zwojów szyjnych i gwiaździstych myszy, dysocjację komórek, krioprezerwację, izolację jądra i kodowanie kreskowe hashtagów.

Izolacja i multipleksowanie jądra o niskim poziomie wejściowym z przeciwciałami kodowymi zwojów współczulnych myszy do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

The cardiac autonomic nervous system is crucial in controlling cardiac function, such as heart rate and cardiac contractility, and is divided into ...

W tym protokole JoVE używamy sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra opartego na kropelkach, aby scharakteryzować biologiczną architekturę neuronów współczulnych serca w zdrowiu i chorobie. Metoda ta umożliwia sekwencjonowanie dużej kolekcji próbek neuronów w określonym czasie. Poprzez wyciąganie jąder oznaczonych kodem kreskowym z hashtagiem oligonukleotydów, metoda ta umożliwia multipleksowanie próbek.Metoda ta może zostać rozszerzona na sekwencjonowanie neuronów w ludzkich zwojach, co było wyzwaniem ze względu na duży rozmiar komórek i trudne jednoczesne pobieranie próbek. Procedurę zademonstrują Conny van Munsteren, technik badawczy i Lieke van Roon, doktorantki z naszego laboratorium Zacznij od zebrania wszystkich materiałów potrzebnych do sekcji, a następnie przymocuj mysz do deski sekcyjnej. Zwilż mysz 70% etanolem, aby zminimalizować rozproszenie sierści.Otwórz skórę w okolicy szyi, wykonując nożyczkami cięcie w linii środkowej. Pod mikroskopem stereoskopowym odsuń gruczoły podżuchwowe na bok i usuń mięsień wyrostka sutkowatego mostka, aby odsłonić tętnicę szyjną wspólną i jej rozwidlenie, a także zwoje szyjki macicy górne i usunąć przyczepioną do nich tkankę. Wypreparuj rozwidlenie prawej i lewej tętnicy szyjnej oraz przyczepioną do niej tkankę.Przenieś każdy wypreparowany fragment tkanki na oddzielną 3,5-centymetrową szalkę Petriego zawierającą zimny PBS. Zlokalizuj górne zwoje szyjne przyczepione do rozwidlenia tętnicy szyjnej. Oczyść górne zwoje szyjne, usuwając tętnicę i przyczepioną tkankę.Aby wyciąć zwoje gwiaździste, wykonaj nacięcie w linii środkowej brzucha, a następnie otwórz przeponę i brzuszną ścianę klatki piersiowej. Usuń płuca, a następnie serce, aby odsłonić grzbietową część klatki piersiowej. Na poziomie pierwszego żebra zlokalizuj lewe i prawe zwoje gwiaździste przednio-boczne do mięśnia długiego colli.Wytnij oba zwoje gwiaździste za pomocą kleszczy, usuwając otaczającą tkankę. Przenieś je na 3,5-centymetrowe szalki Petriego zawierające zimny PBS. Za pomocą kleszczy przenieś górne zwoje szyjne i zwoje gwiaździste do oddzielnych 1,5-mililitrowych mikroprobówek wirówek, a następnie dodaj 500 mikrolitrów 0,25% roztworu trypsyny-EDTA do każdej probówki i inkubuj w wstrząsającej łaźni wodnej.Pozwól, aby zwoje osiadały się na dnie probówek do mikrowirówek. Przenieść supernatant do 15-mililitrowej probówki zawierającej pięć mililitrów pożywki ganglionowej. Do probówek do mikrowirówek dodać 500 mikrolitrów roztworu kolagenazy typu 2 i inkubować w wytrząsającej łaźni wodnej.Po inkubacji ponownie zawiesić zwoje w roztworze kolagenazy, pipetując, aż grudki tkanek przestaną być wykrywane. Przenieś zawiesinę komórek do poprzednio używanej 15-mililitrowej probówki zawierającej pożywkę do hodowli zwojów nerwowych z zawiesiną trypsyny-EDTA. Odwirować zawiesinę komórkową i odrzucić supernatant komórkowy.Zawiesić osad w 270 mikrolitrach płodowej surowicy bydlęcej i przenieść go do 1-mililitrowego kriowialu. Aby policzyć komórki, wymieszaj 5 mikrolitrów zawiesiny komórek zwojowych z pięcioma mikrolitrami 0,4% niebieskiego barwnika trypanowego. Załaduj mieszaninę do hemocytometru i policz całkowitą i żywą liczbę komórek pod mikroskopem.Następnie dodaj 30 mikrolitrów sulfotlenku dimetylu do każdego kriowialu i dobrze wymieszaj. Przenieś kriowiale do pojemnika do zamrażania komórek i umieść go na noc w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Przygotuj 15-mililitrowe probówki z sitkiem o średnicy 30 mikrometrów na wierzchu.Wstępnie przepłukać sitko 1 mililitrem pożywki ganglionowej. Wyjmij kriowiale z ciekłego azotu i natychmiast rozmroź je w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż w kriowiale pozostanie niewielka granulka lodu. Dodaj 1 mililitr pożywki ganglionowej do każdego kriowiala, ostrożnie potrząsając fiolką, aby odzyskać komórki zwojowe.Załaduj zawiesinę komórek zwojowych na sitko i spłucz 4 do 5 mililitrami pożywki ganglionowej. Odwirować odkształconą zawiesinę komórkową. