Name: Usunięcie wewnętrznego translacyjnego miejsca startowego z mRNA przy zachowaniu ekspresji białka o pełnej długości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Poznaj metodę genotypowania myszy z mutacją M213L w genie Gja1 przy użyciu PCR i enzymów restrykcyjnych. Protokół umożliwia efektywną identyfikację genotypów poprzez analizę wzorców pasm na żelu agarozowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekt był wspierany przez granty National Institutes of Health (R01HL152691, R01HL138577 i R01HL159983) dla RMS.

'Wszystkie protokoły opieki nad zwierzętami i badań zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Centrum Medycznym Cedars-Sinai i Uniwersytecie Utah. Do eksperymentów wykorzystano samice myszy C57BL/6J pozyskane ze źródeł komercyjnych w wieku 8-9 tygodni (patrz tabela materiałów).
1. Przygotowanie do celowania w geny
<ol>
	<li>Wybierz prowadzącą sekwencję docelową wokół docelowego miejsca mutacji kodującego M213 za pomocą algorytmu internetowego CRISPOR4,9,10 (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Wybrano 20-zasadową sekwencję prowadzącą (ATTCAGAGCGAGAGACACCA), w przeciwnej nici niż sekwencja kodująca GJA1, z wynikiem MIT11 z 62, w której potencjalne miejsce rozszczepienia znajduje się po 16 zasadach poniżej kodonu, który ma być zmutowany (ATG) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1; cała sekwencja crRNA jest pokazana w Tabeli 1).</li>
	<li>Zsyntetyzuj crRNA i tracrRNA, które oddziałują z Cas9 jako przewodnik RNA12. 
	UWAGA: Chociaż wynik MIT przewodnika RNA wynosi 62, istnieje tylko jedna potencjalna mutacja poza celem z czterema niedopasowaniami oddalonymi od PAM o więcej niż 12 zasad. Dlatego ten przewodnik RNA jest uważany za bezpieczny.</li>
	<li>Zaprojektuj oligonomit donorowy komplementarny do sekwencji prowadzącej w celu wprowadzenia pojedynczego podstawienia aminokwasu (ATG do TTA; M213L) z ramionami homologicznymi o 60 i 48 podstawach odpowiednio po stronie 5' i 3'. 
	UWAGA: Ten oligo dawcy zawiera mutację punktową dla zakłócenia PAM (AGG do ACG) poprzez wprowadzenie cichej mutacji (TCC do TCG; S217S), aby uniknąć ponownej edycji po naprawie skierowanej na homologię CRISPR (HDR)13 w celu wprowadzenia zamierzonych mutacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 1 i Tabela 1).</li>
	<li>Użyj NaCl (200 mM stężenie końcowe) do wytrącenia 10 μg oligonukleotydów, aby zminimalizować przenoszenie soli do projądrowego buforu mikroiniekcyjnego (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 0,1 mM EDTA i 100 mM NaCl bez sperminy i spermidyny14). 
	UWAGA: Nie myj osadu DNA 70% etanolem, ponieważ osad może rozpuścić się w roztworze.</li>
	<li>Wymieszaj 50 ng/μl oligonukleotydy donorowej, 60 ng/μl mieszanki crRNA/tracrRNA (stosunek molowy 1:1) (z kroku 1.2) i 50 ng/μl białka eSpCas9 (patrz tabela materiałów), aby uzyskać mieszaninę CRISPR w końcowej objętości 20 μl (tabela 2). Zmniejszyć stężenie oligonugo dawcy w przypadku zaobserwowania wysokiej toksyczności (np. 25 ng/μl).</li>
</ol>
2. Indukcja superowulacji, pobieranie komórek jajowych, mikroiniekcja projądrowa mieszanki CRISPR i badanie przesiewowe blastocyst
UWAGA: Ta procedura jest zgodna z wcześniej opublikowanym ogólnym protokołem14.
<ol>
	<li>Wstrzyknąć 5 j.m. PMSG (gonadotropina surowicy ciężarnej klaczy) (patrz tabela materiałów) w 100 μl sterylnej wody 5-10 myszy w wieku 8 tygodni przez dotrzewnowe około godziny 15:00 (dzień 1).</li>
	<li>Wstrzyknąć dawcom komórek jajowych 5 j.m. hCG (ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej) (patrz tabela materiałów) w 100 μl sterylnej wody dawcom komórek jajowych dotrzewnowo 46-48 godzin po wstrzyknięciu PMSG (dzień 3). Zakładanie hodowli 1:1 z samcami reproduktorami.</li>
	<li>Zbierz zapłodnione jaja na podłożu M2 z hialuronidazą, przemyj trzy razy w 100 μl podłoża M2 około godziny 10:00, a następnie trzymaj w podłożu mWM15 lub KSOM16 (dzień 4) (patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>Wprowadź mieszaninę CRISPR (krok 1.3) do zarodków w stadium 1-komórkowym pobranych od myszy za pomocą mikroiniekcji projądrowej14 w 100 μL M2 pokrytych olejem parafinowym w plastikowym naczyniu na odwróconym mikroskopie z optyką zwiększającą kontrast wczesnym lub późnym popołudniem (Wideo 1). 
	UWAGA: Mikroiniekcję projądrową mieszaniny CRISPR przeprowadzono na zarodkach w stadium 1-komórkowym po 14-16 godzinach od stosunku (p.c.). Wstrzyknięte zarodki hodowano w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 przez kilka godzin i chirurgicznie przenoszono po 18-20 godzinach dziennie do myszy ICR biorcy, które miały zatyczkę kopulacyjną tego samego ranka.</li>
	<li>Przenieś 20-30 2-komórkowych zarodków do każdego biorcy, aby uzyskać rekombinowane zwierzęta. 
	UWAGA: Postępuj zgodnie z ogólnym protokołem14 lub hoduj te zarodki w pożywce mWM lub KSOM przez 4 dni, aby sprawdzić skuteczność i zbadać toksyczność. Toksyczność mieszaniny CRISPR jest dopuszczalna, gdy co najmniej jedna trzecia wstrzykniętych zarodków osiąga wcześnie stadium w pełni rozwiniętej blastocysty z wieloma rekombinantami wśród nich. Jednocześnie ponad 90% niezmanipulowanych zarodków osiąga ten sam etap blastocysty w równoległej hodowli. Postępuj zgodnie z krokiem 2.6-2.9, aby przeprowadzić badanie przesiewowe blastcyst, które nie jest konieczne, ale można je wykonać, jeśli wolisz, aby określić ilościowo wskaźnik sukcesu HDR.</li>
