Name: Barwienie białek w żelach za pomocą Coomassie G-250 bez rozpuszczalnika organicznego i kwasu octowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-14T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę barwienia białek w żelach poliakrylamidowych za pomocą Coomassie G-250 bez rozpuszczalników organicznych i kwasu octowego. Protokół zapewnia szybką wizualizację pasm białkowych już po jednej minucie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Ines Racké za pomoc techniczną.

Część 1: Przygotowanie roztworu barwiącego CBB
<ol>
<li>Od 60-80 mg CBB G-250 rozpuszcza się w 1 litrze wody bidestylowanej, mieszając przez 2-4 godziny. Następnie do ciemnoniebieskiego roztworu dodaje się 3 ml stężonego HCl, mieszając przez kolejną minutę, a gotowy preparat przechowuje się w ciemności do późniejszego użycia. Roztwór można przechowywać od kilku tygodni do kilku miesięcy bez utraty wydajności barwienia.</li>
<li>Ze stężonym HCl należy obchodzić się z zachowaniem zwykłych środków ostrożności i używać go pod dygestorium. Końcowy roztwór będzie miał pH około 2, dlatego należy stosować rękawice i unikać kontaktu z skórą.</li>
</ol>
Część 2: SDS-PAGE
<ol>
<li>Odpowiednie alikwoty próbek białek miesza się z buforem do prób do uzyskania końcowego stężenia 1x bufor do prób. Stosujemy 2x bufor do prób zawierający 125mM Tris/H3PO4 (pH 7,5 w 25°C), 2mM EDTA, 4% SDS, 200mM DTT, 0,02% błękitu bromofenolowego i 50% glicerolu. Można również stosować inne bufory do prób dla SDS-PAGE.</li>
<li>Próbki białek podgrzewa się przez około 5 min przed nałożeniem. W tym czasie przygotowuje się komorę do elektroforezy żelowej. Stosujemy gotowe żele 4-12% NuPAGE© Bis-Tris (Invitrogen) w systemie XCell SureLock® Mini-Cell (Invitrogen) z buforem MES jako buforem do prowadzenia elektroforezy, jednak można wykorzystać każdy inny żel i system elektroforetyczny.</li>
<li>Próbki białek nanosi się na żel, a następnie prowadzi elektroforezę przez 50 min przy napięciu 220V.</li>
</ol>
Część 3: Barwienie żelu
<ol>
<li>Kasetę do żelu rozmontowuje się, a żel umieszcza w pojemniku w celu przeprowadzenia kolejnych etapów płukania.</li>
<li>Do żelu dodaje się około 100 ml wody bidestylowanej i podgrzewa w kuchence mikrofalowej przez 30 sekund. Podgrzewanie należy przerwać przed momentem zagotowania. Pojemnik z żelem umieszcza się następnie na wytrząsarce na 3-5 min, a ten etap płukania powtarza się dwukrotnie przy użyciu świeżej wody.</li>
<li>Dodaje się wystarczającą ilość roztworu barwiącego CBB, aby przykryć żel w pojemniku, a następnie podgrzewa go w kuchence mikrofalowej przez 10 s bez doprowadzenia do wrzenia. Pojemnik z żelem umieszcza się następnie na wytrząsarce w celu zakończenia barwienia. Prążki białkowe mogą być widoczne już po 1 minucie; w większości przypadków barwienie jest wystarczająco intensywne po 15-30 min.</li>
<li>Roztwór barwiący odlewa się i dodaje 50-100 ml wody bidestylowanej, aby na wytrząsarce dodatkowo odbarwić jasnoniebieskie tło żelu. W razie potrzeby wodę można zastąpić świeżą wodą w celu dalszego odbarwiania.</li>
<li>Żel można zeskanować, sfotografować lub wysuszyć w celu długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>
Część 4: Reprezentatywne wyniki:
Rys. 1 przedstawia prawidłowo zabarwiony żel po zastosowaniu opisanego protokołu.
Rys. 2 przedstawia żel, który nie został wystarczająco długo przemyty przed barwieniem, przez co pozostały SDS hamuje efektywne barwienie. Należy zauważyć, że ścieżki z markerem (*) zawierają tę samą ilość białek markera.
<img src="/files/ftp_upload/1350/Fig1.png" alt="Elektroforeza żelowa SDS-PAGE; rozdzielanie białek; analiza masy cząsteczkowej; wynik laboratoryjny" data-altupdatedat="1787630408000"> Ryc. 1: Reprezentatywny żel barwiony po nałożeniu próbek z oczyszczania białka (*: marker masy cząsteczkowej).
<img src="/files/ftp_upload/1350/Fig2.png" alt="Wynik elektroforezy żelowej, prążki białkowe, analiza masy cząsteczkowej, eksperyment laboratoryjny." data-altupdatedat="1787630408000"> Rys. 2: Żel barwiony CBB, który nie był płukany wystarczająco długo przed barwieniem CBB. Prążki białkowe są słabsze (należy zauważyć, że ścieżka z markerem * zawiera taką samą ilość białka jak na Rys. 1).