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 50 mikrolitrach buforu do przemywania komórek.Przenieś zawiesinę komórkową do 0,5-mililitrowej probówki mikrowirówki o niskim stopniu wiązania. Odwirować zawiesinę komórkową. Od teraz niezbędna jest wirówka z wahliwym wirnikiem kubełkowym.Po odwirowaniu usunąć 45 mikrolitrów supernatantu bez usuwania osadu komórkowego. Dodać 45 mikrolitrów schłodzonego buforu do lizy, delikatnie wymieszanego przez pipetowanie i inkubować komórki przez 8 minut na lodzie, a następnie dodać 50 mikrolitrów zimnego buforu do przemywania jąder do każdej probówki. Odwirować zawiesinę jąder i usunąć 95 mikrolitrów supernatantu bez rozbijania osadu jądrowego.Dodać 45 mikrolitrów schłodzonego buforu do przemywania jąder do osadu, powtórzyć wirowanie i usunąć supernatant. Do osadu jądra dodać 50 mikrolitrów ST-SB i delikatnie pipetować, aż jądra zostaną całkowicie ponownie zawieszone, następnie dodać 5 mikrolitrów odczynnika blokującego FC i inkubować przez 10 minut na lodzie. Następnie dodaj 1 mikrolitr jednojądrowego przeciwciała hashtagowego i inkubuj przez 30 minut na lodzie.Po inkubacji dodaj 100 mikrolitrów ST-SB do każdej probówki. Odwirować zawiesinę i usunąć 145 mikrolitrów supernatantu bez rozbijania osadu jądrowego. Powtórzyć wirowanie i usunąć supernatant.Zawiesić osad jąder w 50 mikrolitrach ST-SB i delikatnie wymieszać. Weź 5 mikrolitrów zawiesiny jąder i wymieszaj je z 5 mikrolitrami 0,4% błękitu trypanowego, aby policzyć jądra pod mikroskopem. Ponownie odwirować zawiesinę jąder i ponownie zawiesić osad jąder w ST-SB, aby osiągnąć docelowe stężenie jąder od 1 000 do 3 000 jąder na mikrolitr.Przeciągnij próbki, aby uzyskać żądaną liczbę komórek. Analiza kontroli jakości w celu przygotowania biblioteki wykazała, że cDNA pochodzące z oligonukleoterapii są mniejsze niż 180 par zasad. Szeroki pik od 300 do 1000 par zasad reprezentował wysokiej jakości bibliotekę ekspresji genów, podczas gdy specyficzny pik 194 par zasad pokazywał bibliotekę oligo hashtagów.Analiza sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra ujawniła, że 12 klastrów, które zostały zwizualizowane przez UMAP i przeciwciała hashtagowe, zostały rozmieszczone we wszystkich klastrach. Specyficzne oznaczanie za pomocą hashtagów oligonukleotydów zostało potwierdzone przez wyrażenie Xist. Hashtagi od 1 do 4 oznaczają kobiety, a od 5 do 8 oznaczają próbki męskie.Jakość i rozdzielczość danych sekwencjonowania zweryfikowano za pomocą kluczowych transkryptów, takich jak TH, DBH i SNAP25 w klastrach 5 i 7 dla neuronów współczulnych, S100B w klastrach od 0 do 3 dla satelitarnych komórek glejowych, PECAM 1 w klastrze 4 dla komórek śródbłonka i ACTA2 w klastrze 8 dla komórek zrębu. Próbując tej metody, należy pamiętać o odpowiednim przygotowaniu i odpowiednim sprzęcie, takim jak drobne nożyczki preparacyjne, ostra pęseta i wirówka z wahadłowym wirnikiem kubełkowym. Stopniowe podejście do sekwencjonowania jednojądrowego RNA współczulnych zewnętrznych zwojów serca ma potencjał do szerokiego zastosowania w charakterystyce zwojów unerwiających inne powiązane narządy i tkanki w zdrowiu i chorobie.

low-input-nucleus-isolation-multiplexing-with-barcoded-antibodies

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Tutaj prezentujemy protokół szybkiego izolowania wysokiej jakości jąder ze świeżej lub zamrożonej tkanki do dalszego masowo równoległego sekwencjonowania RNA. Uwzględniamy opcje detergencyjno-mechanicznego i hipotoniczno-mechanicznego rozbijania tkanek oraz lizy komórek, które można wykorzystać do izolacji jąder.

