Barwienie białek w żelach za pomocą Coomassie G-250 bez rozpuszczalnika organicznego i kwasu octowego

Aby rozpocząć tę procedurę, Kumasi Brilliant Blue lub CBG two 50 rozpuszcza się w jednym litrze wody destylowanej bi, mieszając przez dwie do czterech godzin. Kwas solny dodaje się później do ciemnoniebieskiego roztworu, mieszając przez kolejną minutę, a roztwór przechowuje się w ciemności do późniejszego wykorzystania. Po przygotowaniu próbki białka i stronie STS, kaseta z żelem jest demontowana, a żel umieszczany w pudełku na trzy kolejne etapy mycia wodą destylowaną bi.

Po trzecim etapie mycia woda jest zastępowana wystarczającą ilością roztworu barwiącego CBB, aby pokryć żel w pudełku. Pudełko podgrzewa się w kuchence mikrofalowej przez 10 sekund, a następnie pudełko z żelem umieszcza się na shakerze. Aby zakończyć barwienie, po jednej minucie można zaobserwować pasma białkowe.

Cześć, nazywam się Amri Lawrence i pracuję w zakładzie kaszlu oczyszczającym z ekspresji białek w Emberin Heidelberg. Dzisiaj pokażemy Wam protokół barwienia białek błękitem brylantowym Cooma G hundred 50 w żelach chlorkowych. W przeciwieństwie do klasycznych metod barwienia, w naszym protokole nie stosuje się żadnych rozpuszczalników organicznych ani kwasu octowego.

Używamy tego protokołu do analizy naszych białek po każdym etapie oczyszczania. Więc zacznijmy. Aby przygotować roztwór barwiący CBB, 60 do 80 miligramów CBB rozpuszcza się w jednym litrze wody destylowanej Bist, mieszając przez dwie do czterech godzin.

Po rozpuszczeniu CBV przenieść roztwór do dygestorium. W dygestorii ostrożnie dodaj trzy mililitry stężonego kwasu solnego do ciemnoniebieskiego roztworu. Przy mieszaniu przez minutę należy nosić rękawiczki, ponieważ końcowy roztwór będzie miał pH dwa.

Po przygotowaniu roztworu przechowuje się go w ciemności do późniejszego wykorzystania. Roztwór można przechowywać przez tygodnie lub do kilku miesięcy bez utraty skuteczności barwienia. Aby przygotować próbki białek na stronę SDS, odpowiednie porcje próbek białek miesza się z buforem ładującym do końcowego stężenia jednego x bufor ładujący, podgrzewa próbki białek przez około pięć minut przed załadowaniem.

Podczas podgrzewania próbek przygotowywana jest do pracy komora do elektroforezy żelowej. Używamy prefabrykatów żelowych w mini komórce z buforem MES jako buforem bieżącym. Można jednak zastosować dowolny inny system żelowy i elektroforezowy.

Podgrzane próbki białek są następnie ładowane do żelu i elektro East przez 50 minut pod napięciem 220 woltów. Po zakończeniu strony SDS kaseta z żelem jest demontowana, a żel umieszcza się w pudełku ze 100 mililitrami wody destylowanej bist. W przypadku kolejnych etapów prania pudełko jest podgrzewane w kuchence mikrofalowej przez 30 sekund.

Ogrzewanie należy przerwać przed wrzeniem. Po podgrzaniu pudełka w kuchence mikrofalowej z żelem umieszczonym na shakerze przez trzy do pięciu minut, powtórz ten krok mycia dwukrotnie świeżą wodą. Po trzech myciach wodą dodaje się stały roztwór CBB, aby przykryć żel w pudełku, a pudełko podgrzewa się w kuchence mikrofalowej przez 10 sekund bez gotowania.

Następnie pudełko z żelem umieszcza się na wytrząsarce w celu zakończenia barwienia. Pasma białkowe można zaobserwować po jednej minucie i po 15 do 30 minutach. Barwienie jest zwykle wystarczająco silne.

Roztwór barwiący wylewa się i dodaje od 50 do 100 mililitrów wody destylowanej bi. W celu dalszego zatrzymania jasnoniebieskiego tła żelu na shakerze, wodę można zastąpić świeżą wodą w celu dalszego usuwania barwienia. W razie potrzeby żel można teraz zeskanować, sfotografować lub wysuszyć w celu długotrwałego przechowywania.

Żel, który został poplamiony po tej procedurze, powinien wyglądać tak. W tym żelu pasma białkowe są dobrze wybarwione i wyraźnie widoczne. Podczas gdy tło jest znikome.

Pierwszy pas oznaczony gwiazdką zawiera markery masy cząsteczkowej. W przeciwieństwie do tego, żel, który nie został wystarczająco umyty przed barwieniem, będzie wyglądał tak W tym żelu etapy mycia były zbyt krótkie, więc pasma białkowe nie były wystarczająco dobrze wybarwione. Należy zauważyć, że pas wskazany gwiazdką zawiera takie same ilości białek markerów masy cząsteczkowej jak poprzedni żel, ale wykazuje mniej efektywne barwienie.

Właśnie pokazaliśmy, jak barwieć białka za pomocą co massive brilliant blue w żelach poliamidowych bez konieczności stosowania toksycznych lub łatwopalnych rozpuszczalników organicznych. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że etapy mycia mają kluczowe znaczenie dla skutecznego barwienia białek. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.