<ol><li>Process for fast visualization of protein. US patent. , 6319720 (B1) (2001).</li>
<li>Solution for fast visualization of protein. US patent. , 2001046709 (A1) (2001).</li>
</ol>

Brak konfliktów interesów. Opisana powyżej procedura została pierwotnie opublikowana w zgłoszeniu patentowym autorstwa E.M. Wondraka (patrz Ref.).

<ul>
<li>Etapy płukania są kluczowe dla efektywnego barwienia białek. Skrócenie czasu płukania poniżej 2 min lub zmniejszenie objętości wody (&lt;50ml) może prowadzić do powstania blado niebieskich prążków białkowych, co najprawdopodobniej wynika z większej ilości pozostałego w żelu SDS.*</li>
<li>Jeśli białka mają zostać poddane analizie spektrometrią mas, należy pominąć etapy podgrzewania w kuchence mikrofalowej, wydłużyć czas płukania żelu do około 10 min w każdym kroku oraz przedłużyć czas barwienia, aż intensywność prążków będzie wystarcza...

<table><tbody><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td><td>AppliChem</td><td>A3480</td><td>można również zastosować każdy inny CBB G-250</td></tr><tr><td>Stężony HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

barwienie białek w żelach coomassie g-250 bez użycia rozpuszczalników organicznych i kwasu octowego

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

W klasycznych protokołach barwienia białek z użyciem Coomassie Brilliant Blue (CBB) stosuje się roztwory o wysokiej zawartości toksycznych i łatwopalnych rozpuszczalników organicznych (metanolu, etanolu lub 2-propanolu) oraz kwasu octowego do utrwalania, barwienia i odbarwiania białek w żelu po elektroforezie SDS-PAGE. W celu przyspieszenia procedury często stosuje się krótkotrwałe podgrzewanie roztworu barwiącego w kuchence mikrofalowej. Zazwyczaj prowadzi to do odparowania toksycznego lub niebezpiecznego metanolu, etanolu lub 2-propanolu oraz do powstania w laboratorium intensywnego zapachu kwasu octowego, czego należy unikać ze względów bezpieczeństwa. W protokole pierwotnie opublikowanym w dwóch wnioskach patentowych E.M. Wondraka (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)) opisano alternatywny skład roztworu barwiącego, w którym nie użyto rozpuszczalników organicznych ani kwasów. CBB rozpuszczono w wodzie bidestylowanej (60–80 mg CBB G-250 na litr), a jako jedyny dodatkowy składnik roztworu barwiącego dodano 35 mM HCl. Barwienie żelu CBB przeprowadza się po SDS-PAGE i dokładnym przemyciu żelu wodą bidestylowaną. Dzięki podgrzewaniu żelu podczas etapów mycia i barwienia proces może zostać ukończony szybciej, a do otoczenia nie odparowują żadne toksyczne ani niebezpieczne związki. Barwienie białek następuje już w ciągu 1 minuty po podgrzaniu żelu w roztworze barwiącym i jest w pełni rozwinięte po 15–30 minutach, z lekkim niebieskim tłem, które zostaje całkowicie usunięte poprzez przedłużone płukanie zabarwionego żelu w wodzie bidestylowanej, bez wpływu na zabarwione prążki białkowe.