Izolacja dorosłych jąder rdzenia kręgowego do masowo równoległego sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

Ta publikacja opisuje protokół izolacji jąder z dojrzałych adipocytów, oczyszczania przez sortowanie aktywowane fluorescencją oraz transkryptomiki na poziomie pojedynczej komórki.

Izolacja jąder tkanki tłuszczowej do zastosowań genomicznych pojedynczych komórek

Izolacja pojedynczych jąder opiera się na dysocjacji i przenikaniu błony komórkowej za pomocą detergentów, etapach, które wymagają optymalizacji i są podatne na wprowadzanie artefaktów technicznych. Demonstrujemy bezdetergentowy i bezenzymatyczny protokół szybkiej izolacji nienaruszonych jąder bezpośrednio z całej tkanki, uzyskując jądra odpowiednie do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra (snRNA-Seq) lub ATAC-seq.

Izolacja jąder z całej tkanki metodą bezdetergentową i enzymatyczną

Niejednorodność wewnątrznowotworowa jest nieodłączną cechą nowotworów, w tym glejaków. Opracowaliśmy prosty i wydajny protokół, który wykorzystuje kombinację i wirowania gradientowego do izolowania pojedynczych jąder ze świeżo mrożonych tkanek glejaka do badań sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i ATAC.

Izolacja jąder ze świeżo zamrożonych guzów mózgu dla sekwencji RNA pojedynczego jądra i sekwencji ATAC

Tutaj prezentujemy protokół izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych nerek myszy, który poprawia reprezentację typów komórek rdzeniastych nerek i pozwala uniknąć artefaktów ekspresji genów spowodowanych dysocjacją enzymatyczną tkanki.

Izolacja jąder z nerki dorosłej myszy w celu sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

Tutaj prezentujemy protokół izolacji jąder z błyskawicznie zamrożonych, zarchiwizowanych tkanek wątroby dla jednojądrowego sekwencjonowania RNA, sekwencji ATAC i multiomiki stawów (sekwencja RNA i sekwencja ATAC).

Izolacja jąder z zamrożonej tkanki wątroby w celu multiomiki jednokomórkowej

Tutaj prezentujemy protokół opisujący przygotowanie jąder komórkowych. Po mikrodysekcji i enzymatycznej dysocjacji tkanki serca na pojedyncze komórki, komórki progenitorowe zamrożono, a następnie wyizolowano czyste żywe komórki, które wykorzystano do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i testu pojedynczego jądra dla chromatyny dostępnej dla transpozazy z wysokoprzepustowymi analizami sekwencjonowania.

Izolacja jąder z komórek progenitorowych serca myszy w celu profilowania epigenomu i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Badanie opisuje prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych tkanek ssaków do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder.

Prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolacji pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra

Biologia międzymięśniowej tkanki tłuszczowej (IMAT) jest w dużej mierze niezbadana ze względu na ograniczoną dostępność tkanek ludzkich. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji jąder i przygotowania biblioteki zamrożonego ludzkiego IMAT do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder w celu identyfikacji składu komórkowego tego unikalnego magazynu tłuszczu.

Izolacja jąder z ludzkiej międzymięśniowej tkanki tłuszczowej i sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder w dół

Opisano tutaj zabieg częściowego podwiązania tętnicy szyjnej, który wywołuje zaburzenia przepływu krwi i późniejszy rozwój miażdżycy (w ciągu dwóch tygodni) z neowaskularyzacją wewnątrzblaszczkową (w ciągu czterech tygodni) w wspólnej tętnicy szyjnej myszy. Opisano również nową metodę izolacji RNA z błony wewnętrznej tętnicy szyjnej, zapewniającą wysoką czystość RNA śródbłonkowego.

Model miażdżycy indukowanej zaburzeniem przepływu w tętnicy szyjnej myszy poprzez częściowe podwiązanie oraz prosta metoda izolacji RNA z endotelium tętnicy szyjnej

Poznaj metodę izolacji jąder z neuronów współczulnych serca myszy przy użyciu sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra. Protokół obejmuje barcoding hashtag oligos umożliwiający multipleksowanie próbek o niskim poziomie wejściowym.

Izolacja i multipleksowanie jądra o niskim poziomie wejściowym z przeciwciałami kodowymi zwojów współczulnych myszy do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja i multipleksowanie jądra o niskim poziomie wejściowym z przeciwciałami kodowymi zwojów współczulnych myszy do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

Przeglądaj więcej filmów