Usunięcie wewnętrznego translacyjnego miejsca startowego z mRNA przy zachowaniu ekspresji białka o pełnej długości
16 marca 2022
Obecny protokół opisuje pojedynczą mutację M213L w Gja1, która zachowuje pełną generację Connexin43, ale uniemożliwia translację mniejszej wewnętrznie translowanej izoformy GJA1-20k.
Trudność z podstawieniem pojedynczej pozostałości polega na skutecznym genotypowaniu zwierząt pomimo różnicy w pojedynczej pozostałości. Specjalne zastosowanie enzymu restrykcyjnego dodaje tylko jeden, szybki i tani krok do typowego genotypowania opartego na PCR. Protokół ten można zastosować do dowolnego innego modelu myszy z punktem mutacji, jeśli sekwencja docelowa jest rozpoznawana przez enzym restrykcyjny, co zwykle ma miejsce.
Wytnij od jednego do trzech milimetrów końcówki ogona czystymi nożyczkami i przenieś ją do 0,2-mililitrowej ośmiopaskowej probówki do PCR. Po umieszczeniu próbki ogona zgodnie z opisem w manuskrypcie, należy ją przechowywać w temperaturze T-minus 20 stopni Celsjusza do momentu ekstrakcji, do około tygodnia. Dodać 100 mikrolitrów roztworu do lizy tkanek na probówkę i dobrze wymieszać, a następnie odwirować za pomocą miniwirówki stołowej przy 2,200 razy G przez 10 sekund w temperaturze pokojowej.
Upewnij się, że próbki ogona są zanurzone w roztworze. Umieść probówki na termocyklerze, programując parametry lizy, inaktywacji i utrzymywania tkanek. Przechowuj lizat tkankowy w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do tygodnia, jeśli nie można natychmiast wykonać PCR.
Przygotuj roztwór PCR zawierający pięć mikrolitrów wody wolnej od nukleaz, 0,75 mikrolitra 10-mikromolowych starterów do przodu i do tyłu oraz 7,5 mikrolitra głównej mieszanki PCR na próbkę do nowej probówki PCR. Dodać jeden mikrolitr wcześniej przygotowanego lizatu tkankowego do roztworu PCR. Dobrze wymieszaj roztwór PCR i odwiruj miniwirówką stołową o temperaturze 2 200 razy G przez 10 sekund w temperaturze pokojowej.
Ustaw probówki na zaprogramowanym termocyklerze. Po zakończeniu reakcji produkty PCR należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jeden do dwóch miesięcy lub około jednego roku w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Przygotuj roztwór enzymatyczny zawierający siedem mikrolitrów wody wolnej od nukleaz, dwa mikrolitry buforu CutSmart o stężeniu 10X i jeden mikrolitr enzymu restrykcyjnego NlaIII.
Jeśli jest kilka próbek, pomnóż każdą zawartość, aby uzyskać mieszaninę i podwielokrotność 10 mikrolitrów na probówkę. Dodać 10 mikrolitrów wcześniej otrzymanego produktu PCR do roztworu enzymatycznego na probówkę. Dobrze wymieszaj i odwiruj za pomocą miniwirówki stołowej, jak pokazano wcześniej.
Ustaw rurki na zaprogramowanym termocyklerze lub bloku grzewczym. Produkt po inkubacji przechowywać w niskich temperaturach. Dodaj 0,75 grama agarozy do 50 mililitrów buforu TAE o pojedynczej mocy.
Wymieszaj i podgrzej agarozę w kuchence mikrofalowej, aż całkowicie się rozpuści. Po schłodzeniu dodaj pięć mikrolitrów barwnika DNA i delikatnie wymieszaj. Wlej 25 mililitrów żelu agarozowego do formy żelowej i pozwól żelowi zastygnąć.
Załaduj 10 mikrolitrów strawionego produktu PCR do studzienki. Uruchom żel napięciem 100 woltów przez 35 minut. Wyobraź sobie żel agarozowy w świetle ultrafioletowym.
Elektroforeza agarozowa przeprowadzona przy użyciu strawionego produktu PCR spowodowała powstanie kilku prążków o różnych rozmiarach w każdym genotypie, z dwoma prążkami odpowiednio w typie dzikim, trzema w heterozygotycznym i jednym w homozygotycznym. Wstrzyknięcie testowe z analizą blastocyst wykazało odpowiednio 76,9% wskaźnik sukcesu przy wstrzyknięciu 50 nanogramów na mikrolitr oligonukleotydów i 25% wskaźnik sukcesu po wstrzyknięciu 25 nanogramów na mikrolitr tego samego oligonukleotydów dawcy. Wreszcie, wstrzyknięcie 50 nanogramów na mikrolitr oligonukleotydów dawcy z wytrącaniem etanolu uzyskało zwierzęta założycielskie z 50% wskaźnikiem sukcesu.
Oczyszczanie oligonukleotydów przez wytrącanie etanolu obniżyło toksyczność przy zachowaniu wysokiej wydajności edycji genomu. Bardzo ważne jest ostrożne obchodzenie się z odczynnikami i dodawanie niewielkiej ilości odczynników. Upewnij się, że są prawidłowo dodane i dobrze wymieszane.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę genotypowania zwierząt z pojedynczą mutacją M213L w genie Gja1, która prowadzi do produkcji pełnowymiarowej koneksyny 43, jednocześnie zapobiegając translacji mniejszej izoformy GJA1-20k. Metoda ta podkreśla wydajność i opłacalność zastosowania enzymów restrykcyjnych w genotypowaniu opartym na technice PCR.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Genetyka
- Biologia molekularna
- Modele zwierzęce
Wprowadzenie
- Znaczenie identyfikacji mutacji genetycznych
- Wyzwania związane z podstawieniami pojedynczych reszt
- Zastosowanie enzymów restrykcyjnych w genotypowaniu
Zastosowane metody
- Genotypowanie metodą PCR
- Modele mysie z mutacjami punktowymi
- Elektroforeza w żelu agarozowym do analizy DNA
Główne wyniki
- Skuteczna identyfikacja genotypów o odmiennych wzorach prążkowania
- Wysoki odsetek sukcesu w generowaniu zwierząt założycielskich
- Zwalidowana efektywność opisanych metod analizy genetycznej
Wnioski
- Badanie przedstawia wydajny protokół genotypowania mutacji w modelach mysich.