Opisano krótki protokół barwienia białek Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 w żelach poliakrylamidowych, który nie wymaga użycia rozpuszczalników organicznych ani kwasu octowego, stosowanych w klasycznych procedurach barwienia CBB.

Barwienie białek w żelach Coomassie G-250 bez użycia rozpuszczalników organicznych i kwasu octowego

W klasycznych protokołach barwienia białek z użyciem Coomassie Brilliant Blue (CBB) stosuje się roztwory o wysokiej zawartości toksycznych i łatwopalnych rozpuszczalników organicznych...

Aby rozpocząć tę procedurę, Kumasi Brilliant Blue lub CBG two 50 rozpuszcza się w jednym litrze bi destylowanej wody, mieszając przez dwie do czterech godzin. Następnie do ciemnoniebieskiego roztworu dodaje się kwas solny, mieszając przez kolejną minutę, a roztwór przechowuje się w ciemności do późniejszego użycia. Po przygotowaniu próbek białek i wykonaniu STS page, kaseta żelowa zostaje rozmontowana, a żel umieszczony w pojemniku w celu przeprowadzenia trzech kolejnych etapów płukania bi destylowaną wodą.Po trzecim etapie płukania wodę zastępuje się odpowiednią ilością roztworu barwiącego CBB, tak aby pokrył on żel w pojemniku. Pojemnik podgrzewa się w kuchence mikrofalowej przez 10 sekund, a następnie umieszcza go wraz z żelem na wytrząsarce. Po upływie jednej minuty można obserwować prążki białek, co oznacza zakończenie barwienia.Cześć, jestem Amri Lawrence z laboratorium ekspresji i oczyszczania białek w EMBL Heidelberg. Dzisiaj zaprezentujemy protokół barwienia białek Coomassie Brilliant Blue G-250 w żelach akrylamidowych. W przeciwieństwie do klasycznych metod barwienia, nasz protokół nie wykorzystuje rozpuszczalników organicznych ani kwasu octowego.Niniejszego protokołu używamy do analizy białek po każdym etapie oczyszczania. Przejdźmy zatem do pracy. Aby przygotować roztwór barwiący CBB, 60 do 80 mg CBB rozpuszcza się w jednym litrze wody dwukrotnie destylowanej, mieszając przez dwie do czterech godzin.Po rozpuszczeniu CBV przenieś roztwór do dygestorium. W dygestorium ostrożnie dodaj trzy mililitry stężonego kwasu solnego do ciemnoniebieskiego roztworu. Podczas mieszania przez jedną minutę należy nosić rękawice, ponieważ końcowy roztwór będzie miał pH dwa.Po przygotowaniu roztwór przechowuje się w ciemności do późniejszego użycia. Roztwór może być przechowywany przez wiele tygodni, a nawet kilka miesięcy, bez utraty efektywności barwienia. Aby przygotować próbki białek do elektroforezy SDS-PAGE, odpowiednie alikwoty próbek białek miesza się z buforem do ładowania do końcowego stężenia 1x buforu do ładowania; próbki białek należy podgrzewać przez około pięć minut przed naniesieniem.Podczas podgrzewania próbek przygotowywana jest komora do elektroforezy żelowej. Używamy gotowych żeli w mini-komorze z buforem MES jako buforem do prowadzenia elektroforezy. Można jednak zastosować dowolny inny żel i system elektroforetyczny.Podgrzane próbki białek są następnie naniesione na żel i poddane elektroforezie przez 50 minut przy napięciu 220 V. Po zakończeniu elektroforezy SDS-PAGE kasetę z żelem rozmontowuje się, a żel umieszcza w pojemniku z 100 ml wody dwukrotnie destylowanej. W celu przeprowadzenia kolejnych etapów płukania pojemnik podgrzewa się w kuchence mikrofalowej przez 30 sekund.Podgrzewanie należy przerwać przed wystąpieniem wrzenia. Po mikrofalowym podgrzewaniu pojemnika z żelem umieszczonego na wytrząsarce przez trzy do pięciu minut, należy powtórzyć ten etap płukania dwukrotnie przy użyciu świeżej wody. Po trzech płukaniach wodą, do pojemnika dodaje się gotowy roztwór CBB, aby pokryć żel, a następnie pojemnik podgrzewa się w kuchence mikrofalowej przez 10 sekund, dopilnowując, aby nie doprowadzić do wrzenia.Następnie pojemnik z żelem umieszcza się na wytrząsarce w celu zakończenia barwienia. Prążki białkowe można zaobserwować już po jednej minucie, a także po 15–30 minutach. Barwienie jest zazwyczaj wystarczająco intensywne.Roztwór barwiący zostaje odlany, a następnie dodaje się od 50 do 100 ml wody bi-destylowanej. Aby całkowicie usunąć jasnoniebieskie tło żelu, można umieścić go na wytrząsarce i wielokrotnie wymieniać wodę w celu dalszego odbarwiania. W razie potrzeby żel można teraz zeskanować, sfotografować lub wysuszyć do długoterminowego przechowywania.Żel zabarwiony zgodnie z tą procedurą powinien wyglądać w następujący sposób. W tym żelu prążki białkowe są dobrze zabarwione i wyraźnie widoczne, natomiast tło jest pomijalne.Pierwsza ścieżka oznaczona gwiazdką zawiera markery masy cząsteczkowej. Dla porównania, żel, który nie został wystarczająco przepłukany przed barwieniem, będzie wyglądać w ten sposób. W tym żelu etapy płukania były zbyt krótkie, przez co prążki białkowe nie zostały odpowiednio zabarwione. Należy zauważyć, że ścieżka oznaczona gwiazdką zawiera taką samą ilość markerów masy cząsteczkowej jak poprzedni żel, lecz wykazuje mniejszą efektywność barwienia.Właśnie pokazaliśmy, jak barwić białka barwnikiem Coomassie Brilliant Blue w żelach poliakrylamidowych, bez konieczności stosowania toksycznych lub łatwopalnych rozpuszczalników organicznych. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że etapy płukania są kluczowe dla efektywnego barwienia białek. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