	<li>Indywidualnie pobrać wczesne lub w pełni rozwinięte blastocysty za pomocą 2 μl pożywki hodowlanej, używając zatkanej końcówki pipety z mikropipeterem do pojedynczych probówek do PCR (dzień 8; Wideo 2).</li>
	<li>Poddać lizie blastocysty w 8 μl mieszaniny wytrawiającej (tak samo jak w kroku 3.2; patrz tabela materiałów) i przetwarzać w temperaturze 75 °C przez 10 minut, 95 °C przez 5 minut, a następnie schłodzić do 4 °C w celu przechowywania. Użyj 2 μl lizatu jako matrycy do PCR w mieszaninie PCR o łącznej objętości 15 μl (krok 3).</li>
	<li>Zbadaj skuteczność HDR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym17 próbek PCR po trawieniu restrykcyjnym za pomocą NlaIII (etap 3-5).</li>
	<li>Potwierdź status ukierunkowanej rekombinacji, sekwencjonując 668 pz amplicon17 u założycieli i kolejnego potomstwa, aby potwierdzić integralność mutacji.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja DNA
UWAGA: Myszy w 10 dniu po urodzeniu zostały wykorzystane do tego eksperymentu z powodu nagłej śmierci myszy nokautującej GJA1-20k około 2-4 tygodni po urodzeniu4. Bardziej ogólny protokół może być również zastosowany zgodnie z wcześniej opublikowanymi raportami18.
<ol>
	<li>Odetnij 1-3 mm czubka palca lub ogona czystymi nożyczkami i przenieś do 0,2 ml 8-paskowej probówki do PCR. Aby uniknąć zanieczyszczenia próbek palców u nóg lub ogona, użyj wstępnie oczyszczonych nożyczek lub jednego ostrza na mysz lub wyczyść przed każdą próbką za pomocą 70% etanolu lub 10% wybielacza. Jeśli ogon krwawi po pobraniu próbki, należy krótko docisnąć gazą, aby zatrzymać krwawienie. Próbki z ogona należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu ekstrakcji przez okres do około tygodnia.</li>
	<li>Dodać roztwór do lizy tkanek (patrz tabela materiałów) do 100 μl/probówkę i dobrze wymieszać, a następnie odwirować za pomocą miniwirówki stołowej (2 200 x g przez 10 s w temperaturze pokojowej). Upewnij się, że próbki ogona są zanurzone w roztworze.</li>
	<li>Umieść probówki na termocyklerze ustawionym przez następujący program: 75 °C na 10 minut (liza tkanek), 95 °C na 5 minut (inaktywacja) i 4 °C (trzymanie). Przechowywać lizat tkankowy w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia, jeżeli nie można natychmiast przeprowadzić testu PCR.</li>
</ol>
4. Amplifikacja DNA metodą PCR
<ol>
	<li>Przygotować roztwór do PCR zawierający 5 μl H2O bez nukleaz, 0,75 μ5 μl 10 μM starterów do przodu i do tyłu oraz 7,5 μl głównej mieszanki PCR (patrz tabela materiałów) na próbkę do nowej probówki PCR (patrz tabela 1 dla sekwencji starterów). Jeżeli jest kilka próbek, należy przeskalować zawartość do podwielokrotności 14 μl na probówkę.</li>
	<li>Dodać 1 μl lizatu tkankowego do roztworu PCR przygotowanego w kroku 3.1. Uważaj, aby nie dotknąć ogona.</li>
	<li>Dobrze wymieszać i odwirować za pomocą mini-wirówki stołowej (2 200 x g przez 10 s w temperaturze pokojowej).</li>
	<li>Ustaw lampy na termocyklerze ustawionym przez poniższy program. Produkty PCR należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1-2 miesiące lub ~ 1 rok w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: 95 °C przez 3 minuty (krok 1, początkowa denaturacja), 95 °C przez 15 s (krok 2, denaturacja), 60 °C przez 15 s (krok 2, wyżarzanie), 72 °C przez 45 s (krok 2, przedłużenie), powtórz krok 2 przez 35 cykli, 72 °C przez 10 minut (krok 3, końcowe rozszerzenie) i 4 °C (krok 4, Gospodarstwo rolne).</li>
</ol>
5. Inkubacja z enzymem restrykcyjnym
<ol>
	<li>Przygotować roztwór enzymatyczny zawierający 7 μl wolnego od nukleazH2O, 2 μl 10x buforu CutSmart i 1 μl enzymu restrykcyjnego NlaIII (patrz tabela materiałów). Jeżeli jest kilka próbek, pomnóż każdą zawartość, aby otrzymać mieszaninę i podwielokrotność 10 μl na probówkę.</li>
	<li>Dodać 10 μl produktu PCR otrzymanego w kroku 3 do roztworu enzymu na probówkę.</li>
	<li>Dobrze wymieszać i odwirować za pomocą mini-wirówki stołowej (2 200 x g przez 10 s w temperaturze pokojowej).</li>
	<li>Ustaw rurki na termocyklerze lub bloku grzewczym ustawionym przez poniższy program. Przechowywać produkt po inkubacji w temperaturze 4 °C przez 1-2 miesiące lub ~ 1 rok w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: 37 °C przez 16 godzin (co najmniej 2 godziny; krótki czas inkubacji może spowodować niewystarczające rozszczepienie) i 4 °C przez trzymanie.</li>
</ol>
6. Wykrywanie prążków DNA
<ol>
	<li>Przygotuj 1,5% żel agarozowy zawierający barwnik w żelu DNA do elektroforezy.
	<ol>
		<li>Dodaj 0,75 g agarozy do 50 ml buforu 1x TAE, a następnie wymieszaj i podgrzej w kuchence mikrofalowej, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Po wystudzeniu dodać 5 μl barwnika DNA i delikatnie wymieszać.</li>
		<li>Wlej do formy żelowej (25 ml na formę) i pozwól żelowi zastygnąć. Aby uzyskać lepszą rozdzielczość i separację, w razie potrzeby zwiększ stężenie agarozy do 2,5%-4%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj 10 μl strawionego produktu PCR do studzienki. W razie potrzeby wymieszaj 6x bufor ładujący.</li>
	<li>Uruchom żel napięciem 100 V przez 35 minut 
	UWAGA: Te parametry mogą wymagać optymalizacji.</li>
	<li>Obraz w świetle UV (długość fali 302 nm).</li>
</ol>