- Wnosi ono cenne metodologie do badań genetycznych w biologii rozwoju.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia precyzyjne genotypowanie mutacji punktowych w modelach mysich, wspierając badania nad walidacją celów terapeutycznych, w których konieczna jest analiza ekspresji białek specyficznych dla danej izoformy. Poprzez eliminację zakłócających, skróconych izoform przy jednoczesnym zachowaniu funkcji pełnowymiarowego białka, metoda ta usprawnia ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkryć. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do hipotez terapeutycznych dotyczących biologii białka Connexin 43 oraz powiązanych z nim szlaków połączeń szczelinowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wyizolowanie funkcjonalnego wkładu pełnowymiarowego białka Cx43 z izoform z obciętym końcem N-terminalnym.
- Wartość operacyjna: Zapewnia skalowalną metodę genotypowania pozwalającą na rozróżnienie alleli typu dzikiego, heterozygotycznych i homozygotycznych mutantów w dużych kohortach.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów badawczych poprzez wyjaśnienie, czy obserwowane fenotypy wynikają z utraty pełnowymiarowego białka, czy z mechanizmów specyficznych dla danej izoformy.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość analizy: Generuje próbki DNA z wzorami fragmentów restrykcyjnych odpowiednimi dla wysokoprzepustowych procesów przesiewowych.
- Wynik ilościowy: Umożliwia ilościowe oznaczenie alleli poprzez analizę polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych PCR.
- Powtarzalność: Standaryzuje genotypowanie w różnych laboratoriach dzięki zastosowaniu niskokosztowego dodatku pojedynczego enzymu do istniejących protokołów PCR.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Ułatwia tworzenie modeli przedklinicznych, w których transport Cx43 i montaż połączeń szczelinowych są zaangażowane w zaburzenia kardiologiczne, neurologiczne lub onkologiczne.
- Ciągłość translacyjna: Łączy genotyp molekularny z wynikiem fenotypowym poprzez zachowanie ekspresji pełnej formy Cx43 przy jednoczesnej redukcji GJA1-20k.
- Decyzje dostosowane do ryzyka: Informuje kryteria go/no-go, umożliwiając korelację poziomów ekspresji izoform z odczytami funkcjonalnymi in vivo.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od wczesnej walidacji celu po przedkliniczne badania skuteczności, szczególnie w sytuacjach, gdy konieczne jest rozróżnienie funkcji białek specyficznych dla poszczególnych izoform.
- Biologia odkrywcza: Wspomaga testowanie hipotez poprzez umożliwienie tworzenia modeli genetycznych, które pozwalają rozróżnić funkcję pełnowymiarowego białka od aktywności izoformy skróconej.
- Przesiewy: Dostarcza gotowy do analizy genomowy DNA do dalszych zastosowań, takich jak walidacja CRISPR lub zarządzanie kolonią hodowlaną.
- Analityka: Zapewnia wyraźne, możliwe do oceny wzorce prążkowania na żelu agarozowym, co pozwala na szybkie przypisanie genotypu bez konieczności sekwencjonowania.
- Badania translacyjne: Umożliwia prowadzenie badań przedklinicznych, w których lokalizacja błonowa Cx43 oraz komunikacja międzykomórkowa są kluczowymi punktami końcowymi mechanizmu.
- Ponowne zastosowania w przedsiębiorstwie: Metoda adaptowalna do dowolnej punktowej mutacji, w której można wprowadzić lub zniweczyć miejsce restrykcyjne, co oferuje wielokrotnego użytku platformę genotypowania.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu poprzez izolację wkładu specyficznego dla izoform.
- Wartość operacyjna: zwiększa przepustowość i obniża koszt na próbkę dzięki pojedynczemu etapowi trawienia restrykcyjnego po PCR.
- Wartość strategiczna: zwiększa pewność decyzji w optymalizacji wiodących cząsteczek poprzez wyjaśnienie zależności genotyp-fenotyp.
- Wpływ na portfolio: umożliwia dostosowany do ryzyka postęp kandydatów celujących w szlaki zależne od Cx43.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu biologii molekularnej w obszarze projektowania starterów PCR oraz wyboru enzymów restrykcyjnych.
- Metoda zależy od dostępu do termocyklerów, systemów elektroforezy żelowej w agarozie oraz sprzętu do obrazowania UV.
- Konieczna jest standaryzacja lizy tkanek i warunków PCR pomiędzy użytkownikami w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Adaptacja do alternatywnych systemów modelowych zależy od kontekstu sekwencji i kompatybilności enzymów restrykcyjnych.
- Metoda jest ograniczona do mutacji, które zmieniają lub tworzą miejsce rozpoznawania enzymu restrykcyjnego; mutacje synonimiczne mogą wymagać zastosowania alternatywnych strategii.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
DNA Extraction
1:45
DNA Amplification by PCR
2:42
Incubation with Restriction Enzyme
3:34
Preparation of 1.5% Agarose Gel for Electrophoresis and DNA Band Detection
4:22
Results: Genotype Analysis and Recombination Efficiency
5:21
Conclusion