staining-proteins-gels-with-coomassie-g-250-without-organic-solvent

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Barwienie białek w żelach za pomocą Coomassie G-250 bez użycia rozpuszczalnika organicznego i kwasu octowego

Po rozdzieleniu metodami elektroforetycznymi białka w żelu można wykryć za pomocą kilku metod barwienia. W niniejszym filmie zaprezentowano barwienie białek błękitem Coomassie, barwienie srebrem, SYPRO Orange oraz SYPRO Ruby.

Barwienie białek w żelach

Niniejszy film ma na celu spopularyzowanie protokołu barwienia koloidalnego Coomassie G-250 według Kanga et al., służącego do wykrywania średnio 4 ng białka w żelach. Barwienie zostaje zakończone w ciągu 2 godzin i nie wymaga dużego nakładu pracy. Rutynowo stosujemy protokół Kanga do celów analitycznych w proteomice opartej na żelach.

Szybkie i czułe barwienie białek w żelach poliakrylamidowych koloidalnym barwnikiem Coomassie G-250

Użycie specyficznych glikozydaz do usuwania cukrów z glikoprotein, a następnie przeprowadzenie elektroforezy SDS-PAGE, jest cenną metodą wykrywania modyfikacji glikanowych w próbkach białek i stanowi dobry wybór do wstępnych badań z zakresu glikobiologii. Zmiany występujące po deglikozylacji można wykryć jako przesunięcia w mobilności w żelu lub poprzez barwienie odczynnikami wrażliwymi na glikany.

Identyfikacja i charakterystyka glikozylacji białek przy użyciu specyficznych endo- i egzoglikozydaz

W tym filmie demonstrujemy procedurę łączonego barwienia alcian niebieskim i srebrnym siarczanowych glikozaminoglikanu oligosacharydów. Ta połączona technika barwienia znacznie wzmacnia pasma polimerów glikozaminoglikanu o różnej długości w żelach poliakrylamidowych.