<ol><li>Smyth, J. W., Shaw, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+of+connexin43+gap+junction+formation+by+internally+translated+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms.</a> Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).</li>
<li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GJA1-20k+arranges+actin+to+guide+Cx43+delivery+to+cardiac+intercalated+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercalated discs.</a> Circulation Research. 121 (9), 1069-1080 (2017).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cx43+isoform+GJA1-20k+promotes+microtubule+dependent+mitochondrial+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cx43 isoform GJA1-20k promotes microtubule dependent mitochondrial transport.</a> Frontiers in Physiology. 8, 905(2017).</li>
<li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxiliary+trafficking+subunit+GJA1-20k+protects+connexin-43+from+degradation+and+limits+ventricular+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Auxiliary trafficking subunit GJA1-20k protects connexin-43 from degradation and limits ventricular arrhythmias.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (9), 4858-4870 (2020).</li>
<li>Syvanen, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+gels+to+chips%3A+%26%2334%3Bminisequencing%26%2334%3B+primer+extension+for+analysis+of+point+mutations+and+single+nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">From gels to chips: &#34;minisequencing&#34; primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms.</a> Human Mutation. 13 (1), 1-10 (1999).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+SNP+discovery+in+tetraploid+alfalfa+using+454+sequencing+and+high+resolution+melting+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide SNP discovery in tetraploid alfalfa using 454 sequencing and high resolution melting analysis.</a> BMC Genomics. 12, 1-11 (2011).</li>
<li>Han, Y., Khu, D. M., Monteros, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+melting+analysis+for+SNP+genotyping+and+mapping+in+tetraploid+alfalfa+%28Medicago+sativa+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">High-resolution melting analysis for SNP genotyping and mapping in tetraploid alfalfa (Medicago sativa L.).</a> Molecular Breeding. 29 (2), 489-501 (2012).</li>
<li>Peng, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+quick+PCR-based+method+to+genotype+mice+with+a+leptin+receptor+mutation+%28db%2Fdb+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice).</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (1), 117-123 (2018).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148(2016).</li>
<li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPOR%3A+Intuitive+guide+selection+for+CRISPR%2FCas9+genome+editing+experiments+and+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 242-245 (2018).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Paquet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+introduction+of+specific+homozygous+and+heterozygous+mutations+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9.</a> Nature. 533 (7601), 125-129 (2016).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , (2014).</li>
<li>Pomp, D., Critser, E. S., Rutledge, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+sodium+lactate+in+Whitten%27s+medium+improves+in+vitro+developmental+capacity+of+one-cell+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Lower sodium lactate in Whitten's medium improves in vitro developmental capacity of one-cell mouse embryos.</a> Theriogenology. 29 (5), 1019-1025 (1988).</li>
<li>Summers, M. C., McGinnis, L. K., Lawitts, J. A., Raffin, M., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IVF+of+mouse+ova+in+a+simplex+optimized+medium+supplemented+with+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">IVF of mouse ova in a simplex optimized medium supplemented with amino acids.</a> Human Reproduction. 15 (8), 1791-1801 (2000).</li>
<li>Green, M. R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MRS+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual+%28Fourth+Edition%29%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition)</a>. , (2012).</li>
<li>Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+genotyping+of+animals+followed+by+establishing+primary+cultures+of+brain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments.+95%22%5BJournal%5D)">Rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. 95. (95), e51879(2015).</li>
<li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+unexpected+CRISPR-Cas9+off-target+activity+revealed+by+trio+sequencing+of+gene-edited+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">No unexpected CRISPR-Cas9 off-target activity revealed by trio sequencing of gene-edited mice.</a> PLoS Genetics. 14 (7), 1007503(2018).</li>
<li>Nature Medicine. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keep+off-target+effects+in+focus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Keep off-target effects in focus.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1081(2018).</li>
<li>Mayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+EcoRI-activity+of+EcoRI+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Optimization of the EcoRI-activity of EcoRI endonuclease.</a> FEBS Letters. 90 (2), 341-344 (1978).</li>
<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point+mutations+close+to+the+AUG+initiator+codon+affect+the+efficiency+of+translation+of+rat+preproinsulin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Point mutations close to the AUG initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulin in vivo.</a> Nature. 308 (5956), 241-246 (1984).</li>
<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point+mutations+define+a+sequence+flanking+the+AUG+initiator+codon+that+modulates+translation+by+eukaryotic+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes.</a> Cell. 44 (2), 283-292 (1986).</li>
<li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+response+protein+GJA1-20k+promotes+mitochondrial+biogenesis%2C+metabolic+quiescence%2C+and+cardioprotection+against+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Stress response protein GJA1-20k promotes mitochondrial biogenesis, metabolic quiescence, and cardioprotection against ischemia/reperfusion injury.</a> JCI Insight. 3 (20), 121900(2018).</li>
<li>Shimura, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+mitochondrial+fission+induced+by+stress-responsive+protein+GJA1-20k%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Protective mitochondrial fission induced by stress-responsive protein GJA1-20k.</a> Elife. 10, 69207(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Model myszy zmodyfikowany genowo jest powszechnym podejściem do zrozumienia funkcji genów. Ponieważ jednak wewnętrznie translowana izoforma GJA1-20k ulega translacji z tego samego mRNA Gja1 , co Cx43 o pełnej długości, opracowano strategię twórczą, aby zachować ekspresję Cx43 o pełnej długości, jednocześnie tłumiąc ekspresję GJA1-20k. Podejście to opiera się na mutacji wewnętrznego kodonu start GJA1-20k. Z pojedynczą mutacją punktową, M213 został przełączony na L na mRNA Gja1 , który skutecznie stłumił ...

