Usunięcie wewnętrznego translacyjnego miejsca startowego z mRNA przy zachowaniu ekspresji białka o pełnej długości

Trudność z podstawieniem pojedynczej pozostałości polega na skutecznym genotypowaniu zwierząt pomimo różnicy w pojedynczej pozostałości. Specjalne zastosowanie enzymu restrykcyjnego dodaje tylko jeden, szybki i tani krok do typowego genotypowania opartego na PCR. Protokół ten można zastosować do dowolnego innego modelu myszy z punktem mutacji, jeśli sekwencja docelowa jest rozpoznawana przez enzym restrykcyjny, co zwykle ma miejsce.

Wytnij od jednego do trzech milimetrów końcówki ogona czystymi nożyczkami i przenieś ją do 0,2-mililitrowej ośmiopaskowej probówki do PCR. Po umieszczeniu próbki ogona zgodnie z opisem w manuskrypcie, należy ją przechowywać w temperaturze T-minus 20 stopni Celsjusza do momentu ekstrakcji, do około tygodnia. Dodać 100 mikrolitrów roztworu do lizy tkanek na probówkę i dobrze wymieszać, a następnie odwirować za pomocą miniwirówki stołowej przy 2,200 razy G przez 10 sekund w temperaturze pokojowej.

Upewnij się, że próbki ogona są zanurzone w roztworze. Umieść probówki na termocyklerze, programując parametry lizy, inaktywacji i utrzymywania tkanek. Przechowuj lizat tkankowy w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do tygodnia, jeśli nie można natychmiast wykonać PCR.

Przygotuj roztwór PCR zawierający pięć mikrolitrów wody wolnej od nukleaz, 0,75 mikrolitra 10-mikromolowych starterów do przodu i do tyłu oraz 7,5 mikrolitra głównej mieszanki PCR na próbkę do nowej probówki PCR. Dodać jeden mikrolitr wcześniej przygotowanego lizatu tkankowego do roztworu PCR. Dobrze wymieszaj roztwór PCR i odwiruj miniwirówką stołową o temperaturze 2 200 razy G przez 10 sekund w temperaturze pokojowej.

Ustaw probówki na zaprogramowanym termocyklerze. Po zakończeniu reakcji produkty PCR należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jeden do dwóch miesięcy lub około jednego roku w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Przygotuj roztwór enzymatyczny zawierający siedem mikrolitrów wody wolnej od nukleaz, dwa mikrolitry buforu CutSmart o stężeniu 10X i jeden mikrolitr enzymu restrykcyjnego NlaIII.

Jeśli jest kilka próbek, pomnóż każdą zawartość, aby uzyskać mieszaninę i podwielokrotność 10 mikrolitrów na probówkę. Dodać 10 mikrolitrów wcześniej otrzymanego produktu PCR do roztworu enzymatycznego na probówkę. Dobrze wymieszaj i odwiruj za pomocą miniwirówki stołowej, jak pokazano wcześniej.

Ustaw rurki na zaprogramowanym termocyklerze lub bloku grzewczym. Produkt po inkubacji przechowywać w niskich temperaturach. Dodaj 0,75 grama agarozy do 50 mililitrów buforu TAE o pojedynczej mocy.

Wymieszaj i podgrzej agarozę w kuchence mikrofalowej, aż całkowicie się rozpuści. Po schłodzeniu dodaj pięć mikrolitrów barwnika DNA i delikatnie wymieszaj. Wlej 25 mililitrów żelu agarozowego do formy żelowej i pozwól żelowi zastygnąć.

Załaduj 10 mikrolitrów strawionego produktu PCR do studzienki. Uruchom żel napięciem 100 woltów przez 35 minut. Wyobraź sobie żel agarozowy w świetle ultrafioletowym.

Elektroforeza agarozowa przeprowadzona przy użyciu strawionego produktu PCR spowodowała powstanie kilku prążków o różnych rozmiarach w każdym genotypie, z dwoma prążkami odpowiednio w typie dzikim, trzema w heterozygotycznym i jednym w homozygotycznym. Wstrzyknięcie testowe z analizą blastocyst wykazało odpowiednio 76,9% wskaźnik sukcesu przy wstrzyknięciu 50 nanogramów na mikrolitr oligonukleotydów i 25% wskaźnik sukcesu po wstrzyknięciu 25 nanogramów na mikrolitr tego samego oligonukleotydów dawcy. Wreszcie, wstrzyknięcie 50 nanogramów na mikrolitr oligonukleotydów dawcy z wytrącaniem etanolu uzyskało zwierzęta założycielskie z 50% wskaźnikiem sukcesu.

Oczyszczanie oligonukleotydów przez wytrącanie etanolu obniżyło toksyczność przy zachowaniu wysokiej wydajności edycji genomu. Bardzo ważne jest ostrożne obchodzenie się z odczynnikami i dodawanie niewielkiej ilości odczynników. Upewnij się, że są prawidłowo dodane i dobrze wymieszane.