Barwienie srebrem siarczanowanych glikozaminoglikanów: metoda barwienia do wizualizacji siarczanowych glikozaminoglikanów w żelach poliakryloamidowych

Aby kompleksowo zbadać różnorodność glikanów sprzężonych z O, nowa procedura redukcyjnej eliminacji β w żelu, połączona z permetylacją i metodą szybkiego podziału fazy, jest stosowana do analizy glikanów sprzężonych z O, bezpośrednio uwalnianych z glikoprotein rozdzielonych przez SDS-PAGE i podatnych na późniejszą analizę glikomiczną za pomocą spektrometrii mas.

Ulepszona redukcyjna eliminacja β w żelu dla kompleksowych O-sprzężonych i sulfoglikomów za pomocą spektrometrii mas

Tutaj prezentujemy dwuwymiarową elektroforezę żelową (2DE) w połączeniu ze spektrometrią mas (MS) w celu oddzielenia i identyfikacji proteomu tkankowego ludzkiego gruczolaka przysadki, który przedstawia dobry i powtarzalny wzór 2DE. Wiele białek obserwuje się w każdym miejscu 2DE podczas analizy złożonego proteomu nowotworu przy użyciu MS o wysokiej czułości.

Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa w połączeniu z metodami spektrometrii mas do analizy proteomu tkanki gruczolaka przysadki mózgowej

Architektura kompleksów białkowych jest niezbędna dla ich funkcjonowania. Połączenie różnych technik spektrometrii mas okazało się skuteczne w badaniu ich składania. Udostępniamy protokoły sieciowania chemicznego i natywnej spektrometrii mas oraz pokazujemy, w jaki sposób te uzupełniające się techniki pomagają wyjaśnić architekturę wielopodjednostkowych zespołów białkowych.

Połączenie chemicznego sieciowania i spektrometrii mas nienaruszonych kompleksów białkowych w celu zbadania architektury wielopodjednostkowych zespołów białkowych

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół opisujący nową technikę barwienia fluorescencyjnego do całkowitego wykrywania białek w żelach poliakrylamidowych. Protokół wykorzystuje specyficzną dla jonów srebra sondę fluorescencyjną, która wykrywa kompleksy białkowe Ag + i eliminuje pewne ograniczenia tradycyjnych chromogennych barwników srebra.

Fluorescencyjne barwienie srebrem białek w żelach poliakryloamidowych

Ten protokół skupia się na identyfikacji białek, które wiążą się z fosforanami inozytolu lub fosfonozytydami. Wykorzystuje chromatografię powinowactwa z biotynylowanymi fosforanami inozytolu lub fosfoinozytydami, które są unieruchamiane przez streptawidynę do agarozy lub kulek magnetycznych. Fosforan inozytolu lub białka wiążące fosfoinozytol są identyfikowane za pomocą Western blot lub spektrometrii mas.

Identyfikacja białek oddziałujących z fosforanem inozytolu lub fosfoinozytylem za pomocą chromatografii powinowactwa sprzężonej ze spektrometrią Western Blot lub spektrometrią mas

Ten protokół opisuje ekstrakcję i wizualizację zagregowanych i rozpuszczalnych białek z Escherichia coli po leczeniu proteotoksycznym środkiem przeciwbakteryjnym. Postępowanie zgodnie z tą procedurą pozwala na jakościowe porównanie tworzenia agregatów białkowych in vivo w różnych szczepach bakteryjnych i/lub między zabiegami.

Ekstrakcja i wizualizacja agregatów białkowych po leczeniu Escherichia coli stresorem proteotoksycznym

Ten protokół opisuje technikę analizy superkompleksów oddechowych, gdy dostępne są tylko małe ilości próbek.

Izolacja mitochondriów do analizy superkompleksów mitochondrialnych z próbek małych tkanek i kultur komórkowych

Poznaj uproszczoną metodę barwienia białek w żelach poliakrylamidowych za pomocą Coomassie G-250 bez rozpuszczalników organicznych i kwasu octowego. Protokół zapewnia szybką wizualizację pasm białkowych już po jednej minucie.

Barwienie białek w żelach Coomassie G-250 bez użycia rozpuszczalników organicznych i kwasu octowego

Przeglądaj więcej filmów