Pełnowymiarowa izoforma Connexin 43 (Cx43) i N-końcowa skrócona izoforma, GJA1-20k, kodowane przez ten sam mRNA GJA1, ale wykorzystujące różne kodony startowe1 do zainicjowania translacji. Translacja Cx43 zachodzi w pierwszym kodonie start AUG, podczas gdy translacja GJA1-20k rozpoczyna się w AUG przy reszcie 213. Wcześniej stwierdzono, że GJA1-20k odgrywa istotną rolę w transporcie Cx43 na całej długości, stabilizacji aktyny i regulacji morfologii mitochondriów in vitro1,2,3.
Aby zrozumieć rolę GJA1-20k in vivo, wygenerowano model myszy GJA1-20k "knock-out", który zachował zdolność do tworzenia pełnej długości Cx43. Podejście polegało na użyciu systemu CRISPR-Cas9 do podstawienia pojedynczej reszty w 213 z metioniny (M) do leucyny (L) (Gja1M213L/M213L)4. Wewnętrzna mutacja M do L radykalnie zmniejsza prawdopodobieństwo wystąpienia translacji wewnętrznej, zachowując jednocześnie translację i funkcję białka o pełnej długości4. Ponieważ typ dziki (WT) i zmutowany allel mają identyczne rozmiary i prawie identyczne produkty mRNA, istnieje znaczna trudność w potwierdzeniu genotypu u myszy. Sekwencjonowanie DNA może zidentyfikować mutację, ale jest zbyt drogie i czasochłonne do rutynowego stosowania. Ogólnie rzecz biorąc, ustalono kilka szybszych metod genotypowania, takich jak reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR), minisekwencjonowanie-ligacja, analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości i oporny na leczenie system mutacji amplifikacji tetra-starterów PCR (ARMS-PCR)5,6,7,8. Jednak te alternatywne metody wymagają wielu etapów, unikalnych zasobów i/lub kilku określonych zestawów starterów, które mogą indukować niespecyficzne produkty PCR.
Ten protokół wprowadza szczegółowe podejście do celowania i edycji genów za pomocą CRISPR-Cas9 w celu stworzenia pojedynczej mutacji aminokwasu, a szybkie genotypowanie jest prezentowane w celu potwierdzenia mutacji. Identyfikacja genotypu polega na kreatywnym wykorzystaniu enzymów restrykcyjnych wykorzystujących tylko jeden zestaw starterów do identyfikacji docelowego genu. Czytelnicy są odsyłani do Reference4, aby zaobserwować głęboki elektrofizjologiczny efekt nagłej śmierci sercowej spowodowanej mutacją substytucyjną Gja1M213L/M213L, która nadal generuje białko o pełnej długości, ale nie generuje mniejszej, wewnętrznie translowanej izoformy skrócenia. Protokół ten pomoże innym modelom myszy wykorzystać mutację punktową w celu zmniejszenia wewnętrznej translacji interesującej nas izoformy, przy jednoczesnym zachowaniu ekspresji endogennego białka o pełnej długości.

<table><tbody><tr><td>0,2 ml 8-paskowa probówka do PCR</td><td>Thomas Scientific</td><td>1148A28</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>Do projądrkowego buforu mikoriniekcyjnego</td></tr><tr><td>10x bufor CutSmart</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td>Bufor mineralizacyjny do NlaIII</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 7,5</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td>Do projądrkowego buforu mikoriniekcyjnego</td></tr><tr><td>50x TAE Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>24710-030</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowy termocykler</td><td>Applied Biosystems</td><td>Model # 9902</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>Szczep myszy Jackson Laboratory</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania Chemidoc MP</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>Aby wykonać obraz żelu za pomocą światła UV 302 nm</td></tr><tr><td>białka</td> <td>eSpCas9MilliporeSigma</td><td>ESPCAS9PRO-50UG</td><td></td></tr><tr><td>Gel Lading Dye Purple (6x)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td>Bufor ładujący do elektroforezy</td></tr><tr><td>Rękawice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hCG (ludzka gonadotropina kosmówkowa)</td><td>MiliporeSigma</td><td>23-073-425G</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza</td><td>MiliporeOprogramowanie</td><td>Sigma H3884-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Image Lab</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>Do analizy obrazu żelu</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop stereoskopowy z plasDIC</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert A1</td><td></td></tr><tr><td>KAPA Zestawy do genotypowania myszy</td><td>Roche Diagnostics</td><td>KK7352</td><td>Do lizy tkanek lub komórek, ekstrakcji DNA i wzorcowej mieszanki PCR</td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli zarodków</td><td>KSOM</td><td>LifeGlobal</td><td>ZEKS-050</td> Pożywka</tr><tr><td>laboratoryjna Coart</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>M2</td><td>MilliporeSigma</td><td>MR015D</td><td></td></tr><tr><td>NlaIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0125S</td><td>Do trawienia produktu PCR</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>Do rozcieńczania odczynników</td></tr><tr><td>Olej parafinowy</td><td>Nacalai USA</td><td>2613785</td><td></td></tr><tr><td>Plugged 20 &mu; L końcówka do pipet z drobną pipetą</td><td>FisherScientific</td><td>02-707-171</td><td>Do zbierania blastocytów</td></tr><tr><td>PMSG (klacz w ciąży' s gonadotropina w surowicy)</td><td>ProSpec-Tany</td><td>HOR-272</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Invitrogen</td><td>AM9760G</td><td>Do projądrowego buforu mikoriniekcyjnego</td></tr><tr><td>SYBR bezpieczny żel DNA Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Do wykrywania prążków w żelu</td></tr><tr><td>tracrRNA</td><td>Dharmacon</td><td>U-002000-120</td><td>Guid RNA</td></tr></tbody></table>

usunięcie wewnętrznego translacyjnego miejsca startowego z mrna przy zachowaniu ekspresji białka o pełnej długości

Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein

System edycji genów CRISPR-Cas9, oparty na mechanizmach naprawy genomu, umożliwia szybsze i łatwiejsze generowanie zmodyfikowanych genowo modeli myszy w porównaniu z tradycyjną rekombinacją homologiczną. System CRISPR-Cas9 jest szczególnie atrakcyjny, gdy pożądana jest mutacja jednopunktowa. Białko połączenia szczelinowego, Connexin 43 (Cx43), jest kodowane przez gen Gja1, który ma pojedynczy ekson kodujący i nie może być splicowany. Jednak Gja1 wytwarza nie tylko białko Cx43 o pełnej długości, ale także do sześciu izoform skróconych na N-końcach w procesie znanym jako translacja wewnętrzna, będąca wynikiem inicjacji translacji rybosomalnej w wewnętrznych miejscach startowych AUG (metioniny). GJA1-20k jest najczęściej generowaną skróconą izoformą Cx43 inicjowaną w kodonie AUG w pozycji 213 mRNA Gja1. Ponieważ reszta 213 występuje na końcu ostatniej domeny transbłonowej Cx43, GJA1-20k jest w rzeczywistości ogonem C-końcowym Cx43 o masie 20 kDa jako niezależne białko. Poprzedni badacze zidentyfikowali w komórkach, że kluczową rolą GJA1-20k jest ułatwianie transportu półkanałów Cx43 o pełnej długości do błony komórkowej. Aby zbadać to zjawisko in vivo, wygenerowano zmutowaną mysz z mutacją punktową Gja1, która zastępuje ATG (metioninę) w reszcie 213 TTA (leucyna, mutacja M213L). Wynikiem M213L jest to, że mRNA Gja1 i Cx43 o pełnej długości są nadal generowane, ale translacja Gja1-20k jest znacznie zmniejszona. Niniejszy raport koncentruje się na wyborze miejsca enzymu restrykcyjnego w celu opracowania modelu myszy z mutacją jednego aminokwasu (Gja1M213L/M213L). Protokół ten opisuje genetycznie zmodyfikowane myszy za pomocą systemu CRISPR-Cas9 i szybkie genotypowanie poprzez połączenie PCR i leczenia enzymami restrykcyjnymi.

System edycji genów CRISPR/Cas9 wprowadza mutację ATG na TTA oraz cichą mutację TCC na TCG odpowiednio w pozycjach 56 264 279–56 264 281 oraz 56 264 291–56 264 293 w chromosomie 10 myszy lub w pozycjach 869–871 i 881–883 w mRNA Gja1. Mutacje te skutkują zamianą metioniny 213 na leucynę (M213L) w białku GJA1, a mutacja TTC na TTG zaburza pobliską sekwencję PAM, aby zapobiec niepożądanej edycji genu (Ryc. 1). Szczegóły mutacji zostały opisane w poprzednim raporcie4....

Obecny protokół opisuje pojedynczą mutację M213L w Gja1, która zachowuje pełną generację Connexin43, ale uniemożliwia translację mniejszej wewnętrznie translowanej izoformy GJA1-20k.

Usunięcie wewnętrznego translacyjnego miejsca startowego z mRNA przy zachowaniu ekspresji białka o pełnej długości

The CRISPR-Cas9 gene-editing system, based on genome repair mechanisms, enables the generation of gene-modified mouse models more quickly and easily ...

Trudność z podstawieniem pojedynczej pozostałości polega na skutecznym genotypowaniu zwierząt pomimo różnicy w pojedynczej pozostałości. Specjalne zastosowanie enzymu restrykcyjnego dodaje tylko jeden, szybki i tani krok do typowego genotypowania opartego na PCR. Protokół ten można zastosować do dowolnego innego modelu myszy z punktem mutacji, jeśli sekwencja docelowa jest rozpoznawana przez enzym restrykcyjny, co zwykle ma miejsce.Wytnij od jednego do trzech milimetrów końcówki ogona czystymi nożyczkami i przenieś ją do 0,2-mililitrowej ośmiopaskowej probówki do PCR. Po umieszczeniu próbki ogona zgodnie z opisem w manuskrypcie, należy ją przechowywać w temperaturze T-minus 20 stopni Celsjusza do momentu ekstrakcji, do około tygodnia. Dodać 100 mikrolitrów roztworu do lizy tkanek na probówkę i dobrze wymieszać, a następnie odwirować za pomocą miniwirówki stołowej przy 2,200 razy G przez 10 sekund w temperaturze pokojowej.Upewnij się, że próbki ogona są zanurzone w roztworze. Umieść probówki na termocyklerze, programując parametry lizy, inaktywacji i utrzymywania tkanek. Przechowuj lizat tkankowy w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do tygodnia, jeśli nie można natychmiast wykonać PCR.Przygotuj roztwór PCR zawierający pięć mikrolitrów wody wolnej od nukleaz, 0,75 mikrolitra 10-mikromolowych starterów do przodu i do tyłu oraz 7,5 mikrolitra głównej mieszanki PCR na próbkę do nowej probówki PCR. Dodać jeden mikrolitr wcześniej przygotowanego lizatu tkankowego do roztworu PCR. Dobrze wymieszaj roztwór PCR i odwiruj miniwirówką stołową o temperaturze 2 200 razy G przez 10 sekund w temperaturze pokojowej.Ustaw probówki na zaprogramowanym termocyklerze. Po zakończeniu reakcji produkty PCR należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jeden do dwóch miesięcy lub około jednego roku w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Przygotuj roztwór enzymatyczny zawierający siedem mikrolitrów wody wolnej od nukleaz, dwa mikrolitry buforu CutSmart o stężeniu 10X i jeden mikrolitr enzymu restrykcyjnego NlaIII.Jeśli jest kilka próbek, pomnóż każdą zawartość, aby uzyskać mieszaninę i podwielokrotność 10 mikrolitrów na probówkę. Dodać 10 mikrolitrów wcześniej otrzymanego produktu PCR do roztworu enzymatycznego na probówkę. Dobrze wymieszaj i odwiruj za pomocą miniwirówki stołowej, jak pokazano wcześniej.Ustaw rurki na zaprogramowanym termocyklerze lub bloku grzewczym. Produkt po inkubacji przechowywać w niskich temperaturach. Dodaj 0,75 grama agarozy do 50 mililitrów buforu TAE o pojedynczej mocy.Wymieszaj i podgrzej agarozę w kuchence mikrofalowej, aż całkowicie się rozpuści. Po schłodzeniu dodaj pięć mikrolitrów barwnika DNA i delikatnie wymieszaj. Wlej 25 mililitrów żelu agarozowego do formy żelowej i pozwól żelowi zastygnąć.Załaduj 10 mikrolitrów strawionego produktu PCR do studzienki. Uruchom żel napięciem 100 woltów przez 35 minut. Wyobraź sobie żel agarozowy w świetle ultrafioletowym.Elektroforeza agarozowa przeprowadzona przy użyciu strawionego produktu PCR spowodowała powstanie kilku prążków o różnych rozmiarach w każdym genotypie, z dwoma prążkami odpowiednio w typie dzikim, trzema w heterozygotycznym i jednym w homozygotycznym. Wstrzyknięcie testowe z analizą blastocyst wykazało odpowiednio 76,9% wskaźnik sukcesu przy wstrzyknięciu 50 nanogramów na mikrolitr oligonukleotydów i 25% wskaźnik sukcesu po wstrzyknięciu 25 nanogramów na mikrolitr tego samego oligonukleotydów dawcy. Wreszcie, wstrzyknięcie 50 nanogramów na mikrolitr oligonukleotydów dawcy z wytrącaniem etanolu uzyskało zwierzęta założycielskie z 50% wskaźnikiem sukcesu.Oczyszczanie oligonukleotydów przez wytrącanie etanolu obniżyło toksyczność przy zachowaniu wysokiej wydajności edycji genomu. Bardzo ważne jest ostrożne obchodzenie się z odczynnikami i dodawanie niewielkiej ilości odczynników. Upewnij się, że są prawidłowo dodane i dobrze wymieszane.

removal-an-internal-translational-start-site-from-mrna-while

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Główną przeszkodą w analizach biochemicznych rybosomów zawierających powstające peptydylo-tRNA była obecność innych rybosomów w tych samych próbkach — rybosomów niezaangażowanych w translację konkretnej analizowanej sekwencji mRNA. Opracowaliśmy prostą metodologię pozwalającą na wyłączną puryfikację rybosomów zawierających interesujące nas powstające peptydylo-tRNA.

Izolacja rybosomów translacyjnych zawierających peptydylo-tRNA do analiz funkcjonalnych i strukturalnych

Opisano technikę identyfikacji miejsc zatrzymania translacji na mRNA. Procedura ta opiera się na izolacji nowo powstających polipeptydów gromadzących się na rybosomach podczas translacji in vitro docelowego mRNA, a następnie na analizie wielkości łańcuchów nascentnych przy użyciu denaturującej elektroforezy żelowej.

Izolacja związanych z rybosomami nowo powstałych polipeptydów in vitro w celu identyfikacji miejsc pauzy translacyjnej wzdłuż mRNA

Opisujemy tutaj technikę, która jest obecnie rutynowo stosowana do izolacji stabilnie związanych kompleksów powstającego łańcucha rybosomalnego (RNCs). Technika ta wykorzystuje odkrycie, że sekwencja „zatrzymująca” SecM o długości 17 aminokwasów może wstrzymać elongację translacji w systemie prokariotycznym (E. coli), gdy zostanie wstawiona do niemal każdego białka (lub połączona z jego końcem C).

Wykorzystanie sekwencji zatrzymującej SecM jako narzędzia do izolacji polipeptydów związanych z rybosomami

Tutaj opisujemy metodę wizualizacji mRNA związanych z retikulum endoplazmatycznym w komórkach hodowli tkanek ssaków. Technika ta polega na selektywnej przepuszczalności błony plazmatycznej digitoniną w celu usunięcia zawartości cytoplazmatycznej, a następnie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu wykrycia masowych mRNA poli(A) lub specyficznych transkryptów.

Wizualizacja mRNA zlokalizowanych w retikulum endoplazmatycznym w komórkach ssaków

Wiele mRNA kodujących białka mitochondrialne jest związanych z zewnętrzną błoną mitochondriów. Opisujemy procedurę frakcjonowania subkomórkowego mającą na celu wyizolowanie mitochondriów drożdży wraz z powiązanymi z nimi mRNA i rybosomami. Protokół ten można zastosować do komórek hodowanych w różnych warunkach w celu ujawnienia mechanizmów lokalizacji mRNA i zlokalizowanej translacji w pobliżu mitochondriów.

Izolacja mRNA związanych z mitochondriami drożdży w celu zbadania mechanizmów zlokalizowanej translacji

Ten manuskrypt opisuje metodę wizualizacji i ilościowego określania zlokalizowanych zdarzeń translacji w subkomórkowych przedziałach. Podejście zaproponowane w tym manuskrypcie wymaga podstawowego systemu obrazowania konfokalnego i odczynników oraz jest szybkie i opłacalne.

Immunofluorescencja ilościowa do pomiaru globalnej translacji zlokalizowanej

Toeprinting ma na celu zmierzenie zdolności transkrybowanego RNA in vitro do tworzenia kompleksów inicjujących translację z rybosomami w różnych warunkach. Protokół ten opisuje metodę odciskania palca RNA ssaków i może być stosowany do badania translacji zarówno zależnej od czapeczki, jak i sterowanej przez IRES.

Analiza odcisków palców u nóg tworzenia kompleksu inicjacji translacji na mRNA ssaków

Bezpośrednie dostarczanie wstępnie złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych Cas9/przewodnikowego RNA to szybki i skuteczny sposób na edycję genomu w komórkach krwiotwórczych. Tutaj wykorzystujemy to podejście do usunięcia tłumika intronowego RUNX1 i zbadania odpowiedzi transkrypcyjnych w komórkach białaczkowych OCI-AML3.

Badanie transkrypcyjnej roli tłumika intronowego RUNX1 przez rybonukleoproteinę CRISPR/Cas9 w komórkach ostrej białaczki szpikowej

Niniejsza procedura opisuje sposób tworzenia pierwotnych kultur komórek krwiotwórczych z szpiku kostnego myszy, po których następuje transfekcja przy użyciu systemu elektroporacji Gene Pulser MXCell.

Przygotowanie pierwotnych kultur komórek hematopoetycznych z szpiku kostnego myszy do elektroporacji

Mutageneza celowana całych plazmidów to prosty sposób na stworzenie nieco odmiennych wariantów oryginalnego plazmidu. W niniejszej pracy demonstrujemy łatwą i kosztowo efektywną metodę wprowadzania substytucji zasad w plazmidzie przy użyciu standardowych odczynników.

Własna metoda mutagenezy celowanej całych plazmidów

Poznaj metodę genotypowania myszy z mutacją M213L w genie Gja1 przy użyciu PCR i enzymów restrykcyjnych. Protokół umożliwia efektywną identyfikację genotypów poprzez analizę wzorców pasm na żelu agarozowym.

Usunięcie wewnętrznego translacyjnego miejsca startowego z mRNA przy zachowaniu ekspresji białka o pełnej długości

Przeglądaj więcej filmów